JP2009500035A - エタノール産生のための組み換えホスト細胞及び培地 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本発明は、2005年7月1日出願の米国特許仮出願第60/696,076号の優先権を主張し、その全ての内容を参照として本明細書に明確に組み込む。
本発明に対する資金は、米国農務省の助成金第01−35504−10669号、及び米国エネルギー省のFG02−96ER20222号に基づき、米国政府により一部が提供された。米国政府は、本発明に対するある特定の権利及び資格を有している。
(a)糖をエタノールに変換する酵素をコードする非相同性ポリヌクレオチド配列(ここにおいて、ホスト細胞は、細菌による主要発酵生成物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで、非相同性ポリヌクレオチド配列を発現する)、及び
(b)細胞の代謝経路において、糖からエタノール以外の生成物を産生するタンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列中の突然変異(ここにおける突然変異は、前記突然変異がない細胞によるエタノール産生に比べて、この細胞による増大したエタノール産生をもたらす)、
を含んでなる、サッカライドを分解するのに適している組み換えホスト細胞である。
組み換えホスト細胞のある態様では、この突然変異は、欠失、挿入又は塩基置換の突然変異である。
(a)エタノール産生の親ホスト細胞を、親細胞によってエタノールを産生するのに適した条件下で、選択培地及びオリゴサッカライド源に接触させること、
(b)選択された条件下の培地中で前記サッカライド源から産生されるエタノールのレベルを測定すること、
(c)選択された条件下の培地中で増大した発現を有する望ましくない副生成物を同定するために、サッカライド源から産生されるエタノール以外の少なくとも1つの生成物のレベルを測定すること、そして
(d)代謝経路において、望ましくない副生成物を産生するタンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列を突然変異させ(ここにおける突然変異は、代謝経路中の少なくとも1つの遺伝子産物の発現を低減又は消去して、突然変異なしの親細胞によるエタノール産生に比べて、前記細胞によるエタノール産生を増大させる)、これによりサッカライド源からのエタノール産生を最適化した組み換えホスト細胞を作製すること;
を含んでなる。
(a)選択条件下でのホスト細胞による最適な生育及びエタノール産生を支援する選択培地;
(b)サッカライド源;及び
(c)選択培地及び条件でのエタノール産生のために最適化されている組み換えホスト細胞(この細胞は、
糖をエタノールに変換する酵素をコードする非相同性ポリヌクレオチド配列(ここにおいて、当該細胞は、当該ホスト細胞による主要発酵生成物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで、当該非相同性ポリヌクレオチド配列を発現する);及び
当該細胞の代謝経路において、前記条件下及び培地中で当該サッカライド源からエタノール以外の生成物を産生するタンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列中の突然変異(ここにおける突然変異は、当該タンパク質の発現を低減又は消去し、これにより当該ホスト細胞によるエタノール産生を、突然変異がない細胞によるエタノール産生に比べて増大させて、エタノール産生を最適化する)を包含する)、
を含んでなる。
本発明の他の態様及び利点は以下で論じる。
I.定義
本明細書で用いる「組み換えホスト細胞」、「組み換え微生物」などの用語は、遺伝子操作、例えば、トランスフェクトされるような非相同性ポリヌクレオチド配列を取り込むことができる遺伝子操作に、適しているか又は操作しやすい細胞、又はそのように操作されている細胞を包含するように意図されている。前記細胞は、微生物又は高度な真核細胞であり得る。前記用語は、もともとトランスフェクトされている細胞の子孫を含むように意図されている。ある態様では、細胞は、細菌の細胞、例えば、グラム陽性細菌の細胞又はグラム陰性細菌の細胞である。後者の用語は、エシェリキア属、赤痢菌、シトロバクター属、サルモネラ属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、エルウィニア属、クルイベラ属、セラチア属、セデセア属、モルガネラ属、ハフニア属、エドワードシエラ属、プロビデンシア属、プロテウス属及びエルシニア属のような、腸内細菌科(family Enterobacteriaceae)の条件嫌気性のグラム陰性細胞の全てを含むように意図されている。好ましい組み換えホストは、大腸菌又はクレブシエラ・オキシトカの細胞である。
検討したように、本発明はサッカライドを分解するのに適している、新規及び改良された組み換えホスト細胞に関する。この細胞は、発酵の不要な副生成物産生の代謝経路に関連する1つ又はそれ以上の遺伝子における突然変異を包含する。これらの経路の変動は、サッカライド出発原料のより多くの割合を、他の不要な発酵生成物ではなく、エタノールへ変換させる。
別の態様では、本発明は、酵素α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ及びα−アセトラクテート・シンターゼをそれぞれコードする、budA及びbudB遺伝子配列を包含する単離された核酸分子を特徴としている。この核酸は、グラム陰性及びグラム陽性の細菌、例えば、グラム陰性細菌であるクレブシエラ・オキシトカ由来である。
長さ18塩基対より少ないハイブリッドのためには、Tm(℃)=2(Aの数+T塩基数)+4(Gの数+C塩基数)。
長さ18〜49塩基対の範囲のハイブリッドのためには、Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(G(%)+C)−600/N)。ここにおけるNは、ハイブリッド中の塩基の数であり、そして[Na+]は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度(1×SSC=0.165Mに対する[Na+])である。
本発明は更に、プラスミドベクターを包含するベクター(例えば、組み換えベクター)を特徴としている。本発明によるベクターは、本明細書に記載の核酸分子(例えば、単離の又は組み換えの核酸分子及び/又は遺伝子)を含有している。特に、組み換えベクターは、本明細書に記載のような細菌遺伝子産物、有利にはbudA及びbudB遺伝子産物(例えば、SEQ ID NO:3又は4)、又はホスト細胞においてこれらの遺伝子産物の発現を低減又は消去する、突然変異のbudA及びbudB配列(例えば、SEQ ID NO:5又は8)をコードする核酸配列を包含することを特徴としている。これらの配列は、より有利には、グラム陰性又はグラム陽性細菌のbudA及びbudB遺伝子産物であり、更により有利には、クレブシエラ属又はエルウィニア属由来のbudA及びbudB遺伝子産物である。
上記に検討のように、本発明による組み換えホスト細胞は、サッカライドの発酵時にエタノール以外の生成物を産生することになる、代謝経路由来のタンパク質をコードする1つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列中に突然変異を包含する。欠失突然変異のような突然変異を包含する微生物を作製する遺伝子法は、当該技術分野で公知である。PCRベースの遺伝子のクローニング、プラスミドの構築及び遺伝子分析のような遺伝子構築物の単離及び操作するための遺伝子技術はよく確立されていて、分子生物学の技術分野では日常的である。例えば、「Ausubel et al., 1987; Miller, 1992」及び「Sanbrook and Russell, 2001」[24〜26] のような方法論の論文を参照されたい。除去可能な抗生物質耐性遺伝子の使用を含む、染色体の欠失[22]及び組み込みを作製する方法も、記載されている[27〜29]。
