JP2015505471A - 組換え微生物およびその使用方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、化学的化合物、特に、排他的ではないが、エタノールの、微生物発酵による産生のための方法に関する。一酸化炭素を用いて、１つまたは複数の産物、特に、排他的ではないが、主要産物としてエタノールを産生する能力があり、ならびに低下した量の２，３−ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を産生する能力があり、または２，３−ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を実質的に産生する能力がない遺伝子改変された微生物もまた記載されている。

Description

本発明は、微生物発酵による、化学的化合物、特に、排他的ではないが、エタノールの産生のための方法、およびそのような方法に有用な遺伝子改変された微生物に関する。
酢酸産生微生物は、例えば、一酸化炭素、二酸化炭素、水素、およびメタノールを含む基質の発酵による燃料（例えば、エタノールまたはブタノール）および他の化学物質の産生に有用であることが知られている。これらの微生物の多くは、少なくとも２個（それより多くないかもしれないが）の産物を天然で産生する。しかしながら、微生物が、産物を、特に工業規模で産生するために用いられることになっている場合、微生物が複数の産物を産生することが常に望ましいとは限らない。例えば、複数の産物の産生は、副産物が、主要な所望の産物を産生することに関与する経路から炭素をそらし得るため、特に価値のある産物の産生効率および収量を犠牲にして成り立ち得る。加えて、副産物は、微生物に毒性である場合があり、複数の産物の産生は、所望の産物の回収および分離を困難にさせ得、１つの産物の産生を別のものより有利であるように発酵条件を制御することは困難であり得る。副産物はまた、それらが、望ましくない生物体の基質である場合があるため、発酵槽における潜在的汚染源である可能性がある。
一酸化炭素を含む基質の微生物発酵によるエタノール産生の場合、２，３−ブタンジオールは、典型的には、副産物として産生される。これは、エタノール産生効率および収量を低下させ得、加えて、上記で言及されているように、他の問題を引き起こし得る。
先行技術の欠点の１つまたは複数を克服すること、または少なくとも、有用な選択肢を一般に提供することが本発明の目的である。
本発明は、とりわけ、一酸化炭素を用いて１つまたは複数の産物を産生する能力があり、ならびに親微生物と比較して、低下した量の２，３−ブタンジオールおよび／またはその前駆体を産生する能力がある新規の遺伝子改変された微生物に関する。一実施形態において、遺伝子改変された微生物は、親微生物と比較して、２，３ブタンジオールおよび／またはその前駆体を実質的に産生しない。特定の一実施形態において、微生物は、主要な産物としてエタノールを産生する。
第１の態様において、本発明は、一酸化炭素を含む基質の発酵において、１つもしくは複数の産物を産生し、ならびに低下した量の２，３−ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を産生し、または２，３−ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を実質的に産生しないように適応している、一酸化炭素資化性（carboxydotrophic）酢酸産生微生物であって、親微生物と比較して、２，３−ブタンジオール生合成経路を破壊する１つまたは複数の遺伝子改変を含む、微生物を提供する。
特定の一実施形態において、本発明は、一酸化炭素を含む基質の発酵において、主要な産物としてエタノールを産生し、ならびに低下した量の２，３ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を産生し、または２，３ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を実質的に産生しないように適応している、一酸化炭素資化性酢酸産生微生物であって、親微生物と比較して、２，３−ブタンジオール生合成経路を破壊する１つまたは複数の遺伝子改変を含む、微生物を提供する。
一実施形態において、微生物は、ホルメート、ラクテート、ピルベート、スクシネート、バリン、ロイシン、イソロイシン、アセトラクテート、マレート、フマレート（fumerate）、２−オキソグルタレート（2-oxogluterate）、シトレートのうちの１つまたは複数をさらに産生するように適応している。
一実施形態において、微生物は、親微生物と比較して、増加した量の、エタノール、ホルメート、ラクテート、ピルベート、スクシネート、バリン、ロイシン、イソロイシン、アセトラクテート、マレート、フマレート、２−オキソグルタレート（2-oxogluterate）、シトレートのうちの１つまたは複数を産生するように適応している。
一実施形態において、微生物は、ピルベートをアセトラクテートへ変換する能力がある１つもしくは複数の酵素の発現および／または活性を破壊する少なくとも１つの遺伝子改変を含む。
一実施形態において、ピルベートをアセトラクテートへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素は、アセト乳酸シンターゼ（ａｌｓＳ）である。
一実施形態において、微生物は、アセトラクテートをアセトインへ変換する能力がある１つもしくは複数の発現および／または活性を破壊する少なくとも１つの遺伝子改変を含む。
一実施形態において、アセトラクテートをアセトインへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素は、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ｂｕｄＡ）である。
一実施形態において、微生物は、アセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある１つもしくは複数の酵素の発現および／または活性を破壊する少なくとも１つの遺伝子改変を含む。
一実施形態において、アセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素は、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（２，３ｂｄｈ）、アセトインレダクターゼ、第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼから選択される酵素である。
一実施形態において、微生物は、ピルベートをアセトラクテートへ、アセトラクテートをアセトインへ、および／またはアセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある酵素のうちの２つ以上の組み合わせの発現および／または活性を破壊する少なくとも１つの遺伝子改変を含む。
一実施形態において、遺伝子改変は、１つもしくは複数の以下の発現および／または活性を破壊する：
アセト乳酸シンターゼ（ａｌｓＳ）；
アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＢｕｄＡ）；
２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（２，３ｂｄｈ）；
アセトインレダクターゼ；および
第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼ。
一実施形態において、遺伝子改変は、１つもしくは複数の以下の発現および／または活性を破壊する：
アセト乳酸シンターゼ（ａｌｓＳ）；
アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＢｕｄＡ）；および
２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（２，３ｂｄｈ）。
一実施形態において、１つまたは複数の遺伝子改変は、上記の酵素の１つまたは複数をコードする遺伝子のうちの１つまたは複数を破壊する。一実施形態において、１つまたは複数の遺伝子改変は、上記の酵素の１つまたは複数の発現または活性に必要とされる化合物の活性を破壊する。一実施形態において、１つまたは複数の遺伝子改変は、上記の酵素の１つまたは複数の発現または活性を阻害する、１つまたは複数の化合物の発現または活性を増加させる。
特定の一実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、およびクロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）、ならびに関連した分離株を含む群から選択される。別の実施形態において、群はまた、クロストリジウム・コスカッティ（Clostridium coskatii）を含む。
特定の一実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３である。
第２の態様において、本発明は、一酸化炭素を含む基質の発酵において、１つもしくは複数の産物を産生し、ならびに低下した量の２，３ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を産生し、または２，３ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を実質的に産生しないように適応している一酸化炭素資化性酢酸産生微生物の作製方法であって、２，３−ブタンジオール生合成経路を破壊するように一酸化炭素資化性酢酸産生親微生物を遺伝子改変することを含む、方法を提供する。
一実施形態において、方法は、結果として、親微生物と比較して、１つまたは複数の産物の産生の増加を生じる。
特定の一実施形態において、本発明は、一酸化炭素を含む基質の発酵において、主要な産物としてエタノールを産生し、ならびに低下した量の２，３ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を産生し、または２，３ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を実質的に産生しないように適応している一酸化炭素資化性酢酸産生微生物の作製方法であって、２，３−ブタンジオール生合成経路を破壊するように一酸化炭素資化性酢酸産生親微生物を遺伝子改変することを含む、方法を提供する。
本発明はまた、第２の態様の方法により作製された微生物を提供する。
一実施形態において、方法は、ピルベートをアセトラクテートへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を破壊する１つまたは複数の遺伝子改変を親微生物に導入することを含む。一実施形態において、ピルベートをアセトラクテートへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素は、アセト乳酸シンターゼ（ａｌｓＳ）である。
一実施形態において、方法は、アセトラクテートをアセトインへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を破壊する１つまたは複数の遺伝子改変を親微生物に導入することを含む。一実施形態において、アセトラクテートをアセトインへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素は、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ｂｕｄＡ）である。
一実施形態において、方法は、アセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を破壊する１つまたは複数の遺伝子改変を親微生物に導入することを含む。一実施形態において、アセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素は、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（２，３ｂｄｈ）、アセトインレダクターゼ、第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼから選択される。
一実施形態において、方法は、ピルベートをアセトラクテートへ、アセトラクテートをアセトインへ、および／またはアセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある酵素をコードする遺伝子のうちの２つ以上の組み合わせ破壊する１つまたは複数の遺伝子改変を親微生物に導入することを含む。
一実施形態において、１つまたは複数のアセト乳酸シンターゼ（ａｌｓＳ）、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＢｕｄＡ）、および２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（２，３ｂｄｈ）をコードする遺伝子のうちの１つまたは複数を破壊する１つまたは複数の遺伝子改変を親微生物に導入することを含む。
一実施形態において、方法は、上記の酵素のうちの１つまたは複数の発現または活性に必要とされる化合物の活性を破壊する遺伝子改変を導入することを含む。
一実施形態において、方法は、上記の酵素のうちの１つまたは複数の発現または活性を阻害する１つまたは複数の化合物の発現または活性を増加させる遺伝子改変を導入することを含む。
第３の態様において、本発明は、１つまたは複数の産物の産生のための方法を提供する。一実施形態において、方法は、エタノール、ホルメート、ラクテート、ピルベート、スクシネート、バリン、ロイシン、イソロイシン、アセトラクテート、マレート、フマレート、２−オキソグルタレート、シトレートのうちの１つまたは複数の産生のためのものである。
特定の一実施形態において、本発明は、本発明の第１の態様の、および／または本発明の第２の態様の方法により作製された、１つまたは複数の微生物を用いて、ＣＯを含む基質を発酵させることを含む、微生物発酵による１つまたは複数の産物（一実施形態において、エタノールおよび１つまたは複数の他の産物が挙げられる）の産生方法を提供する。一実施形態において、１つまたは複数の他の産物は、スクシネート、ラクテート、ホルメート、バリン、ロイシン、ピルベート、イソロイシン、アセトラクテート、マレート、フマレート、２−オキソグルタレート、シトレートからなる群から選択される。
本発明は、産業プロセスから総大気中炭素放出を低下させるための方法を提供する。
一実施形態において、方法は以下のステップを含む：
（ａ）本発明の第１の態様の、および／または本発明の第２の態様の方法により作製された、１つまたは複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクタへ、ＣＯを含む基質を供給するステップ；ならびに
（ｂ）バイオリアクタ内で培養物を嫌気的に発酵させて、好ましくはエタノールを含む、上述の産物のうちの１つまたは複数を産生するステップ。
別の実施形態において、方法は、以下のステップを含む：
産業プロセスの結果として生成されるＣＯ含有ガスを、そのガスが大気中へ放出される前に捕獲するステップ；
本発明の第１の態様の、および／または本発明の第２の態様の方法により作製された、１つまたは複数の微生物を含有する培養物により、好ましくはエタノールを含む、上述の産物のうちの１つまたは複数を産生するための、ＣＯ含有ガスの嫌気的発酵。
方法態様の特定の実施形態において、微生物は、水性培地において維持される。
方法態様の特定の実施形態において、基質の発酵は、バイオリアクタ内で起こる。
好ましくは、ＣＯを含む基質は、ＣＯを含むガス状基質である。一実施形態において、基質は、産業廃ガスを含む。ある特定の実施形態において、ガスは、製鋼廃ガスまたは合成ガスである。
一実施形態において、基質は、典型的には、少なくとも約２０体積％〜約１００体積％のＣＯ、２０体積％から７０体積％までのＣＯ、３０体積％から６０体積％までのＣＯ、および４０体積％から５５体積％までのＣＯなどの主要な割合を占めるＣＯを含有する。特定の実施形態において、基質は、約２５体積％、または約３０体積％、または約３５体積％、または約４０体積％、または約４５体積％、または約５０体積％のＣＯ、または約５５体積％のＣＯ、または約６０体積％のＣＯを含む。
基質がいくらかの水素を含有している必要はないが、Ｈ２の存在は、本発明の方法に従った産物形成にとって有害であるものではない。特定の実施形態において、水素の存在は、アルコール産生の全体的な効率の向上を生じる。例えば、特定の実施形態において、基質は、約２：１、または１：１、または１：２の比のＨ２：ＣＯを含んでもよい。一実施形態において、基質は、約３０体積％以下のＨ２、２０体積％以下のＨ２、約１５体積％以下のＨ２、または約１０体積％以下のＨ２を含む。他の実施形態において、基質流（substrate stream）は、低濃度のＨ２、例えば、５％未満、もしくは４％未満、もしくは３％未満、もしくは２％未満、もしくは１％未満を含み、または実質的に水素を含まない。基質はまた、いくらかのＣＯ２、例えば、約１体積％〜約８０体積％のＣＯ２、または１体積％〜約３０体積％のＣＯ２などを含有してもよい。
ある特定の実施形態において、方法は、発酵ブロスから１つまたは複数の産物を回収するステップをさらに含む。一実施形態において、エタノールは、発酵ブロスから回収される。一実施形態において、１つまたは複数の他の産物は、発酵ブロスから回収され、その産物には、ホルメート、ラクテート、ピルベート、スクシネート、バリン、ロイシン、イソロイシン、アセトラクテート、マレート、フマレート、シトレート、および２−オキソグルタレートが挙げられる。
第４の態様において、本発明は、第３の態様の方法によって産生される場合の１つまたは複数の産物を提供する。一実施形態において、１つまたは複数の産物は、エタノール、ホルメート、ラクテート、ピルベート、スクシネート、バリン、ロイシン、イソロイシン、アセトラクテート、マレート、フマレート、シトレート、および２−オキソグルタレートからなる群から選択される。特定の一実施形態において、１つまたは複数の産物は、エタノールを少なくとも含む。
第５の態様において、本発明は、１つまたは複数の非必須遺伝子が親微生物と比較して破壊されている、一酸化炭素資化性酢酸産生微生物を提供する。
第６の態様において、本発明は、１つまたは複数の非必須遺伝子が破壊されている、一酸化炭素資化性酢酸産生微生物を作製する方法であって、親微生物において１つまたは複数の非必須遺伝子を遺伝子改変することを含む、方法を提供する。
本発明はまた、第６の態様の方法によって作製される微生物を提供する。
一実施形態において、１つまたは複数の非必須遺伝子は、アセトラクテートをアセトインへ変換する酵素をコードし、および／またはアセトインを２，３ブタンジオールへ変換する酵素をコードする遺伝子である。一実施形態において、酵素は、本明細書に記載されている通りである。
ある特定の実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）、クロストリジウム・コスカッティ（Clostridium coskatii）、ブチリバクテリウム・リモサム（Butyribacterium limosum）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Butyribacterium methylotrophicum）、アセトバクテリウム・ウッディイ（Acetobacterium woodii）、アルカリバクラム・バッチイ（Alkalibaculum bacchii）、ブラウチア・プロドゥクタ（Blautia producta）、ユーバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）、モーレラ・サーモオートトロフィカ（Moorella thermautotrophica）、オキソバクター・フェニジイ（Oxobacter pfennigii）、およびサーモアナエロバクター・キブイ（Thermoanaerobacter kiuvi）を含む群から選択される。
特定の一実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、およびクロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）を含む群から選択される。別の実施形態において、群はまた、クロストリジウム・コスカッティ（Clostridium coskatii）を含む。
特定の一実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３である。
第７の態様において、本発明は、第５の態様の、および／または第６の態様の方法によって作製された、１つまたは複数の微生物を用いる微生物発酵による１つまたは複数の産物の産生のための方法を提供する。
特定の一実施形態において、本発明は、第５の態様の、および／または第６の態様の方法によって作製された、１つまたは複数の微生物を用いる、ＣＯを含む基質を発酵させることを含む微生物発酵による、エタノールおよび１つまたは複数の他の産物の産生のための方法を提供する。
一実施形態において、方法は、以下のステップを含む：
（ａ）第５の態様の、および／または第６の態様の方法により作製された、１つまたは複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクタへ、ＣＯを含む基質を供給するステップ；ならびに
（ｂ）バイオリアクタ内で培養物を嫌気的に発酵させて、１つまたは複数の産物を産生するステップ。
別の実施形態において、方法は、以下のステップを含む：
（ａ）産業プロセスの結果として生成されるＣＯ含有ガスを、そのガスが大気中へ放出される前に捕獲するステップ；
ｂ）第５の態様の、および／または第６の態様の方法により作製された、１つまたは複数の微生物を含有する培養物により、１つまたは複数の産物を産生するための、ＣＯ含有ガスの嫌気的発酵。
一実施形態において、１つまたは複数の産物は、本明細書に記載された通りである。
一実施形態において、ＣＯを含む基質は、本明細書に記載された通りである。
本発明はまた、本出願の明細書中で言及され、もしくは示された部分、要素、および特徴に個々に、または前記部分、要素、もしくは特徴の２つ以上の任意の、もしくは全ての組み合わせに集合的に、存すると広く言うことができ、本発明が関する技術分野において公知の等価物を有する特定の整数が言及される場合、そのような公知の等価物は、あたかも個々に示されているかのように本明細書に組み入れられているとみなされる。
全ての新規な態様において考慮されるべきである、本発明のこれらを始めとする態様は、添付の図を参照して、以下の説明から明らかになるであろうし、以下の説明は、例としてのみ示されている。
２，３ブタンジオール産生一酸化炭素資化性アセトゲン（aceotgens）（例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３）におけるＣＯからの代謝経路を示す図である。 ２，３−ブタンジオール産生一酸化炭素資化性アセトゲン（actogens）における２，３ブタンジオール生合成経路をノックアウトすることの効果を、炭素フラックスのエタノールへの再分布と共に図示し、ＣＯからの新しい産物、例えば、スクシネート、２−オキソグルタレート、ホルメート、バリン、ロイシンの産生を示す図である。 Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ゲノム上のｂｕｄＡ遺伝子ならびにそれの５’隣接領域および３’隣接領域を示す図である。ｐＭＴＬ８５１４１プラスミドにおける隣接断片のＰＣＲ増幅およびその後のクローニングのために用いられるプライマーもまた示されている。 Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３におけるｂｕｄＡ遺伝子ノックアウトのための、ｌａｃＺ遺伝子によって分離された５’のｂｕｄＡ遺伝子隣接ＤＮＡ断片および３’のｂｕｄＡ遺伝子隣接ＤＮＡ断片を有する例示的なｐＭＴＬ８５１４１−ｂｕｄＡ−ｋｏプラスミドを示す図である。 本発明に有用な例示的なメチル化プラスミドを示す図である。 （Ａ）：ｂｕｄＡ遺伝子ノックアウト後のＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３のゲノム領域の図表示であり、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｂｕｄＡ遺伝子ノックアウトをスクリーニングするために用いられるプライマーの位置、ならびに野生型Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３およびそれの対応するｂｕｄＡ遺伝子ノックアウトからのＰＣＲ産物の予想されるサイズも示す。（Ｂ）Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｂｕｄＡ遺伝子ノックアウトのＰＣＲスクリーニングのアガロースゲル電気泳動画像を示す図である。レーン１および９は、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ（商標）１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダーを示す。レーン２〜６は、プライマーＯｇ０９およびＯｇ１２ｒを用いた、野生型Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３（＋ｖｅ、２．７ｋｂ）および６個の可能性のあるＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｂｕｄＡ遺伝子ノックアウト（１〜６、２．２ｋｂ）から単離されたゲノムＤＮＡ由来のｂｕｄＡターゲット領域のＰＣＲ増幅を示す。レーン１０〜１６は、ｂｕｄＡ遺伝子の２７３ｂｐ内部領域（＊）に特異的なプライマーＯｇ４４ｆおよびＯｇ４５ｒを用いた、野生型（＋ｖｅ）Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３および６個の可能性のあるＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｂｕｄＡ遺伝子ノックアウトから単離されたゲノムＤＮＡに関するＰＣＲを示す。 プライマーＯｇ４４ｆ／Ｏｇ４５ｒおよびＯｇ４２ｆ／Ｏｇ４３ｒを用いた、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｂｕｄＡ遺伝子および２，３ｂｄｈ遺伝子におけるＲＡＭ挿入のＰＣＲ確認を示す図である。 発酵中の、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３およびΔ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体によるアセトインのブタンジオールへの変換率を示す図である。
配列の簡単な説明
この明細書は、以下の配列が列挙されている配列表を添付している。
配列番号１：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｂｕｄＡ遺伝子のヌクレオチド配列のヌクレオチド配列。
配列番号２：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｂｕｄＡタンパク質のアミノ酸配列。
配列番号３：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｂｕｄＡ遺伝子の５’隣接領域のヌクレオチド配列。
配列番号４：ｂｕｄＡ遺伝子の３’隣接配列のヌクレオチド配列。
配列番号５〜８および１０および１１：以下の表１に記載されている。
配列番号９：大腸菌（E. coli）−クロストリジウム（Clostridium）シャトルベクター−プラスミドｐＭＴＬ８５１４１のヌクレオチド配列。
配列番号１２：ｐＭＴＬ８５１４１−ｂｕｄＡ−ｋｏのヌクレオチドシーケンシングの結果であり、そのプラスミド上に見出される隣接ＤＮＡ断片が突然変異を含まなかったことを実証している。
配列番号１３：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｙ１８１７８、ＧＩ：７２７１１０９）。
配列番号１４：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の可能性のあるｂｕｄＡノックアウト形質転換体のコロニー１の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子：（９３％）同一性。
配列番号１５：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の可能性のあるｂｕｄＡノックアウト形質転換体のコロニー２の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子：（９４％）。
配列番号１６：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の可能性のあるｂｕｄＡノックアウト形質転換体のコロニー３の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子：（９５％）。
配列番号１７：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の可能性のあるｂｕｄＡノックアウト形質転換体のコロニー４の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子：（９３％）。
配列番号１８：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の可能性のあるｂｕｄＡノックアウト形質転換体のコロニー５の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子：（９４％）。
配列番号１９：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の可能性のあるｂｕｄＡノックアウト形質転換体のコロニー６の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子：（９２％）。
配列番号２０：プライマーＯｇ０９ｆを用いた、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の可能性のあるｂｕｄＡノックアウト形質転換体のコロニー１ ＰＣＲ産物のヌクレオチドシーケンシングの結果。（９２％）
配列番号２１：プライマーＯｇ１２ｒを用いた、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の可能性のあるｂｕｄＡノックアウト形質転換体のコロニー１ ＰＣＲ産物のヌクレオチドシーケンシングの結果。（９２％）
配列番号２２：プライマーＯｇ１２ｒを用いた、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の可能性のあるｂｕｄＡノックアウト形質転換体のコロニー３ ＰＣＲ産物のヌクレオチドシーケンシングの結果。（９２％）
配列番号２３：プライマーＯｇ１２ｒを用いた、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の可能性のあるｂｕｄＡノックアウト形質転換体のコロニー４ ＰＣＲ産物のヌクレオチドシーケンシングの結果。（９２％）
配列番号２４：プライマーＯｇ１２ｒを用いた、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の可能性のあるｂｕｄＡノックアウト形質転換体のコロニー５ ＰＣＲ産物のヌクレオチドシーケンシングの結果。
配列番号２５：プライマーＯｇ０９ｆを用いた、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の可能性のあるｂｕｄＡノックアウト形質転換体のコロニー６ ＰＣＲ産物のヌクレオチドシーケンシングの結果。
配列番号２６：プライマーＯｇ１２ｒを用いた、クローン６由来のＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｂｕｄＡターゲット領域のヌクレオチドシーケンシングの結果。
配列番号２７および２８：以下の表４に記載されている。
配列番号２９および３０：以下の表４に記載されている。
配列番号３１：誘導性ｌａｃプロモータと融合された新規のメチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列。
配列番号３２：新規のメチルトランスフェラーゼのタンパク質配列。
配列番号３３：プラスミドｐＧＳ２０のヌクレオチド配列。
配列番号３４：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）、およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）由来の新規のアルコールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列。
