JP2013532481A

JP2013532481A - 新規細菌及びその使用方法

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Publication number: JP2013532481A
Application number: JP2013521734A
Authority: JP
Inventors: ハイストラ，ビョルン・ダニエル; ケルン，エフゲニア; ケプケ，ミハエル; セゴヴィア，サイモン; リュウ，ファンミン
Original assignee: ランザテク・ニュージーランド・リミテッド
Priority date: 2010-07-28
Filing date: 2011-07-28
Publication date: 2013-08-19
Anticipated expiration: 2031-07-28
Also published as: US10494600B2; KR20130097174A; EP2598630A4; BR112013003644A2; EP2598630B1; CN103415612A; CA2786903C; US20160017276A1; AU2011283282B2; CA2786903A1; ZA201300612B; CN103415612B; JP5922657B2; US20130217096A1; WO2012015317A1; BR112013003644B1; KR101375038B1; EP2598630A1; EA201390179A1; EA025778B1

Abstract

本発明は、一般にガスの微生物発酵の分野に関する。本発明は、さらに詳しくは、一酸化炭素（ＣＯ）を含有する基質の嫌気発酵によるエタノール生産の効率が向上するClostridium autoethanogenum細菌の新株に関する。
【選択図】図２ｂ

Description

本発明は、一般にガスの微生物発酵の分野に関する。本発明は、さらに詳しくは、一酸化炭素（ＣＯ）を含有する基質の嫌気発酵によるエタノール生産の効率が向上する新規クラスの細菌に関する。

エタノールは世界中で主要な高水素含量の液状交通燃料に急速になりつつある。２００５年のエタノールの世界中の消費量は推定１２２億ガロンであった。燃料エタノール産業の世界市場も、ヨーロッパ、日本、米国、及びいくつかの発展途上国でのエタノールへの関心の高まりのため、将来的に急成長すると予測されている。

例えば、米国では、エタノールは、エタノール１０％混合ガソリンであるＥ１０の製造に使用されている。Ｅ１０ブレンドでは、エタノール成分は酸素化剤として機能し、燃焼効率を改善して大気汚染物質の生成を減少させる。ブラジルでは、エタノールは、ガソリンにブレンドされる酸素化剤として、またそれ自体での純燃料として交通燃料需要の約３０％を満たしている。また、ヨーロッパでも、温室効果ガス（Green House Gas（ＧＨＧ））排出の結果を取り巻く環境問題が刺激となり、欧州連合（European Union（ＥＵ））は、加盟国に対してバイオマス由来エタノール等の持続可能な輸送燃料の消費に関して義務的目標を設定している。

燃料エタノールの大部分は、サトウキビから抽出されるショ糖又は穀類作物から抽出されるデンプン等の作物由来炭水化物を主要な炭素源として使用する伝統的な酵母を用いた発酵プロセスから製造されている。しかし、これらの炭水化物供給原料のコストは、それらの人間又は動物の食料としての価値の影響を受け、他方では、エタノール製造用のデンプン又はショ糖を生産する作物の耕作は、すべての地域で経済的に持続可能であるとは限らない。したがって、より低コスト及び／又はより豊富な炭素資源を燃料エタノールに変換する技術開発に関心が持たれている。

ＣＯは、石炭又は石油及び石油由来製品等の有機材料の不完全燃焼の主要で無償の高エネルギー副生成物である。例えば、オーストラリアの鉄鋼業は、年間５００，０００トンを超えるＣＯを生成して大気中に放出していると報告されている。

接触プロセスは、主としてＣＯ及び／又はＣＯと水素（Ｈ_２）からなるガスを様々な燃料及び化学物質に変換するために使用できる。微生物もまたこれらのガスを燃料及び化学物質に変換するために使用できる。

ＣＯを唯一の炭素源として増殖する微生物の能力は１９０３年に初めて発見された。これは後に独立栄養増殖のアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）生化学経路（ウッド・リュングダール経路及び一酸化炭素脱水素酵素／アセチルＣｏＡ生成酵素（ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）経路としても知られている）を使用する生物の特性であると確定された。カルボキシド栄養性(carboxydotrophic)生物、光合成生物、メタン生成生物及び酢酸生成生物を含む多数の嫌気性生物がＣＯを種々の最終生成物、即ち、ＣＯ_２、Ｈ_２、メタン、ｎ−ブタノール、酢酸塩及びエタノールに代謝することが明らかになっている。すべてのこのような生物は、唯一の炭素源としてＣＯを使用して、これらの最終生成物のうちの少なくとも２種を生成する。

クロストリジウム属(genus Clostridium)の細菌等の嫌気性細菌は、アセチルＣｏＡ生化学経路を介してＣＯ、ＣＯ_２及びＨ_２からエタノールを生産することが実証されている。例えば、ガスからエタノールを生産する種々のクロストリジウム・リュングダリイ(Clostridium ljungdahlii)株が、ＰＣＴ公開ＷＯ００／６８４０７号、欧州特許１１７３０９号、米国特許５，１７３，４２９号、同５，５９３，８８６号及び同６，３６８，８１９号、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／００５５８号及び同０２／０８４３８号に記載されている。またクロストリジウム・オートエタノゲナム種(Clostridium autoethanogenum sp)の細菌もガスからエタノールを生産することが知られている（Abriniら、Archives of Microbiology第１６１巻、３４５〜３５１頁（１９９４））。

しかしながら、微生物によるガス発酵によるエタノールの生産は常に酢酸塩及び／又は酢酸の同時生産を伴う。利用可能な炭素の一部はエタノールではなく酢酸塩／酢酸に変換されてしまい、このような発酵プロセスを用いるエタノールの生産効率は望ましいものとは言い難い。また、酢酸塩／酢酸の副生成物が何か他の目的に使用できない場合には、それは廃棄物処理問題をもたらす可能性がある。酢酸塩／酢酸は微生物によってメタンに変換されるので、ＧＨＧ排出の原因となる可能性もある。

Ｈ_２存在下でＣＯを微生物発酵すると、炭素は実質的に完全にアルコールへ転換される。しかしながら、十分にＨ_２がない場合は、一部のＣＯはアルコールに変換されるが、相当部分は下記式に示すようにＣＯ_２に変換される：
６ＣＯ＋３Ｈ_２Ｏ→Ｃ_２Ｈ_５ＯＨ＋４ＣＯ_２
１２Ｈ_２＋４ＣＯ_２→２Ｃ_２Ｈ_５ＯＨ＋６Ｈ_２Ｏ
ＣＯ_２が生成されるということは、全体的な炭素捕捉の効率の悪さを表しており、放出されるとこれも温室効果ガス排出の一因となる懸念がある。

ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１１７１５７号に、一酸化炭素含有ガスの嫌気発酵によってアルコール、特にエタノールを製造する方法が記載されている。発酵プロセスの副生成物として生成する酢酸塩は、水素ガス及び二酸化炭素ガスに転換され、このいずれか又は両方は嫌気発酵プロセスに使用できる。

ＰＣＴ公開ＷＯ２００８／１１５０８０号には、複数の発酵段階で１種以上のアルコールを製造する方法が記載されている。第１のバイオリアクターでの１種以上のガスの嫌気発酵の結果として生成する副生成物は、第２のバイオリアクターで生成物を製造するのに使用できる。更に、第２の発酵段階の副生成物は、生成物を製造するために第１のバイオリアクターにリサイクルすることができる。

ＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０６４２００号には、一酸化炭素を含有する基質の嫌気性発酵によるエタノール生成効率の高い新規クラスの細菌が記載されている。
一酸化炭素を含有するガスのエタノールへの発酵をより高い効率で行うことが可能な微生物、即ち、先行技術の微生物に比較して、同じ基質から、より高い一酸化炭素の取り込み、より大量のエタノールの生成、及び／又はエタノールの酢酸塩に対するより高い比率を達成することが可能な微生物を提供できれば有益である。

本発明の目的は、ＣＯを含有するガス源のエタノールへの転換において、先行技術の限界の１つを克服する新規クラスの細菌を提供すること、又は有用な選択肢を公衆に少なくとも提供することである。

発明の概要
第１の側面において、本発明は、ＣＯを含む基質の嫌気発酵によってエタノール及び所望により酢酸塩を含む生成物を、少なくとも約２ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日の比生産性で生産することができる細菌の生物学的に純粋な分離株を提供する。