(a)エタノール産生の親ホスト細胞を、親細胞によるエタノール産生に適している条件下で、選択生育培地及びサッカライド源と接触させること、
(b)選択された条件下で、オリゴサッカライド源からのエタノール産生のレベルを測定すること、
(c)当該条件下で増大した発現を有する望ましくない副生成物を同定するために、サッカライド源から産生されるエタノール以外の生成物のうちの少なくとも1つ、好ましくは全てのレベルを測定すること、
(d)代謝経路において、前記の望ましくない副生成物を産生するタンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列を突然変異させ(ここにおける突然変異は、代謝経路中の少なくとも1つの遺伝子産物の発現を低減又は消去して、突然変異なしの親細胞によるエタノール産生に比べて、選択培地中での突然変異細胞によるエタノール産生を増大させる)、これにより選択培地中でのエタノール産生を最適化した組み換えホスト細胞を作製すること。
別の態様では、本発明は、サッカライドを分解するのに適した組み換えホスト細胞による生育及びエタノール産生を支援する最小培地を提供する。本発明の最小培地は以下の主要成分を含有している。
決められた窒素源
複合の窒素源
ホスフェイト源
マグネシウム源
任意に、FeCl2及びNiCl2のような金属イオン源が、クレブシエラ・オキシトカの誘導体のような、ある特定のエタノール産生の細菌株の酵素活性に有用なコファクターとして、培地のある態様に加えられる。
NH2CONH2(尿素) 10.0mM
CSL 10.0g/L
KH2PO4 10.7mM
Na2HPO4 1.3mM
CaCl2 1mM
MgSO4 1mM
FeCl2 0.074mM
NiCl2 0.0068mM
発酵反応に用いるために、サッカライド源、例えば上記のような糖源であるグルコース(例えば、90g/Lで)又はリグノセルロース源を加える。
本発明の上記の最適化最小培地、並びに最大のエタノール産生及び最小の副生成物産生のために遺伝子操作で最適化した組み換え微生物を、有利に組み合わせてエタノール産生のシステムにできる。
(a)選択条件下でのホスト細胞による最適な生育及びエタノール産生を支援する選択培地;
(b)サッカライド源;及び
(c)選択培地及び条件でのエタノール産生のために最適化された組み換えホスト細胞、
この細胞は:
糖をエタノールに変換する酵素をコードする非相同性ポリヌクレオチド配列(ここにおける細胞は、当該ホスト細胞による主要発酵生成物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで、当該非相同性ポリヌクレオチド配列を発現する)、及び
当該細胞の代謝経路において、前記条件下及び培地中で当該オリゴサッカライド源からエタノール以外の生成物を産生するタンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列中の突然変異(ここにおける突然変異は、当該タンパク質の発現を低減又は消去し、これにより当該ホスト細胞によるエタノール産生を、突然変異がない細胞によるエタノール産生に比べて増大させて、エタノール産生を最適化する)を包含する。
上記の方法の実施に一般的に有用な材料及び方法が更に、下記及び以下の実施例に記載されている。
(実施例)
材料及び方法
以下の材料及び方法は次の実施例を通して用いられる。
1a.株及びプラスミド
表1は、本発明の組み換え微生物を構築するために使用される生命体及びプラスミドを記載する。
エタノール産生の株を、2%のグルコース及びクロラムフェニコール(1日おきに、40又は600mg/L)を含有するL寒天培地(Luria agar)[24]上、アルゴン雰囲気下で保持した。その他の株を、糖を添加していないL寒天プレート上で適当な抗生物質と共に保持した。特に断りのない限り、アンピシリン(50mg/L)、カナマイシン(50mg/L)、アプラマイシン(50mg/L)及びテトラサイクリン(12.5mg/L)を選択のために使用した。温度条件付きレプリコンのプラスミドを含有している株を30℃で生育させた。その他の全ての株は、指摘されたものを除いて、37℃で保持した。プラスミド調製物を、−20℃で保存した。保存培養は、グリセロール中、−75℃で保存した。
PCRベースの遺伝子のクローニング、プラスミドの構築及び遺伝子分析について、標準的な方法を用いた[24〜26]。組み込み、染色体の欠失、組み込み、及び移動可能な抗生物質抵抗遺伝子の使用についての方法を、既述のようにして用いた[22、27〜29]。大腸菌DH5αを、構築のために使用した。
α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ(budA)及びα−アセトラクテート・シンターゼ(budB)の5’末端を含有するDNA断片を、鋳型としてのK.オキシトカ由来のゲノムDNA及びTaqPCRマスターミックス(Qiagen)を用いるPCRで増幅した。94℃で3分間の初期変性の後、DNAを30サイクル増幅した(94℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で70秒間の伸長)。72℃で10分間の最終伸長も含まれている。
フォワードプライマー:5’GCTGAATCGGGTCAACATTT−3’(SEQ ID NO:1)
リバースプライマー:5’−TTTCGGTTTGTCCAGGTAGT−3’(SEQ ID NO:2)
を用いて増幅して、pCR2.1−TOPOにクローンした。pLOI3301と呼ばれる、この断片の配列を決定して、GenBankに寄託した(受入番号:AY722056)。
上の1dに記載のように調製された、budA及びbudBに欠失突然変異を含有しているDNA構築物を、これらの構築物で形質転換された組み換え細菌を作製するために使用した。例えば、エタノール産生のクレブシエラ・オキシトカM5A1株の形質転換を記載している実施例5を、参照されたい。次いで、バクテリオファージP1(大腸菌のファージ)を、K.オキシトカM5A1中に構築されているbudAB染色体欠失をP2株に形質導入してBW21株を作製するために用いた。
株は、ボーグ・プロスカウル(Vogues-Proskaur;VP)寒天法の変法を用いて、アセトイン産生についてスクリーニングしたが、この方法は、着色生成物の限界拡散によって感度を増強するために、ペトリプレートの代わりにマイクロタイタープレートを用い、「Blomqvist, et al.」[35]に記載されている。各ウェルに1mlの培地(1リットル当たり、2.5gのディフコバクトペプトン(Difco Bactopeptone)、1.0gのディフコ酵母抽出物、10gのグルコース、1.0gのピルビン酸ナトリウム及び25gの寒天)を入れて、接種した。24時間後に、αーナフトールを5%含有する2.5NのNaOH溶液を200μLずつ各ウェルに加えた。室温で1時間着色を観察した。赤色着色がないことで、アセトイン(budA活性の生成物)のないことを確認した。更なる確認は、発酵生成物のHPLC分析でなされた。
公知の培地及び本明細書で開発された(最適化尿素培地1、OUM1)培地の両方の成分を、表2に要約した。
種培養物(250mlフラスコ中に150ml)を、50g/Lのグルコースを含有する培地で35℃(120rpm)で16時間生育させた。細胞を遠心分離(5000×g、5分間)して採取し、乾燥細胞重量で33mg/Lの初期濃度(OD550nm=0.1)を示す接種材料として用いた。発酵に用いるそれぞれの培地は、種生育にも用いたが、低いグルコース濃度(50g/L)で用いた。発酵容器は、既述されており[34]、350ml(90g/Lのグルコース)の初期容量を含有していた。培養物を、35℃(150rpm)で培養した。培養液を、2NのKOHを自動的に添加してpH5.2に保持した(指示があるときを除いて)。