配列番号３５：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）由来の新規のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の核酸配列。
配列番号３６：Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）由来の新規のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の核酸配列。
配列番号３７：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）由来の新規のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の核酸配列。
配列番号３８：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のリンゴ酸酵素１のヌクレオチド配列。
配列番号３９：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のリンゴ酸酵素１のアミノ酸配列。
配列番号４０：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のリンゴ酸酵素２のヌクレオチド配列。
配列番号４１：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のリンゴ酸酵素２のアミノ酸配列。
配列番号４２：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼのヌクレオチド配列。
配列番号４３：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列。
配列番号４４：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のピルビン酸リン酸ジキナーゼのヌクレオチド配列。
配列番号４５：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のピルビン酸リン酸ジキナーゼのアミノ酸配列。
配列番号４６：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のピルビン酸カルボキシラーゼのヌクレオチド配列。
配列番号４７：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列。
配列番号４８：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のＰＥＰカルボキシキナーゼのヌクレオチド配列。
配列番号４９：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のＰＥＰカルボキシキナーゼのアミノ酸配列。
配列番号５０：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のフマル酸ヒドラターゼ サブユニットＡのヌクレオチド配列。
配列番号５１：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のフマル酸ヒドラターゼ サブユニットＡのアミノ酸配列。
配列番号５２：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のフマル酸ヒドラターゼ サブユニットＢのヌクレオチド配列。
配列番号５３：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のフマル酸ヒドラターゼ サブユニットＢのアミノ酸配列。
配列番号５４：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のフマル酸レダクターゼ１のヌクレオチド配列。
配列番号５５：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のフマル酸レダクターゼ１のアミノ酸配列。
配列番号５６：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のフマル酸レダクターゼ２のヌクレオチド配列。
配列番号５７：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のフマル酸レダクターゼ２のアミノ酸配列。
配列番号５８：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のフマル酸レダクターゼ３のヌクレオチド配列。
配列番号５９：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）のフマル酸レダクターゼ３のアミノ酸配列。
配列番号６０：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のリンゴ酸酵素１のヌクレオチド配列。
配列番号６１：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のリンゴ酸酵素１のアミノ酸配列。
配列番号６２：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼのヌクレオチド配列。
配列番号６３：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列。
配列番号６４：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のピルビン酸リン酸ジキナーゼのヌクレオチド配列。
配列番号６５：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のピルビン酸リン酸ジキナーゼのアミノ酸配列。
配列番号６６：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のピルビン酸カルボキシラーゼのヌクレオチド配列。
配列番号６７：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列。
配列番号６８：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のＰＥＰカルボキシキナーゼのヌクレオチド配列。
配列番号６９：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のＰＥＰカルボキシキナーゼのアミノ酸配列。
配列番号７０：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のフマル酸ヒドラターゼ サブユニットＡのヌクレオチド配列。
配列番号７１：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のフマル酸ヒドラターゼ サブユニットＡのアミノ酸配列。
配列番号７２：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のフマル酸ヒドラターゼ サブユニットＢのヌクレオチド配列。
配列番号７３：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のフマル酸ヒドラターゼ サブユニットＢのアミノ酸配列。
配列番号７４：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のフマル酸レダクターゼ１のヌクレオチド配列。
配列番号７５：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のフマル酸レダクターゼ１のアミノ酸配列。
配列番号７６：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のフマル酸レダクターゼ２のヌクレオチド配列。
配列番号７７：Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のフマル酸レダクターゼ２のアミノ酸配列。
配列番号７８：クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii） ｂｕｄＡ遺伝子の５’上流配列または相同アーム。
配列番号７９：クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii） ｂｕｄＡ遺伝子の３’下流配列または相同アーム。
配列番号８０：クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei） ｂｕｄＡ遺伝子の５’上流配列または相同アーム。
配列番号８１：クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei） ｂｕｄＡ遺伝子の３’下流配列または相同アーム。
配列番号８２：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｂｕｄＡにおけるＣｌｏｓＴｒｏｎターゲティング領域のヌクレオチド配列。
配列番号８３：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ２，３ｂｄｈにおけるＣｌｏｓＴｒｏｎターゲティング領域のヌクレオチド配列。
配列番号８４：Δ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体をスクリーニングするために用いるオリゴヌクレオチドＯｇ４２ｆ。
配列番号８５：Δ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体をスクリーニングするために用いるオリゴヌクレオチドＯｇ４３ｒ。
配列番号８６：プライマーｆＤ１を用いて得られた、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ Δ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎクローン２から増幅された１６ｓ ｒＲＮＡ ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列。
配列番号８７：プライマーｒＰ２を用いて得られた、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ Δ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎクローン２から増幅された１６ｓ ｒＲＮＡ ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列。
配列番号８８：プライマーｆＤ１を用いて得られた、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ Δ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎクローン４の１６ｓ ｒＲＮＡ ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列。
配列番号８９：プライマーｒＰ２を用いて得られた、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ Δ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎクローン４の１６ｓ ｒＲＮＡ ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列。
配列番号９０：プライマーｆＤ１を用いて得られた、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ΔｂｕｄＡ ＣｌｏｓＴｒｏｎクローン１の１６ｓ ｒＲＮＡ ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列。
配列番号９１：プライマーｒＰ２を用いて得られた、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ΔｂｕｄＡ ＣｌｏｓＴｒｏｎクローン１の１６ｓ ｒＲＮＡ ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列。
配列番号９２：プライマーｆＤ１を用いて得られた、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ΔｂｕｄＡ ＣｌｏｓＴｒｏｎクローン３の１６ｓ ｒＲＮＡ ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列。
配列番号９３：プライマーｒＰ２を用いて得られた、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ΔｂｕｄＡ ＣｌｏｓＴｒｏｎクローン３の１６ｓ ｒＲＮＡ ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列。
配列番号９４：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ２，３ｂｄｈ遺伝子の５’相同アームのヌクレオチド配列。
配列番号９５：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ２，３ｂｄｈ遺伝子の３’相同アームのヌクレオチド配列。
配列番号９６および９７：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ２，３ｂｄｈ遺伝子の５’相同アームを増幅するために用いられるプライマー。
配列番号９８および９９：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ２，３ｂｄｈ遺伝子の３’相同アームを増幅するために用いられるプライマー。
配列番号１００および１０１：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ２，３ｂｄｈ遺伝子のノックアウトを確認するために用いることができる隣接プライマー。
配列番号１０２：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ＳｅｃＡｄｈ遺伝子の５’相同アームの核酸配列。
配列番号１０３：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ＳｅｃＡｄｈ遺伝子の３’相同アームの核酸配列。
配列番号１０４および１０５：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ２，３ｂｄｈ遺伝子の５’相同アームを増幅するために用いられるプライマー。
配列番号１０６および１０７：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ２，３ｂｄｈ遺伝子の３’相同アームを増幅するために用いられるプライマー。
配列番号１０８および１０９：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ＳｅｃＡｄｈ遺伝子のノックアウトを確認するために用いることができるプライマー。
配列番号１１０：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ＳｅｃＡｄｈ遺伝子のためのグループＩＩイントロンターゲティングカセットのヌクレオチド配列。
配列番号１１１および１１２：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ＳｅｃＡｄｈ遺伝子の挿入不活性化を確認するために用いることができる隣接プライマー。
配列番号１１３：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ａｌｓＳ遺伝子の５’相同アームのヌクレオチド配列。
配列番号１１４：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ａｌｓＳ遺伝子の３’相同アームのヌクレオチド配列。
配列番号１１５および１１６：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ａｌｓＳ遺伝子の５’相同アームを増幅するために用いられるプライマーの配列。
配列番号１１７および１１８：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ａｌｓＳ遺伝子の３’相同アームを増幅するために用いられるプライマーの配列。
配列番号１１９および１２０：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ａｌｓＳ遺伝子のノックアウトを確認するために用いることができる隣接プライマーの配列。
配列番号１２０：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｉｌｖＣ遺伝子の５’相同アームのヌクレオチド配列。
配列番号１２１：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｉｌｖＣ遺伝子の３’相同アームの核酸配列。
配列番号１２３および１２４：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｉｌｖＣ遺伝子の５’相同アームを増幅するために用いられるプライマーの配列。
配列番号１２５および１２６：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｉｌｖＣ遺伝子の３’相同アームを増幅するために用いられるプライマーの配列。
配列番号１２７および１２８：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｉｌｖＣ遺伝子のノックアウトを確認するために用いることができる隣接プライマーの配列。
配列番号１２９：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｉｌｖＩ遺伝子の５’相同アームのヌクレオチド配列。
配列番号１３０：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｉｌｖＩ遺伝子の３’相同アーム（配列番号１３０）のヌクレオチド配列。
配列番号１３１および１３２：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｉｌｖＩ遺伝子の５’相同アームを増幅するために用いられるプライマーの配列。
配列番号１３３および１３４：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｉｌｖＩ遺伝子の３’相同アームを増幅するために用いられるプライマーの配列。
配列番号１３５および１３６：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｉｌｖＩ遺伝子のノックアウトを確認するために用いることができる隣接プライマーの配列。
配列番号１３７：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｉｌｖＢ遺伝子の５’相同アームのヌクレオチド配列。
配列番号１３８：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｉｌｖＢ遺伝子の３’相同アームのヌクレオチド配列。
配列番号１３９および１４０：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｉｌｖＢ遺伝子の５’相同アームを増幅するために用いられるプライマーの配列。
配列番号１４１および１４２：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｉｌｖＢ遺伝子の３’相同アームを増幅するために用いられるプライマーの配列。
配列番号１４３および１４４：Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ ｉｌｖＢ遺伝子のノックアウトを確認するために用いることができる隣接プライマーの配列。
配列番号１４５：ａｌｓＳのＣｌｏｓＴｒｏｎイントロンターゲティングヌクレオチド配列の例。
配列番号１４６：ｉｌｖＣのＣｌｏｓＴｒｏｎイントロンターゲティングヌクレオチド配列の例。
配列番号１４７：ｉｌｖＩのＣｌｏｓＴｒｏｎイントロンターゲティングヌクレオチド配列の例。
配列番号１４８：ｉｌｖＢのＣｌｏｓＴｒｏｎイントロンターゲティングヌクレオチド配列の例。
配列番号１４９および１５０：ａｌｓＳ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体をスクリーニングするために用いることができるオリゴヌクレオチド。
配列番号１５１および１５２：ｉｌｖＣ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体をスクリーニングするために用いることができるオリゴヌクレオチド。
配列番号１５３および１５４：ｉｌｖＩ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体をスクリーニングするために用いることができるオリゴヌクレオチド。
配列番号１５５および１５６：ｉｌｖＢ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体をスクリーニングするために用いることができるオリゴヌクレオチド。
全ての配列について標準ＩＵＰＡＣ略語が用いられ、http://en.m.wikipedia.org/wiki/Nucleic_acid_notation#section_1を参照されたい。例として：
A アデノシン
C シチジン
G グアノシン
T チミジン

W AまたはT
S CまたはG
M AまたはC
K GまたはT
R AまたはG
Y CまたはT
B C、G、またはT
D A、G、またはT
H A、C、またはT
V A、C、またはG
Nまたは- 任意の塩基(ギャップではない)A、C、G、T
以下は、一般的な用語で示された、本発明の好ましい実施形態を含む本発明の説明である。本発明は、本明細書の下記において、見出し「実施例」の下に示された開示からさらに明らかにされ、その実施例は、本発明を裏付ける実験データ、本発明の様々な態様の特定の例、および本発明を実施する手段を提供している。
本発明は、ＣＯを含む基質の発酵によって１つまたは複数の産物を産生する能力がある微生物を提供する。特定の一実施形態において、本発明は、ＣＯを含む基質の発酵によって、エタノール、またはエタノールと１つもしくは複数の他の産物を産生する能力がある微生物を提供する。組換え微生物は、親微生物と比較して、少なくとも低下した量の２，３ブタンジオールおよび／またはその前駆体を産生する。一実施形態において、微生物は、親微生物と比較して、２，３ブタンジオールまたはその前駆体を実質的に産生しない。
様々な遺伝子ノックアウト研究を通して、本発明者らは、驚くべきことに、一酸化炭素資化性酢酸産生微生物において２，３−ブタンジオール生合成経路が破壊されたならば、その微生物は、親微生物と比較して、増加したレベルのホルメート、ラクテート、スクシネート、２−オキソグルタレート、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびエタノールを産生することができることを同定した。本発明者らはまた、それらの微生物は増加したレベルのピルベートおよびＴＣＡサイクル中間化合物のアセトラクテート、マレート、フマレート、シトレートを産生すると考えており、これらは、スクシネート、２−オキソグルタレート、ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン産生の前駆体であるからである。これは、いくつかの重要な利点を有する。１つの主な利点は、産生される、より高レベルのエタノールを含む、エタノール産生の効率の増加である。いかなる特定の理論によっても縛られることを望まないが、本発明者らは、増加したレベルのバリン、ロイシン、ホルメート、ラクテート、およびピルベートは、結果として、これらの化学物質のより多くを、エタノール産生を供給するのに微生物が利用できるということを生じると考える。加えて、発酵ブロスは、発酵中、微生物の生存率および産生効率を保証するためにアミノ酸および他の化学物質を補充されなければならない場合が多い。本発明の組換え微生物によるバリン、ロイシン、ホルメート、ラクテート、およびピルベートの産生は、これらの化学物質を発酵ブロスに補充する必要性をなくし、そのことにより、コスト削減が生じ得る。さらに、本発明の微生物における２，３−ブタンジオール産生の低下または除去は、利点を有する。２，３−ブタンジオールは、微生物にとって毒性であり得、したがって、発酵および増殖にマイナスの効果を生じる可能性がある。２，３−ブタンジオールを発酵ブロスから低下させ、または除去することはまた、ブロスからのエタノールの回収をより簡単にさせる；典型的には、エタノールと２，３−ブタンジオールの両方は、一緒に回収され、その後、次のステップで分離されなければならない。２，３−ブタンジオールはまた、それが多くの望ましくない生物体についての基質であるため、発酵槽における潜在的な微生物汚染源でもある。加えて、スクシネート、２−オキソグルタレート、ホルメート、ラクテート、ピルベート、バリン、ロイシン、およびイソロイシンは、それらが、いくつかの工業的プロセスにおいて、および下流の化学物質産物の産生における中間化合物として、用いられ得るため、独立した経済的価値を有する。
本発明者らは、一酸化炭素資化性酢酸産生微生物における非必須遺伝子の破壊またはノックアウトを初めて、実証している。したがって、別の態様において、本発明はまた、親微生物と比較して１つまたは複数の非必須遺伝子が破壊されている一酸化炭素資化性酢酸産生微生物を、そのような微生物を作製する方法、およびこれらの微生物を用いる方法と共に、提供する。「非必須」遺伝子は、微生物の生存に必要ではないタンパク質をコードする遺伝子であり、それゆえに、微生物は、そのタンパク質の補充なしに生存することができる。非必須遺伝子の例には、アセト乳酸デカルボキシラーゼおよび２，３ブタンジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が挙げられる。当業者は、（本明細書に記載されているように）遺伝子を破壊するための組換え技術を含む当技術分野における標準技術を、そのような遺伝子改変が微生物の生存に効果を生じるかどうかを試験するための標準アッセイと共に用いて、非必須遺伝子を同定することができるであろう。
以下の本発明の説明は、遺伝子改変による２，３−ブタンジオール生合成経路の破壊に焦点を合わせているが、本発明の微生物がまた、必要に応じて（２，３−ブタンジオール生合成経路に関連していない１つまたは複数の非必須遺伝子の破壊を含む）１つまたは複数の追加の遺伝子改変を含んでもよいことは認識されているはずである。非必須遺伝子の破壊に関する本発明の態様の場合において、２，３−ブタンジオール経路における酵素以外の酵素をコードする遺伝子における遺伝子改変が含まれることは認識されているはずである。
加えて、以下の説明は、主要な産物としてエタノールの産生および回収に焦点を合わし得るが、本発明は、エタノール以外の、またはエタノールに加えて、１つまたは複数の産物の産生のレベルを増加させるために用いられ得ることは認識されているはずである。
定義
本明細書で言及される場合、「発酵ブロス」は、少なくとも栄養培地および細菌細胞を含む培地である。
本明細書で言及される場合、シャトル微生物は、メチルトランスフェラーゼ酵素が発現し、および目的微生物とは異なる微生物である。
本明細書で言及される場合、目的微生物は、発現構築物／ベクター上に含まれる遺伝子が発現し、およびシャトル微生物とは異なる微生物である。
用語「主要な発酵産物」は、最も高い濃度および／または収量で産生される１つの発酵産物を意味するように意図される。
用語「効率を増加させること」、「効率の増加」などには、発酵プロセスに関係して用いられる場合、発酵を触媒する微生物の増殖の速度、増殖速度および／または産物産生速度、消費される基質の体積あたりの産生される所望の産物（例えば、アルコールなど）の体積、所望の産物の産生速度または産生レベル、ならびに発酵の他の副産物と比較した、産生される所望の産物の相対的割合のうちの１つまたは複数を増加させることが挙げられるが、それらに限定されない。
句「一酸化炭素を含む基質」および同様の用語は、その基質中の一酸化炭素を、例えば、増殖および／または発酵のために１つまたは複数の細菌株が利用できる、任意の基質を含むことは理解されているはずである。
句「一酸化炭素を含むガス状基質」ならびに同様の句および用語は、ある程度の一酸化炭素を含有する任意のガスを含む。ある特定の実施形態において、基質は、少なくとも約２０体積％〜約１００体積％のＣＯ、２０体積％から７０体積％までのＣＯ、３０体積％から６０体積％までのＣＯ、および４０体積％から５５体積％までのＣＯを含有する。特定の実施形態において、基質は、約２５体積％、または約３０体積％、または約３５体積％、または約４０体積％、または約４５体積％、または約５０体積％のＣＯ、または約５５体積％のＣＯ、または約６０体積％のＣＯを含む。
基質がいくらかの水素を含有している必要はないが、Ｈ２の存在は、本発明の方法に従った産物形成にとって有害であるものではない。特定の実施形態において、水素の存在は、アルコール産生の全体的な効率の向上を生じる。例えば、特定の実施形態において、基質は、約２：１、または１：１、または１：２の比のＨ２：ＣＯを含んでもよい。一実施形態において、基質は、約３０体積％以下のＨ２、２０体積％以下のＨ２、約１５体積％以下のＨ２、または約１０体積％以下のＨ２を含む。他の実施形態において、基質流は、低濃度のＨ２、例えば、５％未満、もしくは４％未満、もしくは３％未満、もしくは２％未満、もしくは１％未満を含み、または実質的に水素を含まない。基質はまた、いくらかのＣＯ２、例えば、約１体積％〜約８０体積％のＣＯ２、または１体積％〜約３０体積％のＣＯ２などを含有してもよい。一実施形態において、基質は、約２０体積％以下のＣＯ２を含む。特定の実施形態において、基質は、約１５体積％以下のＣＯ２、約１０体積％以下のＣＯ２、約５体積％以下のＣＯ２を含み、または実質的にＣＯ２を含まない。
次に続く説明において、本発明の実施形態は、「ＣＯを含有するガス状基質」を送達して、発酵させることに関して、記載されている。しかしながら、ガス状基質は代替の形をとって供給されてもよいことは認識されているはずである。例えば、ＣＯを含有するガス状基質は、液体中に溶解されて供給されてもよい。本質的に、液体は、一酸化炭素含有ガスで飽和されており、その後、その液体は、バイオリアクタへ加えられる。これは標準方法体系を用いて達成され得る。例として、マイクロバブル分散発生器(Hensirisakら、Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation；Applied Biochemistry and Biotechnology 101巻、3号/2002年10月)を用いることができる。さらなる例として、ＣＯを含有するガス状基質は、固体支持体上に吸着させてもよい。用語「ＣＯを含有する基質」などの使用には、そのような代替方法が含まれる。
本発明の特定の実施形態において、ＣＯ含有ガス状基質は、産業的排ガスまたは廃ガスである。「産業的廃ガスまたは排ガス」は、産業プロセスによって生成されたＣＯを含む任意のガスを含むように広く解釈されるべきであり、それらには、鉄類製品製造、非鉄製品製造、石油精製プロセス、石炭ガス化、バイオマスのガス化、電力生産、カーボンブラック生産、およびコークス製造の結果として生成されるガスが挙げられる。さらなる例は、本明細書中の他のところで提供されている場合がある。
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書で用いられる場合、句「発酵させること」、「発酵プロセス」、または「発酵反応」などは、そのプロセスの増殖相と産物生合成相の両方を含むことを意図される。本明細書でさらに記載されるように、いくつかの実施形態において、バイオリアクタは、第１の増殖リアクタおよび第２の発酵リアクタを含んでもよい。それとして、金属または組成物の発酵反応への添加は、これらのリアクタの一方または両方への添加を含むと理解されるべきである。