他の態様において、前記細菌は少なくとも約３ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日、少なくとも約４ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日、少なくとも約５ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日、少なくとも約６ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日、又は少なくとも約７ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日の比生産性でエタノールを生産することができる。

別の側面において、本発明は、ＣＯを含む基質の嫌気発酵によってエタノール及び所望により酢酸塩を含む生成物を、少なくとも約１０ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／日の生産性で生産することができる細菌の生物学的に純粋な分離株を提供する。

他の態様において、前記細菌は少なくとも約２０ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／日、少なくとも約３０ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／日、少なくとも約４０ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／日、少なくとも約５０ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／日、少なくとも約６０ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／日、又は少なくとも約７０ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／日の生産性で生産することができる。

別の側面において、本発明は、ＣＯを含む基質の嫌気発酵によってエタノール及び所望により酢酸塩を含む生成物を生産することができ、かつ少なくとも１．０ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）の比取り込みが可能である細菌の生物学的に純粋な分離株を提供する。

一態様において、前記細菌は少なくとも約１．２ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）、少なくとも約１．４ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）、少なくとも約１．６ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）、少なくとも約１．８ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）、又は少なくとも約２．０ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）のＣＯの比取り込みが可能である。特定の一態様において、前記細菌は少なくとも約１．２ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）のＣＯの比取り込みが可能である。

別の態様において、本発明は、ＣＯを含む基質の嫌気発酵によってエタノール及び所望により酢酸塩を含む生成物を生産することができ、かつ少なくとも約０．８／日の比増殖速度が可能である細菌の生物学的に純粋な分離株を提供する。

ある態様において、前記細菌は少なくとも約１．０／日、少なくとも約１．２／日、少なくとも約１．４／日、少なくとも約１．６／日、少なくとも約１．８／日、又は少なくとも２．０／日の比増殖速度が可能である。

別の側面において、本発明は、ＣＯを含む基質の嫌気発酵によってエタノール及び所望により酢酸塩を含む生成物を生産することができ、かつエタノールの酢酸塩に対する比が少なくとも約２：１でエタノールを生産することができる細菌の生物学的に純粋な分離株を提供する。

ある態様において、前記細胞は、エタノールの酢酸塩に対する比が、少なくとも約３：１、少なくとも４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約７：１、又は少なくとも約１０：１でエタノールを生産することができる。

一態様において、前記細胞は実質的に酢酸塩を含まないエタノールを生産することができる。
別の側面において、本発明は、細菌がＣＯを含む基質の嫌気発酵によってエタノール及び所望により酢酸塩を含む生成物を生産することができ、かつ約３０ｇ／Ｌ（培養ブロス）までのアルコールに対する耐性能力を有する細菌の生物学的に純粋な分離株を提供する。

ある態様において、細菌は約４０ｇ／Ｌ（培養ブロス）まで、約５０ｇ／Ｌ（培養ブロス）まで、約６０ｇ／Ｌ（培養ブロス）まで、又は最大約７０ｇ／Ｌ（培養ブロス）までのアルコールに対する耐性能力を有する。

別の側面において、本発明は、ＣＯを含む基質の嫌気発酵によってエタノール及び所望により酢酸塩を含む生成物を生産することができ、かつ、以下の特徴の２つ以上を有する細菌の生物学的に純粋な分離株を提供する：
ＣＯを含む基質の嫌気発酵によってエタノール及び所望により酢酸塩を含む生成物を、少なくとも約２ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日の比生産性で生産することができること、
少なくとも約１０ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／日の濃度でエタノールを生産することができること、
少なくとも約１．０ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）のＣＯの比取り込みが可能であること、
少なくとも約１．０ｇ／日の増殖速度が可能であること、
エタノールの酢酸塩に対する比が少なくとも約２：１でエタノールを生産することができること、及び
約３０ｇ／Ｌ（ブロス）までのアルコールに対する耐性能力を有すること。

一態様において、本発明の細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム由来である。好ましい態様では、本発明の細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム株である。

特定の態様において、前記細菌は受託番号ＤＭＳ２３６９３でＤＳＭＺに寄託されたクロストリジウム・オートエタノゲナム株を決定付ける特徴を有する。一態様において、細菌は受託番号ＤＭＳ２３６９３でＤＳＭＺに寄託されたクロストリジウム・オートエタノゲナム株である。

更なる側面において、本発明は、受託番号ＤＭＳ２３６９３でＤＳＭＺに寄託されたクロストリジウム・オートエタノゲナム株の生物学的に純粋な分離株を提供する。
別の側面において、本発明は本明細書中で前述した細菌を用いてＣＯを含む基質を発酵させることを含む１種以上のアルコールの製造方法を提供する。

一態様において、前記方法は、
（ａ）ＣＯを含む基質を本発明の細菌の培養物を含有するバイオリアクターへ供給する工程と、
（ｂ）前記バイオリアクターで前記培養物を嫌気発酵し、１種以上のアルコールを生産する工程とを含む。

更なる側面において、本発明は工業プロセスからの大気中への総炭素排出量を削減する方法であって、前記方法は、
（ａ）工業プロセスの結果として生成するＣＯ含有ガスを、前記ガスが大気中に放出される前に捕捉することと、
（ｂ）本発明の１種以上の細菌を含有する培養物により１種以上のアルコールを生産するために前記ＣＯ含有ガスを嫌気発酵することとを含む。

前記の方法の側面の一態様において、発酵は約３４℃〜約３７℃の温度で行われる。好ましい一態様では、発酵は約３４℃の温度で行われる。
前記の方法の側面のある態様において、酢酸塩は発酵の副生成物として生成する。好ましくは、生産された１種以上のアルコールはエタノールを含む。

前記の方法の側面の特定の態様において、細菌は水性培地中で維持される。
前記の方法の側面の特定の態様において、基質の発酵はバイオリアクター内で起こる。
ある態様において、基質は、体積で少なくとも約２５％のＣＯ、体積で少なくとも約３０％のＣＯ、体積で少なくとも約４０％のＣＯ、体積で少なくとも約５０％のＣＯ、体積で少なくとも約６５％のＣＯ、又は体積で少なくとも約７０％のＣＯを含有する。特定の態様において、基質は、体積で少なくとも約７５％のＣＯ、体積で少なくとも約８０％のＣＯ、体積で少なくとも約８５％のＣＯ、体積で少なくとも約９０％のＣＯ、又は体積で少なくとも約９５％のＣＯを含有する。

一態様において、基質は、体積で約３０％以下のＨ_２を含む。別の態様では、基質は、体積で約２０％以下のＨ_２、体積で約１５％以下のＨ_２、体積で約１０％以下のＨ_２、体積で約５％以下のＨ_２、体積で約４％以下のＨ_２、体積で約３％以下のＨ_２、体積で約２％以下のＨ_２、若しくは体積で約１％以下のＨ_２を含むか、又は実質的にＨ_２を含まない。

一態様において、基質は、体積で約２０％以下のＣＯ_２を含む。特定の態様では、基質は、体積で約１５％以下のＣＯ_２、体積で約１０％以下のＣＯ_２、若しくは体積で約５％以下のＣＯ_２を含むか、又は実質的にＣＯ_２を含まない。

ある態様において、ＣＯを含む基質はＣＯを含有する気体基質である。
ある態様において、気体基質は工業プロセスの副生成物として得られるガスを含む。
ある態様において、前記工業プロセスは鉄金属製品製造、非鉄金属製品製造、石油精製過程、バイオマスのガス化、石炭のガス化、電力生産、カーボンブラック生産、アンモニア生産、メタノール生産、及びコークス生産からなる群から選択される。

一態様において、前記気体基質は製鋼所から得られるガスを含んでもよい。
別の態様において、気体基質は自動車の排ガスを含んでもよい。
前記方法の側面のある態様において、アルコールは発酵ブロスから回収され、前記発酵ブロスは細菌細胞とアルコールを含む水性培地である。

ある態様において、酢酸塩は発酵の副生成物として生成する。
更なる態様において、アルコールと酢酸塩はブロスから回収される。
本発明は上記のように広く定義されるが、本発明はそれらに限定されず、また、以下の説明で例を提供する態様も含む。