ボシュロムスペクトロニク(Bosch & Lomb Spectronic)70分光光度計を用いるOD550nmの測定により、細胞集団を評価した。この測定器では、1単位のOD550nmが、0.33mg(乾燥重量)/Lの細胞密度に相当する。K.オキシトカについての細胞密度の測定は、細胞の凝集性による大きな誤差を有している。エタノールは、既述[11]のように、バリアン(Varian)モデル3400Xを用いるガスクロマトグラフィーで測定した。その他の発酵生成物は、二重検出器(屈折率及びUV210nm)[33]を備えた、ヒューレットパッカード(Hewlett-Packard)モデル1090のシリーズIIクロマトグラフ及びバイオラードアミネックス(Bio-Rad Aminex)87Hイオンパーティションカラム(45℃;4mMのH2SO4;0.4ml/min;10μLの注入容量)を用いる、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって測定した。炭素バランスは、既述[29,36]のように計算した。発酵培地としてLBを用いた場合は、細胞集団は、複合培地成分から単独に作製されたものと仮定して、炭素バランスの計算に含めなかった。
本実施例は、クレブシエラ株のような組み換えエタノール産生の細菌による生育及びエタノール産生のために最適化された、単独の窒素源として尿素を包含する新規な最小培地(OUM1)の開発について記載する。この新規な培地は、K.オキシトカP2株を用いて、その生育及びエタノール産生の能力を幾つかの公知の培地と比較して、開発しそして最適化された。
L培地(LB)(Ausubel et al., 1989);
M9培地(+Fe)(Neidhardt et al., 1974);
U−M9(+Fe)、ここでは、NH4Clが、当量窒素の尿素に置き換わっている;
0.5%のコーンスティープリカー、CSL+M(Martinez et al., 1999);
U−0.5%のCSL+M、ここでは、(NH4)2SO4が、当量窒素の尿素に置き換わっている。
この新規な培地を、本明細書では「最適化尿素培地1号」(OUM1)と称する。
上記培地のそれぞれの組成は、上記表2に示す。
本実施例は、エタノール産生の細菌と共に用いる尿素を包含する最適化された最小培地を開発するための方法を記し、そして「OUM1」と称する培地のような態様の処方を提供する。
上記のように、ある特定タイプの発酵反応、例えば、発酵する糖がリグノセルロース原料由来である反応では、菌体ヒドロラーゼ及びセルラーゼが最適な性能を示す範囲である酸性のpHで、反応を実施することが望ましい。本実施例は、新たに開発された培地OUM1を含む、種々の培地中で生育するエタノール産生の細菌P2株による発酵で、pHがエタノール及び副産物の産生に及ぼす影響を記載する。
本実施例は、細菌(クレブシエラ・オキシトカ)由来の、budA遺伝子の推定全長cDNA配列、及びbudB遺伝子の部分cDNA配列の単離を、そしてブタンジオール経路にあるこれらの遺伝子が崩壊しているDNA断片の構築物を記載している。細菌細胞への導入に続く、これらの構築は、細胞によるサッカライドの発酵時に不要な2,3−ブタンジオール及びアセトインの産生を消去するために有用である。
上記の実施例3及び表3で明確にしたように、発酵反応時にエタノール産生の組み換えK.オキシトカP2株は、OUM1発酵培地中にて酸性pHで生育させると、低下したエタノール産生及びブタンジオール経路の副生成物の増大した産生を示す。上記に検討したように、budAB遺伝子は、2,3−ブタンジオール及びアセトインの産生に関わる2つの酵素、すなわちα−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ及びα−アセトラクテート・シンターゼをそれぞれコードする。本実施例は、突然変異細胞中でbudAB遺伝子産物の発現の消去をもたらす、budAB遺伝子における欠失突然変異を含んでいる、P2株由来の新規なエタノール産生のK.オキシトカ株であるBW21株の作製について記載する。
本実施例は、新たに開発されたエタノール産生のK,オキシトカBW21株(実施例5に記載)による、グルコース発酵の改善されたエタノール産生及び副生成物の低減された産生について、親株であるK.オキシトカP2と比較して、記載する。
上記のように、生成物の収率及び細菌培養培地のような生産材料に関わるコストは、エタノールのような汎用化学製品の経済性において重要な因子である。K.オキシトカは、この細菌が元来尿素を窒素源として使用する能力を有しているので、エタノール産生の細菌として有利な選択肢である。同等の窒素原料として、尿素は通常、アンモニウム塩のコストの約半分で市販されている。窒素源としての尿素の使用は、更に付加的な利点を有している。アンモニウム塩の代謝と異なって、尿素の代謝は、培地の酸性化を助長しない[41]ので、pHを調節するために必要な塩基の量を減少させる。
引例の概説は、本発明の正しい評価を高めるであろうと信じる。以下の文献は、下に示した番号で本明細書を通して参照されている。
2. Zaldivar, J.; Nielsen J.; Olson L. Fuel Ethanol Production from Lignocellulose: a Challenge for Metabolic Engineering and Process Integration. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001, 56, 17-34.
3. Von Sivers M.; Zacchi G.; Olson L.; Hahn-Hagerdal B. Cost Analysis of Ethanol from Willow Using Recombinant Escherichia coli. Biotechnol. Prog. 1994, 10, 555-560
4. Wyman, C. E. Potential Synergies and Challenges in Refining Cellulosic Biomass to Fuels, Chemicals, and Power. Biotechnol. Prog. 2003, 19, 254-262.
5. Ohta, K.; Beall D.S.; Mejia J.P.; Shanmugan K.T.; Ingram L.O. Metabolic Engineering of Klebsiella oxytoca M5A1 for Ethanol Production from Xylose and Glucose. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57, 2810-2815.
6. Wood, B. E.; Ingram L. O. Ethanol Production from Cellobiose, Amorphous Cellulose and Crystalline Cellulose by Recombinant Klebsiella oxytoca Containing Chromosomally Integrated Zymomonas mobilis Genes for Ethanol Production and Plasmids Expressing Thermostable Cellulase Genes from Clostridium thermocellum. Appl. Environ. Microbiol. 1992, 58, 2103-2110.
7. Bothast, R.J.; Saha B,; Flosenzier A.V.; Ingram L.O. Fermentation of L-arabinose D-xylose and D-glucose by Ethanologenic Recombinant Klebsiella oxytoca strain P2. Biotechnol Lett. 1994, 16, 401-406.
