CN114277006B

CN114277006B - 一种醇脱氢酶及其在合成手性杂环醇中的应用

Info

Publication number: CN114277006B
Application number: CN202111670054.5A
Authority: CN
Inventors: 倪晔; 孙泽文; 许国超
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114277006A

Abstract

本发明公开了一种酶法制备杂环类药物中间体的高效方法。本发明以醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶偶联催化杂环酮类底物生成手性杂环醇类药物中间体。本发明的醇脱氢酶在不加任何助溶剂的单水相体系可以减轻产物抑制效应，使转化率在8h内达到99％以上。将醇脱氢酶与葡萄糖脱氢酶偶联，在不添加任何外源辅酶和有机助溶剂的单水相体系，实现了底物浓度高达200g·L^‑1的克级制备，催化剂载量为8％(m/m)。终产物(R)‑N‑Boc‑3‑羟基哌啶的光学纯度高达到99.5％，产品纯度为99.3％。

Description

一种醇脱氢酶及其在合成手性杂环醇中的应用

技术领域

本发明属于生化工程技术领域，尤其是指一种醇脱氢酶及其在合成手性杂环醇中的应用。

背景技术

N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶[NBHP]作为一种典型的有机杂环胺，广泛用作合成有机化合物(包括药物)的基础和试剂，在降血压、抗肿瘤、抗球虫病等多个高附加值医药领域内均有应用。NBHP的一对对映体具有不同的生理活性，(S)-NBHP是长年市售排行前五的治疗淋巴瘤药物-依鲁替尼的关键手性药物中间体，而(R)-NBHP则被广泛应用于治疗高血压的贝尼地平及多种潜在药物的合成，如JAK抑制剂和Chk1抑制剂等。NBHP的制备方法主要有化学拆分法和生物转化法。化学拆分法是将外消3-羟基哌啶在手性有机酸的作用下成盐析出得到3-羟基哌啶的盐，然后游离、上保护基得到NBHP。该方法存在拆分收率低、操作繁琐及成本高昂的缺点。生物酶法合成NBHP的方法更加绿色环保，因而受到越来越多的关注。然而，以往的研究表明生物合成纯手性NBHP需要添加有机助溶剂及昂贵的辅酶，且底物浓度过高可能会导致底物或产物抑制，使NBHP的合成成本大大增加。

(1)2009年，Acheretz等首次采用生物催化合成的方法，利用胡萝卜块中的还原酶进行催化，该催化剂廉价且环境友好，为催化合成光学活性的环状3-羟基哌啶提供了新思路。但是由于底物浓度低(3mM)，添加催化剂浓度高(23％，m/v)，且产率低下(73％)，因此，该反应不利于在工业上放大应用。(ORGANICLETTERS,2009,11(6):1245-1248)。

(2)2014年，鞠鑫等通过筛选商业酮还原酶KRED，利用酮还原酶氧化异丙醇的能力构建底物偶联辅酶再生的方法合成(S)-NBHP，在制备过程中通过分批添加底物，减少了底物抑制效应，最终实现底物浓度100g·L^-1的生物转化。(ORGANIC PROCESS RESEARCH&DEVELOPMENT,2014,18(6):827-830)。

(3)2016年，吴中柳等从Chryseobacterium sp.CA49基因组中调取27个酮还原酶并筛选获得CHKRED03，将CHKRED03与GDH偶联实现辅因子再循环系统的生物合成方法，最终在加入甲醇助溶的反应体系中实现了底物浓度200g·L^-1的生物转化。(PROCESSBIOCHEMISTRY,2016,51(7):881-885.)。

(4)2017年，Jing-Jing Chen等通过使用来源Candida parapsilosis的醇脱氢酶CPRCR与来源Bacillus megaterium的葡糖糖脱氢酶BMGDH在大肠杆菌ROSETTA(DE3)中共表达，使用重组共表达的全细胞在有机-水两相体系中，实现了底物浓度100g·L^-1的生物转化。(WORLD JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY,2017,3(61):2-12)。

(5)2017年，MENGYANH等通过筛选酮还原酶库，获得来源于海栖热袍菌的耐高温酮还原酶AKR-43，其催化过程也是利用生物合成法2中的GDH进行辅酶再生循环利用，并且在加入异丙醇助溶剂的水相体系中实现了底物浓度200g·L^-1的生物转化。(APPLIEDBIOCHEMISTRYANDBIOTECHNOLOGY,2017,181(4):1304-1313)。

