CN102808002B - 一种生物法合成甲基乙偶姻及其衍生物的重组细胞和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了与生产甲基乙偶姻及其衍生化合物相关的方法、重组细胞和酶系统。具体地说，本发明提供了生物法生产甲基乙偶姻及其衍生化合物的核酸、多肽、宿主细胞以及方法和材料。

Description

一种生物法合成甲基乙偶姻及其衍生物的重组细胞和方法

技术领域

本发明涉及生产基乙偶姻化合物的领域，具体涉及一种利用生物法合成甲基乙偶姻化合物及其衍生化合物的领域。

背景技术

甲基乙偶姻是重要的化工原料，用于合成色素、医药、高聚物等化工产品。

甲基乙偶姻传统上由石化工业生产，污染大，不可持续。

目前已经报道了生产甲基乙偶姻的化学合成途径。但用生物法合成甲基乙偶姻的方法还未见报道。

发明内容

本发明涉及用于生物法生产甲基乙偶姻，及其它有机化合物(如2-甲基-2，3-丁二醇，甲基丁烯酮，2-甲基-3-羟基-1-丁烯，异戊二烯)的方法和材料。具体地说，本发明提供了用于生产甲基乙偶姻，2-甲基-2，3-丁二醇，甲基丁烯酮，2-甲基-3-羟基-1-丁烯，异戊二烯的核酸分子、多肽、宿主细胞和方法。甲基乙偶姻及其衍生物具有潜在的生物学和商业上的重要性，例如，可用于合成色素、医药、香料、光敏聚合材料等化工产品。此处提到的核酸分子可用于对宿主细胞进行基因工程改造，使其具有生产甲基乙偶姻，2-甲基-2，3-丁二醇，甲基丁烯酮，2-甲基-3-羟基-1-丁烯，异戊二烯的能力。此处提到的多肽可用在无细胞体系中生产甲基乙偶姻，2-甲基-2，3-丁二醇，甲基丁烯酮，2-甲基-3-羟基-1-丁烯，异戊二烯。此处提到的宿主细胞可用在培养体系中生产甲基乙偶姻，2-甲基-2，3-丁二醇，甲基丁烯酮，2-甲基-3-羟基-1-丁烯，异戊二烯。

一方面，本发明提供了具有甲基乙偶姻合酶活性和/或甲基乙偶姻还原酶活性的细胞，以及通过培养这些细胞来生产如本文所述的那些产物的方法。在一些实施方案中细胞本身含有所需酶活性如枯草芽孢杆菌。在另一些实施方案中，细胞含有编码这些酶的外源核酸。

在一些实施方案中，可以通过使用具有甲基乙偶姻合酶酶活性和甲基乙偶姻还原酶活性的多肽生产本文所述的那些产物。这些多肽的使用可以在体内也可在体外。

在一些实施方案中，所述的细胞还含有乙酰乙酸脱羧酶活性或乙酰乳酸合酶活性或乙偶姻合酶活性。这些细胞可以利用常见碳源如葡萄糖产生丙酮或乙偶姻，并进一步产生本文所述的那些产物。

在一些实施方案中，本发明提供了具有甲基乙偶姻脱水酶活性，甲基丁烯酮还原酶活性和2羟基3丁烯脱水酶活性的细胞，以及通过培养这些细胞来生产异戊二烯的方法。

在一些实施方案中，可以通过使用具有甲基乙偶姻脱水酶活性，甲基丁烯酮还原酶活性和2羟基3丁烯脱水酶活性的多肽从乙偶姻生产异戊二烯。这些多肽的使用可以在体内也可在体外。

在本发明的一些实施方案中，产物在体外(细胞外)生产。在本发明的其它实施方案中，产物是通过体外和体内(细胞内)相结合的方法生产的。还有一些本发明的实施方案，产物是在体内生产的。这里所说的体内生产，使用的可以是分离的培养细胞，也可以是完整的生物如转基因植物、非人的哺乳动物，还可以是单细胞生物如酵母和细菌(如乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞)。在下文中这样的细胞被称为生产细胞。由这些生产细胞所生产的产物可以是有机产物如此处提到的异戊二烯和/或核酸分子和多肽。