用語「バイオリアクタ」は、１つもしくは複数の容器および／もしくは塔、または配管からなる発酵装置を含み、それには、連続撹拌槽型反応器（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｓｔｉｒｒｅｄ Ｔａｎｋ Ｒｅａｃｔｏｒ）（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌ Ｒｅａｃｔｏｒ）（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（Ｔｒｉｃｋｌｅ Ｂｅｄ Ｒｅａｃｔｏｒ）（ＴＢＲ）、気泡塔（Ｂｕｂｂｌｅ Ｃｏｌｕｍｎ）、ガスリフト発酵槽（Ｇａｓ Ｌｉｆｔ Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）、静的ミキサー（Ｓｔａｔｉｃ Ｍｉｘｅｒ）、またはガス−液体接触に適した他の容器もしくは他の装置が挙げられる。本明細書で以後に記載されているように、いくつかの実施形態において、バイオリアクタは、第１の増殖リアクタおよび第２の発酵リアクタを含んでもよい。それとして、基質のバイオリアクタまたは発酵反応への添加について言及される場合、必要に応じて、これらのリアクタの一方または両方への添加を含むことは理解されるべきである。
本発明による発酵の産物に関して用いられる場合、「１つまたは複数の産物」および同様の句は、例えば、エタノール、スクシネート、ピルベート、ラクテート、バリン、ホルメート、イソロイシン、およびロイシンを含むことを意図される。一実施形態において、「１つまたは複数の産物」はまた、アセトラクテート、マレート、フマレート、シトレート、および２−オキソグルタレートのうちの１つまたは複数を含んでもよい。本発明の方法は、エタノールの（単独での、または他の産物と組み合わせての）産生および回収、またはエタノール以外の産物の産生および回収のために意図される方法に適用できることは認識されているはずである。
用語「アセテート」は、酢酸塩単独と、本明細書に記載されているような発酵ブロス中に存在する酢酸塩および遊離酢酸の混合物などの、分子の、または遊離の酢酸および酢酸塩の混合物との両方を含む。発酵ブロス中の分子酢酸対アセテートの比は、システムのｐＨに依存する。スクシネート、ピルベート、ラクテート、ホルメート、アセトラクテート、マレート、フマレート、シトレート、および２−オキソグルタレートという用語は、同様に解釈されるべきである。
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、１つまたは複数の異性体の形（例えば、Ｄ型、Ｌ型、メソ型、Ｓ型、Ｒ型、シス型、またはトランス型）で存在し得る本明細書における任意の化合物への言及は、その化合物の任意の１つまたは複数のそのような異性体への言及を含むものと一般的に解釈されるべきである。例えば、「アセトイン」への言及は、そのＤ型異性体およびＬ型異性体の一方または両方への言及を含むものと解釈されるべきである。
「外因性核酸」は、それらが導入される微生物の外から発生した核酸である。外因性核酸は、任意の適切な源に由来してもよく、その源には、非限定的に、それらが導入されることになっている微生物、それらが導入されることになっている生物体とは異なる生物体の株もしくは種が挙げられ、またはそれらは人工的もしくは組換え的に作製されてもよい。外因性核酸は、それが導入されることになっている微生物のゲノムへ組み込まれるように、または染色体外状態で留まるように、適応してもよい。
「２，３−ブタンジオール生合成経路」は、ピルベートのアセトラクテートへの、アセトラクテートのアセトインへの、およびアセトインの２，３−ブタンジオールへの変換を含む反応の経路である。
本明細書で用いられる場合、「２，３−ブタンジオール生合成経路を破壊する」および同様の句は、２，３−ブタンジオールの産生が低下し、または一実施形態において、実質的に除去されていることを意味することを意図される。
「２，３−ブタンジオールの前駆体」は、アセトインおよびアセトラクテートを含むことを意図される。
酵素は、もし、その活性型において、それが、第１の化合物の少なくとも一部が第２の化合物へ変換される反応を触媒することができるならば、第１の化合物または基質を第２の化合物または生成物へ「変換する能力がある」。
「アルコールデヒドロゲナーゼ」への言及は、ケトン（例えば、アセトイン）の第二級アルコール（例えば、２，３−ブタンジオール）への、または逆の変換を触媒する能力があるアルコールデヒドロゲナーゼを含むと解釈されるべきである。そのようなアルコールデヒドロゲナーゼには、第二級アルコールデヒドロゲナーゼおよび第一級アルコールデヒドロゲナーゼが挙げられる。「第二級アルコールデヒドロゲナーゼ」は、ケトン（例えば、アセトイン）を第二級アルコール（例えば、２，３−ブタンジオール）へ、または逆に変換することができるものである。「第一級アルコールデヒドロゲナーゼ」は、アルデヒドを第一級アルコールへ、または逆に変換することができるものである。しかしながら、いくつかの第一級アルコールデヒドロゲナーゼもまた、ケトンの第二級アルコールへの、または逆の変換を触媒する能力がある。これらのアルコールデヒドロゲナーゼはまた、「第一級−第二級アルコールデヒドロゲナーゼ」と呼ばれる場合がある。したがって、本発明のある特定の実施形態において、「２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ」への言及は、第一級、第二級、または第一級−第二級アルコールデヒドロゲナーゼとして分類され得る２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼへの言及を含むと解釈されるべきである。
本発明に従って、２，３−ブタンジオール生合成経路、または１つもしくは複数の酵素の発現もしくは活性を「破壊する遺伝子改変」は、２，３−ブタンジオールの生合成、１つもしくは複数の酵素の発現もしくは活性を少なくとも低下させ、または一実施形態において、１つもしくは複数の酵素の発現もしくは活性を実質的にブロックし、または２，３−ブタンジオールの産生を実質的に阻止する、任意の遺伝子改変を含むと広く解釈されるべきである。その句は、例えば、酵素のうちの１つまたは複数をコードする遺伝子への改変を含むと解釈されるべきであり、その改変には、遺伝子の発現に関与する遺伝子制御エレメントへの改変；その酵素のうちの１つもしくは複数の活性を低下させ、もしくは阻害し、またはその酵素のうちの１つもしくは複数の発現を低下させ、もしくは阻止するタンパク質を産生する核酸の導入；遺伝子の発現をブロックするように適応する核酸を発現する核酸の導入（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化規則的間隔短鎖パリンドロームリピート（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats））；その酵素のうちの１つまたは複数の発現または活性に必要とされるタンパク質を、そのタンパク質をコードする遺伝子へ改変を導入することにより低下させ、または阻害することが挙げられる。その酵素のうちの１つまたは複数の発現または活性に必要とされるタンパク質は、遺伝子または１つもしくは複数の酵素へ直接的に作用してもよいし、別の化合物を介して間接的に作用してもよいことは認識されているはずである。同様に、１つまたは複数の酵素の活性または発現を低下させ、または阻害するタンパク質は、その遺伝子またはその１つもしくは複数の酵素へ直接的に作用してもよいし、別の化合物を介して間接的に作用してもよい。
「遺伝子改変」は、広く解釈されるべきであり、例えば、１つまたは複数の外因性核酸を微生物へ導入すること、突然変異を遺伝子部位に導入すること、１つまたは複数のヌクレオチドをゲノムに付加し、またはゲノムから除去すること、１つまたは複数のヌクレオチドの異なるヌクレオチドでの置換、遺伝子の置換、遺伝子の除去、遺伝子の付加などを含むことを意図される。
「親微生物」は、本発明の組換え微生物を作製するために用いられる微生物である。一実施形態において、親微生物は、天然に存在するもの（すなわち、野生型微生物）、または以前に改変されているもの（遺伝子改変微生物、または組換え微生物）であってもよい。低下した量の２，３−ブタンジオールを産生し、または２，３−ブタンジオールを実質的に産生しない微生物に関する本発明の実施形態において、親微生物は、（天然に存在する微生物、または以前に改変されている微生物を含む）、機能する２，３−ブタンジオール経路を含むものである。機能する２，３−ブタンジオール生合成経路を含む親微生物の例には、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）、クロストリジウム・コスカッティ（Clostridium coskatii）、および関連した分離株が挙げられる。
「機能する」２，３−ブタンジオール生合成経路は、微生物が、ピルベートを２，３−ブタンジオールへ変換することができる経路である。特定の一実施形態において、経路は、ピルベートのアセトラクテートへの、アセトラクテートのアセトインへの、およびアセトインの２，３−ブタンジオールへの変換を含む。特定の一実施形態において、ピルベートのアセトラクテートへの変換は、アセト乳酸シンターゼによって触媒され、アセトラクテートのアセトインへの変換は、アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒され、アセトインの２，３−ブタンジオールへの変換は、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼまたはアセトインレダクターゼによって触媒される。
核酸「構築物」または「ベクター」という用語および同様の用語は、遺伝子材料を細胞へトランスファーするための媒体として用いるのに適した（ＤＮＡおよびＲＮＡを含む）任意の核酸を含むと広く解釈されるべきである。その用語は、プラスミド、（バクテリオファージを含む）ウイルス、コスミド、および人工染色体を含むように解釈されるべきである。構築物またはベクターは、数あるエレメント、部位、およびマーカーの中でも、１つまたは複数の制御エレメント、複製開始点、マルチクローニング部位、および／または選択マーカーを含んでもよい。特定の一実施形態において、構築物またはベクターは、親微生物本来の遺伝子の破壊を可能にするように適応している。別の実施形態において、構築物またはベクターは、構築物またはベクターによってコードされる１つまたは複数の遺伝子の発現を可能にするように適応している。核酸構築物またはベクターには、裸の核酸、加えて、細胞への送達を促進するために１つまたは複数の作用物質と共に製剤化された核酸（例えば、リポソーム抱合化核酸、核酸が含有される生物体）が挙げられる。
本明細書を通して、例示的な配列情報は、本発明に適用可能な酵素（例えば、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、アセトインレダクターゼ）について提供される。この情報は、本発明に適用可能な例示的な酵素を同定し、および過度の実験を行うことなく、当業者が本発明の特定の実施形態を実施することを可能にするために提供される。酵素についての核酸配列およびアミノ酸配列は、微生物によって異なる可能性があることは認識されているはずである。したがって、本発明は、これらの特定の実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、ピルベートのアセトラクテートへの変換、アセトラクテートのアセトインへの変換、および／またはアセトインの２，３−ブタンジオールへの変換を触媒する能力がある点を除いて、異なる配列を有する酵素の破壊にまで及ぶと解釈されるべきである。典型的には、そのような酵素は、本明細書に例示された酵素と少なくとも約７５％アミノ酸配列同一性を有する。特定の実施形態において、そのような酵素は、本明細書に例示された酵素と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％配列同一性を有する。核酸レベルにおいて、そのような変種酵素をコードする遺伝子は、本明細書に例示された酵素をコードする核酸と少なくとも約７５％配列相同性を有する。特定の実施形態において、そのような核酸は、本明細書に例示された酵素をコードする核酸と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％配列相同性を有する。
変種酵素が、本明細書に具体的に例示された酵素と同じ活性レベルを有する必要はないこともまた認識されているはずである。必要なのは、それが、対象となる変換を触媒することにおけるある程度のレベルの活性を有することだけである。当業者は、特に本明細書に含有される情報に照らせば、他のそのような酵素を容易に認識するであろう。２，３−ブタンジオール経路についての酵素の活性を評価するのに有用な酵素アッセイには、例えば、SpeckmanおよびCollins（Specificity of the Westerfeld Adaptation of the Voges-Proskauer Test、1982、Appl. Environ. Microbiol. 44：40〜43）、またはDulieuおよびPoncelet（Spectrophotometric assay of a-acetolactate decarboxylase、1999、Enzy and Microbiol Technol、25、537〜42）によって記載されたアッセイＶｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ試験が挙げられる。
微生物
本明細書で前に論じられているように、本発明は、一酸化炭素を用いて１つまたは複数の産物（特定の一実施形態において、主要な産物としてエタノール）を産生する能力があり、親微生物と比較して低下した量の２，３ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を産生し、または２，３ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を実質的に産生しない組換え微生物を提供する。微生物は、２，３−ブタンジオール生合成経路を破壊する、（親微生物と比較して）１つまたは複数の遺伝子改変を含む。
上で述べられているように、一実施形態において、微生物は主要な産物としてエタノールを産生する。一実施形態において、微生物はまた、ホルメート、ラクテート、ピルベート、スクシネート、バリン、ロイシン、イソロイシンのうちの１つまたは複数を産生する。特定の一実施形態において、微生物は、親微生物と比較して、増加した量の、エタノール、ホルメート、ラクテート、ピルベート、スクシネート、バリン、ロイシン、イソロイシンのうちの１つまたは複数を産生するように適応している。ある特定の実施形態において、微生物は、アセトラクテート、マレート、シトレート、フマレート、２−オキソグルタレートのうちの１つまたは複数を産生する。特定の一実施形態において、微生物は、増加した量の、アセトラクテート、マレート、シトレート、フマレート、２−オキソグルタレートのうちの１つまたは複数を産生するように適応している。
１つまたは複数の遺伝子改変は、好ましくは、ピルベートをアセトラクテートへ、アセトラクテートをアセトインへ、アセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素の発現および／または活性を破壊する。ある特定の実施形態において、１つまたは複数の遺伝子改変は、ピルベートのアセトラクテートへの変換のみ、アセトラクテートのアセトインへの変換のみ、またはアセトインの２，３−ブタンジオールへの変換のみを破壊する。他の実施形態において、１つまたは複数の遺伝子改変は、これらの変換のうちの２つまたは３つを破壊する。
一実施形態において、ピルベートをアセトラクテートへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素は、アセト乳酸シンターゼ（ａｌｓＳ）である。
アセト乳酸シンターゼ活性は、ピルベートをアセトラクテートへ変換する能力があり、（バリン、ロイシン、イソロイシンを含む）分岐鎖アミノ酸産生にとって必須である（図１）。アセト乳酸シンターゼ活性を有する１つまたは複数の酵素は、親微生物内で発現している場合がある。Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）（ＡＥＩ９０７１９．１、ＡＥＩ９０７３０．１、ＡＥＩ９０７３１．１、ＡＥＩ９０７１３．１、ＡＥＩ９０７１４．１）、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）（ＡＤＫ１５１０４．１、ＡＤＫ１５１０４．１、ＡＤＫ１５１０５．１、ＡＤＫ１５４００．１、ＡＤＫ１５４００．１）、およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）（ＡＥＩ９０７３４．１、ＡＥＩ９０７３４．１、ＡＥＩ９０７３５．１、ＡＥＩ９０７２７．１、ＡＥＩ９０７２７．１）由来の例示的なアミノ酸配列、ならびにＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）（ＨＱ８７６０１３．１、ＨＱ８７６０２３．１、ＨＱ８７６０２１．１）、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）（ＣＰ００１６６６．１ − ＣＬＪＵ＿ｃ３８９２０、ＣＬＪＵ＿ｃ３２４２０、ＣＬＪＵ＿ｃ２０４２０−３０）、およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）（ＨＱ８７６０１４．１、ＨＱ８７６０２４．１、ＨＱ８７６０２２．１）由来のそれぞれの核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋから入手することができる。しかしながら、前に上で述べられているように、そのような酵素をコードする遺伝子の配列およびその酵素のアミノ酸配列は、微生物によって異なり得る。
ある特定の実施形態において、親微生物は、ピルベートをアセトラクテートへ変換する能力がある１つより多い酵素を含有してもよい。親微生物が、ピルベートをアセトラクテートへ変換する能力がある１つより多い酵素を含有する場合、１つまたは複数の遺伝子改変は、その酵素のうちの２つ以上の発現および／または活性が破壊されるように、導入され得る。１つより多い酵素が親微生物内に存在する場合、１つより多いそのような酵素を破壊することは、単一の酵素のみが破壊される場合に達成され得るレベルより上に、スクシネート、１つもしくは複数のＴＣＡサイクル中間体、および／またはエタノールの産生を増加させる効果を生じ得る。産生レベルは、親微生物内に存在するそれぞれの追加の酵素の破壊で、さらに増加し得る。全てのそのような酵素活性の発現および／または活性を破壊することは、所望の産物の産生に関していくつかの利点を提供し得るが、本発明者らは、本発明の恩恵を得るために、全てのそのような酵素の発現および／または活性を破壊することを必要であると考えているわけではない。
一実施形態において、ピルベートをアセトラクテートへ変換する能力がある少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つの酵素が破壊される。
ピルベートのアセトラクテートへの変換が実質的に、または完全にブロックされている本発明の実施形態において、微生物の増殖および微生物による発酵は、例えばバリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む１つまたは複数のアミノ酸の補充を必要とする場合がある。これは、アミノ酸（複数可）を微生物が利用できるようにする任意の手段によって達成することができる。例として、１つまたは複数のアミノ酸は、培養培地、増殖培地、もしくは発酵培地へ、微生物の培養物へ、および／または発酵ブロスへ加えられてもよい。ある特定の実施形態において、アミノ酸（複数可）は、培地もしくはブロスへ直接、加えられてもよいし、または、抽出物、例えば、酵母抽出物の形で加えられてもよい。
一実施形態において、アセトラクテートをアセトインへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素は、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ｂｕｄＡ）である。
アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性は、アセトラクテートをアセトインへ変換する能力がある（図１）。アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有する１つまたは複数の酵素は、親微生物内で発現している場合がある。Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）、およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼについての例示的なアミノ酸（ＡＥＩ９０７１７．１、ＡＤＫ１３９０６．１、ＡＥＩ９０７１８．１）および核酸（ＨＱ８７６０１１．１、ＣＰ００１６６６．１ − ＣＬＪＵ＿ｃ０８３８０、ＨＱ８７６０１２．１）の配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋから入手することができる。しかしながら、本明細書において前に述べられているように、そのような酵素をコードする遺伝子の配列およびその酵素のアミノ酸配列は、微生物によって異なり得る。
ある特定の実施形態において、親微生物は、アセトラクテートをアセトインへ変換する能力がある１つより多い酵素を含有してもよい。親微生物が、１つより多いそのような酵素を含有する場合、その酵素のうちの２つ以上の発現および／または活性が破壊されるように、１つまたは複数の遺伝子改変が導入され得る。１つより多い酵素が親微生物内に存在する場合、１つより多い酵素を破壊することは、単一の酵素のみが破壊される場合に達成され得るレベルより上に、バリン、ロイシン、イソロイシン、エタノール、ラクテート、ホルメート、およびスクシネート、ならびに／または１つもしくは複数のＴＣＡサイクル中間体の産生を増加させる効果を生じ得る。産生レベルは、親微生物内に存在するそれぞれの追加の酵素の破壊で、さらに増加し得る。全てのそのような酵素の発現および／または活性を破壊することは、所望の産物の産生に関していくつかの利点を提供し得るが、本発明者らは、本発明の恩恵を得るために、全てのそのような酵素の発現および／または活性を破壊することを必要であると考えているわけではない。
一実施形態において、アセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素は、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（２，３ｂｄｈ）およびアセトインレダクターゼを含む群から選択される。
２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性は、アセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある（図１）。Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）、およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）由来の２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼについての例示的なアミノ酸（ＡＥＩ９０７１５．１、ＡＤＫ１５３８０．１、ＡＥＩ９０７１６．１）および核酸配列（ＨＱ８７６００９．１、ＣＰ００１６６６．１ − ＣＬＪＵ＿ｃ２３２２０、ＨＱ８７６０１０．１）の情報は、ＧｅｎＢａｎｋから入手することができる。アセト乳酸シンターゼ活性を有する１つまたは複数の酵素は、親微生物内で発現している場合がある。例として、本発明者らは、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）、Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）、およびＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）が、アセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある追加の第一級−第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含むことを同定している。この酵素についての例示的な配列情報は、配列番号３４、３５、３６、および３７において提供される。しかしながら、本明細書において前に述べられているように、そのような酵素をコードする遺伝子の配列およびその酵素のアミノ酸配列は、微生物によって異なり得る。
ある特定の実施形態において、親微生物は、アセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある１つより多い酵素を含有してもよい。親微生物が、１つより多いそのような酵素を含有する場合、１つまたは複数の遺伝子改変は、その酵素のうちの２つ以上の発現および／または活性が破壊されるように、導入され得る。１つより多いそのような酵素が親微生物内に存在する場合、１つより多いそのような酵素を破壊することは、単一の酵素のみが破壊される場合に達成され得るレベルより上に、バリン、ロイシン、イソロイシン、エタノール、ラクテート、ホルメート、およびスクシネート、ならびに／または１つもしくは複数のＴＣＡサイクル中間体の産生を増加させる効果を生じ得る。産生レベルは、親微生物内に存在するそれぞれの追加の酵素の破壊で、さらに増加し得る。全てのそのような酵素の発現および／または活性を破壊することは、所望の産物の産生に関していくつかの利点を提供し得るが、本発明者らは、本発明の恩恵を得るために、全てのそのような酵素の発現および／または活性を破壊することを必要であると考えているわけではない。
一実施形態において、アセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある少なくとも２つまたは３つの酵素が破壊されている。
一実施形態において、微生物は、種のクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）、クロストリジウム・カルボキシディボランス（Clostridium carboxidivorans）、クロストリジウム・ドラケイ（Clostridium drakei）、クロストリジウム・スカトロゲネス（Clostridium scatologenes）、クロストリジウム・アセティクム（Clostridium aceticum）、クロストリジウム・ホルミコアセティクム（Clostridium formicoaceticum）、クロストリジウム・マグナム（Clostridium magnum）、アセトバクテリウム・ウッディイ（Acetobacterium woodii）、アルカリバクラム・バッチイ（Alkalibaculum bacchii）、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）、スポミュサ・オバータ（Sporomusa ovate）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Butyribacterium methylotrophicum）、ブラウチア・プロドゥクタ（Blautia producta）、ユーバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、サーモアナエロバクター・キブイ（Thermoanaerobacter kiuvi）を含む酢酸産生一酸化炭素資化性生物体の群から選択される。
これらの一酸化炭素資化性アセトゲンは、化学合成独立栄養的に一酸化炭素（ＣＯ）および二酸化炭素（ＣＯ２）などのガス状一炭素（Ｃ１）源を、エネルギー源としての一酸化炭素（ＣＯ）および／または水素（Ｈ２）と共に、嫌気条件下で利用し、増殖して、アセチル−ＣｏＡ、アセテート、および他の産物を形成するそれらの能力によって定義される。それらは、同じ発酵様式のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌまたは還元性アセチル−ＣｏＡ経路を共有し、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、および一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）からなる酵素セットの存在によって定義され、それらの酵素の組み合わせは、この型の細菌に特有および独特である（Drake、Kusel、Matthies、Wood、およびLjungdahl、2006）。基質をバイオマス、二次代謝産物およびピルベートへ変換し、そのピルベートから産物が（アセチル−ＣｏＡを介して、または直接的のいずれかで）形成される、糖発酵細菌の化学合成従属栄養的増殖とは対照的に、アセトゲンにおいて、基質は直接アセチル−ＣｏＡへ導かれ、そのアセチル−ＣｏＡから産物、バイオマスおよび二次代謝産物が形成される。
一実施形態において、微生物は、種のクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、および「クロストリジウム・ラグスダレイ」（C. ragsdalei）、ならびに関連分離株を含む一酸化炭素資化性クロストリジウム属のクラスターから選択される。これらには、菌株のクロストリジウム・オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＪＡＩ−１Ｔ（ＤＳＭ１００６１）（Abrini、Naveau、およびNyns、1994）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ／２００９／０６４２００）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＬＢＳ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）、クロストリジウム・リュングダリイ（C. ljungdahlii）ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８＝ＡＴＣＣ ５５３８３）（Tanner、Miller、およびYang、1993)、クロストリジウム・リュングダリイ（C. ljungdahlii）ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ ５５３８０）（米国特許第５，５９３，８８６号）、クロストリジウム・リュングダリイ（C. ljungdahlii）Ｃ−０１（ＡＴＣＣ ５５９８８）（米国特許第６，３６８，８１９号）、クロストリジウム・リュングダリイ（C. ljungdahlii）Ｏ−５２（ＡＴＣＣ ５５９８９）（米国特許第６，３６８，８１９号）、または「クロストリジウム・ラグスダレイ（C. ragsdalei）」「Ｐ１１Ｔ」（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−６２２）（ＷＯ２００８／０２８０５５）、および「Ｃ．コスカッティ（C. coskatii）」などの関連分離株（米国特許出願第２０１１／０２２９９４７号）、ならびにクロストリジウム・リュングダリイ（C. ljungdahlii）ＯＴＡ−１（Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii.博士論文、North Carolina State University、2010）などのそれらの突然変異株が挙げられるが、それらに限定されない。
これらの菌株は、ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合およびＤＮＡフィンガープリンティング実験によって決定される場合、異なる種であるが（ＷＯ２００８／０２８０５５、米国特許出願第２０１１／０２２９９４７号）、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子レベルにおいて少なくとも９９％同一性を有するクロストリジウムｒＲＮＡクラスターＩ（Collinsら、1994）内にサブクラスターを形成する。
このクラスターの菌株は、類似した遺伝子型および表現型の両方を有する共通の特性によって定義され、それらは全て、同じエネルギー変換様式および発酵代謝様式を共有する。このクラスターの菌株は、チトクロームを欠き、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを変換する。
このクラスターの全ての菌株は、約４．２ＭＢｐのゲノムサイズ（Kopkeら、2010)および約３２％ｍｏｌのＧＣ組成（Abriniら、1994；Kopkeら、2010；Tannerら、1993）（ＷＯ２００８／０２８０５５；米国特許出願第２０１１／０２２９９４７号）、ならびにＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素（一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、および一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ）、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、Ｒｎｆ複合体（ｒｎｆＣＤＧＥＡＢ）、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（Kopkeら、2010、2011）をコードする保存的必須の鍵遺伝子オペロンを有する。ガス取り込みに関与するＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路遺伝子の構成および数は、核酸配列およびアミノ酸配列の違いにもかかわらず、全ての種において同じであることが見出されている（Kopkeら、2011）。