(6)2017年，Li-Feng Chen等分离来自马克斯克鲁维酵母ATCC748的NADPH依赖性还原酶(YGL039W)生产(R)-NBHP显示出优异的催化活性，并利用GDH进行循环辅酶再生，在反应体系中添加助溶剂异丙醇实现了底物浓度400g·L^-1的生物转化,然而其催化剂添加量较高(10％，m/v)。(CATALYSISCOMMUNICATIONS,2017,97:5-9)。

(7)2017年，Li-FengChen等分离获得来自酿酒酵母的NADPH依赖性还原酶(YDR541C)，发现其在生产中具有优异的催化活性。同时也采用GDH构建辅酶再生循环，但是在单水相反应体系中发现有严重的产物抑制现象，最终引入1:1(V/V)辛酸乙酯和水的两相体系减轻了产物抑制，实现了底物浓度240g·L^-1的生物转化。(TETRAHEDRON LETTERS,2017,58(16):1644-1650.)。

(8)2017年，郑高伟等通过蛋白工程改造的酮还原酶CGKR1-F92C/F94W制备结构多样的手性醇，通过偶联GDH进行辅酶循环，在加入乙醇助溶剂的体系中实现了底物浓度100g·L^-1的生物转化。(ACS CATALYSIS,2017,7(10):7174-7181.)。

(9)2018年，Xiang-Xian Ying等通过基因组挖掘获得能够催化手性酮的还原酶RECR，其来源于红平红球菌WZ010，并且作者探索了RECR在手性醇合成中的应用。最后，作者利用RECR突变体Y54F，以异辛醇为共底物构建辅酶循环，在异辛醇两相体系中实现了底物浓度300g·L^-1的生物转化。(MOLECULES,2018,23(3117):2-13.)。

(10)2019年，Yi-Tong Chen等将来自热厌氧杆菌的TBADH和枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌BL21(DE3)中共表达，通过优化细胞培养体系，在添加甲醇助溶剂的体系中实现了底物浓度100g·L^-1的生物转化。(RSC ADVANCES,2019,9(4):2325-2331)。

(11)2020年，吴彦霏等将来自克鲁维酵母的KpADH通过半理性设计改造得到突变体Y127W，以枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶进行辅酶循环，通过优化反应条件实现了底物浓度600g·L^-1的生物转化。

(12)专利CN201310173088.2公开了一种利用重组酮还原酶(KRED)酶粉来不对称还原N-BOC-3-哌啶酮，但是并没有公开酮还原酶(KRED)的基因序列或者氨基酸序列。专利CN201310054684.9公开了一种利用醇脱氢酶PAR来不对称合成(S)-1-Boc-3-羟基哌啶，但是利用了有机试剂异丙醇来进行辅酶循环，有机试剂对酶活力有较大程度的损害，且有明显的抑制作用。专利CN201610132936.9公开了一种利用羰基还原酶RECR酶不对称还原酮还原酶(KRED)，但是该酶需要经过Ni-NTA纯化，且需使用仲辛醇-水两相反应，不利于放大生产或生产成本比较高。专利CN108220358A报道的毕赤酵母Pichia sp.SIT2014可作为制备(S)-NBHP的生物催化剂，但是催化剂加量过多增加了生产成本。CN10822061A报道酮还原酶MT-KRED用于制备(S)-NBHP，但在反应过程中需要添加昂贵的辅酶。

以上报道的酮还原酶虽然可以用于制备(R)-或(S)-NBHP，但是反应过程需要使用昂贵的辅酶、或较多的加酶量、有机溶剂等，尤其是(R)-NBHP，仍处于起步阶段，不利于实际工业中的生产应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种醇脱氢酶及其在合成手性杂环醇中的应用。

一种醇脱氢酶，所述醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

SEQ ID No.2:

1 MTAANNNTTVFVSGASGFIA

21 QHIIRQLLDQNYKVIGSVRS

41 TEKGDNLKNAIFKSANFNYE

61 IVKDIADLNAFDPVFEKHGK

81 DIKVVLHTASPLNFTTTEYE

101 KDLLIPAVNGTKGILESIKK

121 YAAQTVERVVVTSSFASHTS

141 TVDMCNTKGKITEDSWNQDT

161 WENCQTDAVRAYFGSKKFAE

181 EAAWEFLNKNKDTVKFKLAT

201 VDPVYVFGPQNHIEPGKKVL

221 NVSSEVINQLVHLKKDDPLP

241 QVACGYIDVRDIAKAHILAF

261 QKDELIGQRLLLHSGLFTVQ

281 TLLDAINEQFPELRGKIPAG

301 EPGSNKPEDLLTPIDNTKTK

321 KLLGFEFRDLKTIIQDTVSQ

341 ILEAENASAKL*.

一种编码所述醇脱氢酶的核酸，所述核酸序列如SEQ ID No.1所示。

SEQ ID No.1:

1 ATGACTGCTG CTAATAACAA CACTACTGTT TTTGTCTCCG GTGCTTCCGG TTTCATTGCT

61 CAACACATCA TCAGACAATT GCTAGACCAG AACTACAAGG TCATTGGTTC TGTTAGATCT

121 ACAGAGAAGG GTGACAACCT GAAGAATGCT ATCTTCAAAA GTGCTAACTT CAACTATGAA

181 ATCGTCAAGG ATATCGCTGA TCTAAATGCT TTTGACCCTG TCTTCGAGAA GCACGGTAAG

241 GATATCAAGG TTGTCCTACA CACCGCCTCT CCTTTGAACT TCACTACTAC CGAATACGAA

301 AAGGATTTGT TGATTCCAGC TGTCAACGGT ACCAAGGGTA TCTTAGAGTC CATCAAGAAG

361 TACGCTGCCC AAACAGTTGA GAGAGTTGTT GTTACTTCCT CCTTTGCTTC TCACACTTCT

421 ACTGTTGACA TGTGCAACAC CAAGGGTAAG ATAACTGAAG ACTCCTGGAA CCAAGACACC

481 TGGGAAAACT GTCAAACGGA TGCCGTTAGA GCTTACTTCG GTTCCAAGAA ATTTGCTGAA

541 GAAGCTGCAT GGGAATTCTT GAACAAGAAC AAAGACACAG TTAAATTCAA GTTGGCCACT

601 GTTGACCCAG TGTACGTCTT CGGTCCTCAA AACCACATCG AGCCTGGCAA GAAGGTATTG

661 AACGTGTCAT CCGAAGTCAT TAACCAATTG GTACACCTAA AGAAAGACGA CCCATTGCCA

721 CAAGTAGCAT GTGGTTACAT CGATGTCCGT GACATTGCTA AGGCTCATAT CCTAGCGTTC

781 CAAAAGGATG AATTAATCGG CCAAAGACTG CTGCTACACT CTGGTTTGTT CACCGTCCAA

841 ACCCTACTGG ACGCTATCAA CGAGCAATTC CCAGAGCTAA GAGGTAAGAT CCCAGCTGGT

901 GAGCCAGGTT CCAACAAGCC AGAAGATCTA CTGACTCCAA TTGACAACAC CAAGACCAAG

961 AAGCTGCTAG GATTCGAGTT CCGTGACCTG AAGACCATCA TCCAGGACAC CGTCTCTCAA

1021 ATCCTAGAAG CTGAGAATGC CAGTGCCAAG TTGTAA.

一种重组表达载体，包含所述的核酸。

一种重组表达转化体，包含所述的重组表达载体。

一种重组菌，包含所述的重组表达转化体。

本发明还提供所述的醇脱氢酶的制备方法，发酵所述重组菌，收集发酵液，提取发酵液中的醇脱氢酶。

一种手性杂环醇的酶催化制备方法，在辅酶及辅酶再生体系的偶联催化反应作用下，将杂环酮类底物转化成手性杂环醇类化合物，所述辅酶及辅酶再生体系包括醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，所述醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

在本发明的一个实施例中，所述杂环酮类底物包括杂环酮二氢-3(2H)-呋喃酮、四氢噻吩-3-酮、环己酮、4-乙基环己酮、N-Boc-3-吡咯烷酮、N-Boc-2-哌啶酮、N-Boc-3-哌啶酮或N-Boc-4-哌啶酮。