在一些实施方案中，本发明提供一种生物法合成甲基乙偶姻的酶系统或重组细胞，所述酶系统包括甲基乙偶姻合酶，所述重组细胞能表达甲基乙偶姻合酶。

在一些实施方案中，所述甲基乙偶姻合酶可将丙酮和乙酰辅酶A、乙醛、丙酮酸、乙偶姻、双乙酰或1-脱氧-酮糖中的至少一种，转化成甲基乙偶姻。

在一些实施方案中，所述酶系统包括甲基乙偶姻合酶、甲基乙偶姻还原酶、甲基乙偶姻脱水酶、甲基丁烯酮还原酶中的至少一种；所述重组细胞是能表达甲基乙偶姻合酶、甲基乙偶姻还原酶、甲基乙偶姻脱水酶或甲基丁烯酮还原酶中的至少一个。

在一些实施方案中，所述酶系统或重组细胞可将甲基乙偶姻转化成2-甲基-2，3-丁二醇，甲基丁烯酮，2-甲基-3-羟基-1-丁烯，异戊二烯。

在一些实施方案中，其中所述甲基乙偶姻脱水酶可将甲基乙偶姻转化成甲基丁烯酮。

在一些实施方案中，其中所述甲基丁烯酮还原酶可将甲基丁烯酮转化成2-甲基-3羟基-1-丁烯。

在一些实施方案中，其中所述甲基乙偶姻还原酶可将甲基乙偶姻转化成2-甲基-2，3-丁二醇。

在一些实施方案中，其中所述甲基乙偶姻合酶、甲基乙偶姻还原酶、甲基乙偶姻脱水酶或甲基丁烯酮还原酶可来源于各种细胞；也可以通过遗传设计提高所述酶的酶活；也可将其他物种的该酶基因转入到重组细胞获得所述酶；也可是通过人工方法改造所述酶；还可以通过诱变筛选或定向进化来获得所述酶。

在一些实施方案中，其中所述重组细胞还含有乙酰乙酸脱羧酶活性或乙酰乳酸合酶活性或乙偶姻合酶活性。

另一方面，本发明还提供一种生物法合成甲基乙偶姻及其衍生物的方法，所述方法是通过上述的重组细胞或酶系统将丙酮和乙酰辅酶A、乙醛、丙酮酸、乙偶姻或双乙酰中的至少一种生物合成甲基乙偶姻，再利用甲基乙偶姻生物合成甲基丁烯酮，甲基丁烯酮还可进一步生物合成2-甲基-3羟基-1-丁烯，得到的2-甲基-3羟基-1-丁烯脱水便可获得异戊二烯的方法；或是通过重组细胞或酶系统将丙酮和乙酰辅酶A、乙醛、丙酮酸、乙偶姻或双乙酰中的至少一种生物合成甲基乙偶姻，再进一步生物合成2-甲基-2，3-丁二醇，最后脱水生成异戊二烯的方法。

在一些实施方案中，其中所述方法包括利用重组细胞或酶系统将常见碳源如葡萄糖转化成丙酮。

在一些实施方案中，其中所述生物合成甲基乙偶姻的方法可以是通过能表达甲基乙偶姻合酶的重组细胞在体内合成；也可通过直接在体外添加甲基乙偶姻合酶生产；也可是通过体外和细胞体内相结合的方法生产的。

在一些实施方案中，其中所述利用甲基乙偶姻生物合成甲基丁烯酮的方法可以是通过能表达甲基乙偶姻脱水酶的重组细胞在体内合成；也可通过直接在体外添加甲基乙偶姻脱水酶生产；也可是通过体外和细胞体内相结合的方法生产的。

在一些实施方案中，其中所述利用甲基丁烯酮生物合成2-甲基-3羟基-1-丁烯的方法可以是通过能表达甲基丁烯酮还原酶的重组细胞在体内合成；也可通过直接在体外添加甲基丁烯酮还原酶生产；也可是通过体外和细胞体内相结合的方法生产的。