8. Doran J.B.; Aldrich H.C.; Ingram L.O. Saccharification and Fermentation of Sugar-cane Bagasse by Klebsiella oxytoca P2 Containing Chromosomally Integrated Genes Encoding the Zymomonas mobilis Ethanol Pathway. Biotechnol. Bioengin. 1994, 44, 240-247.
9. Brooks, T.A.; Ingram L.O. Conversion of Mixed Waste Office Paper to Ethanol by Genetically Engineered Klebsiella oxytoca strain P2. Biotechnol. Prog. 1995, 11, 619-625.
10. Wood, B.E.; Aldrich H.C.; Ingram L.O. Ultrasound Stimulates Ethanol Production During the Simultaneous Saccharification and Fermentation of Mixed Waste Office Paper. Biotechnol. Prog. 1997, 13, 232-237.
11. Ohta, K.; Beall D.S.; Mejia J.P.; Shanmugam K.T.; Ingram L.O. Genetic Improvement of Escherichia coli for Ethanol Production: Chromosomal Integration of Zymomonas mobilis Genes Encoding Pyruvate Decarboxylase and Alcohol Dehydrogenase II. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57, 893-900.
12. Linsay, S.E.; Bothast R.J.; Ingram L.O.. Improved Strains of Recombinant Escherichia coli of Ethanol Production from Sugar Mixtures. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995, 43, 70-75.
13. Yomano, L.P.; York S.W.; Ingram L.O. Isolation and Characterization of Ethanol Tolerant Mutants of Escherichia coli KO11 for Fuel Ethanol Production. J. Ind. Microbiol. 1998, 20, 132-138.
14. Burchhardt, G.; Ingram L.O. Conversion of Xylan to Ethanol by Ethanologenic Strains of Escherichia coli and Klebsiella oxytoca. Appl. Environ. Microbiol. 1992, 58, 1128-1133.
15. Qian Y.; Yomano L.P.; Preston J.F.; Aldrich H.C.; Ingram L.O. Cloning, Characterization, and Functional Expression of the Klebsiella oxytoca Xylodextrin Utilization Operon (xynTB) in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69, 5957-5967
16. Kadam, K.L.; Newman M.M. Development of a Low-cost Fermentation Medium for Ethanol Production from Biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997, 47, 625-629.
17. Ingram, L.O.; Gomez P.F.; Lai X.; Moniruzzaman M.; Wood B.E.; Yomano L.P.; York S.W. Metabolic Engineering of Bacteria for Ethanol Production. Biotechnol. Bioengin. 1998, 58, 204-214.
18. Zhang, J.; Greasham R. Chemically Defined Media for Commercial Fermentations. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999, 51, 407-421.
19. Orskov, I. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol.1, Kreig, N.R.; Holt J. G. Eds,; Williams and Wilkins, Baltimore, MD, 1984. 461-465.
20. Underwood, S. A; Zhou S,; Causey T.B.; Yomano L.P.; Shanmugam K.T.; Ingram L.O. Genetic Changes to Optimize Carbon Partitioning Between Ethanol and Biosynthesis in Ethanologenic Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 2002, 68, 1715-1727.
21. Posfai, G.; Koob M.; Kirkpatrick H.A.; Blattner F.R. Versatile Insertion Plasmids for Targeted Genome Manipulations in Bacteria: Isolation, Deletion, and Rescue of the Pathogenicity Island LEE of the Escherichia coli O157: H7 Genome. J. Bacteriol. 1997, 179, 4426-4428.
22. Datsenko, K.A.; Wanner B.L. One-step Inactivation of Chromosomal Genes in Escherichia coli K-12 Using PCR Products. PNAS. 2000, 97, 6640-6645.
23. Bolndelet-Rouault, M.H.; Weiser J.; Lebrihi A.; Branny P.; Pernodet J.l. Antibiotic Resistance Gene Cassette Derived from the Ω Interposon for Use in E. coli and Streptomyces. Gene 1997, 190, 315-317.
24. Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel, F.M.; Brent R.; Kingston R.E.; Moore D.D; Deidman J.G.; Smith J.A; Struhl K Eds.; John Wiley & Sons, Inc.: New York, N.Y. 1987.
25. Miller, J.H. A Short Course in Bacterial Genetics: a Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Plainview, N.Y. 1992.
26. Sambrook, J.; Russell D.W. Molecular Cloning: a Laboratory Manual;. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY, 2001.
27. Martinez-Morales, F.; Borges A.C.; Martinez A.; Shanmugam K.T.; Ingram L.O. Chromosomal Integration of Heterologous DNA in Eschrichia coli with Precise Removal of Markers and Replicons Used During Construction. J. Bacteriol. 1999, 181, 7143-7148.
28. Zhou S.; Causey T.B.; Hasona A.; Shanmugam K.T.; Ingram L.O. Production of Optically Pure D-Lactic Acid in Mineral Salts Medium by Metabolically Engineered Escherichia coli W3110. Appl Environ Microbiol. 2003, 69, 399-407
29. Causey, T.B.; Shanmugam K.T.; Yomano L.P.; Ingram L.O. Engineering Escherichia coli for Efficient Conversion of Glucose to Pyruvate. PNAS. 2004, 101, 2235-2240.
30. Neidhardt, F.C.; Bloch P.L.; Smith D.F. Culture Media for Enterobacteria. J. Bacteriol. 1974, 119, 736-747.
31. Scopes, R.K. An Iron-Activated Alcohol Dehydrogenase. FEBS Lett. 1983, 156, 303-306.
32. Martinez, A.; York S.W.; Yomano L.P.; Pineda V.L.; Davis F.C.; Shelton J.C.; Ingram L.O. Biosynthetic Burden and Plasmid Burden Limit Expression of Chromosomally Integrated Heterologous Genes (pdc, adhB) in Escherichia coli. Biotechnol Prog. 1999, 15, 891-897.
33. Underwood, S.A.; Buszko M.L.; Shanmugam K.T.; Ingram L.O. Flux Through Citrate Synthase Limits the Growth of Ethanologenic Escherichia coli KO11 During Xylose Fermentation. Appl. Envron. Microbiol. 2002, 68, 1071-1081.
34. Beall, D.S., Ohta K, Ingram L.O. Parametric Studies of Ethanol Producfrom from Xylose and Other Sugars by Recombinant Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 1991, 38, 296-303.
35. Blomqvist, K.; Nikkola M.; Lehtovaara P.; Suihko M.; Airaksinen U.; Straby K.B.; Knowles J.K.; Penttila M.E. Characterization of the 2,3-butanediol Operons from Klebsiella terrigena and Enterobacter aerogenes. J. Bacteriol. 1993, 175, 1392-1404.