図面の簡単な説明
次に、本発明を添付の図を参照しながら詳細に説明する。

図１は、ＤＳＭ１９６３０及びＤＳＭ２３６９３のＣＯ消費を示す。図２は、ＤＳＭ１９６３０（図２ａ）とＤＳＭ２３６９３（図２ｂ）の代謝産物の生産を示す。図２は、ＤＳＭ１９６３０（図２ａ）とＤＳＭ２３６９３（図２ｂ）の代謝産物の生産を示す。図３は、実施例２に記載のＤＳＭ２３６９３の最適化されたバイオマス蓄積及び代謝産物の生産を示す。図４は、新規なＣ．クロストリジウム・オートエタノゲナム株ＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）の、菌株ＬＺ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）に対する変異を示す遺伝子地図を示す。配列番号１：菌株ＬＺ１５６１におけるＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭｕｔＳ遺伝子のヌクレオチド配列配列番号２：菌株ＬＺ１５６０におけるＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭｕｔＳ遺伝子のヌクレオチド配列配列番号３：菌株ＬＺ１５６１におけるＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭｕｔＳ遺伝子のアミノ酸配列配列番号４：菌株ＬＺ１５６０におけるＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭｕｔＳ遺伝子のアミノ酸配列配列番号５：菌株ＬＺ５６１及びＬＺ１５６０中に再配列していることが見出されたヌクレオチド配列配列番号６：菌株ＬＺ１５６１におけるＦ_１Ｆ_ＯＡＴＰ生成酵素オペロンの推定プロモーター領域のヌクレオチド配列配列番号７：菌株ＬＺ１５６０におけるＦ_１Ｆ_ＯＡＴＰ生成酵素オペロンの推定プロモーター領域のヌクレオチド配列配列番号８：菌株ＬＺ１５６１におけるＲｎｆ複合体オペロンの推定プロモーター領域のヌクレオチド配列配列番号９：菌株ＬＺ１５６０におけるＲｎｆ複合体オペロンの推定プロモーター領域のヌクレオチド配列配列番号１０：菌株ＬＺ１５６１における炭素飢餓タンパク質の推定プロモーター領域のヌクレオチド配列配列番号１１：菌株ＬＺ１５６０における炭素飢餓タンパク質の推定プロモーター領域のヌクレオチド配列配列番号１２：菌株ＬＺ１５６１におけるＣＯ脱水素酵素／ＣＯ−メチル化アセチル−ＣｏＡ生成酵素複合体のβサブユニット遺伝子のヌクレオチド配列配列番号１３：菌株ＬＺ１５６０におけるＣＯ脱水素酵素／ＣＯ−メチル化アセチル−ＣｏＡ生成酵素複合体のβサブユニット遺伝子のヌクレオチド配列配列番号１４：菌株ＬＺ１５６１におけるＣＯ脱水素酵素／ＣＯ−メチル化アセチル−ＣｏＡ生成酵素複合体のβサブユニット遺伝子のアミノ酸配列配列番号１５：菌株ＬＺ１５６０におけるＣＯ脱水素酵素／ＣＯ−メチル化アセチル−ＣｏＡ生成酵素複合体のβサブユニット遺伝子のアミノ酸配列配列番号１６：菌株ＬＺ１５６１における５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素遺伝子のヌクレオチド配列配列番号１７：菌株ＬＺ１５６０における５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素遺伝子のヌクレオチド配列

発明者らは新規な細菌を開発した。前記細菌は多くの予期せぬ特性（以下で概説する）の１つ以上を、また好ましい態様ではこれらの特性の全てを有することによって特徴付けられる。嫌気発酵プロセスにおいてこれらの新規な細菌を使用することによって、既存の菌株に比較して、エタノール及び／又は酢酸塩等の生成物を生産する発酵プロセスの全体的な効率の向上を可能にする予想外の利点を提供する。

従って、広い意味では、一側面において、本発明は、新規な細菌及び嫌気性発酵プロセスの効率を上げる細菌の生物学的に純粋な分離株に関する。一態様では、前記細菌はＣＯを含む基質からアルコール、好ましくはエタノールを生産することができる。

更なる側面において、本発明は本発明の細菌によるＣＯ含有基質の嫌気性発酵によってアルコール、好ましくはエタノールを生産する方法に関する。
定義
特に断りのない限り、本明細書全体を通して使用される下記の用語は以下のように定義される。

「ＣＯを含有する基質」、「ＣＯを含む基質」等の用語は、一酸化炭素が例えば増殖及び／又は発酵のために細菌に利用可能な任意の基質を含むと理解される。本発明の特定の態様において、「ＣＯを含有する基質」は気体である。このような基質は、本明細書中では、「ＣＯを含有する気体基質」「ＣＯを含む気体基質」等と呼ばれることもある。

以下の説明では、本発明の態様を「ＣＯを含有する気体基質」を供給して発酵させるという観点で説明する。しかしながら、気体基質は代替の形態で供給してもよい。例えば、ＣＯを含有する気体基質を液体に溶解して供給してもよい。要するに、液体を一酸化炭素含有ガスで飽和させ、次いでその液体をバイオリアクターに添加する。これは標準的な方法を用いて達成できる。例を挙げると、微小気泡分散体発生装置（Hensirisakら、Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology第１０１巻、第３号／１０月、２００２）を使用することができる。更なる例としては、ＣＯを含有する気体基質を固体支持体表面に吸着させてもよい。このような代替の方法は、用語「ＣＯを含有する基質」を使用することで、それに包含される。

「効率を高める」、「高い効率」等の用語は発酵過程に関連して使用される場合、以下の中の１つ以上を高めることを含むが、これらに限定はされない。すなわち、発酵に触媒作用を及ぼす微生物の増殖速度、微生物によるＣＯの取り込み又は消費、消費される基質（例えばＣＯ）の体積あたり生産される目的生成物（例えばアルコール）の体積、培地で生産される目的生成物（例えばアルコール）の濃度、目的生成物の生成速度又は生成濃度、及び発酵の他の副生成物に対する目的生成物の相対的割合。

用語「酢酸塩」は、酢酸塩単体、並びに分子状又は遊離の酢酸及び酢酸塩との混合物、例えば本明細書に記載されている発酵ブロス中に存在する酢酸塩と遊離酢酸の混合物等、の両方を含む。発酵ブロス中の分子状酢酸の酢酸塩に対する比はその系のｐＨに依存する。

用語「バイオリアクター」は１つ以上の容器及び／又は塔又は配管からなる発酵装置を含み、連続撹拌槽型リアクター（Continuous Stirred Tank：ＣＳＴＲ）、固定化細胞リアクター（Immobilized Cell Reactor：ＩＣＲ）、トリクルベッドリアクター（Trickle Bed Reactor：ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静止型混合器、又は気液接触に適切な他の容器又は他の装置を含む。

本明細書で使用される用語「アルコール耐性」は、細菌又は細菌集団が、生存して増殖し続ける、及び／又は少なくともある程度の目的生成物を生産し続けるのに耐えられるアルコール、好ましくはエタノールの濃度を指すと捉えるべきである。

本発明の細菌、又はそれらの培養物又は分離株は、「単離された」又は「生物学的に純粋な」形態にあると説明することができる。これらの用語は、細菌が環境から分離されている、又は天然若しくはそれ以外で見出される場合に細菌に随伴しうる細胞性若しくはそれ以外の１つ以上の成分から分離されていることを意味する。用語「単離された」又は「生物学的に純粋な」が、細菌が精製された程度を示していると解釈してはならない。しかしながら、一態様では、前記細菌の分離株又は培養物は本発明の細菌を優位に含有する。

本発明は、ＣＯを含有する基質の嫌気発酵によってエタノール及び所望により酢酸塩を含む生成物を生産することができ、かつ下記の１つ以上を達成することができる細菌の生物学的に純粋な分離株を提供する：
約２ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日の比生産性でエタノールを生産すること、
少なくとも約１０ｇ／Ｌ（発酵ブロス）／日の生産性でエタノールを生産すること、
少なくとも約１．０ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）のＣＯの比取り込み、
少なくとも約０．８／日の比増殖速度、
エタノールの酢酸塩に対する比が少なくとも約２：１でエタノールを生産すること、及び
約３０ｇ／Ｌ（ブロス）までのアルコール耐性を有すること。

