CN106967741B - 一种体外酶反应生产l(+)-乙偶姻的方法 - Google Patents

一种体外酶反应生产l(+)-乙偶姻的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种体外酶反应生产L(+)‑乙偶姻的方法，步骤为：(1)将载体pET28a与2,3‑丁二醇脱氢酶编码基因bdhA连接得到pET28a‑bdhA并导入大肠杆菌，发酵，纯化，浓缩，得到2,3‑丁二醇脱氢酶浓缩液；将载体pET28a与NADH氧化酶编码基因yodC连接得到pET28a‑yodC并导入大肠杆菌，发酵，纯化，浓缩，得到NADH氧化酶浓缩液；(2)将2,3‑丁二醇脱氢酶浓缩液、NADH氧化酶浓缩液、meso‑2,3丁二醇、NAD+和FAD+混合均匀，反应，得到L(+)‑乙偶姻。本发明以廉价的meso‑2,3‑丁二醇为底物，实现附加值高的L(+)‑乙偶姻的体外生产，产量和纯度高。

Description

一种体外酶反应生产L(+)-乙偶姻的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种体外酶反应生产L(+)-乙偶姻的方法。
背景技术
乙偶姻，化学名为3-羟基-2-丁酮，又叫甲基乙酰甲醇，是一种无色或淡黄色液体，单体为无色或淡黄色液体，呈奶香气，二聚体为白色结晶粉末，能自燃，易溶于水，溶于乙醇、丙二醇、微溶于乙醚，几乎不溶于植物油。乙偶姻是常用的食品级香料，添加到食物中，提升食物中的奶香味。作为美国能源部优先开发的平台化合物之一，乙偶姻广泛应用于功能材料，医药生产和化学合成等领域。
目前，乙偶姻工业化生产的主要方法是化学合成法，包括2,3-丁二醇的氧化、丁酮的氯化水解法和丁二酮的部分加氢等方法。这些生产工艺操作较简便，但是能耗大，得率低且对环境有一定的污染。关键的问题是化学法制得的乙偶姻多为两种手性异构体的混合物。
近年来发展起来的利用微生物发酵法生产化学品成为热点，尤其是结合合成生物学、代谢工程、进化工程等方法，乙偶姻也不例外。目前有许多研究者将目光转向既经济又环保的微生物发酵法生产手性乙偶姻。目前生产乙偶姻的菌株有大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、粘质沙雷氏菌、谷氨酸棒杆菌等。利用微生物法合成乙偶姻的报道很多，产量较高，但微生物代谢复杂，体内合成不易调控。Xiao等[1]利用新的全细胞催化技术，在大肠杆菌中共表达2，3-丁二醇脱氢酶和水合NADH(还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，又作还原型辅酶Ⅰ)氧化酶，以2,3-丁二醇为底物，在实现NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，又称辅酶Ⅰ)再生的情况下，实现手性乙偶姻的生产，最终，43g/L的meso-2,3丁二醇生成36.7g/L L(+)-乙偶姻，但此体系存在严重的底物抑制，meso-2,3-丁二醇浓度大于43g/L时，转化率和乙偶姻产量迅速下降。
相比之下，体外酶反应法可控，转移性强，且对反应条件的要求低，使此方法在重要化学品合成领域中具有广泛的应用潜力。通过无细胞的体外反应，可以控制反应体系各组分用量，精确的控制反应。所以，一部分研究者将目光转向将细胞生长和代谢生产分来的无细胞体外酶反应上。Rieckenberg等[2]利用甘油脱氢酶、丙二醇氧化还原同工酶、氢化酶Ⅰ，成功的将甘油转化为1,3-丙二醇，转化率几乎接近于1，在3g/L的底物浓度下1,3-丙二醇的产量为0.24mmol，虽然转化率很高，但存在底物抑制效应，酶稳定性低等问题，产率低。中国科学院青岛生物能源与过程研究所发明了一种体外酶生产1,2,4-丁三醇，发明利用D-木糖酸脱水酶，2-丙酸脱羧酶和醇脱氢酶，以D-木糖酸为底物，生产1,2,4-丁三醇，体系放大到100mL,30℃，反应24h后，产量达到了5.98g/L，但此发明利用粗酶液催化反应，副产物多(咸漠，蒋昱东，刘炜等，一种体外酶反应生成1，2，4-丁三醇的方法，申请号：201410682463.O)。Jennifer E.Kay[3]等在大肠杆菌中引入合成2,3-丁二醇的外源途径，将工程菌株的细胞提取物中加入底物，ATP和NAD+，30h的补料分批培养，最终2,3-丁二醇的产率达到11.3g L-1h-1。这个研究首次引进外源途径并证明了细胞提取物有辅因子再生的能力，进一步证明了细胞提取物即无细胞代谢工程能够高效实现小分子转化，克服生物转化率低，产量低，细胞内毒性物质限制工业生产等困难。但是此反应的副产物多，影响下游的分离。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种体外酶反应生产L(+)-乙偶姻的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种体外酶反应生产L(+)-乙偶姻的方法，包括如下步骤：