それらの菌株は全て、類似した形態およびサイズ（対数増殖細胞は０．５〜０．７×３〜５μｍの間である）を有し、中温性（３０〜３７℃の間の最適な増殖温度）であり、厳密に嫌気性菌である（Abriniら、1994；Tannerら、1993）（ＷＯ２００８／０２８０５５）。さらに、それらは全て、同じｐＨ範囲（最適な初期ｐＨが５．５〜６である、ｐＨ４〜７．５）、類似した増殖速度でのＣＯ含有ガスにおける強い独立栄養性増殖、ならびに、ある特定の条件下で少量の２，３−ブタンジオールおよび乳酸が形成される、主要な発酵最終産物としてのエタノールおよび酢酸に関する代謝プロフィールなどの同じ主要な系統学的形質を共有する（Abriniら、1994；Kopkeら、2011；Tannerら、1993）（ＷＯ２００８／０２８０５５）。インドール産生は、全ての種に関して観察されている。しかしながら、それらの種は、様々な糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコネート、シトレート）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、または他の基質（例えば、ベタイン、ブタノール）の基質利用において違いがある。それらの種の一部は、ある特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対して栄養要求性であることを見出されたが、他はそうではなかった。カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元は、これらの生物体の範囲において示されている（Perez、Richter、Loftus、およびAngenent、2012）。
それゆえに、記載された形質は、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）またはＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）のような１つの生物体に特異的ではなく、むしろ、一酸化炭素資化性のエタノール合成クロストリジウム属についての一般的な形質である。したがって、本発明は、これらの菌株にわたって機能することが見込まれ得るが、性能に違いがある可能性がある。
特定の実施形態において、親微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、およびクロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）を含む群から選択される。一実施形態において、群はまた、クロストリジウム・コスカッティ（Clostridium coskatii）を含む。特定の一実施形態において、親微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３である。
親微生物は、公知の形質転換技術および組換え核酸技術のいくつでも用いて、本発明の微生物に達するように改変されてもよい。そのような技術は、例えば、Sambrookら、（Molecular Cloning: A laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989）に記載されている。さらなる例として、以下の実施例セクションに記載された方法体系を用いることができる。
一般的な例として、突然変異を遺伝子に導入する場合、または別な形で遺伝子を破壊もしくはノックアウトする場合、適切な核酸構築物またはベクターを、親微生物のゲノムへ組み込んで、その遺伝子を破壊するように設計することができる。そのような構築物は、典型的には、破壊されるべき遺伝子内の、またはそれに隣接する領域に相同の核酸配列（アーム）を含み、そのことにより、相同組換えが起こること、および突然変異の導入、その遺伝子からの核酸の領域の除去、またはその遺伝子の領域の、対照をなす核酸との置換が起こることが可能になる。構築物上のアームが、それらがターゲットされるゲノムにおける領域と１００％相補性を有することが好ましいが、このことは、その配列が、対象となる遺伝子領域とのターゲットされる組換えを可能にするのに十分、相補的であるならば、必要ではない。典型的には、アームは、Sambrookら、1989に定義されているように、ストリンジェントな条件下でターゲット領域へのハイブリダイゼーションを可能にする相同性レベルを有する。
２，３−ブタンジオール生合成経路に関与する酵素についての入手可能な配列情報を考慮して、親微生物のゲノムへ外因性核酸のターゲットされる相同組換えおよび組込みを可能にするのに十分な核酸配列を、当業者は認識しているであろう。しかしながら、例として、ｂｕｄＡの場合、本明細書に記載された隣接の相同アームを用いてもよく（例えば、配列番号３、４、および７８〜８１）、またはＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）の場合、Ｇｅｎｂａｎｋ（ＣＰ００１６６６．１）における核酸配列情報から設計された隣接の相同アームを用いてもよい。さらなる例として、本発明に従って破壊されるべき酵素をコードする遺伝子の隣接配列は、関連微生物からのゲノム配列情報から決定されてもよい。特定の例として、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）における隣接配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ ＣＰ００１６６６．１における情報から決定することができる。
さらなる一般的な例として、２，３−ブタンジオール生合成経路における酵素の発現もしくは活性を阻害するタンパク質もしくは核酸を発現するために、または２，３−ブタンジオール生合成経路における酵素の発現もしくは活性を阻害する化合物の発現を増加させるタンパク質を発現するために、核酸が親微生物へ導入される場合、構築物は、微生物においてそのタンパク質の発現を可能にするように設計される。典型的には、それは、プロモータを含む適切な制御エレメントを含む。構成的または誘導性プロモータが用いられてもよい。
本発明が、突然変異を導入することなどにより遺伝子の直接的破壊を用いる場合、親微生物を形質転換するために用いられる構築物またはベクターは、上で述べられているように、微生物のゲノムへ組み込まれるように適応している。２，３−ブタンジオール生合成経路における酵素の発現もしくは活性を破壊するように、またはその経路に関与する酵素の阻害剤の発現もしくは活性を増加させるように適応しているタンパク質または核酸の発現の場合、構築物は、親微生物の形質転換の際、染色体外に留まってもよいし、または微生物のゲノムへの組込みに適応してもよい。したがって、本発明において有用な構築物は、組込み（例えば、宿主ゲノムへの相同組換えおよびターゲット化組込みを可能にする領域）、または染色体外構築物の発現および複製（例えば、複製開始点、プロモータ、および他の制御配列）を援助するのに適応したヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明において有用な核酸構築物は、当技術分野における標準の技術をいくつでも用いて、構築されてもよい。例えば、化学合成または組換え技術が用いられてもよい。そのような技術は、Sambrookら（Molecular Cloning: A laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989）に記載されている。さらなる例示的な技術は、以下の実施例セクションに記載されている。本質的に、個々の遺伝子、制御エレメント、相同アームなどは、それらがそれらの望ましい機能を実施することができるように、お互いに作動可能に連結される。本発明に用いられる適切なベクターは、当業者によって認識されているであろう。しかしながら、例として、以下のベクターが適し得る：ｐＭＴＬ、ｐＩＭＰ、ｐＪＩＲ、および以下の実施例セクションに例示されたプラスミド。
本発明の微生物を作製するのに有用な核酸は、二本鎖および一本鎖核酸を含む、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡを含む任意の適切な形をとってもよいことは認識されている。
１つまたは複数の外因性核酸は、裸の核酸として親微生物へ送達されてもよいし、または形質転換プロセスを促進するための１つもしくは複数の作用物質と共に製剤化されてもよい（例えば、リポソーム抱合化核酸、核酸が含有されている生物体）。１つまたは複数の核酸は、必要に応じて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせであってもよい。
本発明の微生物は、組換え微生物を作製するための当技術分野において知られた技術をいくつでも用いて、親微生物および１つまたは複数の外因性核酸から調製されてもよい。例としてのみ、（形質導入またはトランスフェクションを含む）形質転換は、エレクトロポレーション、接合、プロファージ誘発、または化学的および天然コンピテンスによって達成され得る。適切な形質転換技術は、例えば、Sambrook J、Fritsch EF、Maniatis T：Molecular Cloning: A laboratory Manual、Cold Spring Harbour Labrotary Press、Cold Spring Harbour、1989に記載されている。
さらなる例として、Koepkeら、2010、Poc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 107：13087〜92；ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３；ＷＯ２０１２／０５３９０５；Straetzら、1994、Appl. Environ. Microbiol. 60：1033〜37；Mermelsteinら、1992、Biotechnology、10、190〜195；Jennertら、2000、Microbiology、146：3071〜3080；Tyurinら、2004、Appl. Environ. Microbiol. 70：883〜890に記載されたエレクトロポレーション技術が用いられ得る。さらなる例として、Prasanna Tamarapu Parthasarathy、2010、Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants、Masters Project Western Kentucky Universityに記載されているようなプロファージ誘発技術を用いることができる。さらなる例として、Herbertら、2003、FEMS Microbiol. Lett. 229：103〜110、またはWilliamsら、1990、J. Gen. Microbiol. 136： 819〜826に記載された接合方法を用いることができる。
ある特定の実施形態において、形質転換されることになっている微生物において活性がある制限系により、微生物へ導入されることになっている核酸をメチル化することが必要である。これは、以下に記載されたもの、およびさらに、以後の実施例セクションに例示されたものを含む、様々な技術を用いて行うことができる。
例として、一実施形態において、本発明の組換え微生物は、以下のステップを含む方法によって作製される：
本明細書に記載されているような親微生物へ導入されることになっている（ｉ）構築物／ベクターおよび（ｉｉ）メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むメチル化構築物／ベクターのシャトル微生物への導入；
メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現；
１つまたは複数の構築物／ベクターのシャトル微生物からの単離；ならびに
１つまたは複数の構築物／ベクターの目的微生物への導入。
一実施形態において、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子は、構成的に発現する。別の実施形態において、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は誘導される。
シャトル微生物は、発現構築物／ベクターを構成する核酸配列のメチル化を促進する微生物、好ましくは、制限ネガティブ微生物である。特定の実施形態において、シャトル微生物は、制限ネガティブの大腸菌（E. coli）、枯草菌（Bacillus subtillis）、またはラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である。
メチル化構築物／ベクターは、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む。
いったん発現構築物／ベクターおよびメチル化構築物／ベクターがシャトル微生物へ導入されたならば、メチル化構築物／ベクター上に存在するメチルトランスフェラーゼ遺伝子が誘導される。誘導は、任意の適切なプロモータ系によってもよいが、本発明の特定の一実施形態において、メチル化構築物／ベクターは、（例えば、配列番号３１においてのように）誘導性ｌａｃプロモータを含み、ラクトースまたはその類似体、より好ましくは、イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導される。他の適切なプロモータには、ａｒａ、ｔｅｔ、またはＴ７系が挙げられる。本発明のさらなる実施形態において、メチル化構築物／ベクタープロモータは構成的プロモータである。
特定の実施形態において、メチル化構築物／ベクターは、メチル化構築物／ベクター上に存在する任意の遺伝子がシャトル微生物内で発現するように、シャトル微生物のアイデンティティに特異的な複製開始点を有する。好ましくは、親微生物へ導入されることになっている構築物／ベクターは、その微生物の独自性に特異的な複製開始点を有する。
メチルトランスフェラーゼ酵素の発現は、親微生物へ導入されることになっている構築物／ベクター上に存在する遺伝子のメチル化を生じる。その後、その構築物／ベクターは、いくつかの知られた方法のいずれか一つに従って、シャトル微生物から単離され得る。例としてのみ、以後に記載された実施例セクションに記載された方法体系が、構築物／ベクターを単離するために用いられてもよい。
特定の一実施形態において、両方の構築物／ベクターが同時に単離される。
親微生物へ運命づけられた構築物／ベクターは、知られた方法をいくつでも用いて、その微生物へ導入されてもよい。しかしながら、例として、以下の実施例セクションに記載された方法体系が用いられてもよい。
メチルトランスフェラーゼ遺伝子がシャトル微生物へ導入され、過剰発現し得ることが構想される。したがって、一実施形態において、生じたメチルトランスフェラーゼ酵素は、知られた方法を用いて収集され、親微生物へ導入されることになっている構築物をメチル化するためにインビトロで用いられてもよい。その後、その構築物／ベクターは、目的（親）微生物へ導入されてもよい。別の実施形態において、メチルトランスフェラーゼ遺伝子は、シャトル微生物のゲノムへ導入され、その後、親微生物へ運命づけられた構築物のシャトル微生物への導入、シャトル微生物からの１つまたは複数の構築物／ベクターの単離、およびその後、その構築物／ベクターの目的（親）微生物への導入が続く。
上記で定義されているような、親微生物へ運命づけられた構築物／ベクター、およびメチル化構築物／ベクターが組み合わされて、組成物を提供することが構想される。そのような組成物は、本発明の組換え微生物を作製するために制限バリア機構を回避することにおいて特別な有用性をもつ。
特定の一実施形態において、本明細書で前に記載された構築物／ベクターはプラスミドである。
当業者は、本発明の微生物を作製するのに有用ないくつかの適切なメチルトランスフェラーゼを認識しているであろう。しかしながら、例として、枯草菌（Bacillus subtilis）ファージΦＴ１メチルトランスフェラーゼおよび以下の実施例に記載されたメチルトランスフェラーゼが用いられてもよい。適切なメチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、所望のメチルトランスフェラーゼの配列および遺伝暗号を考慮すれば、容易に認識されるであろう。一実施形態において、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、以下の実施例に記載されている（例えば、配列番号３１の核酸）。
メチル化構築物／ベクターを作製するために、メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を可能にするように適応した構築物／ベクターをいくつでも用いてもよい。しかしながら、例として、以下の実施例セクションに記載されたプラスミドが用いられてもよい。
本明細書に含まれる情報から、１つまたは複数の産物の産生を１つまたは複数の他の産物より優先するように親微生物の遺伝子改変を仕立て得ることは認識されているであろう。例えば、ピルベートのアセトラクテートへの変換を破壊することは、ラクテート、ホルメート、マレート、フマレート、シトレート、スクシネート、２−オキソグルタレートの産生を、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの産生より優先する。
産生方法
本発明は、本発明の微生物を用いて、ＣＯを含む基質を発酵することを含む、微生物発酵により１つまたは複数の産物を産生するための方法を提供する。特定の一実施形態において、方法は、本発明の微生物を用いて、ＣＯを含む基質を発酵することを含む、微生物発酵によりエタノールまたは１つもしくは複数の他の産物を産生するためのものである。本発明の方法は、産業プロセスから総大気中炭素放出を低下させるために用いられてもよい。
好ましくは、発酵は、本発明の組換え微生物を用いて、１つまたは複数の産物（特定の一実施形態において、エタノール、またはエタノールおよび１つもしくは複数の他の産物）を産生するためにバイオリアクタ内で基質を嫌気的に発酵させるステップを含む。
一実施形態において、方法は以下のステップを含む：
（ａ）本発明の第１の態様の１つまたは複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクタへ、ＣＯを含む基質を供給するステップ；および
（ｂ）バイオリアクタ内で培養物を嫌気的に発酵させて、（一実施形態において、エタノールを含む）１つまたは複数の産物を産生するステップ。
一実施形態において、方法は、以下のステップを含む：
ｉ．産業プロセスの結果として生成されるＣＯ含有ガスを、そのガスが大気中へ放出される前に捕獲するステップ；
ｉｉ．本発明の第１の態様の１つまたは複数の微生物を含有する培養物により、（一実施形態において、エタノールを含む）１つまたは複数の産物を産生するための、ＣＯ含有ガスの嫌気的発酵。
本発明の実施形態において、微生物によって発酵されるガス状基質は、ＣＯを含有するガス状基質である。ガス状基質は、産業プロセスの副産物として得られる、または自動車の排出ガスからなどのいくつかの他の源からのＣＯ含有廃ガスであってもよい。ある特定の実施形態において、産業プロセスは、鉄鋼などの鉄類製品製造、非鉄製品製造、石油精製プロセス、石炭ガス化、電力生産、カーボンブラック生産、アンモニア生産、天然ガス精製、メタノール生産、およびコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態において、ＣＯ含有ガスは、任意の便利な方法を用いて、それが大気中へ放出される前に産業プロセスから捕獲されてもよい。ＣＯは、合成ガス（一酸化炭素および水素を含むガス）の成分であってもよい。産業プロセスから生成されたＣＯは、通常、燃焼されて、ＣＯ２を生じ、それゆえに、本発明は、ＣＯ２温室効果ガス排出を低下させ、およびバイオ燃料として用いられるブタノールを生産することにおいて特別な有用性をもつ。ガス状ＣＯ含有基質の組成に依存して、それを発酵に導入する前に、ダスト粒子などの任意の望ましくない不純物を除去するようにそれを処理することも望ましい場合がある。例えば、ガス状基質は、知られた方法を用いて濾過され、または洗浄されてもよい。
細菌の増殖およびＣＯからエタノール（および／または他の産物（複数可））への発生ために、ＣＯ含有基質ガスに加えて、適切な液体栄養培地をバイオリアクタへ供給することが必要となることは認識されているであろう。基質および培地は、連続様式、バッチ様式、またはフェドバッチ様式でバイオリアクタへ供給されてもよい。栄養培地は、用いられる微生物の増殖を可能にするのに十分なビタミンおよびミネラルを含有する。ＣＯを用いてエタノール（および任意で、１つまたは複数の他の産物）を産生するための発酵に適した嫌気性培地は、当技術分野において知られている。例えば、適切な培地は、Biebel（Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology （2001）27、18〜26）に記載されている。基質および培地は、連続様式、バッチ様式、またはフェドバッチ様式でバイオリアクタへ供給されてもよい。本発明の一実施形態において、培地は、以下の実施例セクションに記載されている通りである。
発酵は、望ましくは、ＣＯからエタノール（および／または他の産物（複数可））への発酵が起こるのに適切な条件下で行われるべきである。考慮されるべきである反応条件には、圧力、温度、ガス流速、液体流速、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹拌速度（連続的撹拌槽型リアクタを用いる場合）、接種レベル、液相中のＣＯが限界にならないことを保証し得る最大ガス基質濃度、および産物阻害を避け得る最大産物濃度が挙げられる。
加えて、ＣＯが基質である場合、基質流のＣＯ濃度（またはガス状基質におけるＣＯ分圧）を増加させ、したがって、発酵反応の効率を増加させることは望ましいことが多い。増加した圧力において作動させることは、エタノール（および／または他の産物（複数可））の産生のための炭素源として微生物によってＣＯが取り込まれ得る場合、気相から液相へのＣＯ移行速度の有意な増加を可能にする。これは、次には、バイオリアクタが、大気圧よりむしろ上昇した圧力で維持される場合、保持時間（入力ガス流速で割られたバイオリアクタ中の液体体積として定義される）を低下させ得ることを意味する。最適な反応条件は、用いられる本発明の特定の微生物に一部、依存する。しかしながら、一般的に、発酵が、周囲圧力より高い圧力で実施されることが好ましい。また、所定のＣＯからエタノール（および／または他の産物（複数可））への変換速度は、一つには、基質保持時間の関数であり、望ましい保持時間を達成することは、次には、バイオリアクタの必要とされる容積を決定づけることになるため、加圧システムの使用は、必要とされるバイオリアクタの容積を大いに低下させ、その結果として、発酵設備の資本コストを低下させることができる。米国特許第５，５９３，８８６号に示された例により、リアクタ容積は、リアクタ作動圧力を増加させることに線形比例して、低下させることができ、すなわち、１０気圧の圧力で作動されるバイオリアクタは、１気圧の圧力で作動されるバイオリアクタの体積の１０分の１だけを必要とする。
上昇した圧力においてガスからエタノールへの発酵を行うことの利点は、他の所で記載されている。例えば、ＷＯ０２／０８４３８は、３０ｐｓｉｇおよび７５ｐｓｉｇの圧力下で実施されたガスからエタノールへの発酵が、それぞれ、１５０ｇ／ｌ／日および３６９ｇ／ｌ／日のエタノール生産性を与えることを記載している。しかしながら、周囲圧力において類似した培地および入力ガス組成を用いて実施された例の発酵は、１日あたり１リットルにつき、１０分の１から２０分の１の間のエタノールを生産することが見出された。
ＣＯ含有ガス状基質の導入速度が、液相中のＣＯ濃度が限界にならないことを保証するような速度であることも望ましい。これは、ＣＯ制限条件の結果が、エタノール産物が培養物によって消費されるという可能性があるためである。
発酵反応に供給するために用いられるガス流の組成は、その反応の効率および／またはコストに有意な影響を及ぼし得る。例えば、Ｏ２は、嫌気的発酵プロセスの効率を低下させ得る。発酵前または発酵後の発酵プロセスの段階における望まれない、または不必要なガスの処理は、そのような段階において負担を増加させ得る（例えば、ガス流が、バイオリアクタに入る前に圧縮される場合、発酵中に必要とされないガスを圧縮するために不必要なエネルギーが用いられる可能性がある）。したがって、望まれない成分を除去し、および望ましい成分の濃度を増加させるために、基質流、特に、産業発生源に由来した基質流を処理することが望ましい場合がある。
ある特定の実施形態において、本発明の細菌の培養物は、水性培地中で維持される。好ましくは、水性培地は、嫌気性微生物増殖最少培地である。適切な培地は当技術分野において知られており、例えば、米国特許第５，１７３，４２９号および第５，５９３，８８６号、ならびにＷＯ０２／０８４３８に記載され、以下の実施例セクションに記載されている通りである。
本発明の方法によって産生される１つまたは複数の産物（一実施形態において、エタノール、またはエタノールおよび／もしくは１つもしくは複数の他の産物を含有する混合アルコール流）は、分別蒸留または蒸発、浸透気化法、および例えば液−液抽出を含む、抽出発酵などの当技術分野において知られた方法によって発酵ブロスから回収されてもよい。アセテートを含む酸などの副産物もまた、当技術分野において知られた方法を用いて発酵ブロスから回収されてもよい。例えば、活性炭フィルターまたは電気透析を含む吸着系が用いられてもよい。あるいは、連続ガスストリッピングもまた用いられてもよい。
本発明のある特定の好ましい実施形態において、エタノールおよび／または１つもしくは複数の他の産物は、バイオリアクタからブロスの一部を連続的に取り除き、ブロスから微生物細胞を（便利には、濾過により）分離し、ブロスから１つまたは複数の産物を回収することにより、発酵ブロスから回収される。アルコールは、便利には、例えば、蒸留により回収されてもよく、酸は、例えば、活性炭上への吸着により回収されてもよい。分離された微生物細胞は、好ましくは、発酵バイオリアクタへ戻される。いかなるアルコール（複数可）も酸（複数可）も除去された後、残留する、細胞を含まない透過物もまた、好ましくは、発酵バイオリアクタへ戻される。細胞を含まない透過物に、それがバイオリアクタへ戻される前に、追加の栄養分（例えば、ビタミンＢ）が、栄養培地を補充するために加えられてもよい。
また、ブロスのｐＨが、酢酸の活性炭への吸着を増強するために上記のように調整された場合、そのｐＨは、バイオリアクタへ戻される前に、発酵バイオリアクタ内のブロスのｐＨと類似したｐＨに再調整されるべきである。
スクシネートは、酸性化、イオン交換クロマトグラフィと組み合わされた電気透析（SongおよびLee、2006、Enzyme Microb Technol 39、352〜361）、濾過および硫酸の添加と組み合わされたＣａ（ＯＨ）２での沈殿（Leeら、2008、Appl Microbiol Biotechnol 79、11〜22）、またはトリ−ｎ−オクチルアミンなどのアミンに基づいた抽出剤での反応性抽出（Huhら、2006、Proc Biochem 41、1461〜1465）などのいくつかの技術を用いて発酵ブロスから回収することができる。全ての方法について、遊離酸の形をもち、塩の形ではないことは重要である。しかしながら、コハク酸についてのほとんどのバイオテクノロジー的産生プロセスは、ｐＨ６〜７の中性または弱酸性の範囲で作動する。コハク酸のｐＫａ（ｐＫａ＝４．１６および５．６１）を考慮すれば、大部分は、これらの条件下で、塩として存在し、遊離酸として存在しない。しかしながら、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）および一酸化炭素資化性アセトゲンは、ｐＨ４〜６の望ましい低いｐＨ範囲において耐え、および増殖することが知られている。
分岐鎖アミノ酸のバリン、ロイシン、およびイソロイシンは、バイオマスの濃縮（例えば、逆浸透法）および結晶化または除去（例えば、限界濾過または遠心分離）、ならびにイオン交換クロマトグラフィ（Ikeda, A.、2003、Amino Acid Production Processes、R. FaurieおよびJ. Thommel（編）Microbial production of L-amin acids、1〜35）により発酵ブロスから比較的容易に回収することができる。
ラクテート、ホルメート、２−オキソグルタレート、および他の産物は、任意の知られた方法により発酵ブロスから回収することができる。しかしながら、例として、ラクテートの場合、通常の発酵プロセスは、乳酸カルシウム沈殿物を生じ、それは、収集され、再酸化され得る。あるいは、電気透析などの膜技術は、ラクテートを分離するように遂行することができる。低濃度のラクテートは、選択的イオン透過性膜にわたって適切な電位をかけることにより、発酵ブロスから分離することができる。他の適切な技術には、ナノ濾過が挙げられ、その場合、一価イオンが、加圧下で膜を選択的に通過することができる。
いくつかの状況において、方法が、エタノール以外の産物（例えば、バリン、ロイシン、スクシネート、ピルベート、ラクテート、およびホルメートを含む１つまたは複数の産物）を産生し、および回収するために実施され得ることは認識されているであろう。したがって、本発明は、これらの産物のうちの１つまたは複数の産生のための方法を含むと理解されるべきである。
実施例
本発明は、これから、以下の非限定的例を参照してより詳細に記載される。
相同組換えによるＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ｂｕｄＡ遺伝子の除去
Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３のｂｕｄＡ遺伝子の５’相同アームおよび３’相同アームを含有するプラスミドを用いて遺伝子改変を行った（図１〜２）。このプラスミドを、新規なメチルトランスフェラーゼを用いてインビボでメチル化し、その後、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３（ＤＳＭＺ、Ｇｅｒｍａｎｙ）へ形質転換した。ｂｕｄＡ遺伝子ノックアウトは、ＰＣＲにより、およびＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ΔｂｕｄＡ株における２，３−ブタンジオール産生の阻害によって示されている。
発現プラスミドの構築：
標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を本発明に用い、それは、Sambrookら、1989およびAusubelら、1987によって記載されている。クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridum autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３のｂｕｄＡ遺伝子の５’上流隣接相同アーム（配列番号３）および３’下流隣接相同アーム（配列番号４）のＤＮＡ配列を、ＮＣＢＩから入手した。
クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridum autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３由来のゲノムＤＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＰｕｒｅｌｉｎｋゲノムＤＮＡミニキットを用いて、製造会社の使用説明書に従って、単離した。
５’隣接相同アーム（配列番号３）および３’隣接相同アーム（配列番号４）を、鋳型としてクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridum autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ゲノムＤＮＡ、ｉＰｒｏｏｆ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ）、および以下のプログラムを用いて、表１におけるオリゴヌクレオチドでのＰＣＲによって増幅した：９８℃で３０秒間の最初の変性、続いて、最後のエクステンションステップ（７２℃で７分間）前の、変性（９８℃で１０秒間）、アニーリング（６０℃で１５秒間）、および伸長（７２℃で３０秒間）の２５サイクル。