36. Zabriskie, D.W.; Armiger W.B.; Phillips D.H.; Albano P.A. Traders Guide to Fermentation Media Formulation; Traders Protein. Memphis, TN. 1984.
37. Mayer, D.; Schlensog V.; Bock A. Identification of the Transcriptional Activator Controlling the Butanediol Fermentation Pathway in Klebsiella terrigena. J. Bacteriol. 1995, 177, 5261-5269.
38. Yang, Y.; Peredelchuk M.; Bennet G.N.; San K. Effect of Variation of Klebsiella pneumoniae Acetolactate Synthase Expression on Metabolic Flux Redistribution in Escherichia coli. Biotechnol. Bioengin. 2000, 69, 150-159.
39. Tolan, J.S.; Finn, R.K Fermentation of D-Xylose to Ethanol by Genetically Modified Klebsiella planticola. Appl. Environ. Microbiol. 1987, 53, 2039-2044
40. Washington University Klebsiella pneumoniae genome sequencing project home page. http://genome.wustl.edu/projects/bacterial/kpneumoniae (Accessed Nov. 2003)
41. Teixeira de Mattos, M.J.; Neijssel O.M. Bioenergetic Consequences of Microbial Adaptation to Low-nutrient Environments. J. Biotechnol. 1997, 59, 117-126.
42. Nieves, R.A.; Ehrman C.I.; Adney W.S.; Elander R.T.; Himmel M.E. Technical Communication: Survey and Analysis of Commercial Cellulase Preparations Suitable for Biomass Conversion to Ethanol. World J. Microbiol. Biotechnol. 1998, 14, 301-304.
43. Johansen, L.; Bryn K.; Stormer F.C. Physical and Biochemical Rose of the Butanediol Pathway in Aerobacter (Enterobacter) aerogenes. J. Bacteriol. 1975, 123, 1124-1130.
本明細書に開示された全ての特許、公開された特許出願及びその他の引例は、それらの全てを参照して本明細書に特別に取り込まれている。
本明細書に記載の本発明の具体的な態様の多くの均等物を、当業者は認識できるであろう、又は単なる通常の実験を用いて確認できるであろう。このような均等物は、本願の特許請求の範囲に含まれるように意図されている。
Claims (111)
- (a)糖をエタノールに変換する酵素をコードする非相同性ポリヌクレオチド配列(ここにおいて、当該ホスト細胞は、当該細胞による主要発酵生成物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで、当該非相同性ポリヌクレオチド配列を発現する)、及び
(b)当該細胞の代謝経路において、糖からエタノール以外の生成物を産生するタンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列中の突然変異(ここにおける突然変異は、突然変異がない細胞によるエタノール産生に比べて、当該細胞による増大したエタノール産生をもたらす)、
を含んでなる、サッカライドを分解するのに適している組み換えホスト細胞。 - 前記突然変異のポリヌクレオチド配列が、非相同性ヌクレオチド配列を含んでなる、請求項1に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記突然変異が、欠失、挿入又は塩基置換の突然変異である、請求項1に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記細胞が、線虫、昆虫、は虫類、鳥、両生動物、及び哺乳動物よりなる群から選ばれる高等真核生物のものである、請求項1に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記細胞が、単細胞又は多細胞微生物のものである、請求項1に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記微生物が、細菌である、請求項5に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記微生物が、真菌又は酵母である、請求項5に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記酵母が、サッカロミセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、パチオソレン属(Pachyosolen)、クルベロミセス属(Kluyveromyces)、デバリオミセス属(Debaryomyces)、ヤロウイア属(Yarrowia)及びピキア属(Pichia)よりなる群から選ばれる、請求項7に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記細菌が、グラム陰性細菌よりなる群から選ばれる、請求項6に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記細菌が、グラム陽性細菌よりなる群から選ばれる、請求項6に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記細菌が、条件的嫌気性である、請求項9に記載の組み換えホスト細胞。
- ホスト細胞が、腸内細菌科(family Enterobacteriaceae)から選ばれる、請求項11に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記細菌が、エシェリキア属(Escherichia)、赤痢菌(Shigella)、シトロバクター属(Citrobacter)、サルモネラ属(Salmonella)、クレブシエラ属(Klebsiella)、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルウィニア属(Erwinia)、クルイベラ属(Kluyvera)、セラチア属(Serratia)、セデセア属(Cedecea)、モルガネラ属(Morganella)、ハフニア属(Hafnia)、エドワードシエラ属(Edwardsiella)、プロビデンシア属(Providencia)、プロテウス属(Proteus)及びエルシニア属(Yersinia)よりなる群から選ばれる、請求項12に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記細菌が、エルウィニア属及びクレブシエラ属よりなる群から選ばれる、請求項13に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記細菌が、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)株よりなる群から選ばれる、請求項14に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記ホスト細菌が、クレブシエラ・オキシトカP2株(ATCC55307)である、請求項15に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 前記細菌が、バチルス属(Bacillus)、ゲオバチルス属(Geobacillus)、クロストリジウム属(Clostridium)、連鎖球菌(Streptococcus)及びセルロモナス属(Cellulomonas)よりなる群から選ばれる、請求項10に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記非相同性ポリヌクレオチド配列が、アルコールデヒドロゲナーゼ及び/又はピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする、前記請求項の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼが、ザイモモナス属(Zymomonas)由来である、請求項18に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記ザイモモナス属が、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)である、請求項19に記載の組み換えホスト細胞。
- (a)アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼを、コードする非相同性ポリヌクレオチド配列(ここにおいて、当該細菌は、当該細菌による主要発酵生成物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで、当該非相同性ポリヌクレオチド配列を発現する)、及び
(b)当該細胞の代謝経路において、糖からエタノール以外の生成物を産生するタンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列中の突然変異(ここにおける突然変異は、当該タンパク質の発現を減少又は消去し、これにより突然変異がない組み換え細菌性ホスト細胞によるエタノール産生に比べて、前記組み換え細菌性ホスト細胞によるエタノール産生を増大させる)、