好ましい態様において、本発明の細菌は、上記の特徴の２つ、３つ、４つ、又は５つを達成することが可能である。
ある態様において、前記細菌は、少なくとも約３ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日、少なくとも約４ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日、少なくとも約５ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日、少なくとも約６ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日、又は少なくとも約７ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日の比生産性でエタノールを生産することができる。

ある態様において、前記細菌は、少なくとも約２０ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／日、少なくとも約３０ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／日、少なくとも約４０ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／日、又は少なくとも約５０ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／日の生産性でエタノールを生産することができる。最大値は、化学量論、ＣＯの取り込み及びエタノール除去を考慮して決める。

ある態様において、前記細菌は、少なくとも約１．２ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）、少なくとも約１．４ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）、少なくとも約１．６ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）、少なくとも約１．８ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）、又は少なくとも約２．０ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）のＣＯの比取り込みが可能である。特定の態様において、前記細菌は、少なくとも約１．２ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）の比取り込みが可能である。

ある態様において、前記細菌は、少なくとも約１．０／日、少なくとも約１．２／日、少なくとも約１．４／日、少なくとも約１．６／日、少なくとも約１．８／日、又は少なくとも約２．０／日の比増殖速度が可能である。ある態様において、前記細菌は、エタノールの酢酸塩に対する比が、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約７：１、又は少なくとも約１０：１でエタノールを生産することができる。特定の態様において、発酵中に正味の酢酸塩は生産されない。

ある態様において、前記細菌は、最大約４０ｇ／Ｌ（培養ブロス）、最大約５０ｇ／Ｌ（培養ブロス）、又は最大約６０ｇ／Ｌ（培養ブロス）までのアルコールに対する耐性能力を有する。特定の態様において、前記細菌は、最大約７０ｇ／Ｌ（培養ブロス）までのアルコールに対する耐性能力を有する。

好ましい態様において、本発明の細菌はクロストリジウム・オートエタノゲナムに由来する。本発明の更に好ましい態様において、前記細菌はクロストリジウム・オートエタノゲナム株ＤＳＭ１９６３０（ＤＳＭＺ、ドイツ）（ＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０６４２００号に記載）に由来する。

好ましい態様において、本発明の細菌はクロストリジウム・オートエタノゲナム株である。
クロストリジウム・オートエタノゲナムは、例えば、Abriniら、Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide（クロストリジウム・オートエタノゲナム新種、一酸化炭素からエタノールを生産する嫌気性細胞）、Arch Microbiol.，第１６１巻、３４５〜３５１頁（１９９４）に記載されている。

本発明のある態様において、前記細菌は、ブダペスト条約に従って２０１０年６月７日にドイツのＤＳＭＺに寄託されたクロストリジウム・オートエタノゲナム株ＤＳＭ２３６９３を決定付ける特徴を有する。特定の態様において、前記細菌はクロストリジウム・オートエタノゲナム株ＤＳＭ２３６９３である。

本発明は、また本発明の細菌由来の細菌にも関する。
本発明のある態様の細菌は、高いアルコール生産速度、高い増殖速度、ＣＯの高い消費速度又は更新速度、アルコールの酸に対する高い生成比、及び／又はアルコールに対する高い耐性を達成することが可能である。この細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナムを含むクロストリジウム種の他の菌株よりも利益をもたらす。従って、本発明の細菌を使用することによって、酢酸塩及び／又はエタノール等の生成物を生産するための発酵プロセスの全体的な効率を高めることができる。

特定の態様において、本発明の細菌は、生産性、増殖速度、アルコールの酸に対する比率、ＣＯ消費及びアルコール耐性は、前述の通り、気体基質中のＣＯ濃度を上げた状態で達成が可能である。例えば、気体基質は体積で少なくとも約５０％のＣＯ、体積で少なくとも約６５％のＣＯ、又は体積で少なくとも約７０％のＣＯを含んでもよい。ある態様では、気体基質は、体積で少なくとも約８０％のＣＯ、又は体積で少なくとも約８５％のＣＯ、又は体積で少なくとも約９０％のＣＯ、又は体積で少なくとも約９５％のＣＯを含んでもよい。

同様に、生産性、増殖速度、アルコールの酸に対する比率、ＣＯ消費及びアルコール耐性は、前述の通り、ある態様では、気体基質中のＨ_２が低い濃度から存在しない状態で達成することが可能である。気体基質は体積で約３０％以下のＨ_２を含んでもよい。特定の態様では、気体基質は体積で約２０％以下のＨ_２、体積で約１５％以下のＨ_２、体積で約１０％以下のＨ_２、体積で約５％以下のＨ_２、体積で約４％以下のＨ_２、体積で約３％以下のＨ_２、体積で約２％以下のＨ_２、又は体積で約１％以下のＨ_２を含む、あるいは実質的にＨ_２を含まない。

ある態様において、本発明の細菌は、また、生産性、増殖速度、アルコールの酸に対する比率、ＣＯ消費及びアルコール耐性を、前述の通り、比較的少量のＣＯ_２を含む気体基質を供給された場合にも達成可能である。一態様において、気体基質は、体積で約２０％以下のＣＯ_２を含む。ある態様では、気体基質は、体積で約１５％以下のＣＯ_２、体積で約１０％以下のＣＯ_２、若しくは体積で約５％以下のＣＯ_２を含む。特定の態様では、気体基質は実質的にＣＯ_２を含まない。

ある態様において、本発明の細菌の培養物は水性培地中で維持される。好ましくは、前記水性培地は最少嫌気性微生物増殖培地である。適切な培地は当該技術分野で公知であり、例えば米国特許第５，１７３，４２９号及び同５，５９３，８８６号及びＰＣＴ公開ＷＯ０２／０８４３８号、並びにKlassonら[(1992). Bioconversion of Synthesis Gas into Liquid or Gaseous Fuels（合成ガスの液体又は気体燃料への生物変換）. Enz. Microb. Technol. 第１４巻、６０２〜６０８頁）］、Najafpour及びYounesi[(2006). Ethanol and acetate synthesis from waste gas using batch culture of Clostridium ljungdahlii（クロストリジウム・リュングダリイの回分培養を利用した廃棄物からのエタノール及び酢酸塩合成）. Enzyme and Microbial Technology、第３８巻、第１号〜第２号、２２３〜２２８頁]及びLewisら[(2002). Making the connection-conversion of biomass-generated producer gas to ethanol（バイオマス生成された発生炉ガスのエタノールへの接続変換実施）. Abst. Bioenergy, ２０９１〜２０９４頁]に記載されている。本発明の特定の態様において、最少嫌気性微生物増殖培地は、以下の実施例の項に記載する。

本発明は、また、ＣＯを含む気体基質から１種以上のアルコールを製造する方法を提供し、前記方法は、前記基質の存在下で本発明の１種以上の細菌分離株の培養物を維持すること、及び前記基質を前記１種以上の細菌分離株によって１種以上のアルコールにする嫌気発酵を含む。

本発明は、また、工業プロセスからの大気中への総炭素排出量を削減する方法も提供し、前記方法は、
（ａ）工業プロセスの結果として生成するＣＯ含有ガスを、前記ガスが大気中に放出される前に捕捉することと、
（ｂ）本発明の１種以上の細菌分離株を含有する培養物により１種以上のアルコールを生産するために前記ＣＯ含有ガスを嫌気発酵することとを含む。

本発明の方法のある態様において、酢酸塩は発酵の副生成物として生成する。生成したアルコールはエタノールである。
ある態様において、培養物は液体栄養培地中で維持される。

発酵は任意の適切なバイオリアクター、例えば、連続撹拌槽型リアクター（continuous stirred tank reactor：ＣＴＳＲ）、気泡塔リアクター（bubble column reactor：ＢＣＲ）又は細流床リアクター（trickle bed reactor：ＴＢＲ）中で実施できる。また、本発明のいくつかの好ましい態様において、バイオリアクターは、１つ目に、微生物が培養される増殖リアクターと、２つ目に、増殖リアクターから発酵ブロスが供給されて、ほとんどの発酵生成物（エタノール及び酢酸塩）が製造される発酵リアクターとを含んでもよい。