(1)将蛋白质表达载体pET28a与2,3-丁二醇脱氢酶编码基因bdhA连接得到质粒pET28a-bdhA，将所述质粒pET28a-bdhA导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中得到菌株BL21-1，对菌株BL21-1培养发酵表达2,3-丁二醇脱氢酶，纯化，浓缩，得到2,3-丁二醇脱氢酶浓缩液；将蛋白质表达载体pET28a与NADH氧化酶编码基因yodC连接得到质粒pET28a-yodC，将所述质粒pET28a-yodC导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中得到菌株BL21-2，对菌株BL21-2培养发酵表达NADH氧化酶，纯化，浓缩，得到NADH氧化酶浓缩液；
(2)将2,3-丁二醇脱氢酶浓缩液、NADH氧化酶浓缩液、meso-2,3丁二醇、NAD+和FAD+混合均匀，反应，得到L(+)-乙偶姻。
本发明的方法，能够以较为廉价的meso-2,3-丁二醇为底物，实现附加值较高的L(+)-乙偶姻的体外生产，产量为6.35g/L，且手性纯度达95％。双酶体系的核心成分为2，3-丁二醇脱氢酶和NADH氧化酶，通过两种酶的合理搭配，实现了辅因子NAD+的有效再生以及L(+)-乙偶姻的生产。
附图说明
图1为构建的pET28a-bdhA质粒载体的图谱。
图2为构建的pET28a-yodC质粒载体的图谱。
图3为2,3-丁二醇脱氢酶和NADH氧化酶的SDS-PAGE电泳胶图。
图4为手性乙偶姻的气相色谱检测，其中，A为两种手性乙偶姻的混合物在气相色谱中的峰图；B为反应样在气相色谱中的峰图。
具体实施方式
下面结合实施实例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好的理解本发明，但对本发明不作任何限制。
本发明所选用的2,3-丁二醇脱氢酶编码基因bdhA，Genebank登陆号为939490。由其编码的2,3-丁二醇脱氢酶，可催化meso-2,3-丁二醇生成L(+)-乙偶姻同时有辅因子NAD+的参与，其反应式为：
Figure BDA0001262151090000031
本发明所选用的NADH氧化酶编码基因yodC，Genebank登陆号939506。由其编码的水合NADH氧化酶，可催化氧气生成水，同时有辅因子NADH的参与，其反应式为：
Figure BDA0001262151090000032
原始质粒pET28a来源为biovector(http://www.biovector.net/)；
原始菌株B.subtilis 168来源为BGSC(Bacillus Genetic Stock Center，http://www.bgsc.org/)；
E.coli BL21(DE3)感受态来源为NEB(http://www.neb-china.com/)；
所用meso-2,3-丁二醇和乙偶姻标准品从sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)购买。
所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等、分子生物学试剂从thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)。
所用其他生化试剂(如胰蛋白胨，酵母抽提物，NaCl，HEPES，TRIS，咪唑、NAD+、FAD+等)从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。
实施例1 使用商业化蛋白质表达载体pET28a过表达2,3-丁二醇脱氢酶(bdhA)
以枯草芽孢杆菌B.subtilis 168基因组为模板，以引物p-bdhA1和p-bdhA2用于扩增基因bdhA片段(约1.0kp)。将bdhA片段和pET28A质粒使用Thermo Fast digest NheI/BamHI双酶切，经连接、转化后得到bdhA基因的表达载体pET28a-bdhA(见图1),测序检测无误。将测序结果正确的质粒通过传统氯化钙法转入商业化感受态大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到2,3-丁二醇脱氢酶(bdhA)过表达的BL21-1。
实施例2 使用商业化蛋白质表达载体pET28a过表达NADH氧化酶(yodC)
以枯草芽孢杆菌B.subtilis 168基因组为模板，以引物p-yodC1和p-yodC2用于扩增基因yodC片段(609bp)。然后将yodC片段和pET28a质粒使用Thermo Fast digest NdeI/XhoI双酶切，经连接、转化后得到yodC基因的表达载体pET28a-yodC(见图2),测序检测无误。将测序结果正确的质粒通过传统氯化钙法转入商业化感受态大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到NADH氧化酶(yodC)过表达的BL21-2。