在本发明的一个实施例中，所述醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的质量比为3.5-9:1；所述偶联催化反应的温度为25-30℃，pH为6.0-7.0；所述杂环酮类底物的载量为20-200g·L-1；醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶质量之和是所述杂环酮类底物的质量的5％-12.5％。

在本发明的一个实施例中，所述醇脱氢酶的用量为2.5-22.5g/L；所述杂环酮类底物浓度为0.02-1.0M。

在本发明的一个实施例中，具体制备方法为：

(1)将CgADH的编码基因插入含有pET28a载体构建重组质粒pET28a-cgadh，通过化学转化将重组质粒导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，测序验证重组菌落已经成功构建。

(2)将上述重组大肠杆菌BL21(DE3)菌种接入到TB培养基中，然后，控制温度在37℃下通气搅拌活化培养待OD600值至6.0-7.0后，将温度降到25℃，加入终浓度为0.2mM的IPTG，再适时适量补加碳源及氮源，继续控制温度在25℃，发酵培养结束后得到相应的发酵液。离心收集菌体，低温保存备用。

(3)取上述得到的菌体，以磷酸钠缓冲液进行重悬，而后经高压均质破壁2遍后得到相应的破壁酶液，再经离心，得到待用酶液，低温过夜冰冻后放入真空冻干机中冻干，得到酶粉。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明的醇脱氢酶CgADH在不加任何助溶剂的单水相体系可以减轻产物抑制效应使转化率在12h内达到99％以上。将醇脱氢酶CgADH与葡萄糖脱氢酶BmGDH偶联，在最优条件下，不添加任何外源辅酶和有机助溶剂的单水相体系，实现了100mL规模，底物浓度高达200g·L^-1的克级制备，催化剂载量为12.5％。终产物(R)-NBHP的e.e.值高达到99.1％，产品纯度为99.38％。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是CgADH的粗酶及纯酶的SDS-PAGE分析图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明所使用的测试方法：

酶活测定方法测活原理：根据NADPH在340nm下有特征性吸收峰，酮还原酶在发生氧化或还原的反应过程中会产生或消耗NADPH。因此，采用NADPH在340nm下的变化，可间接计算出酶的活力。一个酶活力单位(U)定义为在上述测活条件下每分钟氧化1μmolNADPH所需的酶量。

还原活力的测定体系：

氧化活力的测定体系：

测活过程：设置测活温度为30℃，将所有缓冲液在30℃内预热。分别将底物、辅酶及缓冲液加入干净的酶标板。

粗酶液蛋白浓度的测定采用Bradford法，根据考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后变色，在595nm波长下可以测定蛋白质-色素的结合物，其吸收值与蛋白质的浓度呈正比。采用浓度5mg·L^-1的BSA牛血清标准蛋白为母液，梯度稀释配制浓度区间为0.01-0.12mg·L^-1的蛋白浓度标准曲线。将待测蛋白稀释至蛋白浓度标准曲线的区间内，吸取20μL的蛋白液并加入180μL的考马斯亮蓝30℃静置5min，在595nm处检测。为减少误差每次测定的样品均与蛋白标准曲线一起测定，绘制标准蛋白浓度曲线，根据曲线计算待测样品的蛋白浓度。每个样品均测定3个平行样。

纯酶蛋白浓度的测定是根据大多蛋白在280nm下有最大吸收峰，因此可以通过Nanodrop仪器直接获取浓度数据。纯化的蛋白浓缩除盐之后，利用网站https://web.expasy.org/protparam/查得蛋白的摩尔消光系数和蛋白分子量，将5μL纯酶液滴定在仪器上，根据摩尔消光系数和蛋白分子量设置读取蛋白浓度。蛋白依次稀释不同的倍数，验证在不同稀释倍数下测定结果均有良好的线性关系，即可获得纯酶的蛋白浓度。

采用高效液相色谱法(HPL)分析转化率。待测样品先通过乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，真空浓缩仪挥发乙酸乙酯，最后溶解在流动相中。分析柱为C₁₈柱(4.6×250mm，Diamonsil，Shanghai DIKMA Co.Ltd)，流动相为55％体积分数的乙腈和45％体积分数的水。检测器波长为210nm，柱温为30℃。立体选择性分析柱为Superchiral S-AY柱(4.6×150m，Shanghai Chiralway Biotech Co.Ltd)，流动相为95％体积分数的正己烷和5％体积分数的乙醇。检测器波长为210nm，柱温为30℃。

