CN114774491B

CN114774491B - 制备(2s,3r)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸酯的方法

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Publication number: CN114774491B
Application number: CN202210483357.4A
Authority: CN
Inventors: 陶荣盛; 李涛; 朱傅赟; 潘震华; 原犇犇; 沈正权; 沈青; 郑云; 孙梁栋; 刘萍; 胡海亮
Original assignee: Huzhou Yisheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Huzhou Yisheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-05-05
Filing date: 2022-05-05
Publication date: 2024-04-26
Anticipated expiration: 2042-05-05
Also published as: CN114774491A

Abstract

本发明提供了一种利用羰基还原酶催化制备(2S,3R)‑2‑(邻苯二甲酰亚胺基甲基)‑3‑羟基丁酸酯的方法，包括如下步骤：以2‑(邻苯二甲酰亚胺基甲基)‑3‑氧代丁酸酯为底物，使用羰基还原酶SEQ ID NO:1催化还原反应，得到(2S,3R)‑2‑(邻苯二甲酰亚胺基甲基)‑3‑羟基丁酸酯。

Description

制备(2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸酯的方法

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种利用羰基还原酶催化还原反应制备(2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸酯的方法。

背景技术

具有两个手性中心的手性化合物(2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸酯能够用于合成许多药物中间体，例如可以用于合成碳青霉烯类抗生素的关键手性中间体4-AA。

该工艺中，以(2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸酯(II)为原料，用叔丁基二甲基硅基(TBS)保护羟基后，再脱除邻苯二甲酰亚胺基保护，得到的中间体在格氏试剂的存在下关环形成丁内酰胺中间体，最后用过氧乙酸氧化即可以得到产品4-AA。

4-AA是4-乙酰氧基氮杂环丁酮的简称，作为碳青霉烯的母核，是生产所有碳青霉烯类抗生素原料药的主要原料。碳青霉烯类抗生素(即培南类抗生素)是一类应用广泛的广谱型抗生素，主要包括亚胺培南、美罗培南、帕尼培南等，全球市场需求巨大。

目前4-AA手性中间体的制备方法主要有过渡金属催化剂催化还原和酶催化还原两种方式。由于过渡金属催化剂价格昂贵，且反应需要高温高压条件下进行，重金属残留难以除去，导致生产成本较高，工业应用受限。

近年来利用生物酶催化不对称还原受到了广泛的关注和应用。这些应用包括：将表达羰基还原酶的完整细胞应用于生物催化反应；或者采用纯化的羰基还原酶与诸如葡萄糖脱氢酶(GDH)、甲酸脱氢酶等辅因子(NADH或NADPH)再生酶在体外联合使用。

使用羰基还原酶一步催化不对称还原生产手性化合物的例子包括：不对称还原2-苯甲酰氨基甲基-3-氧丁酸甲酯的外消旋混合物至(2S,3R)-2-苯甲酰氨基甲基-3-羟基丁酸甲酯(CN101883846A)、不对称还原2-取代氨基甲基-3-酮丁酸酯为(2S,3R)-2-取代氨基甲基-3-羟基丁酸酯(CN113528592A)等。文献(MG Perrone et al.,Adv.Synth.Catal.2007,349,1111-1118.)公开了1种酵母来源的羰基还原酶对2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-酮丁酸乙酯的不对称催化还原反应，但该酶的发酵酶活较低，生成的产物手性不符目标要求，且对映选择性不佳，工业生产受限，因此需要筛选高酶活、高立体选择性、更适合工业化应用的羰基还原酶。

发明内容

为了探索生物催化法制备(2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸酯的工业化可行性，发明人设计了利用还原酶催化2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-氧代丁酸酯进行立体选择性还原反应制备具有(2S,3R)两个手性中心的(2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸酯的工艺构思。为此，发明人对数百种微生物来源的羰基还原酶进行了筛选，通过实验比较，筛选出较为理想的羰基还原酶。具体地，本发明包括如下技术方案。