在一些实施方案中，其中所述利用甲基乙偶姻生物合成2-甲基-2，3-丁二醇的方法可以是通过能表达甲基乙偶姻还原酶的重组细胞在体内合成；也可通过直接在体外添加甲基乙偶姻还原酶生产；也可是通过体外和细胞体内相结合的方法生产的。

在一些实施方案中，其中所述体内生产使用的可以是分离的培养细胞，也可以是完整的生物如转基因植物、非人的哺乳动物，还可以是单细胞生物如酵母和细菌(如乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞)。

在另一方面，本发明还提供通过本发明的方法生产的甲基乙偶姻，2-甲基-2，3-丁二醇，甲基丁烯酮，2-甲基-3-羟基-1-丁烯，异戊二烯。

优选地，本发明提供以下各项：

1.一种生物合成甲基乙偶姻的方法，其包括使用甲基乙偶姻合酶酶促合成甲基乙偶姻的步骤。

2.根据以上1所述的方法，其中所述甲基乙偶姻合酶是以硫胺素焦磷酸为辅酶的蛋白，优选选自由以下组成的组：乙偶姻脱氢酶，乙偶姻脱氢酶的E1亚基，(动物的)丙酮酸脱氢酶的E1亚基，丙酮酸脱羧酶，乙酰乳酸合酶，和转酮酶。

3.根据以上1或2所述的方法，其中所述甲基乙偶姻合酶将丙酮、乙酰辅酶A、乙醛、丙酮酸、乙偶姻、双乙酰中或1-脱氧-酮糖中的至少一种转化成甲基乙偶姻，优选将下列各组物质转化成甲基乙偶姻：(1)丙酮、乙酰辅酶A和NADH；(2)丙酮和乙醛；(3)丙酮和丙酮酸；(4)丙酮和乙偶姻；(5)丙酮和双乙酰；和(6)上述任何一组或多组的组合，优选所述方法还包括利用重组细胞或酶系统将常见碳源如葡萄糖转化成丙酮或乙偶姻的步骤。

4.根据以上1-3中任一项的方法，所述方法是在体内或体外进行的，优选在重组细胞(如分离的培养细胞)，完整的生物体如转基因植物、非人的哺乳动物，重组单细胞生物如酵母和细菌(如乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞)中进行，或在体外酶反应体系中进行。

5.一种生物合成甲基乙偶姻衍生物的方法，其包括：(1)根据以上1-4中任一项的方法生物合成甲基乙偶姻的步骤；和(2)以在步骤(1)中合成的甲基乙偶姻作为中间体合成甲基乙偶姻衍生物的步骤，优选所述甲基乙偶姻衍生物选自由以下组成的组：2-甲基-2，3-丁二醇，甲基丁烯酮，2-甲基-3-羟基-1-丁烯，异戊二烯或它们的组合。

6.根据以上5所述的方法，其中步骤(2)选自以下组成的组：(a)甲基乙偶姻首先通过酶促反应转化为2-甲基-3-羟基-1-丁烯，再脱水生成异戊二烯；(b)甲基乙偶姻首先通过酶促反应转化为2-甲基-2，3-丁二醇，再脱水生成异戊二烯；或(a)和(b)的组合。

7.根据以上6所述的方法，其中在(a)中甲基乙偶姻首先被甲基乙偶姻脱水酶转化为甲基丁烯酮，再被甲基丁烯还原酶或化学还原剂转化为2-甲基-3-羟基-1-丁烯，优选所述化学还原剂选自由金属铂、金属钯和金属镍组成的组，和/或其中在(b)中甲基乙偶姻被甲基乙偶姻还原酶转化为2-甲基-2，3-丁二醇。