上述のように、発酵反応のための炭素源は、ＣＯを含有する気体基質である。気体基質は、工業プロセスの副生成物として、あるいは自動車の排気ガスからなどの他の供給源から得られるＣＯ含有廃棄物ガスであってもよい。ある態様において、工業プロセスは、製鋼所等の鉄金属製品製造、非鉄金属製品製造、石油精製過程、石炭のガス化、電力生産、カーボンブラック生産、アンモニア生産、メタノール生産、及びコークス生産からなる群から選択される。これらの態様では、ＣＯ含有ガスは、それが大気中に排出される前に何らかの好都合な方法を用いて工業プロセスから捕捉してもよい。ＣＯ含有気体基質の組成によっては、基質を発酵に導入する前に処理をして、塵粒等の不要な不純物を除去することも望ましい場合がある。例えば、気体基質を公知の方法を用いてろ過又は洗浄集塵をしてもよい。

さらに、基質流のＣＯ濃度（即ち、気体基質中のＣＯ分圧）を増加させることでＣＯを基質とする発酵反応の効率を向上させるのが望ましい場合が多い。気体基質中のＣＯ分圧を増加させることによって、発酵培地へのＣＯの物質移動が増加する。発酵反応に供給するのに使用されるガス流の組成は、この反応の効率及び／又はコストに顕著な影響を与える可能性がある。例えばＯ_２は嫌気発酵プロセスの効率を低下させる可能性がある。発酵プロセスの段階で発酵の前又は後に望ましくない又は不必要なガスを処理することは、そのような段階への負担を増加しかねない（例えば、ガス流がバイオリアクターに入る前に圧縮される場合、発酵に必要としないガスを圧縮するために不必要なエネルギーが使用される可能性がある）。従って、基質流、特に工業用供給源由来の基質流を処理して、望ましくない成分を除去して目的の成分の濃度を増加させるのが望ましいと考えられる。

工業用供給源由来の基質流は、通常は組成が変動し易い。さらに、高ＣＯ濃度（例えば、少なくとも４０％のＣＯ、少なくとも５０％のＣＯ、又は少なくとも６５％のＣＯ）を含む工業用供給源由来の基質流はＨ_２成分が少ないことが多い（例えば、２０％未満又は１０％未満又は実質的に０％）。そのため、微生物が、ある範囲のＣＯ及びＨ_２濃度、特に高濃度のＣＯ及び低濃度のＨ_２を含む基質を嫌気発酵することによって生成物を生産する能力を有することが特に望ましい。本発明の細菌は、ＣＯを含み（Ｈ_２を含まない）基質を発酵し、驚くべき高い増殖速度とエタノール生成速度を有する。

基質流中に水素を存在させることによって、全体的炭素捕獲及び／又はエタノール生産性の効率の向上をもたらすことができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０８４３８号には、様々な組成のガス流を用いたエタノールの製造が開示されている。ＰＣＴＷＯ０２／０８４３８号には、バイオリアクター内のＣ．リュングダリイ培養物に供給され、微生物の増殖及びエタノール生成を促進する６３％Ｈ_２、３２％ＣＯ及び５％ＣＨ_４を含む基質流が報告されている。培養物が定常状態に達して、微生物増殖がもはや主目的でなくなった時点で、わずかに過剰のＣＯを供給してエタノール生成を促進するために、基質流を１５．８％のＨ_２、３６．５％のＣＯ、３８．４％のＮ_２及び９．３％のＣＯ_２に切り替えられた。この文献には、より高いＣＯ濃度、より低いＣＯ濃度、及びより低いＨ_２濃度を有するガス流についての記載もある。

当然のことながら、本明細書中に記載の本発明の方法は、工業プロセスの結果として生成するＣＯ含有ガスを捕捉して本明細書中に記載の発酵プロセスの基質として用い、工業プロセスからの大気中への総炭素排出量を削減するために使用できる。

あるいは、本発明の他の態様において、前記ＣＯ含有気体基質はバイオマスのガス化を供給源としてもよい。ガス化プロセスは、空気又は酸素の供給が制限された中でバイオマスの部分燃焼させることを伴う。得られたガスは、典型的には、主にＣＯ及びＨ_２、並びに最小量のＣＯ_２、メタン、エチレン及びエタンを含む。例えば、サトウキビから砂糖、若しくはトウモロコシや穀物からデンプン等の食料を抽出や加工をする際に得られるバイオマス副産物、あるいは林業によって生じる非食料バイオマス廃棄物をガス化し、本発明での使用に適したＣＯ含有ガスを製造することができる。

ＣＯ含有気体基質はＣＯを主成分として含有するのが一般的に好ましい。特定の態様において、気体基質は、体積で少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６５％、又は少なくとも約７０％〜約９５％のＣＯを含む。気体基質は水素を含有する必要はない。気体基質は、また所望により、ある程度のＣＯ_２、例えば体積で約１％〜約３０％、例えば約５％〜約１０％のＣＯ_２を含有する。

当然のことながら、細菌の増殖及びＣＯからエタノールへの発酵が起こるには、ＣＯ含有基質ガスに加えて、適切な液体栄養培地をバイオリアクターに供給する必要がある。栄養培地は、使用される微生物を増殖させるのに十分なビタミン及びミネラルを含有している。ＣＯを唯一の炭素源として使用するエタノールの発酵に適する嫌気性培地は当業者に周知である。例えば、適切な培地は、米国特許第５，１７３，４２９号、同５，５９３，８８６号及びＰＣＴ公開ＷＯ０２／０８４３８号、並びに本明細書中で前に引用した他の出版物に記載されている。本発明の一態様において、培地は以下の実施例の項に記載されている通りである。

前記発酵は、望ましくは、ＣＯからエタノールへの発酵が起こる適切な条件で実施されるべきである。考慮されるべき反応条件には、圧力、温度、ガス流速、液体流速、培地ｐＨ、培地の酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽型リアクターを使用する場合）、植菌量、液相中のＣＯが限界とならないような最大の気体基質濃度、及び生成物抑制を回避するための最大の生成物濃度が含まれる。

最適な反応条件は、一部は使用される本発明の特定の微生物に左右される。しかしながら、一般的に、発酵は周囲圧力より高い圧力で行うのが好ましい。より高い圧力での操作により、エタノール生成のための炭素源としてのＣＯが気相から微生物に取り込まれる場所である液相に移行する速度が著しく上昇する。このことは、ひいては、バイオリアクターが大気圧より高い圧力に維持された場合、滞留時間（バイオリアクター中の液量÷流入ガス流速として定義される）を短縮できることを意味している。

また、所定のＣＯ−エタノール変換速度は、ある程度基質の滞留時間に依存し、また所望の滞留時間を達成することで、バイオリアクターの必要容量が決定されることになるので、加圧システムの使用は必要なバイオリアクターの容量を大きく削減でき、その結果、発酵装置の資本コストも削減できる。米国特許第５，５９３，８８６号に示されている実施例によれば、リアクターの容量はリアクターの操作圧力の増加に線形比例して削減できる。すなわち、１０気圧の圧力で操作されるバイオリアクターは、１気圧の圧力で操作されるリアクターの容量の１０分の１しか必要ない。

ガスからエタノールへの発酵を高圧で行うことの利点は他でも記載されている。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０８４３８号には、３０ｐｓｉｇ及び７５ｐｓｉｇの圧力下で実施されたガスからエタノールへの発酵で、それぞれ１５０ｇ／Ｌ／日及び３６９ｇ／Ｌ／日のエタノール生産性が得られたことが記載されている。しかしながら、同様の培地及び流入ガス組成を用いて大気圧で実施された発酵例では、１日あたり１リットルにつき１０〜２０分の１のエタノールしか生産されないことが分かった。

ＣＯ含有気体基質の導入速度は、液相中のＣＯ濃度が律速にならないことが確実である速度であることもまた望ましい。なぜならば、ＣＯが制限された条件では、エタノール生成物が培養物によって消費されるという結果になる可能性があるからである。

ある態様において、上記の本発明による発酵プロセスの結果、水性培地中に細菌細胞と共にエタノールを含む発酵ブロスが得られる。前記方法の好ましい態様において、エタノールは発酵ブロスから回収される。

ある態様において、エタノールの回収は、連続的にブロスの一部を取り出すことと、その取り出されたブロス部分からアルコールを回収することを含む。
特定の態様において、エタノールの回収は、エタノールを含有する取り出されたブロス部分を分離装置に通してブロスから細菌細胞を分離し、無細胞アルコール含有透過物を得ること、及び細菌細胞をバイオリアクターに戻すことを含む。