表1 菌株构建所用引物序列
Figure BDA0001262151090000033
实施例3 2,3-丁二醇脱氢酶和NADH氧化酶的纯化浓缩
1、2,3-丁二醇脱氢酶的纯化浓缩具体步骤为：
1)将大肠杆菌BL21-1接种到400mL LB培养基中，摇床37℃，220rpm培养至OD600为0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，16℃培养12h，4℃，4200rpm离心20min收集菌体，并用20mL buffer A悬浮。
2)收集步骤1)得到的BL21-1的悬浮液，在高压细胞破碎机的作用下破碎细胞，在4℃，1200bar，油压18Kg/cm3条件下处理3次，破碎后4℃，8000rpm离心30min，收集上清得到粗酶液。
3)将步骤2)中得到的粗酶液，利用重力镍柱纯化方法，纯化蛋白。在4℃条件下，将粗酶液全部流穿装有镍填料的柱子，再用buffer A和buffer B配制的不同的咪唑浓度(20mM，50mM，100mM，150mM，200mM，250mM，500mM)的洗脱液洗脱，收集流出液，得到高纯度的2,3-丁二醇脱氢酶溶液。
4)收集步骤3)得到的目的蛋白溶液，利用孔径10KD的超滤管浓缩蛋白。将收集的流出液，在4800rpm，4℃离心。最后用5mL HEPES-NaCl缓冲液洗涤2次，继续离心至剩余量为2mL，分装。得到高浓度的2，3-丁二醇脱氢酶溶液。再利用Bradford法[4]测定2,3-丁二醇脱氢酶浓度，其终浓度为：18.6mg/mL。
5)将步骤4)得到的2,3-丁二醇脱氢酶溶液进行SDS-PAGE电泳，确认2,3-丁二醇脱氢酶大小正确(见图3，泳道1，M:Marker；1:2,3-丁二醇脱氢酶(40.6kDa))
2、NADH氧化酶的纯化浓缩具体步骤为：
1)将大肠杆菌BL21-2接种到400mL LB培养基中，摇床37℃，220rpm培养至OD600为0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，16℃培养12h，4℃，4200rpm离心20min收集菌体，并用20mL buffer A悬浮。
2)收集步骤1)得到的BL21-2悬浮液，在高压细胞破碎机的作用下破碎细胞，在4℃，1200bar，油压18Kg/cm3条件下处理3次，破碎后4℃，8000rpm离心30min，收集上清得到粗酶液。
3)将步骤2)中得到的粗酶液，利用重力镍柱纯化方法，纯化蛋白。在4℃条件下，将粗酶液全部流穿装有镍填料的柱子，再用buffer A和buffer B配置的不同的咪唑浓度(20mM，50mM，100mM，150mM，200mM，250mM，500mM)的洗脱液洗脱，收集流出液，得到高纯度的NADH氧化酶溶液。
4)收集步骤3)得到的目的蛋白溶液，利用超滤管浓缩蛋白。将收集的流出液，在4800rpm，4℃离心。最后用5mL HEPES-NaCl缓冲液洗涤2次，继续离心至剩余量为2mL，分装，得到高浓度的2，3-丁二醇脱氢酶溶液。再利用Bradford法测定NADH氧化酶浓度，其终浓度为：13.6mg/mL。
5)将步骤4)得到的NADH氧化酶溶液进行SDS-PAGE电泳，确认NADH氧化酶大小正确(见图3，泳道2，M:Marker；2:NADH氧化酶(24.4kDa))
LB培养基配方为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L NaCl，调节pH至7.5。0.1Mpa压力下灭菌20min。
HEPES-NaCl buffer配方为：20mM HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)，50mM NaCl，调节PH至7.5。
buffer A配方为：25mM Tris，150mM NaCl，20mM咪唑，调节PH至7.5。
buffer B配方为：25mM Tris，150mM NaCl，500mM咪唑，调节PH至7.5。
实施例4 2,3-丁二醇脱氢酶和NADH氧化酶比酶活的测定
1.2,3-丁二醇脱氢酶的比酶活测定，具体步骤为：2，3丁二醇的脱氢反应在37℃下进行，通过测定340nm下NADH的增加量，即NAD+的还原量，来表征2，3丁二醇脱氢酶的酶活。反应体系组分：0.5M meso-2,3-丁二醇，10m M NAD+，0.1mg/mL 2,3-丁二醇脱氢酶,HEPES-NaCl buffer补齐至200μL。1U 2,3-丁二醇脱氢酶定义为每分钟1μmol NAD+转化为NADH所需的酶量。结果测得2,3-丁二醇脱氢酶的比酶活为0.312U/mg。