实施例1：

TB培养基的配制：在5L发酵罐中加入酵母抽提物144g，蛋白胨72g，甘油24g，水4L，磷酸二氢钾10g，磷酸氢二钾12g，121℃灭菌20min，冷却至37℃，得到相应的TB培养基。

将60mL含有T7启动子和表达重组羰基还原酶的重组大肠杆菌菌种接入到TB培养基中，然后，控制温度在37℃下通气搅拌活化培养待OD600至6.0-7.0后，将温度降到25℃，加入终浓度为0.2mM的IPTG，再适时适量补加碳源及氮源，继续控制温度在25℃，发酵培养结束后得到相应的发酵液。离心收集菌体，-20℃保存备用。

取上述得到的菌体100g，以1.0L 10mmol/L pH值为6.0的磷酸钠缓冲液进行重悬，而后经高压均质破壁2遍后得到相应的破壁酶液，再经10000rpm离心15min，得到待用酶液，放置-80℃冰箱过夜冰冻后放入真空冻干机中冻干48h，得到酶粉20g。

实施例2：

为了探索CgADH的底物谱，选取杂环酮二氢-3(2H)-呋喃酮、四氢噻吩-3-酮、环己酮、4-乙基环己酮、N-Boc-3-吡咯烷酮、N-Boc-2-哌啶酮、N-Boc-3-哌啶酮、N-Boc-4-哌啶酮等底物，分别测定CgADH对杂环酮的活力及选择性。如表1所示，CgADH对所有底物均有活力，且对于含侧链取代基底物有较高立体选择性。

表1：CgADH底物谱分析

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注：N.A.:notavailable(无)

实施例3：反应pH对醇脱氢酶CgADH合成R-NBHP的影响

选取了三个pH(pH5.0、pH6.0、pH7.0)探讨醇脱氢酶CgADH的最佳反应pH。使用50mgCgADH及40mgBmGDH的冻干酶粉加入20mL反应体系，其中包含0.4g底物和0.6g葡萄糖。反应过程中，先加入冻干酶粉及PBS7.0或PBS6.0缓冲液采用机械搅拌均匀，一次性加入底物及葡萄糖。由表2可以看出CgADH最佳反应pH为6.0。

表2反应pH的优化

实施例4：酶添加量对反应的影响

选取了三个不同酶量探讨醇脱氢酶CgADH的添加量对反应的影响。使用CgADH及BmGDH的冻干酶粉加入20mL反应体系，其中包含0.4g底物和0.6g葡萄糖。反应过程中，先加入冻干酶粉及PBS6.0缓冲液采用机械搅拌均匀，一次性加入底物及葡萄糖。由表3可以看出CgADH最佳加酶量为5g/L CgADH及1g/L BmGDH。

表3酶添加量对反应的影响

实施例5：醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶比例对反应的影响

将反应等比例扩大至500mM(100g/L)底物，然后选取了三个不同酶量比例探讨两个酶的最优比例。使用CgADH及BmGDH的冻干酶粉加入20mL反应体系，其中包含2g底物和3g葡萄糖。反应过程中，先加入冻干酶粉及PBS6.0缓冲液采用机械搅拌均匀，一次性加入底物及葡萄糖。由表4可以看出最佳加酶比例为22.5g/L CgADH及2.5g/L BmGDH。

表4两酶添加比例对反应的影响

实施例6：反应温度对反应的影响

选取三个不同温度探讨反应的最适温度。用150mg CgADH及100mg BmGDH的冻干酶粉加入20mL反应体系，其中包含2g底物和3g葡萄糖。反应过程中，先加入冻干酶粉及PBS6.0缓冲液采用机械搅拌均匀，一次性加入底物及葡萄糖。由表5可以看出其最适反应温度为25℃。确定好以上优化条件，进行底物浓度为200g/L的放大反应。