を含んでなる、サッカライドを分解するのに適している組み換え細菌性ホスト細胞。 - 前記突然変異のポリヌクレオチド配列が、非相同性ヌクレオチド配列を含んでなる、請求項21に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 前記突然変異が、欠失、挿入又は塩基置換の突然変異である、請求項21に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 前記突然変異が、欠失突然変異である、請求項21に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 前記細菌が、グラム陰性細菌よりなる群から選ばれる、請求項21に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 前記細菌が、グラム陽性細菌よりなる群から選ばれる、請求項21に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 前記細菌が、条件的嫌気性である、請求項25に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- ホスト細胞が、腸内細菌科から選ばれる、請求項27に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 前記細菌が、エシェリキア属、赤痢菌、シトロバクター属、サルモネラ属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、エルウィニア属、クルイベラ属、セラチア属、セデセア属、モルガネラ属、ハフニア属、エドワードシエラ属、プロビデンシア属、プロテウス属及びエルシニア属よりなる群から選ばれる、請求項28に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 前記細菌が、エルウィニア属及びクレブシエラ属よりなる群から選ばれる、請求項29に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 前記細菌が、クレブシエラ・オキシトカ株よりなる群から選ばれる、請求項30に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 前記ホスト細菌が、クレブシエラ・オキシトカP2株(ATCC55307)である、請求項31に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 前記細菌が、バチルス属、ゲオバチルス属、クロストリジウム属、連鎖球菌及びセルロモナス属よりなる群から選ばれる、請求項26に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 前記エタノール以外の生成物が、ホルメート、ラクテート、スクシネート、アセテート、アセトイン、ブタンジオール、2,3−ブタンジオール、キシリトール、ブチレート、ピルベート、プロピオネート、イソプロピルアルコール、1−プロパノール、2−プロパノール、プロパンジオール、シトレート、グルタメート及びアセトンよりなる群から選ばれる、請求項1〜33の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、budA、budB、budR及びbudC、並びにそれらのホモログ、オーソログ及び機能的断片よりなる群から選ばれる遺伝子由来のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項21に記載の組み換えホスト細胞。
- 当該突然変異が、当該細胞中でのブタンジオールを産生する代謝経路に関わる酵素をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列中にある、請求項35に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 当該突然変異が、budA及びbudBの遺伝子のうちの片方又は両方の中にある、請求項31に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 前記突然変異が、当該細胞中でのα−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ又はα−アセトラクテート・シンターゼの発現を低減又は消去する、請求項37に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 前記突然変異が、当該細胞中でのα−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ及びα−アセトラクテート・シンターゼの発現を低減又は消去する、請求項37に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 当該非相同性ポリヌクレオチド配列が、アルコールデヒドロゲナーゼ及び/又はピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする、請求項35〜39の何れか一項に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 前記アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼが、ザイモモナス属由来である、請求項40に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- 前記ザイモモナス属が、ザイモモナス・モビリスである、請求項41に記載の組み換え細菌性ホスト細胞。
- BW15(NRRLB−30857)、BW19(NRRLB−30858)及びBW21(NRRLB−30859)よりなる群から選ばれるクレブシエラ・オキシトカ株で示される、組み換え細菌性ホスト細胞。
- (a)アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする非相同性ポリヌクレオチド配列(ここにおいて、当該ホスト細胞は、当該細胞による主要発酵生成物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで、当該非相同性ポリヌクレオチド配列を発現する)、及び
(b)当該代謝経路において、当該細胞でブタンジオールを産生するタンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列中の欠失突然変異(ここにおける突然変異は、当該タンパク質の発現を低減又は消去し、これにより突然変異がない細胞によるエタノール産生に比べて、当該細胞によるエタノール産生を増大させる)
を含んでなる、細菌性ホスト細胞がクレブシエラ・オキシトカである、組み換え細菌性ホスト細胞。 - サッカライド源を前記請求項の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞と接触させ、これによりサッカライド源からエタノールを産生することを含んでなる、サッカライド源からエタノールを産生する方法。
- 前記組み換えホスト細胞を得ることを更に含んでなる、請求項45に記載の方法。
- (a)エタノール産生の親ホスト細胞に、当該親細胞によってエタノールを産生するのに適した条件下で、選択培地及びサッカライド源を接触させること、
(b)前記条件下及び培地中で、サッカライド源から産生されるエタノールのレベルを測定すること、
(c)前記条件下及び培地中で増大した発現を有する望ましくない副生成物を同定するために、前記サッカライド源から産生されるエタノール以外の少なくとも1つの生成物のレベルを測定すること、そして
(d)代謝経路において、前記の望ましくない副生成物を産生する遺伝子産物をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列を突然変異させ(ここにおける突然変異は、代謝経路中の少なくとも1つの遺伝子産物の発現を低減又は消去して、突然変異なしの親細胞によるエタノール産生に比べて、当該細胞によるエタノール産生を増大させる)、これによりサッカライド源からのエタノール産生を最適化した組み換えホスト細胞を作製すること、
を含んでなる、サッカライド源からのエタノール産生を最適化した組み換えホスト細胞を作製する方法。 - 遺伝子中に突然変異を包含する単離されたポリヌクレオチド断片を作製し、そしてこの突然変異したポリヌクレオチド断片を親細胞中に導入することを、更に含んでなる、請求項47に記載の方法。
- 前記突然変異が、欠失、挿入又は塩基置換の突然変異を含んでなる、請求項47又は48に記載の方法。
- 前記細胞が、最小培地でのエタノール産生に最適化されている、請求項49に記載の方法。
- 前記細胞が、線虫、昆虫、は虫類、鳥、両生動物、及び哺乳動物よりなる群から選ばれる高等真核生物のものである、請求項47又は48に記載の方法。
- 細胞が、単細胞又は多細胞微生物のものである、請求項47又は48に記載の方法。
- 前記微生物が、細菌である、請求項52に記載の方法。
- 前記微生物が、真菌又は酵母である、請求項52に記載の方法。
- 前記酵母が、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ハンゼヌラ属、パチオソレン属、クルベロミセス属、デバリオミセス属、ヤロウイア属及びピキア属よりなる群から選ばれる、請求項54に記載の方法。
- 前記細菌が、グラム陰性細菌よりなる群から選ばれる、請求項53に記載の方法。
- 前記細菌が、グラム陽性細菌よりなる群から選ばれる、請求項53に記載の方法。
- 前記細菌が、条件的嫌気性である、請求項56に記載の方法。
- ホスト細胞が、腸内細菌科から選ばれる、請求項58に記載の方法。
- 前記細菌が、エシェリキア属、赤痢菌、シトロバクター属、サルモネラ属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、エルウィニア属、クルイベラ属、セラチア属、セデセア属、モルガネラ属、ハフニア属、エドワードシエラ属、プロビデンシア属、プロテウス属及びエルシニア属よりなる群から選ばれる、請求項59に記載の方法。
- 前記細菌が、エルウィニア属及びクレブシエラ属よりなる群から選ばれる、請求項60に記載の方法。
- 前記細菌が、クレブシエラ・オキシトカ株よりなる群から選ばれる、請求項61に記載の方法。
- 前記ホスト細菌が、クレブシエラ・オキシトカP2株(ATCC 55307)である、請求項62に記載の方法。
- 前記細菌が、バチルス属、ゲオバチルス属、クロストリジウム属、連鎖球菌及びセルロモナス属よりなる群から選ばれる、請求項57に記載の方法。
- 請求項47又は48に記載の方法で作製される、請求項1〜39の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞。
- 決められた窒素源;
複合の窒素源;
ホスフェイト源;及び
マグネシウム源:
を含んでなる、サッカライドを分解するのに適している組み換えホスト細胞による生育及びエタノール産生を支援する最小培地。 - 決められた窒素源が、尿素様化合物である、請求項66に記載の最小培地。
- 決められた窒素源が、尿素である、請求項67に記載の最小培地。
- 複合の窒素源が、コーンスティープリカー(CSL)、酵母自己消化物及び/又は抽出物、トウモロコシ加工副産物、大豆加工副産物、及び使用済みの発酵培養液よりなる群から選ばれる、請求項65、66又は67に記載の最小培地。