ｂｕｄＡ遺伝子の増幅された９６４ｂｐの５’隣接相同アーム（５’ＨＡ）を、ＳｂｆＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で切断し、ＳｂｆＩおよびＮｏｔＩ制限部位ならびに大腸菌（E. coli）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’Ｋａｎ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、大腸菌（E. coli）−クロストリジウム（Clostridium）シャトルベクターｐＭＴＬ ８５１４１（配列番号９；ＦＪ７９７６５１．１；Ｎｉｇｅｌ Ｍｉｎｔｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；Heapら、2009）へクローニングした。作製されたプラスミドｐＭＴＬ８５１４１−ｂｕｄＡ−５’ＨＡ、およびｂｕｄＡ遺伝子の３’相同アームの９７７ｂｐ ＰＣＲ産物をどちらも、ＮｈｅＩおよびＡｓｃＩで切断した。これらの消化されたＤＮＡ断片のライゲーションを、大腸菌（E. coli）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’Ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へ形質転換し、プラスミドｐＭＴＬ８５１４１−ｂｕｄＡ−ｋｏが生じた。生じたプラスミドｐＭＴＬ８５１４１−ｂｕｄＡ−ｋｏ（配列番号１２）における挿入断片を、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いて完全にシーケンシングし、シーケンシング結果により、５’相同アームおよび３’相同アームの両方が突然変異を含まないことが確認された。
ＤＮＡのメチル化：
誘導性ｌａｃプロモータに融合したハイブリッドメチルトランスフェラーゼ遺伝子（配列番号３１）を、米国特許出願第１３／０４９，２６３号に記載されているように、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）、およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）由来のメチルトランスフェラーゼ遺伝子のアラインメントにより設計した。メチルトランスフェラーゼの発現は、配列番号３２の配列を有するタンパク質を生じる。ハイブリッドメチルトランスフェラーゼ遺伝子を化学合成し、ＥｃｏＲＩを用いて、ベクターｐＧＳ２０（ＡＴＧ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍｅｒｚｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ − 配列番号３３）へクローニングした。生じたメチル化プラスミドｐＧＳ２０−メチルトランスフェラーゼを、プラスミドｐＭＴＬ８５１４１−ｂｕｄＡ−ｋｏと共に、制限ネガティブ大腸菌（E. coli）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’Ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へ二重形質転換した。インビボメチル化を、１ｍＭ ＩＰＴＧの添加により誘導し、メチル化プラスミドを、Ｚｙｍｏ ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を用いて単離した。生じたメチル化プラスミド組成物を、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の形質転換のために用いた。
形質転換：
完全形質転換実験中、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３を、Hungate（1969）およびWolfe（1971）によって記載された標準嫌気性技術を用いて、還元剤の存在下で、および３０ｐｓｉ鉄鋼廃ガス（Ｇｌｅｎｂｒｏｏｋ、ＮＺにおけるＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｓｔｅｅｌ敷地から収集された；組成：４４％ＣＯ、３２％Ｎ２、２２％ＣＯ２、２％Ｈ２）と共に、ＹＴＦ培地（表２）中、３７℃で増殖させた。
コンピテント細胞を作製するために、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の５０ｍｌの培養物を、新鮮なＹＴＦ培地へ５日間連続、継代培養した。これらの細胞を用いて、４０ｍＭ ＤＬ−スレオニンを含有する５０ｍｌ ＹＴＦ培地に０．０５のＯＤ６００ｎｍで接種した。培養が、０．５のＯＤ６００ｎｍに達した時、細胞を氷上、３０分間、インキュベートし、その後、嫌気性チャンバーへ移し、４，７００ｘｇおよび４℃で収集した。培養物を、氷冷エレクトロポレーション緩衝液（２７０ｍＭスクロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、７ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で２回、洗浄し、最後に、６００μｌの体積の新鮮なエレクトロポレーション緩衝液中に懸濁させた。この混合物を、あらかじめ冷却されたエレクトロポレーションキュベット中へ、２μｇのメチル化プラスミド混合物および１μｌ Ｔｙｐｅ １制限阻害剤（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する０．４ｃｍ電極ギャップと共に移し、すぐに、Ｇｅｎｅ ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌエレクトロポレーションシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を以下の設定：２．５ｋＶ、６００Ω、および２５μＦで用いて、パルスを加えた。３．７〜４．０ｍｓの時定数が達成された。培養物を、５ｍｌの新鮮なＹＴＦ培地へ移した。細胞の再生を、チューブホルダーを備えたＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｈｅｌｉｏｓ Ｅｐｓｉｌｏｎ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、６００ｎｍの波長でモニターした。バイオマスにおける初期の減少後、細胞は再び、増殖し始めた。バイオマスがそのポイントから倍加した時点で、約２００μｌの培養物を、ＹＴＦ−寒天プレート、および５ｇ／ｌフルクトースを含有するＰＥＴＣ寒天プレート（表３）上に広げた（どちらも１．２％Ｂａｃｔｏ（商標）寒天（ＢＤ）および１５μｇ／ｍｌチアンフェニコールを含有する）。３７℃での３０ｐｓｉ鉄鋼ガスとの３〜４日間のインキュベーション後、プレートあたり５００個のコロニーが視覚的に明らかであった。
５ｇ／Ｌフルクトースおよび１５μｇ／ｍｌチアンフェニコールもまた含有する新鮮なＰＥＴＣ寒天プレート上にコロニーを画線した。３７℃での３０ｐｓｉ鉄鋼ガスと共の２日間のインキュベーション後、これらのプレート由来の単一コロニーを、５ｇ／ｌフルクトースのみを含有する新鮮な非選択性ＰＥＴＣ寒天プレート上に、再び画線した。５ｇ／ｌフルクトースを含むＰＥＴＣ寒天プレート上での再画線を、もう一度繰り返し、プレートを３７℃で３０ｐｓｉ鉄鋼ガスと共にインキュベートした。３日後、非選択性培地上で増殖した６個の単一コロニーを、５ｇ／ｌフルクトースを含有する２ｍｌのＰＥＴＣ液体培地中に接種した。増殖が起きると、培養物を、逐次的に、炭素源として５ｇ／ｌフルクトースおよび３０ｐｓｉ鉄鋼ガスを含有する５ｍｌ、２５ｍｌ、およびその後、５０ｍｌのＰＥＴＣ培地へスケールアップした。
成功した形質転換の高次構造：
Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）：６個のクローンのアイデンティティおよびＤＮＡトランスファーを検証するために、Ｐｕｒｅｌｉｎｋ（商標）ゲノムＤＮＡミニキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造会社の使用説明書に従って、ＰＥＴＣ液体培地中の全ての６個のコロニー／クローンからゲノムＤＮＡを単離した。Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３野生型のゲノムＤＮＡと共にこれらのゲノムＤＮＡをＰＣＲにおける鋳型として用いた。ＰＣＲを、ｉｐｒｏｏｆ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ）、表４に列挙されているようなプライマー、および以下のプログラムを用いて実施した：９８℃で２分間の最初の変性、続いて、最後のエクステンションステップ（７２℃で７分間）前の、変性（９８℃で１０秒間）、アニーリング（６１℃で１５秒間）、および伸長（７２℃で９０秒間）の２５サイクル。野生型Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３由来のゲノムＤＮＡを、対照ＰＣＲにおける鋳型として用いた。
６個のクローンのアイデンティティを確認するために、ＰＣＲを、ｆＤ１（配列番号２７）およびｒＰ２（配列番号２８）を用いて１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対して、上記のようなＰＣＲ条件を用いて実施した。ＰＣＲ産物を、Ｚｙｍｏ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）キットを用いて精製し、プライマーｒＰ２（配列番号２８）を用いてシーケンシングした。全ての６個のクローンの配列（配列番号１３〜１９）は、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（配列番号１５；Ｙ１８１７８、ＧＩ：７２７１１０９）に対して少なくとも９０％同一性を示した。
プライマーＯｇ０９ｆ（配列番号５）およびＯｇ１２ｒ（配列番号８）を用いた、ｂｕｄＡターゲット領域に特異的なプライマーでの６個の分析されたクローンのＰＣＲは、６個のクローンのうち５個から２．２ｋｂのＤＮＡ断片の増幅を生じた。野生型Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ゲノムＤＮＡに関して２．７ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。可能性のあるｂｕｄＡノックアウトクローン由来の２．２ｋｂ ＰＣＲ産物のアイデンティティを、表５に列挙されたプライマーでのシーケンシング（配列番号２０〜２６）により確認し、ｂｕｄＡ遺伝子の配列がこれらの断片において検出されなかった。ｌａｃＺ ＤＮＡ断片がｂｕｄＡ遺伝子に取って代わっていた。これらの６個のクローンにおけるｂｕｄＡ遺伝子の非存在を、（野生型Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３からのみ増幅される）Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ｂｕｄＡ遺伝子の２７５ｂｐ内部領域に特異的なプライマーＯｇ４４ｆ（配列番号２９）およびＯｇ４５ｒ（配列番号３０）でのＰＣＲにより再び、確認した。
２，３−ブタンジオール産生の欠如およびエタノール収量の増加
アセトインおよびその後の２，３−ブタンジオール産生の欠損を実証するために、血清ボトル実験（serum bottle experiments）を、鉄鋼廃ガス（組成、４４％ＣＯ、３２％Ｎ２、２２％ＣＯ２、および２％Ｈ２；Ｇｌｅｎｂｒｏｏｋ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄにおける鉄鋼産業敷地から収集された）および上記のようなＰＥＴＣ培地を用いてクローン１に関して三連で行った。Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の非改変野生株を、対照として同じ条件下で増殖させた。
代謝産物の分析を、３５℃で操作されるＲＩＤ（屈折率検出器）および３２℃に保持されるＡｌｌｔｅｃｈ ＩＯＡ−２０００有機酸カラム（１５０×６．５ｍｍ、粒子サイズ５μｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣシステムを用いるＨＰＬＣにより実施した。弱酸性水（０．００５Ｍ Ｈ２ＳＯ４）を、移動相として０．２５ｍｌ／分の流速で用いた。タンパク質および他の細胞残渣を除去するために、４００μｌの試料を、１００μｌの２％（ｗ／ｖ）５−スルホサリチル酸と混合し、１４，０００ｘｇで３分間、遠心分離して、沈殿した残留物を分離した。その後、１０μｌの上清を、分析のためにＨＰＬＣへ注入した。
ΔｂｕｄＡ Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３クローン１および非改変野生型Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３に関しての血清ボトル実験の結果は、表５に示されている。ΔｂｕｄＡ Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３株の最大バイオマスは、０．５８のＯＤ６００ｎｍまで増殖した非改変野生型より、相対的に低い０．３２のＯＤ６００ｎｍを有した。野生型と比較して、ΔｂｕｄＡ Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３クローン１の培養物において２，３−ブタンジオールは検出されず、エタノール収量は、ΔｂｕｄＡ Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３クローン１において、非改変Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３においてより有意に高かった（表５）。
他の代謝産物 − ラクテート、ホルメート、スクシネート、２−オキソグルタレート、バリン、ロイシン、イソロイシンの産生：
同時に、興味深いことに、非改変Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３は、他の副産物として０．０２ｇ／ｌの乳酸のみを産生したが、ΔｂｕｄＡ Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３は、有意により高い量の乳酸０．０７ｇ／ｌ（バイオマスに対して標準化された０．１９７ｇ／ｌ）、加えて、０．５３ｇ／ｌ（バイオマスに対して標準化された１．６４７ｇ／ｌ）のギ酸、および０．１３ｇ／ｌ（バイオマスに対して標準化された０．３４４ｇ／ｌ）のコハク酸を産生した（表５）。この増加は、２，３−ブタンジオールの産生をブロックしているｂｕｄＡ遺伝子のノックアウトのせいによる、２，３−ブタンジオールの初期の前駆体であるピルベート（図１）からの蓄積である可能性が高い。
ΔｂｕｄＡ Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３によるスクシネートおよびラクテートの産生をまた、ガスクロマトグラフィ−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）によって確認した。これについて、０．３２の光学密度における、鉄鋼廃ガス（組成、４４％ＣＯ、３２％Ｎ２、２２％ＣＯ２、および２％Ｈ２；Ｇｌｅｎｂｒｏｏｋ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄにおける鉄鋼産業敷地から収集された）と共に増殖したΔｂｕｄＡ Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３クローン１の約２．５ｍｌの培養物を遠心分離し、上清を０．２ｕＭフィルターを通して濾過した(Smart KF、Aggio RB、Van Houtte JR、Villas-Boas SG、Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry、Nat Protoc. 2010年9月；5(10)：1709〜29、2010)。野生型Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の約０．６５ｍｌの培養物および２．５ｍｌの培地ブランクを同様に処理した。試料を凍結乾燥し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＡｕｃｋｌａｎｄにおいてＧＣ−ＭＳにより三連で分析した。表６に見られるように、スクシネートおよびラクテートのシグナルのピーク強度は、非改変Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３および対照培地ブランクと比較して、ΔｂｕｄＡ Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３クローン１においてより強かった。スクシネートおよびラクテートについてのＧＣ−ＭＳ結果は、ＨＰＬＣ結果と一致している。
ＧＣ−ＭＳ結果（表６）は、ΔｂｕｄＡ Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３クローン１に関してラクテートおよびスクシネートの産生を確認しただけではなく、スクシネート以外の他の不完全ＴＣＡサイクルの最終産物である２−オキソグルタレート、および分岐鎖アミノ酸のバリン、ロイシン、イソロイシン（ΔｂｕｄＡ Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）株において上昇したレベルで存在する可能性が高い、２，３−ブタンジオールの前駆体である、ピルベートおよびアセトラクテートから産生される）の産生も示している。マレート、フマレート、シトレート、シス−アコニテート、イソ−シトレートなどのＴＣＡサイクル中間体を試験していないが、最終産物のスクシネートおよび２−オキソグルタレートが産生されていることが見出されているため、上昇している可能性が高い（図１ｂ）。
アセトインおよび２，３−ブタンジオールの産生は、通常、強いピルビン酸の脱酸と関連しており（Xiao, Z.およびP. Xu. 2007. Acetoin metabolism in bacteria. Crit. Rev. Biochem. Microbiol. 33：127〜140）、そのピルビン酸は、エネルギー変換に必要とされる内部ｐＨおよびプロトン勾配を破壊することにより、細胞に深刻な脅威をもたらし得る。アセトインおよび２，３−ブタンジオールのどちらもｐＨ中性化合物である。２，３−ブタンジオールの産生はまた、発酵プロセス中に生成される過剰な還元当量をオフロードするための電子シンク（electron sink）としての役割を果たす。
いかなる特定の理論によっても縛られることを望まないが、本発明者らは、アセトインおよび２，３−ブタンジオールの産生をノックアウトすることにより、細胞が、ピルビン酸（ｐＫａ＝２．５０）を脱酸し、および還元当量をオフロードするための他の方法を見出す必要があり、それに伴って、分岐鎖アミノ酸のバリン、ロイシン、またはイソロイシン、スクシネート（ｐＫａ１＝４．２０、ｐＫａ２＝５．６０）、乳酸（ｐＫａ＝３．８６）、およびギ酸（ｐｋａ＝３．７７）などの他の（新規の）産物の産生へそれの代謝をシフトしていると考える。コハク酸の産生はまた、４還元当量をオフロードする機会を与え、一方、２還元当量は、乳酸の産生によってオフロードすることができる。
スクシネート経路
スクシネートの産生のための経路は図１ｂに記載されている。それぞれの遺伝子を、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）において同定し、酵素活性を実証した。
第１のステップにおいて、ピルベートは、リンゴ酸酵素によって直接的に触媒されるか、またはリンゴ酸デヒドロゲナーゼによって触媒されたオキザロアセテートを経由してかのいずれかで、マレートへ変換される。オキザロアセテート（ＯＡＡ）は、ピルビン酸カルボキシラーゼの作用により、またはピルビン酸リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）およびホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）によって触媒される２ステップの変換においてホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を経由して、ピルベートから産生され得る。マレートは、その後、フマル酸ヒドラターゼおよびフマル酸レダクターゼにより触媒される２ステッププロセスにおいてスクシネートへ変換される。それぞれの遺伝子をＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）において同定し、相同遺伝子が、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のような他の一酸化炭素資化性アセトゲンにおいて存在している（表７）。
酵素活性のアッセイ：
細胞（クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum））を、嫌気性増殖の対数期において収集した。培養物（Ａ６００ 約０．４５）を８０００ｘｇ、４℃で１０分間、ペレット化した。上清を捨て、ペレットを、洗浄緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ｐＨ６．５、４℃）において２回、洗浄した。最後に、ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有する洗浄緩衝液中に再懸濁し、１．４４ｇのジルコニアビーズ（Ａｍｂｉｏｎ ＲｉｂｏＰｕｒｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｋｉｔ）と混合した。サイクル間に氷上での１分間を挟む、１分間の３２００ｒｐｍでのビーティングの５サイクルを通しての、ボルテックスアダプタを有するボルテックスミキサー（Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ ２、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）における破壊の前に、チューブを氷上で５分間、冷却した。溶解後、試料を遠心分離し（１３，０００ｘｇ、４℃、１０分間）、上清を分注し、分析まで−８０℃で保存した。
全てのアッセイは、１ｃｍのパス長を有するキュベット中の嫌気性条件下でのＮＡＤＨのＮＡＤへの酸化（ε＝６．２ｍＭ−１ｃｍ−１）に基づいた。少なくとも２回の独立した細胞抽出の３回の反復試験から酵素活性を得た。抽出物のタンパク質含有量を、市販のキット（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて決定した。酵素活性の１ユニットを、１ナノモルの基質を、１ｍｇの総タンパク質あたり１分につき、産物へ変換することができる酵素の量として定義した。
リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性を、還元型ピリジンヌクレオチドのオキザロアセテート（ＯＡＡ）での酸化を追跡することにより分光光度的に測定した（Sridhar J.ら、2000、Elucidation of enzymes in fermentation pathways used by Clostridium thermosuccinogenes growing on inulin. Appl. Environ. Microbiol. 66、246〜51）。反応混合物は以下を含有した：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ６．５、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ、５ｍＭフマレート、０．３ｍＭ ＮＡＤＨ、および無細胞抽出物。反応を、ＯＡＡの添加により開始し、室温でモニターした。クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）の無細胞抽出物におけるこの酵素の特異的活性を、１６０±１７ｎｍｏｌ分−１ｍｇタンパク質−１として測定した。この活性は、３７℃で測定されたクロストリジウム・サーモスクシノゲネス（Clostridium thermosuccinogenes）に見出されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Sridhar J.ら、2000、Elucidation of enzymes in fermentation pathways used by Clostridium thermosuccinogenes growing on inulin. Appl. Environ. Microbiol. 66、246〜51）に匹敵した。
フマル酸レダクターゼの活性を、フマレートのスクシネートへの変換に基づいて測定した（Sridhar J.ら、2000、Elucidation of enzymes in fermentation pathways used by Clostridium thermosuccinogenes growing on inulin. Appl. Environ. Microbiol. 66、246〜51)。反応混合物は、以下を含有した：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ６．５、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ、５ｍＭフマレート、および無細胞抽出物。反応を、フマレートの添加により開始し、室温でモニターした。クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）の無細胞抽出物におけるこの酵素の特異的活性を、１７．３±１．３ｎｍｏｌ分−１ｍｇタンパク質−１として測定した。
アッセイにより、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）がリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性、フマル酸レダクターゼ／コハク酸デヒドロゲナーゼを有することが確認された。
本明細書に記載されているように、本発明は、一酸化炭素を含む基質の微生物発酵によるエタノールの産生の増加を可能にする微生物および方法を提供する。それはまた、スクシネートの産生も提供する。アセトゲン、ましてや一酸化炭素資化性アセトゲンによるスクシネートの産生の報告は以前には存在していない。微生物発酵によるスクシネートを産生する可能性は、現在の石油化学製造方法を超えるいくつかの利点を有する可能性がある。その微生物はまた、酢酸産生微生物による発酵の産物として以前には記載されていない、ホルメートおよび分岐鎖アミノ酸も産生する。
スクシネートは、１，４−ブタンジオール、テトラヒドロフラン、γ−ブチロラクトン、エチレンジアミンジスクシネート、ジエチルスクシネート、およびアジピン酸を含むいくつかの工業化学物質の産生のためのバルクプラットフォーム化学物質として用いられる。ホルメートは、動物性食品の保存において、および革なめし処理において、加えて、紙パルプ工業における漂白液として用いられる。分岐鎖アミノ酸は、工業バイオテクノロジーにおいていくつかの用途がある。
本発明の微生物はまた、１つまたは複数の他の産物を産生する。これらの産物の用途は、本明細書における他のところで記載されている。
Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３における２，３−ＢＤＯ生合成に関与する遺伝子のグループＩＩイントロンに基づいた挿入不活性化
ｂｕｄＡおよび２，３ｂｄｈ遺伝子をターゲットするＣｌｏｓＴｒｏｎ構築物の設計および構築：
Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３における２，３−ブタンジオール産生に関与するアセト乳酸デカルボキシラーゼ（ｂｕｄＡ）遺伝子および２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（２，３−ｂｄｈ）遺伝子を、ＣｌｏｓＴｒｏｎ グループＩＩイントロン媒介性遺伝子破壊ツールを用いて不活性化した（Heapら、2010）。ＣｌｏｓＴｒｏｎ．ｃｏｍにおいて提供されるＰｅｒｕｔｋａアルゴリズムを用いて、ｂｕｄＡ遺伝子および２，３−ｂｄｈ遺伝子のセンス鎖、それぞれにおいて塩基４５０／４５１の間および４６８／４６９の間にグループＩＩイントロンターゲット部位を同定した。同じアルゴリズムを用いて、ＤＮＡ２．０によって商業的に合成され、およびｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５ベクターにおいて送達されるイントロンターゲティング領域（配列番号８２および８３）を設計した。最終ベクター、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５−ｂｕｄＡ−４５０！４５１ｓおよびｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５−２，３ｂｄｈ−４６８！４６９ｓは、ターゲット部位への挿入により抗生物質クラリスロマイシンに対する抵抗性を与えるレトロ転位活性化ｅｒｍＢマーカー（ＲＡＭ）を含有する。
ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５−ｂｕｄＡ−４５０！４５１ｓプラスミドおよびｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５−２，３ｂｄｈ−４６８！４６９ｓプラスミドを、ドナーとしてのドナー大腸菌（E. coli）ＣＡ４３４株と接合することにより、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３へ導入した。簡単に述べれば、ドナー株は、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを追加したＬＢ培地において一晩、増殖させた。１．５ｍｌ培養物からの細胞を収集し、リン酸緩衝食塩水中で洗浄した。ドナー細胞ペレットを、指数関数的に増殖したレシピエントＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の２００μｌの培養物中に再懸濁した。その混合物を、フルクトースを追加したＰＥＴＣ寒天培地上にスポットし、加圧ガスジャーにおいて３７℃でインキュベートした。２４時間後、細胞を掻爬し、５００μｌ ＰＥＴＣブロス中に再懸濁し、１５μｇ／ｍｌチアンフェニコール（Ｓｉｇｍａ）および１０μｇ／ｍｌトリメトプリム（Ｓｉｇｍａ）を追加したＰＥＴＣ寒天培地上に広げた。Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）接合完了体を、１５μｇ／ｍｌチアンフェニコールを用いて選択し、大腸菌（E. coli）ＣＡ４３４株を、１０μｇ／ｍｌトリメトプリムを用いて対抗選択した。加圧ガスジャーにおける３７℃での３日間のインキュベーション後、コロニーを観察した。
単一コロニーの画線を、まず、１５μｇ／ｍｌチアンフェニコールおよび１０μｇ／ｍｌトリメトプリムを含有するＰＥＴＣ−ＭＥＳ培地上に、その後、５μｇ／ｍｌクラリスロマイシンを含有するＰＥＴＣ培地での寒天プレート上に、逐次的に行った。プラスミドあたり４個のコロニーを、ｂｕｄＡ遺伝子におけるグループＩＩイントロン挿入部位に隣接するプライマーＯｇ４４ｆ（配列番号２９）およびＯｇ４５ｒ（配列番号３０）、ならびに２，３−ｂｄｈ遺伝子におけるグループＩＩイントロン挿入部位に隣接するプライマーＯｇ４２ｆ（配列番号８４）およびＯｇ４３ｒ（配列番号８５）を用いるＰＣＲにより、グループＩＩイントロン挿入についてランダムにスクリーニングした。Ｍａｘｉｍｅ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘキットをＰＣＲのために用いた。１６ｓ ｒＤＮＡもまた、プライマーｆＤ１（配列番号２７）およびｒＰ２（配列番号２８）ならびにＭａｘｉｍｅ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘキットを用いてＰＣＲ増幅した。
ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩ挿入不活性化ツールを用いたｂｕｄＡおよび２，３ｂｄｈ遺伝子破壊の確認：