ある態様において、本発明の方法は連続的なプロセスである。
特定の態様において、酢酸塩は発酵の副生成物として生成する。
更なる態様において、エタノール及び酢酸塩はブロスから回収される。

ある態様において、エタノール及び酢酸塩の回収は、ブロスの一部分を連続的に取り出すこと、及び取り出されたブロス部分からエタノールと酢酸塩を別々に回収することを含む。

いくつかの態様において、エタノール及び酢酸塩の回収は、エタノール及び酢酸塩を含有する取り出されたブロス部分を分離装置に通して、エタノール及び酢酸塩から細菌細胞を分離し、エタノール及び酢酸塩を含有する無細胞透過物を得ること、及び細菌細胞をバイオリアクターに戻すことを含む。

上記態様において、エタノール及び酢酸塩の回収は、好ましくは、最初にエタノールを、無細胞透過物から取り出し、その後、酢酸塩を無細胞透過物から取り出すことを含む。好ましくは、無細胞透過物は次いでバイオリアクターに戻される。

エタノールは発酵の好ましい目的の最終生成物である。エタノールは、分別蒸留又は蒸発、及び抽出発酵のような当業者に周知の方法によって発酵ブロスから回収することができる。発酵ブロスからのエタノールの蒸留は、エタノールと水の共沸混合物（すなわちエタノール９５％及び水５％）を生成する。無水エタノールは、その後、同じく当業者に周知の分子篩エタノール脱水技術によって得ることができる。抽出発酵法は、エタノールを希釈発酵ブロスから回収するために発酵生体に対する毒性リスクの低い水混和性溶媒の使用を伴う。例えば、オレイルアルコールは、このタイプの抽出プロセスに使用できる溶媒である。オレイルアルコールを発酵槽に連続的に導入すると、すぐにこの溶媒は上昇して発酵槽の上部に層を形成するので、これを連続的に抽出して遠心分離機に送り込む。次いで、水と細胞はオレイルアルコールから容易に分離されて発酵槽に戻され、一方、エタノールを含んだ溶媒はフラッシュ蒸発装置に送り込まれる。ほとんどのエタノールは蒸発され、凝縮されるが、オレイルアルコールは非揮発性で、発酵で再使用するために回収される。

酢酸塩もまた当業界で周知の方法を用いて発酵ブロスから回収できる。酢酸塩の回収方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１１７１５７号及びＷＯ２００８／１１５０８０号に詳細に記載されている。

本発明のある態様において、エタノール及び酢酸塩は、発酵バイオリアクターからブロスの一部分を連続的に取り出し、前記ブロスから微生物細胞を分離し（簡便に濾過によって）、最初にエタノールを、次いで酢酸塩を前記ブロスから回収することによって、発酵ブロスから回収される。上記方法を用いて、エタノールは簡便に蒸留によって回収でき、酢酸塩は活性炭への吸着によって回収できる。分離された微生物細胞は好ましくは発酵バイオリアクターに戻される。エタノール及び酢酸塩が除去された後に残る無細胞透過物も、好ましくは発酵バイオリアクターに戻される。バイオリアクターに戻す前に無細胞透過物に追加の栄養素（例えばビタミンＢ類）を加えて栄養培地に補充してもよい。また、酢酸の活性炭への吸着を促進するために上記のようにブロスのｐＨを調整する場合には、そのｐＨをバイオリアクターに戻す前に発酵バイオリアクターのブロスのｐＨと同等のｐＨに再調整するべきである。

反応化学量論
理論に拘束されたくはないが、本発明のプロセスにおいてＣＯからエタノール（ａ）及び酢酸（ｂ）への発酵の化学反応は、次のようであると考えられる。
（ａ）６ＣＯ＋３Ｈ_２Ｏ→ＣＨ_３ＣＨ_２ＯＨ＋４ＣＯ_２
（ｂ）４ＣＯ＋２Ｈ_２Ｏ→１ＣＨ_３ＣＯＯＨ＋２ＣＯ_２
次に、本発明を以下の非限定的実施例を参照しながらさらに詳細に説明する。

材料と方法

Ｃｒ（ＩＩ）溶液の調製
１Ｌの三つ口フラスコに気密性の流入口と流出口を取り付け、不活性ガス中での作業とそれに続く適切な貯蔵フラスコへの目的生成物の移送ができるようにした。前記フラスコに、ＣｒＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ（４０ｇ、０．１５ｍｏｌ）、亜鉛顆粒（２０メッシュ）（１８．３ｇ、０．２８ｍｏｌ）、水銀（１３．５５ｇ、１ｍＬ、０．０６７６ｍｏｌ）及び蒸留水５００ｍＬを仕込んだ。Ｎ_２を１時間流した後、混合物を約８０℃に温めて反応を開始させた。一定流量のＮ_２流中で２時間撹拌した後、混合物を室温に冷却し、さらに４８時間連続撹拌した。その時間までに反応混合物は濃青色溶液に変化した。この溶液をＮ_２置換した血清瓶に移し、今後の使用のために冷蔵庫に保管した。

細菌
使用されるクロストリジウム・オートエタノゲナムの２つのタイプは、ドイツ生物材料資源センター（German Resource Centre for Biological Material（ＤＳＭＺ））に寄託し、受託番号ＤＳＭ１９６３０及びＤＳＭ２３６９３が割り当てられた。ＤＳＭ２３６９３は、反復選択プロセスによってクロストリジウム・オートエタノゲナム株ＤＳＭ１９６３０（ＤＳＭＺ、ドイツ）から開発された。

試料採取及び分析手順
培地試料は、ＣＳＴＲリアクターから各発酵の過程で間隔を置いて採取した。培地を採取するたびに、リアクターに気体が出入りしないように注意した。

ＨＰＬＣ：
ＨＰＬＣシステムＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ。移動相：０．００２５Ｎ硫酸。流量及び圧力：０．８００ｍＬ／分。カラム：ＡｌｌｔｅｃｈＩＯＡ；カタログ番号９６４８、１５０×６．５ｍｍ、粒径５μｍ。カラム温度：６０℃。検出器：屈折率。検出器の温度：４５℃。

試料調製法：
試料（４００μＬ）、０．１５ＭＺｎＳＯ_４（５０μＬ）及び０．１５ＭＢａ（ＯＨ）_２（５０μＬ）をエッペンドルフ管に入れる。前記管を１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離する。２００μＬの上清をＨＰＬＣバイアルに移し、５μＬをＨＰＬＣ装置に注入する。

ヘッドスペース分析：
測定は、二つのチャンネルが設けられたＶａｒｉａｎＣＰ−４９００マイクロＧＣで実施した。チャンネル１を、１０ｍの分子篩カラムで、７０℃、２００ｋＰａのアルゴン及びバックフラッシュ時間４．２秒で運転し、チャンネル２を、１０ｍのＰＰＱカラムで、９０℃、１５０ｋＰａのヘリウムで、バックフラッシュなしで運転した。両チャンネルの注入器温度は７０℃であった。測定時間は１２０秒に設定したが、関連するすべてのピークは通常１００秒より前に溶離した。

細胞密度：
細胞密度は、規定分量の発酵ブロス中の細菌細胞を数えることによって決定した。あるいは、試料の吸光度を６００ｎｍで測定し（分光光度計）、公表されている手順に従って計算して乾燥質量を決定した。

解読：
ゲノム解読によって、Ｃ．オートエタノゲナム株ＬＺ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）及び新規な菌株ＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）のゲノム中のいくつかの変異が明らかとなった。これらの変異が性能の向上に寄与している可能性がある。