2.NADH氧化酶的比酶活测定，具体步骤为：NADH的氧化反应在37℃下进行，通过测定340nm下NADH的减少量，来表征NADH氧化酶的酶活。反应体系组分：10mM NAD+，0.1mg/mLNADH氧化酶,HEPES-NaCl buffer补齐至200μL。1U NADH氧化酶定义为每分钟1μmol NADH转化为NAD+所需的酶量。结果测得NADH氧化酶的比酶活为0.415U/mg。
实施例5 体外双酶体系生产手性乙偶姻
利用2,3-丁二醇脱氢酶和NADH氧化酶所催化的两个反应的耦合，设计出体外酶反应体系生产L(+)-乙偶姻。其具体参数如表2所示,在30℃、500rpm条件下反应12h后终止反应。
表2.反应体系
注：HEPES-NaCl Buffer PH＝8.5配方为：100mM HEPES，50mM NaCl，调节PH至8.5。
使用GC-FID检测乙偶姻的手性纯度，使用手性柱HP-chiral 20b column(AgilentTechnologies)。手性L(+)-乙偶姻的色谱检测见图4，其中，A图为两种手性乙偶姻的混合物的峰图(依次为D-(-)-乙偶姻，L-(+)-乙偶姻)；B图为反应样的检测峰图。
从发酵结果可以看出，乙偶姻的总产量为6.35g/L，手性L(+)-乙偶姻纯度为95％，本发明所构建的体外双酶反应体系能够实现体外手性乙偶姻的生产和辅因子的再生，手性纯度较高，具有良好的应用前景。
参考文献：
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[2]Rieckenberg,F.,et al.,Cell-free synthesis of 1,3-propanediol fromglycerol with a high yield.Engineering in Life Sciences,2014.14(4):p.380-386.
[3]Kay,J.E.and M.C.Jewett,Lysate of engineered Escherichia colisupports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol.Metabolicengineering,2015.32:p.133-142.
[4]Bradford,M.M.,A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding.Analytical Biochemistry,1976.72(1-2):p.248-254.
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cgcggatcct tagttaggtc taacaagg 28
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ctacgggcta gcatgaaggc agcaagatgg cataac 36
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tatccatatg atgacgaata ctctggatg 29
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ccgctcgagt tacagccaag ttgatac 27

Claims (1)

1.一种体外酶反应生产L(+)-乙偶姻的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将蛋白质表达载体pET28a与2,3-丁二醇脱氢酶编码基因bdhA连接得到质粒pET28a-bdhA，将所述质粒pET28a-bdhA导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中得到菌株BL21-1，对菌株BL21-1培养发酵表达2,3-丁二醇脱氢酶，纯化，浓缩，得到2,3-丁二醇脱氢酶浓缩液；将蛋白质表达载体pET28a与NADH氧化酶编码基因yodC连接得到质粒pET28a-yodC，将所述质粒pET28a-yodC导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中得到菌株BL21-2，对菌株BL21-2培养发酵表达NADH氧化酶，纯化，浓缩，得到NADH氧化酶浓缩液；
(2)将1U/ml的2,3-丁二醇脱氢酶浓缩液、1U/ml的NADH氧化酶浓缩液、0.3M的meso-2,3-丁二醇、20mM的NAD+和50μM的FAD+混合均匀，反应，得到L(+)-乙偶姻；
所述2,3-丁二醇脱氢酶编码基因bdhA，Genbank登陆号为939490；
所述NADH氧化酶编码基因yodC，Genbank登陆号为939506。
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