プライマーＯｇ４４ｆ／Ｏｇ４５ｒおよびＯｇ４２ｆ／Ｏｆ４３ｒでの２７３ｂｐおよび３７５ｂｐのＰＣＲ産物の増幅は、非改変野生型ｂｕｄＡ遺伝子および２，３−ｂｄｈ遺伝子をそれぞれ、示している。同じプライマーセットを用いた約２ｋｂのＰＣＲ産物の増幅は、ターゲット遺伝子におけるＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロンの挿入を示している。ｂｕｄＡ遺伝子をターゲットしたクローンの場合、クローン１およびクローン３は、予想されたサイズのバンドを有した。クローン４は、野生型遺伝子と破壊された遺伝子の両方での混合物であるように思われる（図６）。２，３−ｂｄｈ遺伝子についてターゲットされた全ての４個のクローンは、約２ｋｂ ＰＣＲ産物の増幅によって見られるように、遺伝子破壊についてポジティブであるように見える（図６）。これらの結果により、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３におけるｂｕｄＡ遺伝子および２，３−ｂｄｈ遺伝子の破壊が確認されている。
Δ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎの、クローン２の１６ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ産物（配列番号８６および８７）およびクローン４の１６ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ産物（配列番号８８および８９）、ならびにΔｂｕｄＡ ＣｌｏｓＴｒｏｎの、クローン１の１６ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ産物（配列番号９０および９１）およびクローン３の１６ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ産物（配列番号９２および９３）を、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３のものであることを配列確認した。
このように、本発明者らは、２つの異なるアプローチ − （ｉ）相同組換えによる遺伝子ノックアウトおよび（ｉｉ）グループＩＩイントロンに基づいた挿入不活性化ツールを用いる遺伝子破壊を用いて、酢酸産生Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３における、ターゲットされた遺伝子の破壊を実証している。
２，３ＢＤＯ産生についてのΔｂｕｄＡ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体およびΔ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体の研究：
血清ボトルにおいて増殖したΔｂｕｄＡ突然変異体およびΔ２，３ｂｄｈ突然変異体からの代謝産物を、（先に説明されているように）ＨＰＬＣによって分析した。ΔｂｕｄＡノックアウト突然変異体のようにΔｂｕｄＡ Ｃｌｏｓｔｒｏｎ突然変異体は、２，３−ＢＤＯを産生しなかった（表８）。Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）における２つの異なる方法によるｂｕｄＡ遺伝子の破壊は、２，３−ＢＤＯ生合成におけるｂｕｄＡ遺伝子の役割を確認している。
Δ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体は、まだなお２，３−ＢＤＯを産生し（表８）、アセトインを２，３−ＢＤＯへ変換することにおける第２の遺伝子の関与を示した。
Yanらは、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）および３つの他の生物体由来の第二級アルコールデヒドロゲナーゼもまた、アセトインを２，３−ＢＤＯへ変換することができることを示している（Yan. LeeおよびLiao、2009）。類似した第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（ＳｅｃＡｄｈ）遺伝子は、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３（配列番号３４および３５）、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）（配列番号３６）、およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）（配列番号３７）に見出される。
Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３における２，３−ｂｄｈ遺伝子の非存在下において、ＳｅｃＡｄｈが、アセトインを２，３−ＢＤＯへ変換する可能性が最も高い。
アセトインを２，３−ＢＤＯへ変換することにおける第２のデヒドロゲナーゼの役割：
アセトインを２，３−ＢＤＯへ変換することにおける第２の遺伝子の役割を試験するために、野生型Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３およびΔ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体に、発酵実験において１０ｇ／Ｌアセトインを供給した。
野生型およびΔ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体での発酵：
発酵を、３７℃、１．５Ｌバイオリアクタ内で、下記のように、ＣＯ含有鉄鋼ガスが唯一のエネルギーおよび炭素源として、行った。１リットルあたりＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２（０．５ｍＭ）、ＫＣｌ（２ｍＭ）、Ｈ３ＰＯ４（５ｍＭ）、Ｆｅ（１００μＭ）、Ｎｉ、Ｚｎ（５μＭ）、Ｍｎ、Ｂ、Ｗ、Ｍｏ、Ｓｅ（２μＭ）を含有する限定培地を培養増殖に用いた。その培地を、バイオリアクタへ移し、１２１℃で４５分間、オートクレーブした。オートクレーブ後、培地に、チアミン、パントテネート（０．０５ｍｇ）、ビオチン（０．０２ｍｇ）を追加し、３ｍＭシステイン−ＨＣｌで還元した。嫌気性を達成するために、リアクタ容器に、０．２μｍフィルターを通して窒素を散布した。接種前、ガスを、ＣＯ含有鉄鋼ガスへ切り替え、リアクタへ連続的に供給した。供給ガスの組成は、２％Ｈ２、４２％ＣＯ、２０％ＣＯ２、３６％Ｎ２であった。培養物のｐＨを、５から５．２の間に維持した。ガス流を、最初、８０ｍｌ／分に設定し、対数期の中間期の間、２００ｍｌ／分まで増加させ、同時に、撹拌を２００ｒｐｍから３５０ｒｐｍまで増加させた。Ｎａ２Ｓを、０．２５ｍｌ／時でバイオリアクタへ投与した。ＯＤ６００が０．５に達するとすぐに、バイオリアクタを、１．０ｍｌ／分の速度（希釈速度０．９６ｄ−１）での連続様式へ切り替えた。増殖が安定したとき、リアクタを、１０ｇ／Ｌアセトインのラセミ混合物でスパイクした。培地試料を採取して、バイオマスおよび代謝産物をＨＰＬＣによって測定した。
代謝産物を、アセトインの消失まで定期的にＨＰＬＣにより分析した。野生型Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３は、１時間未満内に、全アセトインをメソ−ＢＤＯおよび２，３−ＢＤＯへ変換した（図７）。アセトインのメソ−ＢＤＯおよび２，３−ＢＤＯへの変換速度は、Δ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体において相対的に遅かった。Δ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体は、２時間を超えて、１０ｇ／Ｌアセトインを還元した。これらの結果は、より遅い速度ではあるが、２，３ｂｄｈ遺伝子の破壊を補うことにおける第２のデヒドロゲナーゼの役割を示している。
アセトインのみを産生する改変Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３株
アセトインのエタノールからの工業的分離は、それの下流産物である２，３−ＢＤＯと比較して、技術的に、より実行可能である。したがって、アセトインを産生し、およびそれの還元型２，３−ＢＤＯを産生しないＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）株を有することは望ましい。Δ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体はまだなお、２，３−ＢＤＯを産生するため、２，３ｂｄｈ遺伝子およびＳｅｃＡｄｈ遺伝子の両方が破壊されているＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３株を有することが望ましい。これは、実施例１および実施例３に説明されているような２つの方法、（ａ）相同組換えおよび（ｂ）ＣｌｏｓＴｒｏｎツールを用いるマーカーレス遺伝子破壊によって達成することができる。
（ａ）相同組換えによるΔ２，３ｂｄｈ ΔＳｅｃＡｄｈ二重ノックアウトＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３株：
２，３ｂｄｈ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号９４）および３’相同アーム（配列番号９５）を、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーＯｇ１３ｆ（配列番号９６）／Ｏｇ１４ｒ（配列番号９７）およびＯｇ１５ｆ（配列番号９８）／Ｏｇ１６ｒ（配列番号９９）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−２，３ｂｄｈ−ＫＯを得る。このプラスミドを、上記の実施例において記載されているように、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３へ接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより、導入する。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲおよびこのＰＣＲ産物のシーケンシングのために、２，３ｂｄｈの相同アームに隣接するプライマーＯｇ３３ｆ（配列番号１００）およびＯｇ３４ｒ（配列番号１０１）を用いて、２，３ｂｄｈノックアウトについてスクリーニングする。
ＳｅｃＡｄｈ遺伝子ノックアウトのためのプラスミドを、同様に構築する。ＳｅｃＡｄｈ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号１０２）および３’相同アーム（配列番号１０３）を、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーＳｅｃ５ｆ（配列番号１０４）／Ｓｅｃ５ｒ（配列番号１０５）およびＳｅｃ３ｆ（配列番号１０６）／Ｓｅｃ３ｒ（配列番号１０７）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−ＳｅｃＡｄｈ−ＫＯを得る。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲのために、ＳｅｃＡｄｈ遺伝子の相同アームに隣接するプライマーＳｅｃＯｆ（配列番号１０８）およびＳｅｃＯｒ（配列番号１０９）を用いて、ＳｅｃＡｄｈノックアウトについてスクリーニングする。
Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３において２，３ｂｄｈ遺伝子またはＳｅｃＡｄｈ遺伝子のいずれかのノックアウトを達成したならば、これらの単一突然変異体における第２の遺伝子を、ｐＭＴＬ８５１５１−２，３ｂｄｈ−ＫＯプラスミドかまたはｐＭＴＬ８５１５１−ＳｅｃＡｄｈ−ＫＯプラスミドのいずれかを用いてターゲットする。プラスミドを、実施例１および３においてすでに記載されているように、単一遺伝子ノックアウト突然変異体へエレクトロポレーションかまたは接合のいずれかにより、導入する。形質転換体を、第２の遺伝子のノックアウトについて、その対応する遺伝子の相同アームに隣接するプライマーを用いて、スクリーニングする。
（ｂ）ＣｌｏｓＴｒｏｎを用いるΔ２，３ｂｄｈ ΔＳｅｃＡｄｈ二重遺伝子破壊：
ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン構築物におけるＲＡＭ ｅｒｍＢカセットは、フリッパーゼ組換え部位（Ｆｒｔ）に隣接している。Δ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体へフリッパーゼリコンビナーゼを接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかによって導入することにより、約１．３ｋｂのＲＡＭ ｅｒｍＢマーカーを、突然変異体のゲノムから除去し、それに伴って、ｅｒｍＢマーカーをリサイクルする。グループＩＩイントロンの約０．８ｋｂ断片は、ゲノム上に残る。これは、（ｉ）それのクラリスロマイシンに対する感受性を試験することにより、ならびに（ｉｉ）プライマーＯｇ４２ｆ（配列番号８４）およびＯｇ４３ｒ（配列番号８５）を用いてのグループＩＩイントロン挿入部位に隣接するプライマーでのＰＣＲおよびそのＰＣＲ産物のシーケンシングにより、確認される。ＲＡＭ ｅｒｍＢマーカーを含まないΔ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体（Δ２，３ｂｄｈ−ｅｒｍＢ ＣｌｏｓＴｒｏｎ）を得たならば、その突然変異体におけるＳｅｃＡｄｈ遺伝子を、同様の方法で、ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン挿入不活性化ツールを用いてターゲットする。センス鎖上の塩基３９９と塩基４００の間のイントロン挿入部位を、ＣｌｏｓＴｒｏｎ．ｃｏｍで提供されるＰｅｒｕｔｋａアルゴリズムを用いてＳｅｃＡｄｈ遺伝子内において同定し、イントロンターゲティングカセットは設計されている（配列番号１１０）。イントロンターゲティングカセットは、ＤＮＡ２．０によって商業的に合成され、接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかによりΔ２，３ｂｄｈ−ｅｒｍＢ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体へ導入されるｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５−ＳｅｃＡｄｈ−３９９！４００ｓとして、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２ベクターにおいて送達される。形質転換体を、チアンフェニコール寒天プレート上およびクラリスロマイシン寒天プレート上で逐次的に選択し、実施例３において先に説明されているように、プライマーＳｅｃＣＴｆ（配列番号１１１）およびＳｅｃＣＴｒ（配列番号１１２）でのＰＣＲによってスクリーニングする。
Δ２，３ｂｄｈ ΔＳｅｃＡｄｈ二重遺伝子破壊型Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３突然変異体を、上記の段落で説明されているように、相同組換え技術を用いるかまたはＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン挿入不活性化ツールのいずれかにより、作製する。
２，３ｂｄｈ遺伝子およびＳｅｃＡｄｈ遺伝子の破壊、ならびにアセトイン、他の代謝産物、および２，３−ＢＤＯの産生を、前に記載されているように、アセトインの２，３−ＢＤＯへの変換についての酵素活性アッセイを実施することにより、およびまた突然変異体により産生された産物をＨＰＬＣによって分析することにより、確認する。
低下した２，３−ＢＤＯを産生し、または２，３−ＢＤＯを産生しない改変Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３株
図１に示されているように、アセトラクテートは、２，３−ＢＤＯ生合成における中間体のうちの１つであり、分岐鎖アミノ酸の合成についての前駆体でもある。酵素のアセト乳酸シンターゼは、基質としての２分子のピルベートからアセトラクテートをもたらす反応を触媒する。酵素アセト乳酸シンターゼは、大きく以下の２つの群へ分類される：（ｉ）同化性アセト乳酸シンターゼは、バリン、イソロイシン、およびロイシンのような分岐型アミノ酸の合成に関与する遺伝子に関連しており、ならびに（ｉｉ）異化性アセト乳酸シンターゼは、２，３−ＢＤＯ合成に関連している（ａｌｓＳ；アミノ酸 − ＡＥＩ９０７１９．１および核酸 − ＨＱ８７６０１３．１）。
Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３のゲノムは、３個の推定同化性アセト乳酸シンターゼ遺伝子、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢを有する。Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）（ＡＥＩ９０７１９．１、ＡＥＩ９０７３０．１、ＡＥＩ９０７３１．１、ＡＥＩ９０７１３．１、ＡＥＩ９０７１４．１）、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）（ＡＤＫ１５１０４．１、ＡＤＫ１５１０４．１、ＡＤＫ１５１０５．１、ＡＤＫ１５４００．１、ＡＤＫ１５４００．１）、およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）（ＡＥＩ９０７３４．１、ＡＥＩ９０７３４．１、ＡＥＩ９０７３５．１、ＡＥＩ９０７２７．１、ＡＥＩ９０７２７．１）由来の例示的なアミノ酸配列、ならびにＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）（ＨＱ８７６０１３．１、ＨＱ８７６０２３．１、ＨＱ８７６０２１．１）、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）（ＣＰ００１６６６．１ − ＣＬＪＵ＿ｃ３８９２０、ＣＬＪＵ＿ｃ３２４２０、ＣＬＪＵ＿ｃ２０４２０−３０）、およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）（ＨＱ８７６０１４．１、ＨＱ８７６０２４．１、ＨＱ８７６０２２．１）由来のそれぞれの核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋから入手される。
全ての４個のアセト乳酸シンターゼ遺伝子またはこれらの４個の遺伝子の任意の組み合わせの破壊は、アセトインおよび２，３−ＢＤＯの産生の減少をもたらすはずである。これらの突然変異体の増殖を保証するために、培地に、３つの分岐鎖アミノ酸、バリン、ロイシン、およびイソロイシンを追加する。
実施例１、３、および４に記載されているように、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３の単一突然変異体、ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ突然変異体は、相同組換えか、またはＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン突然変異誘発ツールを用いることのいずれかにより、作製することができる。
ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢノックアウトカセットの設計：
ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ遺伝子についてのノックアウト構築物を、上記で説明されているように、設計する。ａｌｓＳ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号１１３）および３’相同アーム（配列番号１１４）を、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーａｌｓＳ５ｆ（配列番号１１５）／ａｌｓＳ５ｒ（配列番号１１６）およびａｌｓＳ３ｆ（配列番号１１７）／ａｌｓＳ３ｒ（配列番号１１８）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−ａｌｓＳ−ＫＯを得る。このプラスミドを、上記の実施例において記載されているように、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３へ接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより、導入する。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲおよびこのＰＣＲ産物のシーケンシングのために、ａｌｓＳの相同アームに隣接するプライマーａｌｓＳＯｆ（配列番号１１９）およびａｌｓＳＯｒ（配列番号１２０）を用いて、ａｌｓＳノックアウトについてスクリーニングする。
ｉｌｖＣ遺伝子のノックアウトについては、ｉｌｖＣ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号１２１）および３’相同アーム（配列番号１２２）を、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーｉｌｖＣ５ｆ（配列番号１２３）／ｉｌｖＣ５ｒ（配列番号１２４）およびｉｌｖＣ３ｆ（配列番号１２５）／ｉｌｖＣ３ｒ（配列番号１２６）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−ｉｌｖＣ−ＫＯを得る。このプラスミドを、上記の実施例において記載されているように、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３へ接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより、導入する。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲおよびこのＰＣＲ産物のシーケンシングのために、ｉｌｖＣ遺伝子の相同アームに隣接するプライマーｉｌｖＣＯｆ（配列番号１２７）およびｉｌｖＣＯｒ（配列番号１２８）を用いて、ｉｌｖＣノックアウトについてスクリーニングする。
ｉｌｖＩ遺伝子のノックアウトについては、ｉｌｖＩ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号１２９）および３’相同アーム（配列番号１３０）を、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーｉｌｖＩ５ｆ（配列番号１３１）／ｉｌｖＩ５ｒ（配列番号１３２）およびｉｌｖＩ３ｆ（配列番号１３３）／ｉｌｖＩ３ｒ（配列番号１３４）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−ｉｌｖＩ−ＫＯを得る。このプラスミドを、上記の実施例において記載されているように、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３へ接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより、導入する。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲおよびこのＰＣＲ産物のシーケンシングのために、ｉｌｖＩ遺伝子の相同アームに隣接するプライマーｉｌｖＩＯｆ（配列番号１３５）およびｉｌｖＩＯｒ（配列番号１３６）を用いて、ｉｌｖＩノックアウトについてスクリーニングすることができる。
ｉｌｖＢ遺伝子のノックアウトについては、ｉｌｖＢ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号１３７）および３’相同アーム（配列番号１３８）を、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーｉｌｖＢ５ｆ（配列番号１３９）／ｉｌｖＢ５ｒ（配列番号１４０）およびｉｌｖＢ３ｆ（配列番号１４１）／ｉｌｖＢ３ｒ（配列番号１４２）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−ｉｌｖＢ−ＫＯを得る。このプラスミドを、上記の実施例において記載されているように、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３へ接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより、導入する。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲおよびこのＰＣＲ産物のシーケンシングのために、ｉｌｖＢ遺伝子の相同アームに隣接するプライマーｉｌｖＢＯｆ（配列番号１４３）およびｉｌｖＢＯｒ（配列番号１４４）を用いて、ｉｌｖＢノックアウトについてスクリーニングする。
単一遺伝子ノックアウト突然変異体が得られたならば、他の３個のアセト乳酸シンターゼ遺伝子を逐次的にターゲットして、全ての４個のアセト乳酸シンターゼ遺伝子が欠失した突然変異体を作製する。これらの突然変異体の増殖は、分岐鎖アミノ酸に対して栄養要求性である可能性がある。これらの突然変異体におけるアセトイン、２，３−ＢＤＯ、および他の代謝産物の産生または産生の欠如を、前の実施例について記載されているように、ＨＰＬＣによって分析することができる。基質としてのピルベート、ならびに補因子としてのチアミン二リン酸およびフラビンアデニンジヌクレオチドを用いた酵素活性アッセイを実施し、これらの突然変異体におけるアセト乳酸シンターゼ活性の喪失について確認することができる（Tittmann、Vyazmensky、Hubner、Barak、およびChipman、2005；Vinogradovら、2006）。
ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ遺伝子についてのＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロンターゲティングカセットの設計：
Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９ ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ遺伝子はまた、ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン媒介性遺伝子破壊ツールを用いて破壊し、または不活性化することができる（Heapら、2010）。ＣｌｏｓＴｒｏｎ．ｃｏｍで提供されるＰｅｒｕｔｋａアルゴリズムを用いて、ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩのセンス鎖、およびｉｌｖＢ遺伝子のアンチセンス鎖上で、それぞれ、塩基３０３／３０４の間、２２８／２２９の間、９７５／９７６の間、および１５７／１５８の間にグループＩＩイントロンターゲット部位を同定する。アルゴリズムによって同定される他の部位もまたターゲットすることができる。ＤＮＡ２．０によって商業的に合成され、およびｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２ベクターにおいて送達することができるイントロンターゲティング領域（ａｌｓＳ − 配列番号１４５；ｉｌｖＣ − 配列番号１４６；ｉｌｖＩ − 配列番号１４７、およびｉｌｖＢ − 配列番号１４８）を、同じアルゴリズムを用いて設計している。最終ベクター、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ａｌｓＳ−３０３！３０４ｓ、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ｉｌｖＣ−２２８！２２９ｓ、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ｉｌｖＩ−９７５！９７６ｓ、およびｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ｉｌｖＢ−１５７！１５８ａは、ターゲット部位への挿入により抗生物質クラリスロマイシンに対する抵抗性を与えるレトロ転位活性化ｅｒｍＢマーカー（ＲＡＭ）を含有する。これらのプラスミドを、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９へ、接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより導入する。形質転換体を、チアンフェニコール寒天プレートおよびクラリスロマイシン寒天プレート上で逐次的に選択し、ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ遺伝子の不活性化について、それぞれ、プライマーａｌｓＳＣＴｆ（配列番号１４９）およびａｌｓＳＣＴｒ（配列番号１５０）、ｉｌｖＣＣＴｆ（配列番号１５１）およびｉｌｖＣＣＴｒ（配列番号１５２）、ｉｌｖＩＣＴｆ（配列番号１５３）およびｉｌｖＩＣＴｒ（配列番号１５４）、ならびにｉｌｖＢＣＴｆ（配列番号１５５）およびｉｌｖＢＣＴｒ（配列番号１５６）を用いたＰＣＲによってスクリーニングする。
単一遺伝子が破壊されたＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体が得られたならば、エレクトロポレーションかまたは接合のいずれかにより突然変異体へ導入されるフリッパーゼ遺伝子を有するｐＭＴＬプラスミドを用いて、ＲＡＭ ｅｒｍＢカセットを、これらの突然変異体のゲノムから除去する。生じた形質転換体を、クラリスロマイシンに対するそれの感受性を試験することにより、ならびに（ｉｉ）ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＢ１、およびｉｌｖＢ２遺伝子におけるａｌｓＳＣＴｆ（配列番号１４９）およびａｌｓＳＣＴｒ（配列番号１５０）、ｉｌｖＣＣＴｆ（配列番号１５１）およびｉｌｖＣＣＴｒ（配列番号１５２）、ｉｌｖＩＣＴｆ（配列番号１５３）およびｉｌｖＢＩＣＴｒ（配列番号１５４）、ならびにｉｌｖＢＣＴｆ（配列番号１５５）およびｉｌｖＢＣＴｒ（配列番号１５６）、それぞれを用いての、グループＩＩイントロン挿入部位に隣接するプライマーでのＰＣＲにより、ならびにこれらのＰＣＲ産物のさらなるシーケンシングにより、ｅｒｍＢカセットの喪失についてスクリーニングする。
ｅｒｍＢカセットの喪失を確認した後、ノックアウト突然変異体のようなＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体を、他のアセト乳酸シンターゼ遺伝子を不活性化するために、逐次的にターゲットする。一実施形態において、これらのＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体を、分岐鎖アミノ酸の存在下で増殖させる。これらの突然変異体におけるアセトイン、２，３−ＢＤＯ、および他の代謝産物の産生または産生の欠如を、前の実施例において記載されているように、ＨＰＬＣによって分析することができる。基質としてのピルベート、ならびに補因子としてのチアミン二リン酸およびフラビンアデニンジヌクレオチドを用いた酵素活性アッセイを実施し、これらの突然変異体におけるアセト乳酸シンターゼ活性の喪失について確認することができる（Tittmanら、2005；Vinogradovら、2006）。
Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）における２，３−ＢＤＯ経路遺伝子の破壊
２，３−ＢＤＯ産生についての経路は、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）、およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）を含むアセトゲンにわたって保存されている。その３つのアセトゲンにおけるａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、ｉｌｖＢ、ｂｕｄＡ、２，３ｂｄｈ、およびＳｅｃＡｄｈ遺伝子は、高程度の配列相同性を共有する。このゆえに、これらの遺伝子は、その３つのアセトゲンにおいて２，３−ＢＤＯ産生を増加または減少させるために遺伝子改変することができる。エレクトロポレーションによりＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）を遺伝子改変するための方法は、記載されている（Kopkeら、2010）（ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３）。Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）について上で記載されているエレクトロポレーション方法および接合方法は、任意の当業者によりＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）に適用することができる。
Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＢ１、ｉｌｖＢ２、ｂｕｄＡ、および２，３ｂｄｈ遺伝子についてのアミノ酸配列および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋから入手することができる。Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）のＳｅｃＡｄｈヌクレオチド配列（配列番号３６）およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のＳｅｃＡｄｈヌクレオチド配列（配列番号３７）が提供される。
Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）において相同組換えおよびＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロンに基づいた挿入不活性化によりａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＢ１、ｉｌｖＢ２、ｂｕｄＡ、２，３ｂｄｈ、およびＳｅｃＡｄｈ遺伝子を破壊するために用いられたノックアウトプラスミドおよびＣｌｏｓＴｒｏｎプラスミドはまた、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）における同じ遺伝子を破壊するために用いることができる。例えば、ｐＭＴＬ８５１４１−ｂｕｄＡ−ｋｏ、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５−ｂｕｄＡ−４５０！４５１ｓ、およびｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５−２，３ｂｄｈ−４６８！４６９ｓを、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）（下記の実施例６ａにおいて説明されている）およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）（下記の実施例６ｂにおいて説明されている）へ、実施例１および３においてＣ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）について上で記載されているように、エレクトロポレーションかまたは接合のいずれかにより、導入することができる。同様の突然変異体スクリーニング方法および特徴づけ方法は、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）およびＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）において適用することができる。
（実施例６ａ）
２，３−ＢＤＯ産生なし、および２，３−ＢＤＯ産生低下のための、相同組換えおよびグループＩＩイントロンに基づいた挿入不活性化ツールによるＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）におけるｂｕｄＡ遺伝子および２，３ｂｄｈ遺伝子の破壊
プラスミドｐＭＴＬ８５１４１−ｂｕｄＡ−ｋｏを、エレクトロポレーションによりＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）へ導入する（Koepkeら、2010）。１５μｇ／ｍｌチアンフェニコールを含有するＰＥＴＣ−寒天プレート上で形質転換体を選択し、プライマーＯｇ４４ｆ（配列番号２９）およびＯｇ４５ｒ（配列番号３０）を用いてｂｕｄＡノックアウトについてスクリーニングする。
ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロンに基づいた挿入不活性化ツールを用いたＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）におけるｂｕｄＡおよび２，３ｂｄｈ遺伝子破壊について、プラスミドｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５−ｂｕｄＡ−４５０！４５１ｓおよびｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５−２，３ｂｄｈ−４６８！４６９ｓを接合によりＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）へ導入する。接合後、単一コロニーの画線を、まず、１５μｇ／ｍｌチアンフェニコールおよび１０μｇ／ｍｌトリメトプリムを含有するＰＥＴＣ寒天培地上に、その後、５μｇ／ｍｌクラリスロマイシンを含有するＰＥＴＣ培地での寒天プレート上に、逐次的に行った。プラスミドごとのコロニーを、ｂｕｄＡ遺伝子におけるグループＩＩイントロン挿入部位に隣接するプライマーＯｇ４４ｆ（配列番号２９）およびＯｇ４５ｒ（配列番号３０）、ならびに２，３−ｂｄｈ遺伝子におけるグループＩＩイントロン挿入部位に隣接するプライマーＯｇ４２ｆ（配列番号８４）およびＯｇ４３ｒ（配列番号８５）を用いるＰＣＲにより、グループＩＩイントロン挿入についてランダムにスクリーニングする。
上記で作製されたｂｕｄＡおよび２，３ｂｄｈノックアウトおよびＣｌｏｓＴｒｏｎ Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）突然変異体を、実施例１および３において説明されているように、ＨＰＬＣおよびバイオリアクタ内での発酵により、２，３−ＢＤＯおよびアセトイン産生について分析する。
（実施例６ｂ）
２，３−ＢＤＯ産生なし、および２，３−ＢＤＯ産生低下のための、相同組換えおよびグループＩＩイントロンに基づいた挿入不活性化ツールによるＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）におけるｂｕｄＡ遺伝子および２，３ｂｄｈ遺伝子の破壊
プラスミドｐＭＴＬ８５１４１−ｂｕｄＡ−ｋｏを、エレクトロポレーションかまたは接合のいずれかにより、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）またはＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）について上で記載されているように、エレクトロポレーションにより、Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）へ導入する。１５μｇ／ｍｌチアンフェニコールを含有するＰＥＴＣ−寒天プレート上で形質転換体を選択し、プライマーＯｇ４４ｆ（配列番号２９）およびＯｇ４５ｒ（配列番号３０）を用いてｂｕｄＡノックアウトについてスクリーニングする。
ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロンに基づいた挿入不活性化ツールを用いたＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）におけるｂｕｄＡおよび２，３ｂｄｈ遺伝子破壊について、プラスミドｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５−ｂｕｄＡ−４５０！４５１ｓおよびｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５−２，３ｂｄｈ−４６８！４６９ｓを接合によりＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）へ導入する。接合後、単一コロニーの画線を、まず、１５μｇ／ｍｌチアンフェニコールおよび１０μｇ／ｍｌトリメトプリムを含有するＰＥＴＣ寒天培地上に、その後、５μｇ／ｍｌクラリスロマイシンを含有するＰＥＴＣ培地での寒天プレート上に、逐次的に行う。プラスミドごとのコロニーを、ｂｕｄＡ遺伝子におけるグループＩＩイントロン挿入部位に隣接するプライマーＯｇ４４ｆ（配列番号２９）およびＯｇ４５ｒ（配列番号３０）、ならびに２，３−ｂｄｈ遺伝子におけるグループＩＩイントロン挿入部位に隣接するプライマーＯｇ４２ｆ（配列番号８４）およびＯｇ４３ｒ（配列番号８５）を用いるＰＣＲにより、グループＩＩイントロン挿入についてランダムにスクリーニングする。
上記で作製されたｂｕｄＡおよび２，３ｂｄｈノックアウトおよびＣｌｏｓＴｒｏｎ Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）突然変異体を、実施例１および３において説明されているように、ＨＰＬＣおよびバイオリアクタ内での発酵により、２，３−ＢＤＯおよびアセトイン産生について分析する。
アセトインのみを産生する改変Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）
先に説明されているように、アセトインのエタノールからの分離は、２，３−ＢＤＯと比較して、技術的に、より実行可能である。したがって、アセトインを産生し、および２，３−ＢＤＯを産生しないＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）株を有することは望ましい。これは、実施例６ａに説明されているような２つの方法：（ａ）相同組換えおよび（ｂ）ＣｌｏｓＴｒｏｎツールを用いるマーカーレス遺伝子破壊において２，３ｂｄｈ遺伝子およびＳｅｃＡｄｈ遺伝子の両方を除去または破壊することにより達成される。
（ａ）相同組換えによるΔ２，３ｂｄｈ ΔＳｅｃＡｄｈ二重ノックアウトＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）株：
２，３ｂｄｈ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号９４）および３’相同アーム（配列番号９５）を、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーＯｇ１３ｆ（配列番号９６）／Ｏｇ１４ｒ（配列番号９７）およびＯｇ１５ｆ（配列番号９８）／Ｏｇ１６ｒ（配列番号９９）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−２，３ｂｄｈ−ＫＯを得る。このプラスミドを、上記の実施例６ａにおいて記載されているように、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）へ接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより、導入する。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲおよびこのＰＣＲ産物のシーケンシングのために、２，３ｂｄｈの相同アームに隣接するプライマーＯｇ３３ｆ（配列番号１００）およびＯｇ３４ｒ（配列番号１０１）を用いて、２，３ｂｄｈノックアウトについてスクリーニングする。
ＳｅｃＡｄｈ遺伝子ノックアウトのためのプラスミドを、同様に構築する。ＳｅｃＡｄｈ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号１０２）および３’相同アーム（配列番号１０３）を、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーＳｅｃ５ｆ（配列番号１０４）／Ｓｅｃ５ｒ（配列番号１０５）およびＳｅｃ３ｆ（配列番号１０６）／Ｓｅｃ３ｒ（配列番号１０７）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−ＳｅｃＡｄｈ−ＫＯを得る。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲのために、ＳｅｃＡｄｈ遺伝子の相同アームに隣接するプライマーＳｅｃＯｆ（配列番号１０８）およびＳｅｃＯｒ（配列番号１０９）を用いて、ＳｅｃＡｄｈノックアウトについてスクリーニングする。
Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）において２，３ｂｄｈ遺伝子またはＳｅｃＡｄｈ遺伝子のいずれかのノックアウトを達成したならば、これらの単一突然変異体における第２の遺伝子を、ｐＭＴＬ８５１５１−２，３ｂｄｈ−ＫＯプラスミドかまたはｐＭＴＬ８５１５１−ＳｅｃＡｄｈ−ＫＯプラスミドのいずれかを用いてターゲットする。プラスミドを、実施例６ａにおいてすでに記載されているように、単一遺伝子ノックアウト突然変異体へエレクトロポレーションかまたは接合のいずれかにより、導入する。形質転換体を、第２の遺伝子のノックアウトについて、その対応する遺伝子の相同アームに隣接するプライマーを用いてスクリーニングする。
（ｂ）Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）における、ＣｌｏｓＴｒｏｎを用いるΔ２，３ｂｄｈ ΔＳｅｃＡｄｈ二重遺伝子破壊：
ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン構築物におけるＲＡＭ ｅｒｍＢカセットは、フリッパーゼ組換え部位（Ｆｒｔ）に隣接している。Δ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体へフリッパーゼリコンビナーゼを接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかによって導入することにより、約１．３ｋｂのＲＡＭ ｅｒｍＢマーカーを、突然変異体のゲノムから除去し、それに伴って、ｅｒｍＢマーカーをリサイクルすることができる。グループＩＩイントロンの約０．８ｋｂ断片は、ゲノム上に残る。これは、（ｉ）それのクラリスロマイシンに対する感受性を試験することにより、ならびに（ｉｉ）プライマーＯｇ４２ｆ（配列番号８４）およびＯｇ４３ｒ（配列番号８５）を用いてのグループＩＩイントロン挿入部位に隣接するプライマーでのＰＣＲおよびそのＰＣＲ産物のシーケンシングにより、確認される。ＲＡＭ ｅｒｍＢマーカーを含まないΔ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体（Δ２，３ｂｄｈ−ｅｒｍＢ ＣｌｏｓＴｒｏｎ）を得たならば、その突然変異体におけるＳｅｃＡｄｈ遺伝子を、同様の方法で、ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン挿入不活性化ツールを用いてターゲットする。センス鎖上の塩基３９９と塩基４００の間のイントロン挿入部位を、ＣｌｏｓＴｒｏｎ．ｃｏｍで提供されるＰｅｒｕｔｋａアルゴリズムを用いてＳｅｃＡｄｈ遺伝子内において同定し、イントロンターゲティングカセットを設計する（配列番号１１０）。イントロンターゲティングカセットは、ＤＮＡ２．０によって商業的に合成され、接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかによりΔ２，３ｂｄｈ−ｅｒｍＢ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体へ導入されるｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５−ＳｅｃＡｄｈ−３９９！４００ｓとして、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２ベクターにおいて送達される。形質転換体を、チアンフェニコール寒天プレート上およびクラリスロマイシン寒天プレート上で逐次的に選択し、実施例６ａにおいて先に説明されているように、プライマーＳｅｃＣＴｆ（配列番号１１１）およびＳｅｃＣＴｒ（配列番号１１２）でのＰＣＲによってスクリーニングする。
Δ２，３ｂｄｈ ΔＳｅｃＡｄｈ二重遺伝子破壊型Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）突然変異体を、上記の段落で説明されているように、相同組換え技術を用いるかまたはＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン挿入不活性化ツールのいずれかにより、作製する。
２，３ｂｄｈ遺伝子およびＳｅｃＡｄｈ遺伝子の破壊、ならびに代謝産物および２，３−ＢＤＯの産生を、前に記載されているように、アセトインの２，３−ＢＤＯへの変換についての酵素活性アッセイを実施することにより、およびまた突然変異体により産生された産物をＨＰＬＣによって分析することにより、確認する。
低下した２，３−ＢＤＯを産生し、または２，３−ＢＤＯを産生しない改変Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）株
図１に示されているように、アセトラクテートは、２，３−ＢＤＯ生合成における中間体のうちの１つであり、分岐鎖アミノ酸の合成についての前駆体でもある。酵素のアセト乳酸シンターゼは、基質としての２分子のピルベートからアセトラクテートをもたらす反応を触媒する。酵素アセト乳酸シンターゼは、大きく以下の２つの群へ分類される：（ｉ）同化性アセト乳酸シンターゼは、バリン、イソロイシン、およびロイシンのような分岐型アミノ酸の合成に関与する遺伝子に関連しており、ならびに（ｉｉ）異化性アセト乳酸シンターゼは、２，３−ＢＤＯ合成に関連している。
Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）のゲノムは、３個の推定同化性アセト乳酸シンターゼ遺伝子、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ、ならびに１個の異化性アセト乳酸シンターゼ、ａｌｓＳを有する。Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）由来の例示的なアミノ酸配列（ＡＤＫ１５１０４．１、ＡＤＫ１５１０４．１、ＡＤＫ１５１０５．１、ＡＤＫ１５４００．１、ＡＤＫ１５４００．１）、およびＣ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）由来のそれぞれの核酸配列（ＣＰ００１６６６．１、ＣＬＪＵ＿ｃ３８９２０、ＣＬＪＵ＿ｃ３２４２０、ＣＬＪＵ＿ｃ２０４２０−３０）は、ＧｅｎＢａｎｋから入手される。
全ての４個のアセト乳酸シンターゼ遺伝子またはこれらの４個の遺伝子の任意の組み合わせの破壊は、アセトインおよび２，３−ＢＤＯの産生の減少をもたらすはずである。これらの突然変異体の増殖を保証するために、培地に、３つの分岐鎖アミノ酸、バリン、ロイシン、およびイソロイシンを追加する。
実施例６ａおよび７に記載されているように、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）の単一突然変異体、ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ突然変異体は、相同組換えか、またはＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン突然変異誘発ツールを用いることのいずれかにより、作製することができる。
ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢノックアウトカセットの設計：
ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ遺伝子についてのノックアウト構築物を、上記で説明されているように、設計する。
ａｌｓＳ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号１１３）および３’相同アーム（配列番号１１４）を、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーａｌｓＳ５ｆ（配列番号１１５）／ａｌｓＳｒ（配列番号１１６）およびａｌｓＳ３ｆ（配列番号１１７）／ａｌｓＳ３ｒ（配列番号１１８）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−ａｌｓＳ−ＫＯを得る。このプラスミドを、上記の実施例において記載されているように、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）へ接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより、導入する。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲおよびこのＰＣＲ産物のシーケンシングのために、ａｌｓＳの相同アームに隣接するプライマーａｌｓＳＯｆ（配列番号１１９）およびａｌｓＳＯｒ（配列番号１２０）を用いて、ａｌｓＳノックアウトについてスクリーニングする。
ｉｌｖＣ遺伝子のノックアウトについては、ｉｌｖＣ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号１２１）および３’相同アーム（配列番号１２２）を、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーｉｌｖＣ５ｆ（配列番号１２３）／ｉｌｖＣ５ｒ（配列番号１２４）およびｉｌｖＣ３ｆ（配列番号１２５）／ｉｌｖＣ３ｒ（配列番号１２６）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−ｉｌｖＣ−ＫＯを得る。このプラスミドを、上記の実施例において記載されているように、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）へ接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより、導入する。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲおよびこのＰＣＲ産物のシーケンシングのために、ｉｌｖＣ遺伝子の相同アームに隣接するプライマーｉｌｖＣＯｆ（配列番号１２７）およびｉｌｖＣＯｒ（配列番号１２８）を用いて、ｉｌｖＣノックアウトについてスクリーニングする。
ｉｌｖＩ遺伝子のノックアウトについては、ｉｌｖＩ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号１２９）および３’相同アーム（配列番号１３０）を、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーｉｌｖＩ５ｆ（配列番号１３１）／ｉｌｖＩ５ｒ（配列番号１３２）およびｉｌｖＩ３ｆ（配列番号１３３）／ｉｌｖＩ３ｒ（配列番号１３４）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−ｉｌｖＩ−ＫＯを得る。このプラスミドを、上記の実施例において記載されているように、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）へ接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより、導入する。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲおよびこのＰＣＲ産物のシーケンシングのために、ｉｌｖＩ遺伝子の相同アームに隣接するプライマーｉｌｖＩＯｆ（配列番号１３５）およびｉｌｖＩＯｒ（配列番号１３６）を用いて、ｉｌｖＩノックアウトについてスクリーニングする。
ｉｌｖＢ遺伝子のノックアウトについては、ｉｌｖＢ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号１３７）および３’相同アーム（配列番号１３８）を、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーｉｌｖＢ５ｆ（配列番号１３９）／ｉｌｖＢ５ｒ（配列番号１４０）およびｉｌｖＢ３ｆ（配列番号１４１）／ｉｌｖＢ３ｒ（配列番号１４２）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−ｉｌｖＢ−ＫＯを得る。このプラスミドを、上記の実施例において記載されているように、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）へ接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより、導入する。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲおよびこのＰＣＲ産物のシーケンシングのために、ｉｌｖＢ遺伝子の相同アームに隣接するプライマーｉｌｖＢＯｆ（配列番号１４３）およびｉｌｖＢＯｒ（配列番号１４４）を用いて、ｉｌｖＢノックアウトについてスクリーニングする。
単一遺伝子ノックアウト突然変異体が得られたならば、他の３個のアセト乳酸シンターゼ遺伝子を逐次的にターゲットして、全ての４個のアセト乳酸シンターゼ遺伝子が欠失した突然変異体を作製する。これらの突然変異体の増殖は、分岐鎖アミノ酸に対して栄養要求性である可能性がある。これらの突然変異体におけるアセトイン、２，３−ＢＤＯ、および他の代謝産物の産生または産生の欠如を、前の実施例について記載されているように、ＨＰＬＣによって分析することができる。基質としてのピルベート、ならびに補因子としてのチアミン二リン酸およびフラビンアデニンジヌクレオチドを用いた酵素活性アッセイを実施し、これらの突然変異体におけるアセト乳酸シンターゼ活性の喪失について確認することができる（Tittmann、Vyazmensky、Hubner、Barak、およびChipman、2005；Vinogradovら、2006）。
ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ遺伝子についてのＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロンターゲティングカセットの設計：
Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii） ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ遺伝子はまた、ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン媒介性遺伝子破壊ツールを用いて破壊し、または不活性化することができる（Heapら、2010）。ＣｌｏｓＴｒｏｎ．ｃｏｍで提供されるＰｅｒｕｔｋａアルゴリズムを用いて、ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩのセンス鎖、およびｉｌｖＢ遺伝子のアンチセンス鎖上で、それぞれ、塩基３０３／３０４の間、２２８／２２９の間、９７５／９７６の間、および１５７／１５８の間にグループＩＩイントロンターゲット部位を同定する。アルゴリズムによって同定される他の部位もまたターゲットすることができる。ＤＮＡ２．０によって商業的に合成され、およびｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２ベクターにおいて送達されるイントロンターゲティング領域（ａｌｓＳ − 配列番号１４５；ｉｌｖＣ − 配列番号１４６；ｉｌｖＩ − 配列番号１４７、およびｉｌｖＢ − 配列番号１４８）を、同じアルゴリズムを用いて設計する。最終ベクター、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ａｌｓＳ−３０３！３０４ｓ、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ｉｌｖＣ−２２８！２２９ｓ、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ｉｌｖＩ−９７５！９７６ｓ、およびｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ｉｌｖＢ−１５７！１５８ａは、ターゲット部位への挿入により抗生物質クラリスロマイシンに対する抵抗性を与えるレトロ転位活性化ｅｒｍＢマーカー（ＲＡＭ）を含有する。これらのプラスミドを、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）へ、接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより導入する。形質転換体を、チアンフェニコール寒天プレートおよびクラリスロマイシン寒天プレート上で逐次的に選択し、ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ遺伝子の不活性化について、それぞれ、プライマーａｌｓＳＣＴｆ（配列番号１４９）およびａｌｓＳＣＴｒ（配列番号１５０）、ｉｌｖＣＣＴｆ（配列番号１５１）およびｉｌｖＣＣＴｒ（配列番号１５２）、ｉｌｖＩＣＴｆ（配列番号１５３）およびｉｌｖＩＣＴｒ（配列番号１５４）、ならびにｉｌｖＢＣＴｆ（配列番号１５５）およびｉｌｖＢＣＴｒ（配列番号１５６）を用いたＰＣＲによってスクリーニングする。
単一遺伝子が破壊されたＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体が得られたならば、エレクトロポレーションかまたは接合のいずれかにより突然変異体へ導入されるフリッパーゼ遺伝子を有するｐＭＴＬプラスミドを用いて、ＲＡＭ ｅｒｍＢカセットを、これらの突然変異体のゲノムから除去する。生じた形質転換体を、クラリスロマイシンに対するそれの感受性を試験することにより、ならびに（ｉｉ）ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＢ１、およびｉｌｖＢ２遺伝子におけるａｌｓＳＣＴｆ（配列番号１４９）およびａｌｓＳＣＴｒ（配列番号１５０）、ｉｌｖＣＣＴｆ（配列番号１５１）およびｉｌｖＣＣＴｒ（配列番号１５２）、ｉｌｖＩＣＴｆ（配列番号１５３）およびｉｌｖＩＣＴｒ（配列番号１５４）、ならびにｉｌｖＢＣＴｆ（配列番号１５５）およびｉｌｖＢＣＴｒ（配列番号１５６）、それぞれを用いての、グループＩＩイントロン挿入部位に隣接するプライマーでのＰＣＲにより、ならびにこれらのＰＣＲ産物のさらなるシーケンシングにより、ｅｒｍＢカセットの喪失についてスクリーニングする。
ｅｒｍＢカセットの喪失を確認した後、ノックアウト突然変異体のようなＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体を、他のアセト乳酸シンターゼ遺伝子を不活性化するために、逐次的にターゲットする。一実施形態において、これらのＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体を、分岐鎖アミノ酸の存在下で増殖させる。これらの突然変異体におけるアセトイン、２，３−ＢＤＯ、および他の代謝産物の産生または産生の欠如を、前の実施例において記載されているように、ＨＰＬＣによって分析し、基質としてのピルベート、ならびに補因子としてのチアミン二リン酸およびフラビンアデニンジヌクレオチドを用いた酵素活性アッセイを実施して研究し、これらの突然変異体におけるアセト乳酸シンターゼ活性の喪失について確認することができる（Tittmannら、2005；Vinogradovら、2006）。
アセトインのみを産生する改変Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）
先に説明されているように、アセトインのエタノールからの分離は、２，３−ＢＤＯと比較して、技術的に、より実行可能である。したがって、アセトインを産生し、および２，３−ＢＤＯを産生しないＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）株を有することは望ましい。これは、実施例６ｂに説明されているような２つの方法：（ａ）相同組換えおよび（ｂ）ＣｌｏｓＴｒｏｎツールを用いるマーカーレス遺伝子破壊において２，３ｂｄｈ遺伝子およびＳｅｃＡｄｈ遺伝子の両方を除去または破壊することにより達成される。
（ａ）相同組換えによるΔ２，３ｂｄｈ ΔＳｅｃＡｄｈ二重ノックアウトＣ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）株：
２，３ｂｄｈ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号９４）および３’相同アーム（配列番号９５）を、Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーＯｇ１３ｆ（配列番号９６）／Ｏｇ１４ｒ（配列番号９７）およびＯｇ１５ｆ（配列番号９８）／Ｏｇ１６ｒ（配列番号９９）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−２，３ｂｄｈ−ＫＯを得る。このプラスミドを、上記の実施例６ｂにおいて記載されているように、Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）へ接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより、導入する。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲおよびこのＰＣＲ産物のシーケンシングのために、２，３ｂｄｈの相同アームに隣接するプライマーＯｇ３３ｆ（配列番号１００）およびＯｇ３４ｒ（配列番号１０１）を用いて、２，３ｂｄｈノックアウトについてスクリーニングする。