両方の菌株は、ＰＥＴＣ培地で、光学濃度（ＯＤ_{６００ｎｍ}）が１になるまで嫌気的に培養し、ゲノムＤＮＡを一晩培養した１００ｍＬの培養物から単離した。細胞は遠心分離（６，０００×ｇ、１５分，４°Ｃ）で採取し、リン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ；ｐＨ７．５）で洗浄し、１．９ｍＬのＳＴＥ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのスクロース；ｐＨ８．０）に懸濁した。この懸濁液を３００μＬのリゾチ−ム（〜１００，０００Ｕ；３０分、３７°Ｃ）及び２８０μＬのＳＤＳ溶液（１０％（Ｗ／Ｖ）；１０分）で処理した。２４０μＬのＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ；ｐＨ８）、２０μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ；ｐＨ７．５）、及び１０μＬのＲＮアーゼＡ（５０，０００Ｕ）の添加によりＲＮＡを１時間消化した。１００μＬのプロテイナーゼＫ（０．５Ｕ）の添加によりタンパク質分解を３７℃で１〜３時間行った。最後に、６００μＬの過塩素酸ナトリウム（５Ｍ）を加え、続いてフェノール−クロロホルム抽出及びイソプロパノール沈殿を行った。ＤＮＡの純度及び量は、ナノドロップ（登録商標）１０００分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）及びゲル電気泳動により検証した。

ショットガン法によるゲノム配列決定は、４５４ＧＳ（ロシュ・アプライド・サイエンス、インディアナポリス、インディアナ州、米国）を用いて行った。ＬＺ１５６０の全長４４，４２４，５２３塩基の１９１，３６８の単一読み取り（１０×カバー度）が作成され、ＬＺ１５６１の全長２０２，５９１，５７２塩基対の５７９，５４５のペアエンド読み取り（４７．５×カバー度）が作成された。これらの読み取りは、Newblerパッケージ（ロシュ・アプライド・サイエンス、インディアナポリス、インディアナ州、米国）を用いて組み立てられ、配列をMAUVEパッケージ（Darlingら、２００４年、Genome Res. 第１４巻：１３９４〜１４０３頁）を有するGeneious（Biomatter株式会社、オークランド、ニュージーランド）を用い、かつArtemis Comparison Tool （Carverら、２００８年、Bioinformatics 第２４巻：２６７２〜２６７６頁）によって比較した。

ＬＺ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）及び新菌株ＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）の組み立てられたゲノム配列に全部で６４個の変異が見出された（図４）。ほとんどの変異は単一塩基変異であるが、一方、１個の２１塩基対欠失（推定ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭｕｔＳ（配列番号１〜４）をエンコードする遺伝子中）及び１１個の遺伝子（窒素固定、糖代謝、糖輸送、カタボライト制御に関与する）を含む１５，４０８個の塩基対領域（配列番号５）の再配列事象が認められた。６２個の単一塩基変異の内、２２個は点突然変異、また４０個は挿入／欠失であった。これらの変異の内、１８個は遺伝子間領域に、４４個はコーディング領域で見出された。コーディング領域での変異の内５個は沈黙しており、アミノ酸配列変異をもたらさず、１４個が単一アミノ酸変異で、２５個がフレームシフトであるという結果であった。

最も顕著なことは、２１２，５３０（Ｆ_１Ｆ_ＯＡＴＰ生成酵素オペロンの推定プロモーター領域、配列番号６〜７）、１，１７１，８７４（Ｒｎｆ複合体オペロンの推定プロモーター領域、配列番号８〜９）、３７１７，４９５（炭素飢餓タンパク質の推定プロモーター領域、配列番号１０〜１１）の位置での変異、及び３，７４１，７３０（ＣＯ脱水素酵素／ＣＯ−メチル化アセチル−ＣｏＡ生成酵素複合体βサブユニット、配列番号１２〜１５）及び３，７４８，０５８（５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、配列番号１６〜１７）の位置でのウッド・リュングダール−遺伝子クラスターにおける２個の変異であり、これらは、ＣＯ／Ｈ_２での増殖及びエネルギー代謝に直接遡ることができる。他の影響を受けた殆どの遺伝子は、未同定である。

〔実施例１〕
Ａ：ＣＳＴＲ中でのバッチ発酵
約１５００ｍＬの溶液Ａを１．５Ｌの発酵槽に移送し、窒素を吹き込んだ。レサズリン（１．５ｍＬの２ｇ／Ｌ溶液）及びＨ_３ＰＯ_４（２．２５ｍＬの８５％溶液）を加え、濃ＮＨ_４ＯＨ（水溶液）を用いて、ｐＨを５．３に調整した。ニトリロ三酢酸（０．３ｍＬの０．１５Ｍ溶液）を加えた後、１．５ｍＬの溶液Ｃを加えた。これに続いて、ＮｉＣｌ_２（０．７５ｍＬの０．１Ｍ溶液）及びＮａ_２ＷＯ_３（１．５ｍＬの０．０１Ｍ溶液）を加えた。１５ｍＬの溶液Ｂを加え、その溶液にＮ_２を吹き込んだ後、７０ｍＬ／分のＣＯ含有ガス（５０％ＣＯ、２８％Ｎ_２、２％Ｈ_２、２０％ＣＯ_２）に切り替えた。次いで、発酵槽に２００ｍＬのクロストリジウム・オートエタノゲナム１９６３０培養物を植菌した。発酵槽を３７℃に維持し、３００ｒｐｍで攪拌した。この実験の間、Ｎａ_２Ｓ溶液（０．２Ｍ溶液）を約０．３ｍＬ／時間の速度で添加した。基質供給は、微生物培養の要件に対応して増加させた。

細菌培養物は使用した実験条件では急速に増殖しなかった。培養物は４８時間の増殖後、３５０ｍＭのＣＯ取り込みを示し（図１ａ及び表２）、培養物の倍加時間は４０．８時間（図２ａ）であった。これは、０．４１／日の比増殖速度に相当する。比ＣＯ取り込み量は実験中に増加し、最大値は、０．５４ｍＭのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）であった。１．０日目の比取り込み量：０．２８ｍＭのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）（表１）。２．０日目の比取り込み量：０．５４ｍＭのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）（表２）。

Ｂ：ＣＳＴＲ中でのバッチ発酵
約１５００ｍＬの溶液Ａを１．５Ｌの発酵槽に移送し、窒素を吹き込んだ。レサズリン（１．５ｍＬの２ｇ／Ｌ溶液）及びＨ_３ＰＯ_４（２．２５ｍＬの８５％溶液）を加え、濃ＮＨ_４ＯＨ（水溶液）を用いて、ｐＨを５．３に調整した。ニトリロ三酢酸（０．３ｍＬの０．１５Ｍ溶液）を加えた後、１．５ｍＬの溶液Ｃを加えた。Ｎａ_２ＷＯ_３（１．５ｍＬの０．０１Ｍ溶液）を加えた。１５ｍＬの溶液Ｂを加え、溶液にＮ_２を吹き込んだ後、６０ｍＬ／分のＣＯ含有ガス（５０％ＣＯ；５０％Ｎ_２）に切り替えた。次いで、発酵槽に１８０ｍＬのクロストリジウム・オートエタノゲナム２３６９３培養物を植菌した。発酵槽を３７℃に維持し、３００ｒｐｍで攪拌した。この実験の間、Ｎａ_２Ｓ溶液（０．５Ｍ溶液）を約０．１２ｍＬ／時間の速度で添加した。基質供給は、微生物培養の要件に対応して増加させた。

細菌培養物は使用した実験条件では急速に増殖した。培養物は４３時間の増殖後、８４００ｍＭのＣＯ取り込みを示し（図２ｂ）、一方で培養物の倍加時間は９．６時間（図２ｂ）であった。これは、１．７３／日の比増殖速度に相当する。実験中に到達した最大ＣＯ比取り込み量は１．１７ｍＭのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）であった。１．０日後の比取り込み量：１．１７ｍＭのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）（表１）。２．０日後の比取り込み量：１．０３ｍＭのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）（表２）。発酵条件は、実施例１Ａで使用した条件と同一又は少なくとも非常に類似していた。培地調製液は、全く同じ成分を同様の濃度で含有し、ガスは共に少なくとも５０％（ｖ／ｖ）のＣＯを含有していた。この大きなＣＯ取り込み量の差に対して発酵条件は同様であることは、親株のクロストリジウム・オートエタノゲナム１９６３０に対して、開発されたクロストリジウム・オートエタノゲナム２３６９３培養物の効率が向上していることによって培養物の性能が変化したことを示している。