8.根据以上6所述的方法，其中(a)和(b)中的脱水是通过脱水酶或化学脱水催化剂来完成的，优选所述化学脱水催化剂是选自由浓硫酸、乙酸、乙酸盐或磷酸锂组成的组。

9.一种用于生物合成甲基乙偶姻的重组细胞，其包含或表达甲基乙偶姻合酶，优选其中所述甲基乙偶姻合酶是以硫胺素焦磷酸为辅酶的蛋白，更优选选自由以下组成的组：乙偶姻脱氢酶，乙偶姻脱氢酶的E1亚基，(动物的)丙酮酸脱氢酶的E1亚基，丙酮酸脱羧酶，乙酰乳酸合酶，和转酮酶；优选所述重组细胞还包含或表达甲基乙偶姻还原酶、甲基乙偶姻脱水酶和甲基丁烯酮还原酶中的至少一种；更优选所述重组细胞还含有乙酰乙酸脱羧酶活性或乙酰乳酸合酶活性或乙偶姻合酶活性。

10.根据以上9所述的重组细胞，其中所述重组细胞是分离的培养细胞，如酵母和细菌，例如乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞。

除非另有定义，在此所用的所有技术和科学术语，其意义与本发明相关领域普通专业技术人员通常理解的意义相同。尽管与在此描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或试验，但最适的方法和材料将在下文中描述。在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以其全文在此引作参考。在有冲突的情况下，以本说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅为说明性的并不以其为限。

附图说明

图1是本文件中提到的各化合物的结构式；

图2是利用丙酮和生物细胞中普遍存在的乙酰辅酶，利用甲基乙偶姻合酶合成甲基乙偶姻，2-甲基-2，3-丁二醇，甲基丁烯酮，2-甲基-3-羟基-1-丁烯，异戊二烯的代谢路径示意图(图中1表示甲基乙偶姻合酶，2表示甲基乙偶姻还原酶，3表示甲基乙偶姻脱水酶，4表示甲基丁烯酮还原酶)；

图3是利用丙酮和乙醛，利用甲基乙偶姻合酶合成甲基乙偶姻，2-甲基-2，3-丁二醇，甲基丁烯酮，2-甲基-3-羟基-1-丁烯，异戊二烯的代谢路径示意图(图中1表示甲基乙偶姻合酶，2表示甲基乙偶姻还原酶，3表示甲基乙偶姻脱水酶，4表示2-甲基-3羟基-1-丁烯还原酶)；

图4是利用丙酮和丙酮酸，利用甲基乙偶姻合酶合成甲基乙偶姻，2-甲基-2，3-丁二醇，甲基丁烯酮，2-甲基-3-羟基-1-丁烯，异戊二烯的代谢路径示意图(图中1表示甲基乙偶姻合酶，2表示甲基乙偶姻还原酶，3表示甲基乙偶姻脱水酶，4表示2-甲基-3羟基-1-丁烯还原酶)；

图5是利用丙酮和乙偶姻，利用甲基乙偶姻合酶合成甲基乙偶姻，2-甲基-2，3-丁二醇，甲基丁烯酮，2-甲基-3-羟基-1-丁烯，异戊二烯的代谢路径示意图(图中1表示甲基乙偶姻合酶，2表示甲基乙偶姻还原酶，3表示甲基乙偶姻脱水酶，4表示2-甲基-3羟基-1-丁烯还原酶)；

图6是利用丙酮和双乙酰，利用甲基乙偶姻合酶合成甲基乙偶姻，2-甲基-2，3-丁二醇，甲基丁烯酮，2-甲基-3-羟基-1-丁烯，异戊二烯的代谢路径示意图(图中1表示甲基乙偶姻合酶，2表示甲基乙偶姻还原酶，3表示甲基乙偶姻脱水酶，4表示2-甲基-3羟基-1-丁烯还原酶)；