ＳｅｃＡｄｈ遺伝子ノックアウトのためのプラスミドを、同様に構築する。ＳｅｃＡｄｈ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号１０２）および３’相同アーム（配列番号１０３）を、Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーＳｅｃ５ｆ（配列番号１０４）／Ｓｅｃ５ｒ（配列番号１０５）およびＳｅｃ３ｆ（配列番号１０６）／Ｓｅｃ３ｒ（配列番号１０７）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−ＳｅｃＡｄｈ−ＫＯを得る。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲのために、ＳｅｃＡｄｈ遺伝子の相同アームに隣接するプライマーＳｅｃＯｆ（配列番号１０８）およびＳｅｃＯｒ（配列番号１０９）を用いて、ＳｅｃＡｄｈノックアウトについてスクリーニングする。
Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）において２，３ｂｄｈ遺伝子またはＳｅｃＡｄｈ遺伝子のいずれかのノックアウトを達成したならば、これらの単一突然変異体における第２の遺伝子を、ｐＭＴＬ８５１５１−２，３ｂｄｈ−ＫＯプラスミドかまたはｐＭＴＬ８５１５１−ＳｅｃＡｄｈ−ＫＯプラスミドのいずれかを用いてターゲットする。プラスミドを、実施例６ｂにおいてすでに記載されているように、単一遺伝子ノックアウト突然変異体へエレクトロポレーションかまたは接合のいずれかにより、導入する。形質転換体を、第２の遺伝子のノックアウトについて、その対応する遺伝子の相同アームに隣接するプライマーを用いてスクリーニングする。
（ｂ）Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）における、ＣｌｏｓＴｒｏｎを用いるΔ２，３ｂｄｈ ΔＳｅｃＡｄｈ二重遺伝子破壊：
ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン構築物におけるＲＡＭ ｅｒｍＢカセットは、フリッパーゼ組換え部位（Ｆｒｔ）に隣接している。Δ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体へフリッパーゼリコンビナーゼを接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかによって導入することにより、約１．３ｋｂのＲＡＭ ｅｒｍＢマーカーを、突然変異体のゲノムから除去し、それに伴って、ｅｒｍＢマーカーをリサイクルすることができる。グループＩＩイントロンの約０．８ｋｂ断片は、ゲノム上に残る。これは、（ｉ）それのクラリスロマイシンに対する感受性を試験することにより、ならびに（ｉｉ）プライマーＯｇ４２ｆ（配列番号８４）およびＯｇ４３ｒ（配列番号８５）を用いてのグループＩＩイントロン挿入部位に隣接するプライマーでのＰＣＲおよびそのＰＣＲ産物のシーケンシングにより、確認される。ＲＡＭ ｅｒｍＢマーカーを含まないΔ２，３ｂｄｈ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体（Δ２，３ｂｄｈ−ｅｒｍＢ ＣｌｏｓＴｒｏｎ）を得たならば、その突然変異体におけるＳｅｃＡｄｈ遺伝子を、同様の方法で、ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン挿入不活性化ツールを用いてターゲットする。センス鎖上の塩基３９９と塩基４００の間のイントロン挿入部位を、ＣｌｏｓＴｒｏｎ．ｃｏｍで提供されるＰｅｒｕｔｋａアルゴリズムを用いてＳｅｃＡｄｈ遺伝子内において同定し、イントロンターゲティングカセットは設計されている（配列番号１１０）。イントロンターゲティングカセットは、ＤＮＡ２．０によって商業的に合成され、接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかによりΔ２，３ｂｄｈ−ｅｒｍＢ ＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体へ導入されるｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ５−ＳｅｃＡｄｈ−３９９！４００ｓとして、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２ベクターにおいて送達される。形質転換体を、チアンフェニコール寒天プレート上およびクラリスロマイシン寒天プレート上で逐次的に選択し、実施例６ｂにおいて先に説明されているように、プライマーＳｅｃＣＴｆ（配列番号１１１）およびＳｅｃＣＴｒ（配列番号１１２）でのＰＣＲによってスクリーニングする。
Δ２，３ｂｄｈ ΔＳｅｃＡｄｈ二重遺伝子破壊型Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）突然変異体を、上記の段落で説明されているように、相同組換え技術を用いるかまたはＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン挿入不活性化ツールのいずれかにより、作製する。
２，３ｂｄｈ遺伝子およびＳｅｃＡｄｈ遺伝子の破壊を、前に記載されているように、アセトインの２，３−ＢＤＯへの変換についての酵素活性アッセイを実施することにより、およびまた突然変異体により産生された代謝産物および２，３−ＢＤＯをＨＰＬＣによって分析することにより、確認する。
低下した２，３−ＢＤＯを産生し、または２，３−ＢＤＯを産生しない改変Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）株
図１に示されているように、アセトラクテートは、２，３−ＢＤＯ生合成における中間体のうちの１つであり、分岐鎖アミノ酸の合成についての前駆体でもある。酵素のアセト乳酸シンターゼは、基質としての２分子のピルベートからアセトラクテートをもたらす反応を触媒する。酵素アセト乳酸シンターゼは、大きく以下の２つの群へ分類される：（ｉ）同化性アセト乳酸シンターゼは、バリン、イソロイシン、およびロイシンのような分岐型アミノ酸の合成に関与する遺伝子に関連しており、ならびに（ｉｉ）異化性アセト乳酸シンターゼは、２，３−ＢＤＯ合成に関連している。
Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）のゲノムは、３個の推定同化性アセト乳酸シンターゼ遺伝子、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ、ならびに１個の異化性アセト乳酸シンターゼ、ａｌｓＳを有する。Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）由来の例示的なアミノ酸配列（ＡＥＩ９０７３４．１、ＡＥＩ９０７３４．１、ＡＥＩ９０７３５．１、ＡＥＩ９０７２７．１、ＡＥＩ９０７２７．１）、およびそれぞれの核酸配列（ＨＱ８７６０１４．１、ＨＱ８７６０２４．１、ＨＱ８７６０２２．１）は、ＧｅｎＢａｎｋから入手される。
全ての４個のアセト乳酸シンターゼ遺伝子またはこれらの４個の遺伝子の任意の組み合わせの破壊は、アセトインおよび２，３−ＢＤＯの産生の減少をもたらすはずである。これらの突然変異体の増殖を保証するために、培地に、３つの分岐鎖アミノ酸、バリン、ロイシン、およびイソロイシンを追加する。
実施例６ｂおよび９に記載されているように、Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）の単一突然変異体、ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ突然変異体は、相同組換えか、またはＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン突然変異誘発ツールを用いることのいずれかにより、作製することができる。
ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢノックアウトカセットの設計：
ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ遺伝子についてのノックアウト構築物を、上記で説明されているように、設計する。
ａｌｓＳ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号１１３）および３’相同アーム（配列番号１１４）を、Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーａｌｓＳ５ｆ（配列番号１１５）／ａｌｓＳｒ（配列番号１１６）およびａｌｓＳ３ｆ（配列番号１１７）／ａｌｓＳ３ｒ（配列番号１１８）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−ａｌｓＳ−ＫＯを得る。このプラスミドを、上記の実施例において記載されているように、Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）へ接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより、導入する。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲおよびこのＰＣＲ産物のシーケンシングのために、ａｌｓＳの相同アームに隣接するプライマーａｌｓＳＯｆ（配列番号１１９）およびａｌｓＳＯｒ（配列番号１２０）を用いて、ａｌｓＳノックアウトについてスクリーニングする。
ｉｌｖＣ遺伝子のノックアウトについては、ｉｌｖＣ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号１２１）および３’相同アーム（配列番号１２２）を、Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーｉｌｖＣ５ｆ（配列番号１２３）／ｉｌｖＣ５ｒ（配列番号１２４）およびｉｌｖＣ３ｆ（配列番号１２５）／ｉｌｖＣ３ｒ（配列番号１２６）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−ｉｌｖＣ−ＫＯを得る。このプラスミドを、上記の実施例において記載されているように、Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）へ接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより、導入する。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲおよびこのＰＣＲ産物のシーケンシングのために、ｉｌｖＣ遺伝子の相同アームに隣接するプライマーｉｌｖＣＯｆ（配列番号１２７）およびｉｌｖＣＯｒ（配列番号１２８）を用いて、ｉｌｖＣノックアウトについてスクリーニングする。
ｉｌｖＩ遺伝子のノックアウトについては、ｉｌｖＩ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号１２９）および３’相同アーム（配列番号１３０）を、Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーｉｌｖＩ５ｆ（配列番号１３１）／ｉｌｖＩ５ｒ（配列番号１３２）およびｉｌｖＩ３ｆ（配列番号１３３）／ｉｌｖＩ３ｒ（配列番号１３４）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−ｉｌｖＩ−ＫＯを得る。このプラスミドを、上記の実施例において記載されているように、Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）へ接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより、導入する。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲおよびこのＰＣＲ産物のシーケンシングのために、ｉｌｖＩ遺伝子の相同アームに隣接するプライマーｉｌｖＩＯｆ（配列番号１３５）およびｉｌｖＩＯｒ（配列番号１３６）を用いて、ｉｌｖＩノックアウトについてスクリーニングする。
ｉｌｖＢ遺伝子のノックアウトについては、ｉｌｖＢ遺伝子の約１ｋｂの５’相同アーム（配列番号１３７）および３’相同アーム（配列番号１３８）を、Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する。プライマーｉｌｖＢ５ｆ（配列番号１３９）／ｉｌｖＢ５ｒ（配列番号１４０）およびｉｌｖＢ３ｆ（配列番号１４１）／ｉｌｖＢ３ｒ（配列番号１４２）を用いて、それぞれ、５’相同アームおよび３’相同アームを増幅する。２つのＰＣＲ産物を、ｐＭＴＬ８５１５１プラスミドへＳｂｆ１／Ｎｏｔ１部位の間およびＮｈｅ１／Ａｓｃ１部位の間にクローニングして、ｐＭＴＬ８５１５１−ｉｌｖＢ−ＫＯを得る。このプラスミドを、上記の実施例において記載されているように、Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）へ接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより、導入する。チアンフェニコールプレート上での選択後、形質転換体を、ＰＣＲおよびこのＰＣＲ産物のシーケンシングのために、ｉｌｖＢ遺伝子の相同アームに隣接するプライマーｉｌｖＢＯｆ（配列番号１４３）およびｉｌｖＢＯｒ（配列番号１４４）を用いて、ｉｌｖＢノックアウトについてスクリーニングする。
単一遺伝子ノックアウト突然変異体が得られたならば、他の３個のアセト乳酸シンターゼ遺伝子を逐次的にターゲットして、全ての４個のアセト乳酸シンターゼ遺伝子が欠失した突然変異体を作製する。これらの突然変異体の増殖は、分岐鎖アミノ酸に対して栄養要求性である可能性がある。これらの突然変異体におけるアセトイン、２，３−ＢＤＯ、および他の代謝産物の産生または産生の欠如を、前の実施例について記載されているように、ＨＰＬＣによって分析することができる。基質としてのピルベート、ならびに補因子としてのチアミン二リン酸およびフラビンアデニンジヌクレオチドを用いた酵素活性アッセイを実施し、これらの突然変異体におけるアセト乳酸シンターゼ活性の喪失について確認することができる（Tittmann、Vyazmensky、Hubner、Barak、およびChipman、2005；Vinogradovら、2006）。
ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ遺伝子についてのＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロンターゲティングカセットの設計：
Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei） ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ遺伝子はまた、ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン媒介性遺伝子破壊ツールを用いて破壊し、または不活性化することができる（Heapら、2010）。ＣｌｏｓＴｒｏｎ．ｃｏｍで提供されるＰｅｒｕｔｋａアルゴリズムを用いて、ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩのセンス鎖、およびｉｌｖＢ遺伝子のアンチセンス鎖上で、それぞれ、塩基３０３／３０４の間、２２８／２２９の間、９７５／９７６の間、および１５７／１５８の間にグループＩＩイントロンターゲット部位を同定する。アルゴリズムによって同定される他の部位もまたターゲットすることができる。ＤＮＡ２．０によって商業的に合成され、およびｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２ベクターにおいて送達されるイントロンターゲティング領域（ａｌｓＳ − 配列番号１４５；ｉｌｖＣ − 配列番号１４６；ｉｌｖＩ − 配列番号１４７、およびｉｌｖＢ − 配列番号１４８）を、同じアルゴリズムを用いて設計する。最終ベクター、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ａｌｓＳ−３０３！３０４ｓ、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ｉｌｖＣ−２２８！２２９ｓ、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ｉｌｖＩ−９７５！９７６ｓ、およびｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ｉｌｖＢ−１５７！１５８ａは、ターゲット部位への挿入により抗生物質クラリスロマイシンに対する抵抗性を与えるレトロ転位活性化ｅｒｍＢマーカー（ＲＡＭ）を含有する。これらのプラスミドを、Ｃ．ラグスダレイ（C. ragsdalei）へ、接合かまたはエレクトロポレーションのいずれかにより導入する。形質転換体を、チアンフェニコール寒天プレートおよびクラリスロマイシン寒天プレート上で逐次的に選択し、ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＩ、およびｉｌｖＢ遺伝子の不活性化について、それぞれ、プライマーａｌｓＳＣＴｆ（配列番号１４９）およびａｌｓＳＣＴｒ（配列番号１５０）、ｉｌｖＣＣＴｆ（配列番号１５１）およびｉｌｖＣＣＴｒ（配列番号１５２）、ｉｌｖＩＣＴｆ（配列番号１５３）およびｉｌｖＩＣＴｒ（配列番号１５４）、ならびにｉｌｖＢＣＴｆ（配列番号１５５）およびｉｌｖＢＣＴｒ（配列番号１５６）を用いたＰＣＲによってスクリーニングする。
単一遺伝子が破壊されたＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体が得られたならば、エレクトロポレーションかまたは接合のいずれかにより突然変異体へ導入されるフリッパーゼ遺伝子を有するｐＭＴＬプラスミドを用いて、ＲＡＭ ｅｒｍＢカセットを、これらの突然変異体のゲノムから除去する。生じた形質転換体を、クラリスロマイシンに対するそれの感受性を試験することにより、ならびに（ｉｉ）ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＢ１、およびｉｌｖＢ２遺伝子におけるａｌｓＳＣＴｆ（配列番号１４９）およびａｌｓＳＣＴｒ（配列番号１５０）、ｉｌｖＣＣＴｆ（配列番号１５１）およびｉｌｖＣＣＴｒ（配列番号１５２）、ｉｌｖＩＣＴｆ（配列番号１５３）およびｉｌｖＢＩＣＴｒ（配列番号１５４）、ならびにｉｌｖＢＣＴｆ（配列番号１５５）およびｉｌｖＢＣＴｒ（配列番号１５６）、それぞれを用いての、グループＩＩイントロン挿入部位に隣接するプライマーでのＰＣＲにより、ならびにこれらのＰＣＲ産物のさらなるシーケンシングにより、ｅｒｍＢカセットの喪失についてスクリーニングする。
ｅｒｍＢカセットの喪失を確認した後、ノックアウト突然変異体のようなＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体を、他のアセト乳酸シンターゼ遺伝子を不活性化するために、逐次的にターゲットする。一実施形態において、これらのＣｌｏｓＴｒｏｎ突然変異体を、分岐鎖アミノ酸の存在下で増殖させる。これらの突然変異体におけるアセトイン、２，３−ＢＤＯ、および他の代謝産物の産生または産生の欠如を、前の実施例において記載されているように、ＨＰＬＣによって分析し、基質としてのピルベート、ならびに補因子としてのチアミン二リン酸およびフラビンアデニンジヌクレオチドを用いた酵素活性アッセイを実施して、これらの突然変異体におけるアセト乳酸シンターゼ活性の喪失について確認することができる（Tittmannら、2005；Vinogradovら、2006）。
本発明は、読者が過度の実験なしに本発明を実施することを可能にするために、ある特定の好ましい実施形態に関して、本明細書に記載されている。しかしながら、その成分およびパラメータの多くが、本発明の範囲から逸脱することなく、ある程度まで変化もしくは改変されて得、または既知の等価物に置き換えられ得ることに、当業者は容易に気づくであろう。そのような改変および等価物は、あたかも個々に示されているように、本明細書に組み入れられていることは認識されているはずである。タイトル、見出しなどは、この文書の読者の理解を増強するために提供され、本発明の範囲を限定するものとして読み取られるべきではない。
もしあれば、上記および下記で引用された全ての出願、特許、および刊行物の全開示は、参照により本明細書に組み入れられている。しかしながら、本明細書におけるいかなる出願、特許、および刊行物への参照も、それらが妥当な先行技術を構成し、または世界中のどの国においても共通の一般的な知識の一部を形成するという承認、またはいかなる型の示唆としても解釈されず、および解釈されるべきではない。
本明細書およびこれに続く任意の請求項を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、語「含む」、「含むこと」などは、排他的意味にではなく、包括的意味に、換言すると、「含むが、限定されない」という意味に解釈されるべきである。
（参考文献）

Claims (29)

  1. 一酸化炭素を含む基質の発酵において、１つまたは複数の産物を産生し、ならびに低下した量の２，３ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を産生し、または２，３ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を実質的に産生しないように適応している組換え一酸化炭素資化性酢酸産生微生物であって、親微生物と比較して、２，３−ブタンジオール生合成経路を破壊する１つまたは複数の遺伝子改変を含む、微生物。
  2. 一酸化炭素を含む基質の発酵において、主要産物としてエタノールを産生し、ならびに低下した量の２，３ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を産生し、または２，３ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を実質的に産生しないように適応している組換え一酸化炭素資化性酢酸産生微生物であって、親微生物と比較して、２，３−ブタンジオール生合成経路を破壊する１つまたは複数の遺伝子改変を含む、微生物。
  3. ホルメート、ラクテート、ピルベート、スクシネート、バリン、ロイシン、イソロイシン、アセトラクテート、マレート、フマレート、２−オキソグルタレート、シトレートのうちの１つまたは複数をさらに産生するように適応している、請求項２に記載の組換え微生物。
  4. 親微生物と比較して、増加した量の、エタノール、ホルメート、ラクテート、ピルベート、スクシネート、バリン、ロイシン、イソロイシン、アセトラクテート、マレート、フマレート、２−オキソグルタレート、シトレートのうちの１つまたは複数を産生するように適応している、請求項２または３に記載の組換え微生物。
  5. ピルベートをアセトラクテートへ変換する能力がある１つもしくは複数の酵素の発現および／または活性を破壊する少なくとも１つの遺伝子改変を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換え微生物。
  6. アセトラクテートをアセトインへ変換する能力がある１つもしくは複数の発現および／または活性を破壊する少なくとも１つの遺伝子改変を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換え微生物。
  7. アセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある１つもしくは複数の酵素の発現および／または活性を破壊する少なくとも１つの遺伝子改変を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換え微生物。
  8. ピルベートをアセトラクテートへ、アセトラクテートをアセトインへ、およびアセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある酵素のうちの２つ以上の組み合わせの発現および／または活性を破壊する少なくとも１つの遺伝子改変を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換え微生物。
  9. ピルベートをアセトラクテートへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素が、アセト乳酸シンターゼ（ａｌｓＳ）である、請求項５または８に記載の組換え微生物。
  10. アセトラクテートをアセトインへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素が、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ｂｕｄＡ）である、請求項６または８に記載の組換え微生物。
  11. アセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素が、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（２，３ｂｄｈ）、アセトインレダクターゼ、第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼから選択される酵素である、請求項７または８に記載の組換え微生物。
  12. １つまたは複数の遺伝子改変が、アセト乳酸シンターゼ（ａｌｓＳ）、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＢｕｄＡ）、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（２，３ｂｄｈ）、アセトインレダクターゼ、および第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼの１つもしくは複数の発現および／または活性を破壊する、請求項１から１１のいずれか一項または複数に記載の組換え微生物。
  13. 親微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）、およびクロストリジウム・コスカッティ（Clostridium coskatii）を含む群から選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組換え微生物。
  14. 親微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）ＤＳＭ２３６９３である、請求項１２に記載の組換え微生物。
  15. 一酸化炭素を含む基質の発酵において、１つまたは複数の産物を産生する能力があり、ならびに低下した量の２，３ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を産生する能力があり、または２，３ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を実質的に産生する能力がない組換え一酸化炭素資化性酢酸産生微生物の作製方法であって、２，３−ブタンジオール生合成経路を破壊するように一酸化炭素資化性酢酸産生親微生物を遺伝子改変することを含む、方法。
  16. 一酸化炭素を含む基質の発酵において、主要産物としてエタノールを産生する能力があり、ならびに低下した量の２，３ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を産生する能力があり、または２，３ブタンジオールおよび／もしくはその前駆体を実質的に産生する能力がない組換え一酸化炭素資化性酢酸産生微生物の作製方法であって、２，３−ブタンジオール生合成経路を破壊するように一酸化炭素資化性酢酸産生親微生物を遺伝子改変することを含む、方法。
  17. ピルベートをアセトラクテートへ、アセトラクテートをアセトインへ、および／またはアセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を破壊する１つまたは複数の遺伝子改変を親微生物に導入することを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. ピルベートをアセトラクテートへ、アセトラクテートをアセトインへ、および／またはアセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある酵素をコードする２つ以上の遺伝子の組み合わせを破壊する１つまたは複数の遺伝子改変を親微生物に導入することを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. ピルベートをアセトラクテートへ変換する能力がある１つもしくは複数の酵素が、アセト乳酸シンターゼ（ａｌｓＳ）であり、アセトラクテートをアセトインへ変換する能力がある１つもしくは複数の酵素が、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ｂｕｄＡ）であり、および／またはアセトインを２，３−ブタンジオールへ変換する能力がある１つもしくは複数の酵素が、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（２，３ｂｄｈ）、アセトインレダクターゼ、第一級：第二級アルコールデヒドロゲナーゼから選択される酵素である、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. １つまたは複数のアセト乳酸シンターゼ（ａｌｓＳ）、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ＢｕｄＡ）、および２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（２，３ｂｄｈ）をコードする遺伝子のうちの１つまたは複数を破壊する１つまたは複数の遺伝子改変を親微生物に導入することを含む、請求項１５から１９に記載の方法。
  21. 請求項１５から２０のいずれか一項に記載の方法によって作製される組換え微生物。
  22. 請求項１から１４および２１のいずれか一項に記載の微生物を用いた、ＣＯを含む基質の発酵を含む、１つまたは複数の産物の産生方法。
  23. 請求項１から１４および２１のいずれか一項に記載の微生物を用いた、ＣＯを含む基質の発酵を含む、エタノール、ホルメート、ラクテート、ピルベート、スクシネート、バリン、ロイシン、イソロイシン、アセトラクテート、マレート、フマレート、２−オキソグルタレート、シトレートのうちの１つまたは複数の産生方法。
  24. （ａ）請求項１から１３および１９のいずれか一項に記載の１つまたは複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクタに、ＣＯを含む基質を供給するステップ；ならびに
    （ｂ）バイオリアクタ内で培養物を嫌気的に発酵して、好ましくはエタノールを含む、１つまたは複数の産物を産生するステップ
    を含む、請求項２２または２３に記載の方法。
  25. （ａ）産業プロセスの結果として生成されるＣＯ含有ガスを、前記ガスが大気中へ放出される前に、捕獲するステップ；
    （ｂ）請求項１から１３および１９のいずれか一項に記載の１つまたは複数の微生物を含有する培養物による、好ましくはエタノールを含む、１つまたは複数の産物を産生するためのＣＯ含有ガスの嫌気性発酵ステップ
    を含む、請求項２２または２３に記載の方法。
  26. 基質が、少なくとも約２０体積％〜約１００体積％のＣＯを含む、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 発酵ブロスから１つまたは複数の産物を回収するステップをさらに含む、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 請求項２２から２７のいずれか一項に記載の方法によって産生される場合の１つまたは複数の産物。
  29. エタノール、ホルメート、ラクテート、ピルベート、スクシネート、バリン、ロイシン、イソロイシン、アセトラクテート、マレート、フマレート、シトレート、および２−オキソグルタレートからなる群から選択される、請求項２８に記載の１つまたは複数の産物。
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