結果：
表１：１日目

表２：２日目

〔実施例２〕
約１５００ｍＬの溶液Ａを１．５Ｌの発酵槽に移送し、窒素を吹き込んだ。レサズリン（１．５ｍＬの２ｇ／Ｌ溶液）とＨ_３ＰＯ_４（０．５６ｍＬの８５％溶液）を加え、濃ＮＨ_４ＯＨ（水溶液）でｐＨを５．３に調整した。溶液Ｃ（１．５ｍＬ）を加え、その後、Ｎａ_２ＷＯ_３（１．５ｍＬの０．０１Ｍ溶液）を加えた。１５ｍＬの溶液Ｂを加え、溶液にＮ_２を吹き込んだ後、６０ｍＬ／分のＣＯ含有ガス（５０％ＣＯ；５０％Ｎ_２）に切り替えた。次いで、発酵槽に１００ｍＬのクロストリジウム・オートエタノゲナム２３６９３培養物を植菌した。発酵槽を３７℃に維持し、３００ｒｐｍで攪拌した。この実験の間、Ｎａ_２Ｓ溶液（０．５Ｍ溶液）を約０．１５ｍＬ／時間の速度で添加した。基質供給は、微生物培養の要件に対応して増加させた。

細菌培養物は使用した実験条件で急速に増殖した。発酵条件は、実施例１Ａ＋Ｂで使用した条件と同一又は少なくとも非常に類似し、ガスは共に少なくとも５０％（ｖ／ｖ）のＣＯを含有していた。培養物は、ＨＰＬＣで最大エタノール濃度（５５．８ｇ／Ｌ）が測定された定常期まで増殖した。

本明細書中に記載された特定の方法及び組成物は、好ましい態様の代表及び例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。その他の目的、側面及び態様は、本明細書を考慮すれば、当業者に想起され、それらも本発明の範囲及び精神の中に包含される。当業者は、本明細書中に開示された発明に対して様々な置換及び変更が本発明の範囲及び精神から逸脱することなくできることは容易に分かる。本明細書に適切に例示的に記載された本発明は、本明細書中に不可欠であるとして具体的に開示されていない１つ以上の構成要素、又は１つ以上の制限がなくとも実施することができる。従って、例えば、本明細書における各場合において、本発明の態様又は実施例において、「含む(comprising、including)」、「含有する(containing)」などの用語は、制限なしに拡大的に読まれるものとする。さらに、表題、見出し等は、本文献に対する読者の理解を高めるために提供されるものであって、本発明の範囲を制限するものとして解釈すべきでない。

以上及び以下で引用されたすべての出願、特許及び刊行物（もしあるとすれば）の全開示内容は引用によって本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書におけるいずれの出願、特許及び刊行物の引用も、それらが有効な先行技術を構成していること又は世界中のどの国においても共通の一般的知識の一部を形成していることの承認又は何らかの形態の示唆ではなく、そのように受け取られるべきではない。

Claims

ＣＯを含む基質の嫌気発酵によってエタノール及び所望により酢酸塩を含む生成物を、少なくとも約２ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日の比生産性で生産することができる細菌の生物学的に純粋な分離株。
前記比生産性が少なくとも約５ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日である、請求項１に記載の細菌。
前記比生産性が少なくとも７ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日の比生産性で生産する、請求項１又は２のいずれかに記載の細菌。
ＣＯを含む気体基質の嫌気発酵によってアルコール及び所望により酢酸塩を含む生成物を生産することができる細菌の生物学的に純粋な分離株であって、前記細菌の生産性が少なくとも約１０ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／日である、生物学的に純粋な分離株。
前記細菌の生産性が少なくとも約５０ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／日である、請求項４に記載の生物学的に純粋な分離株。
エタノールの酢酸塩に対する比が少なくとも２：１で生産することができる細菌の生物学的に純粋な分離株。
エタノールの酢酸塩に対する比が少なくとも７：１で生産することができる請求項６に記載の細菌の生物学的に純粋な分離株。
エタノールの酢酸塩に対する比が少なくとも１０：１で生産することができる、請求項７に記載の細菌の生物学的に純粋な分離株。
少なくとも１．０ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）のＣＯの比取り込みができる、細菌の生物学的に純粋な分離株。
少なくとも２．０ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）のＣＯの比取り込みができる、請求項９に記載の細菌の生物学的に純粋な分離株。
少なくとも０．８／日の比増殖速度を有する細菌の生物学的に純粋な分離株。
少なくとも２．０／日の比増殖速度を有する、請求項１１に記載の細菌の生物学的に純粋な分離株。
３０ｇ／Ｌ（培養ブロス）までのアルコールに対する耐性を有する細菌の生物学的に純粋な分離株。
７０ｇ／Ｌ（培養ブロス）までのアルコールに対する耐性を有する、請求項１３に記載の細菌の生物学的に純粋な分離株。
ＣＯを含む基質の嫌気発酵によってエタノール及び所望により酢酸塩を含む生成物を生産することができ、かつ、
ａ．約２ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／ｇ（バイオマス）／日の比生産性でエタノールを生産すること、
ｂ．少なくとも約１０ｇ／Ｌ（発酵ブロス）／日の生産性でエタノールを生産すること、
ｃ．少なくとも約１．０ｍＭｏｌのＣＯ／分／ｇ（バイオマス）のＣＯの比取り込み、
ｄ．少なくとも約０．８／日の比増殖速度、
ｅ．エタノールの酢酸塩に対する比が少なくとも約２：１でエタノールを生産すること、及び
ｆ．少なくとも３０ｇ／Ｌ（ブロス）のアルコール耐性を有すること
のうち、２つ以上を達成することができる細菌の生物学的に純粋な分離株。
前記細菌が、クロストリジウム・オートエタノゲナム由来である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の生物学的に純粋な分離株。
アクセッション番号ＤＳＭ２３６９３で微生物及び細胞培養物のためのドイツ微生物保存機関(ＤＳＭＺ）に寄託されたクロストリジウム・オートエタノゲナム株を決定付ける特徴を有する、請求項１６に記載の細菌。
アクセッション番号ＤＳＭ２３６９３でＤＳＭＺに寄託されたクロストリジウム・オートエタノゲナム株である、請求項１７に記載の細菌。
ＣＯを含有する基質を、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の１種以上の細菌を用い発酵させることを含む１種以上のアルコールを生産する方法。
ａ．ＣＯを含有する基質を、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の細胞培養物を含有するバイオリアクターに供給する工程と、
ｂ．前記バイオリアクターで前記培養物を嫌気発酵し、１種以上のアルコールを生産する工程と、
を含む、請求項１９に記載の方法。
１種以上のアルコールがエタノールを含有し、かつエタノール生産性が少なくとも約２ｇのエタノール／Ｌ（発酵ブロス）／日である、請求項１９又は請求項２０に記載の方法。
ＣＯを含有する前記基質が気体基質である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
ＣＯを含有する気体基質が工業プロセスの副生成物として得られるガスである、請求項２２に記載の方法。
前記工業プロセスが、鉄金属製品製造、非鉄金属製品製造、石油精製過程、バイオマスのガス化、石炭のガス化、電力生産、カーボンブラック生産、アンモニア生産、メタノール生産、及びコークス生産からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
前記基質が、体積で少なくとも約３０％のＣＯ、又は体積で少なくとも約４０％のＣＯ、又は体積で少なくとも約５０％のＣＯ、又は体積で少なくとも約６５％のＣＯ、又は体積で少なくとも約７０％のＣＯ、又は体積で少なくとも約８０％のＣＯ、又は体積で少なくとも約９０％のＣＯ、又は体積で少なくとも約９５％のＣＯを含有する、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
前記基質が、体積で３０％未満のＨ_２、体積で２０％未満のＨ_２、体積で１５％未満のＨ_２、体積で１０％未満のＨ_２、体積で５％未満のＨ_２、体積で３％未満のＨ_２、体積で２％未満のＨ_２、体積で１％未満のＨ_２を含むか、又は実質的にＨ_２を含まない、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
工業プロセスからの大気中への総炭素排出量を削減する方法であって、前記方法は、
ａ．前記工業プロセスの結果として生成するＣＯ含有ガスを、前記ガスが大気中に放出される前に捕捉することと、
ｂ．請求項１〜１８のいずれか１項に記載の１種以上の細菌分離株を含有する培養物により嫌気発酵し、１種以上のアルコールを生産することと、
を含む方法。
前記１種以上のアルコールがエタノールを含む、請求項２７に記載の方法。
酢酸塩が前記発酵の副生成物として生産される、請求項２７又は２８のいずれかに記載の方法。