图7是质粒pJXL32的结构示意图；

图8是质粒pJXL37的结构示意图；

图9是质粒pJXL40的结构示意图；

图10是产生的2-甲基-2，3-丁二醇用气相色谱质谱联用仪检测产生的TIC图；

图11是产生的2-甲基-2，3-丁二醇用气相色谱质谱联用仪检测，2-甲基-2，3-丁二醇峰的质谱图；

图12是生产的甲基乙偶姻用气相色谱质谱联用仪检测产生的TIC图；

图13是产生的甲基乙偶姻用气相色谱质谱联用仪检测，甲基乙偶姻峰的质谱图；

图14是质粒pJXL41的结构示意图。

具体实施方式

图1-4描述了生物法合成甲基乙偶姻及其衍生物的路径。

丙酮或乙酰乙酸与乙酰辅酶A或乙醛或丙酮酸或乙偶姻或双乙酰在甲基乙偶姻合酶的作用下生成甲基乙偶姻。甲基乙偶姻在脱水酶或化学催化剂的作用下生成甲基丁烯酮。甲基丁烯酮在还原酶或化学还原催化剂的作用下生成2-甲基-3羟基-1-丁烯。2-甲基-3羟基-1-丁烯在脱水酶或化学脱水催化剂的作用下生成异戊二烯。甲基乙偶姻在还原酶的作用下生成2-甲基-2，3-丁二醇。2-甲基-2，3-丁二醇在脱水酶或化学催化剂的作用下生成异戊二烯。这里所说的合酶、还原酶、脱水酶活性广泛存在于各种细胞中。可以利用细胞中固有的这些酶活性。也可以从另外的物种中克隆到这些酶然后转入到细胞中去。这些酶也可以是通过改造的酶。这种改造可以通过诱变筛选或定向进化来实现。这里所说的化学催化剂中的脱水催化剂如浓硫酸，乙酸，乙酸盐或磷酸锂；这里所说的化学催化剂中的还原催化剂如金属铂，金属钯，金属镍。

目前人们已经发现的多种以硫胺素焦磷酸为辅酶的蛋白具有图1-4中所示的乙偶姻合酶活性。比如乙偶姻脱氢酶，乙偶姻脱氢酶的E1亚基，动物的丙酮酸脱氢酶的E1亚基，丙酮酸脱羧酶，乙酰乳酸合酶，转酮酶。这些蛋白都可以应用于本发明。这些蛋白及编码他们的核酸的来源举例如下：

目前人们已经发现的多种蛋白具有图1-4所示的乙偶姻还原酶活性。比如2，3-丁二醇脱氢酶，醇脱氢酶。这些蛋白及编码他们的核酸来源举例如下：

如果这些酶的活性过低或存在产物抑制情况。可采用标准的蛋白质工程技术加以改造以获得更好的性能。具体方法可参照参考文献(1)。

编码这些酶的核酸可以构建在合适的载体上比如pET28a，pACYduet1上，转入细胞。也可以利用细胞本身就有的酶活性，比如枯草芽孢杆菌的2，3-丁二醇脱氢酶活性和乙偶姻合酶活性。在后一种情况下可以通过提高基因的拷贝数增加酶的催化活性。构建所说的这些细胞的方法都是生物学中常用的方法，具体步骤可参照Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Third Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(2001)；and Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley and Sons，Baltimore，Md.(1999).

酶的表达被传统的Northern杂交法验证。细胞生产异戊二烯，甲基乙偶姻，异戊二醇，甲基丁烯酮，2-甲基-3-羟基-1-丁烯的能力通过检测发酵产物证明。这些产物的检测采用气相色谱和质谱技术。

实施例1

枯草芽孢杆菌的acoA、acoB基因(GenBank Accession No.936152；939697)被克隆在pACYduet1(购自Novagen)质粒的NcoI和SalI位点之间，构建好的pJXL32质粒(如图7所示)被电转化入大肠杆菌BL21(DE3)(购自Invitrogen)中。构建好的细胞，在100ml LB培养基中培养(LB培养基，1L水溶解10g氯化钠，10g胰蛋白粉，和5g酵母粉)。培养温度稳定在30摄氏度。当细胞生长到一定阶段，通常是指数生长阶段，IPTG(终浓度为50mg/L)和丙酮(终浓度为1M)被添加到培养基中。使细胞生产甲基乙偶姻。