表5反应温度的优化

实施例7：100mL规模(R)-NBHP的克级制备

使用CgADH及BmGDH的冻干酶粉将上述优化的20mL反应体系放大至100mL，其中包含20g底物和30g葡萄糖。反应过程中，先加入冻干酶粉及PBS6.0缓冲液采用机械搅拌均匀，一次性加入底物及葡萄糖。过程曲线如表，100mL反应体系与20mL反应体系的进程一致，没有遇到放大困难，也没有产物及底物的抑制现象。反应持续进行，经过8h，转化率到达100％，说明该醇脱氢酶还有继续催化NBPO的潜力。且e.e.值在反应过程中恒定在99％以上，说明该醇脱氢酶的e.e.值不受反应时间或者底物产物浓度的影响。在12h反应结束后，收集反应液。

表6：100mL规模制备(R)-NBHP

实施例8：产物的提取及核磁鉴定

根据产物在不同有机相的分配系数，我们采用产物分配系数最高的二氯甲烷进行萃取。将收集的反应液在70℃下放置2h，使部分蛋白变性，减轻萃取过程中的乳化现象。取反应液3倍体积的二氯甲烷萃取3次，过程中没有观察到严重的乳化现象。收集萃取液，采用真空旋蒸仪30℃水浴挥发二氯甲烷，当大部分二氯甲烷挥发完毕之后，提高水浴温度至50℃，将残留二氯甲烷旋蒸干净。浓缩结束获得产物(R)-NBHP，4℃冰箱放置，为淡黄色的固体。将产物(R)-NBHP通过核磁NMR进行结构鉴定，通过气相色谱鉴定纯度，通过液相色谱鉴定立体选择性以及通过旋光仪测定旋光度。核磁结果：¹³C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ155.24,79.73,66.12,50.62,32.55,28.42,22.49.¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ3.82-3.68(m,2H),3.56(s,1H),3.07(s,1H),3.01(dd,J＝12.8,7.7Hz,1H),2.84(s,1H),2.46(s,1H),1.89(s,1H),1.75(dtd,J＝13.3,6.5,3.5Hz,1H),1.45(s,9H).旋光度：[α]²⁵ _D＝-22.7(c0.1EtOH)。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种醇脱氢酶及其在合成手性杂环醇中的应用