- 尿素窒素の濃度が、約0.1mM〜約100mMである、請求項67に記載の最小培地。
- 尿素窒素の濃度が、約2mM〜約20mMである、請求項70に記載の最小培地。
- 尿素窒素の濃度が、約8mM〜約12mMである、請求項71に記載の最小培地。
- 前記CSLの濃度が、約0.1g/L〜約100g/Lである、請求項69に記載の最小培地。
- 前記CSLの濃度が、約1g/L〜約20g/Lである、請求項73に記載の最小培地。
- 前記CSLの濃度が、約5g/L〜約10g/Lである、請求項74に記載の最小培地。
- 総ホスフェイト濃度が、約1mM〜約100mMである、請求項66〜75の何れか1項に記載の最小培地。
- ホスフェイト濃度が、約10mM〜約12mMである、請求項76に記載の最小培地。
- マグネシウム濃度が、約0.1mM〜約5.0mMである、請求項66〜77の何れか一項に記載の最小培地。
- マグネシウム濃度が、約0.25mM〜約1.0mMである、請求項78に記載の最小培地。
- サッカライドを分解するのに適している組み換えホスト細胞による生育及びエタノール産生を支援するために最適化された、請求項66〜79の何れか一項に記載の最小培地。
- 酸性のpHでの生育及びエタノール産生を支援するために最適化された、請求項80に記載の最小培地。
- 請求項1〜45の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞による生育及びエタノール産生を支援するために最適化された、請求項66〜81の何れか一項に記載の最小培地。
- クレブシエラ・オキシトカ株による生育及びエタノール産生を支援するために最適化された、請求項80に記載の最小培地。
- 更にサッカライド源を含んでなる、請求項66〜83の何れか一項に記載の最小培地。
- サッカライド源が、リグノセルロースを含んでなる、請求項84に記載の最小培地。
- SEQ ID NO:3又は4に記載のヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:6又は7に記載のアミノ酸配列を包含するポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:6又は7に記載のアミノ酸配列を包含するポリペプチドの天然型の対立遺伝子多型をコードする、単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:6又は7に記載のアミノ酸配列を包含するポリペプチドのホモログをコードする、単離された核酸分子。
- (a)SEQ ID NO:3若しくは4、又はこれらの補体のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%同一である、ヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子、
(b)SEQ ID NO:3若しくは4、又はこれらの補体のヌクレオチド配列を包含する核酸の少なくとも100個のヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子、
(c)SEQ ID NO:6又は7のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一のアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチドをコードする核酸分子、及び
(d)SEQ ID NO:6又は7のアミノ酸配列を包含するポリペプチドの断片(ここにおける断片は、SEQ ID NO:6又は7のアミノ酸配列の少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を包含する)をコードする、核酸分子、
よりなる群から選ばれる、単離された核酸分子。 - 厳しい条件下で、請求項86〜89の何れか一項に記載の核酸分子にハイブリダイズする、単離された核酸分子。
- 請求項86〜91の何れか一項に記載の核酸分子のヌクレオチド配列に相補的である、ヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子。
- 請求項86〜92の何れか一項に記載の核酸分子及び非相同性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:5又は8に記載のヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子。
- (a)SEQ ID NO:6又は7のアミノ酸配列を包含するポリペプチドの断片(ここにおける断片は、SEQ ID NO:6又は7のアミノ酸の少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を包含する)、
(b)SEQ ID NO:6又は7のアミノ酸配列を包含するポリペプチドの天然型の対立遺伝子多型(ここにおけるポリペプチドは、厳しい条件下でSEQ ID NO:3又は4を含む核酸分子にハイブリダイズする、核酸分子によってコードされる)、
(c)SEQ ID NO:3又は4のヌクレオチド配列を包含する核酸に対して少なくとも60%同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子によってコードされるポリペプチド、及び
(d)SEQ ID NO:6又は7のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一のアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチド、
よりなる群から選ばれる、単離されたポリペプチド。 - α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ及びα−アセトラクテート・シンターゼタンパク質のうちの少なくとも1つをコードする細菌遺伝子中に突然変異を包含するポリヌクレオチド配列を含んでなる、ベクター(ここにおける当該ベクターは、細菌性ホスト細胞に組み入れられた場合に前記タンパク質の発現を低減又は消去する)。
- ポリヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:3又は4に記載のヌクレオチド配列、又はその機能的断片を包含する単離された核酸分子中に突然変異を含んでなる、請求項96に記載のベクター。
- 突然変異が、欠失突然変異である、請求項97に記載のベクター。
- SEQ ID NO:5又は8に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなる、請求項98に記載のベクター。
- SEQ ID NO:5又は8に対して少なくとも80%同一であるポリヌクレオチド配列中に突然変異を含んでなる、請求項99に記載のベクター。
- SEQ ID NO:5に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなる、請求項96又は97に記載のベクター。
- pLOI3310又はpLOI3313と命名されている、請求項98又は99に記載のプラスミドベクター。
- 請求項86〜89の何れか一項に記載の単離された核酸配列を含んでなる、ベクター。
- (a)選択条件下での当該ホスト細胞による最適な生育及びエタノール産生を支援する選択培地、
(b)サッカライド源、及び
(c)選択培地及び条件でのエタノール産生のために最適化された組み換えホスト細胞(この細胞は、
糖をエタノールに変換する酵素をコードする非相同性ポリヌクレオチド配列(ここにおける細胞は、当該ホスト細胞による主要発酵生成物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで、当該非相同性ポリヌクレオチド配列を発現する)、及び
当該細胞の代謝経路において、前記条件下及び培地中で当該オリゴサッカライド源からエタノール以外の生成物を産生するタンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列中の突然変異(ここにおける突然変異は、当該タンパク質の発現を低減又は消去し、これにより当該ホスト細胞によるエタノール産生を、突然変異がない細胞によるエタノール産生に比べて増大させて、エタノール産生を最適化する)を包含する)、
を含んでなる、オリゴサッカライドを分解するのに適している組み換えホスト細胞によるオリゴサッカライド源からエタノールを産生するために最適化されているシステム。 - 前記選択培地が、最小培地である、請求項104に記載のシステム。
- 前記最小培地が、請求項66〜85の何れか一項に記載の培地である、請求項105に記載のシステム。
- 前記組み換えホスト細胞が、請求項1〜44の何れか一項に記載の細胞である、請求項105に記載のシステム。
- サッカライド源が、リグノセルロースを含んでなる、請求項104に記載のシステム。
- 選択培地が請求項66に記載の最小培地であり、そして組み換えホスト細胞が、ブタンジオール経路のタンパク質をコードする遺伝子における欠失突然変異を包含する、クレブシエラ・オキシトカ株である、請求項108に記載のシステム。
- 培地のpHが、酸性の範囲である、請求項108又は109に記載のシステム。
- 請求項45〜64及び104〜110の何れか一項に記載の方法又はシステムに従って、組み換えホスト細胞を使用するための説明書と共に包装されている、請求項1〜45の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞を含んでなる、キット。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015505471A (ja) * | 2012-01-31 | 2015-02-23 | ランザテク・ニュージーランド・リミテッド | 組換え微生物およびその使用方法 |
JP2018121583A (ja) * | 2017-02-01 | 2018-08-09 | 三谷産業株式会社 | カルノシン製造方法及び新規微生物 |
WO2019088293A1 (ja) * | 2017-11-06 | 2019-05-09 | トヨタ自動車株式会社 | エタノール発酵によるエタノール生産性の向上に関与する変異遺伝子及びこれを用いたエタノールの製造方法 |
WO2019188839A1 (ja) * | 2018-03-27 | 2019-10-03 | 積水化学工業株式会社 | エタノールの製造方法及びエタノール組成物 |
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---|---|---|---|---|
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US20100285534A1 (en) * | 2007-04-19 | 2010-11-11 | Mascoma Corporation | Combined thermochemical pretreatment and refining of lignocellulosic biomass |