产生的甲基乙偶姻用气相色谱质谱联用仪加以检测结果如图12，13所示。

细菌培养物中的甲基乙偶姻或甲基丁烯酮被用气提或分馏的方法分离出来。甲基乙偶姻在脱水催化剂浓硫酸的作用下生成甲基丁烯酮。甲基丁烯酮在金属钯催化剂的作用下加氢生成2-甲基-3-羟基-1-丁烯。2-甲基-3-羟基-1-丁烯在浓硫酸的作用下生成异戊二烯。脱水反应具体操作可参照《有机合成事典》(出版社：北京理工大学出版社出版；日期：1992-01第589页)，加氢反应具体操作可参照《有机合成事典》(出版社：北京理工大学出版社出版；日期：1992-01第707页)。

实施例2

枯草芽孢杆菌的bdhA(GenBank Accession No.939490)基因被克隆在之前所述的pJXL32上的SalI和aflII位点之间，构建好的pJXL37质粒(如图8所示)被电转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。构建好的细胞，在100ml LB培养基中培养。培养温度稳定在30摄氏度。当细胞生长到一定阶段，通常是指数生长阶段，IPTG(终浓度为50mg/L)和丙酮(终浓度为1M)被添加到培养基中。使细胞生产2-甲基-2，3-丁二醇。产生的2-甲基-2，3-丁二醇用气相色谱质谱联用仪加以检测结果如图10，11所示。

细菌培养物中的2-甲基-2，3-丁二醇被用蒸馏的方法分离出来。2-甲基-2，3-丁二醇在醋酸锂催化200摄氏度下生成异戊二烯化，具体操作参考文献(2)。

实施例3

醋酸丁醇梭菌的thl基因(GenBank Accession No.1119056)，大肠杆菌的atoAD基因(GenBank Accession No.947525；946719)，和醋酸丁醇梭菌的abc基因(GenBank Accession No.1116170)，用overlap extension PCR的方法连接在一起，然后以同源重组的方法被克隆在pET28a上(3)。构建好的质粒称为pJXL40(如图9所示)。将pJXL40和pJXL32同时电转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。构建好的细胞，在100ml LB培养基中培养。培养温度稳定在30摄氏度。当细胞生长到一定阶段，通常是指数生长阶段，IPTG(终浓度为50mg/L)和葡萄糖(终浓度为20g/L)添加到培养基中。经质谱图谱分析，细胞生产甲基乙偶姻。

实施例4

将pJXL40和pJXL37同时电转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。构建好的细胞，在100ml LB培养基中培养。培养温度稳定在30摄氏度。当细胞生长到一定阶段，通常是指数生长阶段，IPTG(终浓度为50mg/L)和葡萄糖添(终浓度为20g/L)加到培养基中。经质谱图谱分析，细胞生产2-甲基-2，3-丁二醇。

实施例5

将pJXL32电转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。构建好的细胞，在100mlLB培养基中培养。培养温度稳定在30摄氏度。当细胞生长到一定阶段，通常是指数生长阶段，加入IPTG(终浓度为50mg/L)和丙酮(终浓度为1M)，然后加入乙偶姻(终浓度为1M)或双乙酰(终浓度为1M)到培养基中。经质谱图谱分析，细胞生产甲基乙偶姻。

实施例6

将pJXL37电转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。构建好的细胞，在100mlLB培养基中培养。培养温度稳定在30摄氏度。当细胞生长到一定阶段，通常是指数生长阶段，加入IPTG(终浓度为50mg/L)和丙酮(终浓度为1M)，然后加入乙偶姻(终浓度为1M)或双乙酰(终浓度为1M)到培养基中。经质谱图谱分析，细胞生产2-甲基-2，3-丁二醇。