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1056

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 1

atgactgctg ctaataacaa cactactgtt tttgtctccg gtgcttccgg tttcattgct 60

caacacatca tcagacaatt gctagaccag aactacaagg tcattggttc tgttagatct 120

acagagaagg gtgacaacct gaagaatgct atcttcaaaa gtgctaactt caactatgaa 180

atcgtcaagg atatcgctga tctaaatgct tttgaccctg tcttcgagaa gcacggtaag 240

gatatcaagg ttgtcctaca caccgcctct cctttgaact tcactactac cgaatacgaa 300

aaggatttgt tgattccagc tgtcaacggt accaagggta tcttagagtc catcaagaag 360

tacgctgccc aaacagttga gagagttgtt gttacttcct cctttgcttc tcacacttct 420

actgttgaca tgtgcaacac caagggtaag ataactgaag actcctggaa ccaagacacc 480

tgggaaaact gtcaaacgga tgccgttaga gcttacttcg gttccaagaa atttgctgaa 540

gaagctgcat gggaattctt gaacaagaac aaagacacag ttaaattcaa gttggccact 600

gttgacccag tgtacgtctt cggtcctcaa aaccacatcg agcctggcaa gaaggtattg 660

aacgtgtcat ccgaagtcat taaccaattg gtacacctaa agaaagacga cccattgcca 720

caagtagcat gtggttacat cgatgtccgt gacattgcta aggctcatat cctagcgttc 780

caaaaggatg aattaatcgg ccaaagactg ctgctacact ctggtttgtt caccgtccaa 840

accctactgg acgctatcaa cgagcaattc ccagagctaa gaggtaagat cccagctggt 900

gagccaggtt ccaacaagcc agaagatcta ctgactccaa ttgacaacac caagaccaag 960

aagctgctag gattcgagtt ccgtgacctg aagaccatca tccaggacac cgtctctcaa 1020

atcctagaag ctgagaatgc cagtgccaag ttgtaa 1056

<210> 2

<211> 351

<212> PRT

<213> （人工合成）

<400> 2

Met Thr Ala Ala Asn Asn Asn Thr Thr Val Phe Val Ser Gly Ala Ser

1 5 10 15

Gly Phe Ile Ala Gln His Ile Ile Arg Gln Leu Leu Asp Gln Asn Tyr

20 25 30

Lys Val Ile Gly Ser Val Arg Ser Thr Glu Lys Gly Asp Asn Leu Lys

35 40 45

Asn Ala Ile Phe Lys Ser Ala Asn Phe Asn Tyr Glu Ile Val Lys Asp

50 55 60

Ile Ala Asp Leu Asn Ala Phe Asp Pro Val Phe Glu Lys His Gly Lys

65 70 75 80

Asp Ile Lys Val Val Leu His Thr Ala Ser Pro Leu Asn Phe Thr Thr

85 90 95

Thr Glu Tyr Glu Lys Asp Leu Leu Ile Pro Ala Val Asn Gly Thr Lys

100 105 110

Gly Ile Leu Glu Ser Ile Lys Lys Tyr Ala Ala Gln Thr Val Glu Arg

115 120 125

Val Val Val Thr Ser Ser Phe Ala Ser His Thr Ser Thr Val Asp Met

130 135 140

Cys Asn Thr Lys Gly Lys Ile Thr Glu Asp Ser Trp Asn Gln Asp Thr

145 150 155 160

Trp Glu Asn Cys Gln Thr Asp Ala Val Arg Ala Tyr Phe Gly Ser Lys

165 170 175

Lys Phe Ala Glu Glu Ala Ala Trp Glu Phe Leu Asn Lys Asn Lys Asp

180 185 190

Thr Val Lys Phe Lys Leu Ala Thr Val Asp Pro Val Tyr Val Phe Gly

195 200 205

Pro Gln Asn His Ile Glu Pro Gly Lys Lys Val Leu Asn Val Ser Ser

210 215 220

Glu Val Ile Asn Gln Leu Val His Leu Lys Lys Asp Asp Pro Leu Pro

225 230 235 240

Gln Val Ala Cys Gly Tyr Ile Asp Val Arg Asp Ile Ala Lys Ala His

245 250 255

Ile Leu Ala Phe Gln Lys Asp Glu Leu Ile Gly Gln Arg Leu Leu Leu

260 265 270

His Ser Gly Leu Phe Thr Val Gln Thr Leu Leu Asp Ala Ile Asn Glu

275 280 285

Gln Phe Pro Glu Leu Arg Gly Lys Ile Pro Ala Gly Glu Pro Gly Ser

290 295 300

Asn Lys Pro Glu Asp Leu Leu Thr Pro Ile Asp Asn Thr Lys Thr Lys

305 310 315 320

Lys Leu Leu Gly Phe Glu Phe Arg Asp Leu Lys Thr Ile Ile Gln Asp

325 330 335

Thr Val Ser Gln Ile Leu Glu Ala Glu Asn Ala Ser Ala Lys Leu

340 345 350

Claims

1.一种手性杂环醇的酶催化制备方法，其特征在于，在辅酶及辅酶再生体系的偶联催化反应作用下，将杂环酮类底物转化成手性杂环醇类化合物，所述辅酶及辅酶再生体系包括醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，所述醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述杂环酮类底物为杂环酮二氢-3(2H)-呋喃酮、四氢噻吩-3-酮、环己酮、4-乙基环己酮、N-Boc-3-吡咯烷酮、N-Boc-2-哌啶酮、N-Boc-3-哌啶酮或N-Boc-4-哌啶酮。

2.根据权利要求1所述酶催化制备方法，其特征在于，所述醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的质量比为3.5-9:1；所述偶联催化反应的温度为25-30 ℃，pH为6.0-7.0；所述杂环酮类底物的载量为20-200 g·L^-1；醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶质量之和是所述杂环酮类底物的质量的5％-12.5%。

3.根据权利要求1所述酶催化制备方法，其特征在于，所述醇脱氢酶的用量为2.5-22.5g/L；所述杂环酮类底物浓度为0.02-1.0 M。

4.根据权利要求1所述酶催化制备方法，其特征在于，编码权利要求1所述醇脱氢酶的核酸如SEQ ID No.1所示。

5.根据权利要求1所述酶催化制备方法，其特征在于，醇脱氢酶通过以下方法制备得到：发酵含有如所述SEQ ID No.2所示的醇脱氢酶基因的重组菌，收集发酵液，提取发酵液中的醇脱氢酶。