SG178735A1 (en) * | 2007-06-01 | 2012-03-29 | Scripps Research Inst | High throughput screening of genetically modified photosynthetic organisms |
MX349413B (es) * | 2008-02-06 | 2017-07-19 | Biocon Ltd | Medios de fermentacion y procedimientos para los mismos. |
EP2192177A1 (en) | 2008-11-28 | 2010-06-02 | Total S.A. | Cellulase Cel5H related reagents and their use in microorganisms |
EP2446019B1 (en) | 2009-06-23 | 2015-03-25 | BP Corporation North America, Inc. | Recombinant ethanologenic bacteria |
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WO2011123055A1 (en) * | 2010-03-29 | 2011-10-06 | Agency For Science, Technology And Research | Process for preparing ethanol from crude glycerol using novel bacteria |
CN102808002B (zh) * | 2011-05-31 | 2015-09-16 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种生物法合成甲基乙偶姻及其衍生物的重组细胞和方法 |
US9908796B2 (en) * | 2012-10-23 | 2018-03-06 | Ecolab Usa Inc. | Use of oxidizing and non-oxidizing biocides for control of bacteria tolerant to stabilized-oxidant treatment |
KR101546752B1 (ko) | 2012-12-05 | 2015-11-23 | 대한민국 | 산화질소생성을 유도하는 자이리톨유도체의 반복단위구조를 가지는 뒤영벌유충 유래 다당폴리머 |
US9850512B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-12-26 | The Research Foundation For The State University Of New York | Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield |
US9951363B2 (en) | 2014-03-14 | 2018-04-24 | The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry | Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects |
EP3172313A1 (en) * | 2014-07-25 | 2017-05-31 | Alderys | Method for producing acetoin |
US20190233741A1 (en) | 2017-02-12 | 2019-08-01 | Magēmā Technology, LLC | Multi-Stage Process and Device for Reducing Environmental Contaminates in Heavy Marine Fuel Oil |
US10604709B2 (en) | 2017-02-12 | 2020-03-31 | Magēmā Technology LLC | Multi-stage device and process for production of a low sulfur heavy marine fuel oil from distressed heavy fuel oil materials |
US11788017B2 (en) | 2017-02-12 | 2023-10-17 | Magëmã Technology LLC | Multi-stage process and device for reducing environmental contaminants in heavy marine fuel oil |
US20210261987A1 (en) | 2020-02-21 | 2021-08-26 | Braskem S.A. | Production of ethanol with one or more co-products in yeast |
CN115125180B (zh) * | 2022-05-24 | 2023-11-21 | 天津大学 | 一种利用双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用 |
WO2024030344A1 (en) * | 2022-08-04 | 2024-02-08 | Absci Corporation | Genetic algorithm and imodulon based optimization of media formulation for quality, titer, strain, and process improvement biologics |
CN116024201B (zh) * | 2022-12-23 | 2024-03-19 | 天津大学 | α-乙酰乳酸脱羧酶突变体及其在生产乙偶姻中的应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6107093A (en) * | 1988-08-31 | 2000-08-22 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Recombinant cells that highly express chromosomally-integrated heterologous genes |
WO2003078643A1 (en) * | 2002-03-19 | 2003-09-25 | Forskarpatent I Syd Ab | Metabolic engineering for improved xylose utilisation of saccharomyces cerevisiae |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3816251A (en) | 1971-05-07 | 1974-06-11 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Process for producing adenosine-3,5 -cyclic monophosphoric acid by fermentation |
US5314814A (en) | 1985-11-15 | 1994-05-24 | Gist-Brocades | Preparation of novel immobilized biocatalysts |
NZ523192A (en) * | 2000-06-26 | 2005-03-24 | Univ Florida | Methods and compositions for simultaneous saccharification and fermentation |
JP4294373B2 (ja) * | 2003-05-23 | 2009-07-08 | 財団法人地球環境産業技術研究機構 | エタノールの新規製造方法 |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6107093A (en) * | 1988-08-31 | 2000-08-22 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Recombinant cells that highly express chromosomally-integrated heterologous genes |
WO2003078643A1 (en) * | 2002-03-19 | 2003-09-25 | Forskarpatent I Syd Ab | Metabolic engineering for improved xylose utilisation of saccharomyces cerevisiae |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
JPN6011061083; Biotechnol Bioeng. Vol.58, 1998, p.204-214 * |
JPN6011061085; J Bacteriol. Vol.123, 1975, p.1124-1130 * |
JPN6011061088; J Bacteriol. Vol.177, 1995, p.5261-5269 * |
JPN6011061091; Biotechnol Bioeng. Vol.69, 2000, p.150-159 * |
JPN6011061093; Appl Environ Microbiol. Vol.69, 2003, p.5892-5897 * |
JPN6013038168; J. Bacteriol. Vol. 175, No. 5, 1993, p. 1392-1404 * |
Cited By (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019088292A (ja) * | 2012-01-31 | 2019-06-13 | ランザテク・ニュージーランド・リミテッド | 組換え微生物およびその使用方法 |
JP2015505471A (ja) * | 2012-01-31 | 2015-02-23 | ランザテク・ニュージーランド・リミテッド | 組換え微生物およびその使用方法 |
JP2018121583A (ja) * | 2017-02-01 | 2018-08-09 | 三谷産業株式会社 | カルノシン製造方法及び新規微生物 |
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