实施例7

化学合成的嗜热菌Sulfolobus solfataricus的基因SSO1525和SSO1526(pdhA-2和pdhB-2 GenBank Accession Nos：1454527；1454528)被克隆到pACYduet1上的NdeI和XhoI位点之间。构建好的质粒称为pJXL41(见图14)，电转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。构建好的细胞，在100ml LB培养基中培养。培养温度稳定在30摄氏度。当细胞生长到一定阶段，通常是指数生长阶段，IPTG添加到培养基中。经质谱图谱分析，细胞生产甲基乙偶姻合酶。细胞用超声波破碎后加热到90摄氏度10min，制成甲基乙偶姻合酶粗酶液。粗酶液在合适的反应体系中催化丙酮，甲基乙偶姻与乙醛，丙酮酸，乙偶姻，双乙酰，的互相转化。缓冲液的成分为20mM pH 7.0的磷酸钾缓冲液，2mM MgCl₂和0.2mM硫胺素焦磷酸。最适反应温度为80摄氏度。

参考文献

1.Zhao，H.，和Zha，W.(2006)Nat.Protocols 1，1865-1871

2.(1973)DEHYDRATION CATALYSTS，PARTICULARLY FOR THEDEHYDRATION OF DIOLS.Google Patents

3.Li，M.Z.，和Elledge，S.J.(2007)Nat Meth 4，251-256

Claims (6)

1.一种生物合成甲基乙偶姻的方法，其包括使用甲基乙偶姻合酶在丙酮存在下酶促合成甲基乙偶姻的步骤，所述步骤是在表达所述甲基乙偶姻合酶的重组大肠杆菌细胞中进行的，所述甲基乙偶姻合酶是以硫胺素焦磷酸为辅酶的蛋白，其是乙偶姻脱氢酶的E1亚基或丙酮酸脱氢酶的E1亚基，其中所述乙偶姻脱氢酶的E1亚基由GenBank Accession No为936152、939697的枯草芽孢杆菌的acoA、acoB基因的编码产物组成，并且其中所述丙酮酸脱氢酶的E1亚基由GenBank Accession No为1454527、1454528的嗜热菌Sulfolobus solfataricus的SSO1525和SSO1526基因的编码产物组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述甲基乙偶姻合酶将下列各组物质转化成甲基乙偶姻：(1)丙酮、乙酰辅酶A和NADH；(2)丙酮和乙醛；(3)丙酮和丙酮酸；(4)丙酮和乙偶姻；(5)丙酮和双乙酰；和(6)上述任何一组或多组的组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其还包括利用重组细胞或酶系统将常见碳源转化成丙酮的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述常见碳源是葡萄糖。

5.一种用于生物合成甲基乙偶姻的重组大肠杆菌细胞，其表达甲基乙偶姻合酶，其中所述甲基乙偶姻合酶是以硫胺素焦磷酸为辅酶的蛋白，其是乙偶姻脱氢酶的E1亚基或丙酮酸脱氢酶的E1亚基，其中所述乙偶姻脱氢酶的E1亚基由GenBank Accession No为936152、939697的枯草芽孢杆菌的acoA、acoB基因的编码产物组成，并且其中所述丙酮酸脱氢酶的E1亚基由GenBank Accession No为1454527、1454528的嗜热菌Sulfolobus solfataricus的SSO1525和SSO1526基因的编码产物组成。

6.一种用于生物合成2-甲基-2,3丁二醇的重组大肠杆菌细胞，其表达甲基乙偶姻合酶，其中所述甲基乙偶姻合酶是乙偶姻脱氢酶的E1亚基或丙酮酸脱氢酶的E1亚基，其中所述乙偶姻脱氢酶的E1亚基由GenBankAccession No为936152、939697的枯草芽孢杆菌的acoA、acoB基因的编码产物组成，并且其中所述丙酮酸脱氢酶的E1亚基由GenBank Accession No为1454527、1454528的嗜热菌Sulfolobus solfataricus的SSO1525和SSO1526基因的编码产物组成，并且所述细胞还表达甲基乙偶姻还原酶，所述甲基乙偶姻还原酶是GenBank Accession No为939490的枯草芽孢杆菌的bdhA基因的编码产物。