一种酶催化制备手性化合物(2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸酯的方法，包括如下步骤：

以式I所示的2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-氧代丁酸酯为底物，使用羰基还原酶SEQ ID NO:1或者其同源性≥80％、优选≥85％、≥90％、≥95％的同工酶催化还原反应，得到式II所示的(2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸酯：

其中，R为C1-C4烷基，选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基。

上述同工酶能够催化底物I发生还原反应、同时具有与SEQ ID NO:1基本相同的立体选择性，所得产物II具有(2S,3R)两个手性中心的光学活性。

上述羰基还原酶来源于微生物Microbacterium chocolatum(巧克力色微杆菌)，简称MCADH，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1(GenBank:WP_053546729.1)：

MKAVQYREVGKGPQVVEVDVPEPGPGQIRLKVTAAGLCHSDWFVMDLPAEQYSYGLPLTLGHEGVGVVDKLGAGVEGIEVGGSYAVYGPWGCGLCHACATGRENYCPNAAELGIAPPGLGAPGAMAEYMIVDDKRHLIPLGDLDPVQTVSLTDAGLTPYHAVKNALPKLRPGSTVLVIGVGGLGHVGIQIIRALSQARVIAADLGEDKLALAREVGAHETLISGADTADRVREMTGGRGVDAVFDFVGAGPTLETARAAVAVDGHIEIVGIGGGTLTAGFFATPFGATVRAPYWGSRSELMEVLDLARAGAISVHVETFGIDDAVTAYGKLHDGTVRGRAVIVP(SEQ ID NO:1)。

在一种实施方式中，上述R为甲基或乙基，优选R为甲基。即，底物I为2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-氧代丁酸甲酯或2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-氧代丁酸乙酯，产物II为(2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸甲酯或(2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸乙酯。

在反应体系中，所述羰基还原酶SEQ ID NO:1或者所述同工酶可以呈酶形式或者其表达微生物菌体形式。

当上述羰基还原酶SEQ ID NO:1或者其同工酶呈酶形式时，可以为游离酶或者固定化酶。

当上述羰基还原酶SEQ ID NO:1或者其同工酶呈微生物菌体形式时，所述微生物优选是增殖速度快、适合于表达外源重组蛋白的微生物，例如选自枯草芽孢杆菌、短乳杆菌、大肠杆菌、木兰假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母。

优选地，上述微生物是大肠杆菌，更优选是大肠杆菌BL21(DE3)。

当羰基还原酶SEQ ID NO:1通过大肠杆菌表达时，其编码基因的核苷酸序列可以为SEQ ID NO:2：

ATGAAGGCGGTGCAGTACCGTGAGGTTGGCAAAGGTCCGCAAGTGGTTGAGGTGGATGTTCCGGAACCGGGTCCGGGTCAGATCCGTCTGAAAGTTACCGCGGCGGGTCTGTGCCACAGCGACTGGTTCGTTATGGATCTGCCGGCGGAGCAATACAGCTATGGCCTGCCGCTGACCCTGGGTCATGAAGGCGTGGGTGTGGTTGATAAACTGGGCGCGGGTGTGGAGGGCATCGAAGTTGGTGGCAGCTACGCGGTTTATGGTCCGTGGGGCTGCGGTCTGTGCCATGCGTGCGCGACCGGTCGTGAGAACTACTGCCCGAACGCGGCGGAACTGGGTATTGCTCCGCCGGGTCTGGGTGCGCCGGGTGCGATGGCGGAATATATGATCGTGGACGATAAGCGTCACCTGATTCCGCTGGGTGACCTGGACCCGGTGCAGACCGTTAGCCTGACCGATGCGGGTCTGACCCCGTATCATGCGGTTAAGAACGCGCTGCCGAAACTGCGTCCGGGCAGCACCGTGCTGGTTATCGGTGTGGGTGGCCTGGGCCACGTTGGTATTCAGATCATTCGTGCGCTGAGCCAAGCGCGTGTGATTGCGGCGGACCTGGGTGAAGATAAACTGGCGCTGGCGCGTGAGGTTGGTGCGCACGAAACCCTGATTAGCGGTGCGGACACCGCGGATCGTGTGCGTGAAATGACCGGTGGCCGTGGTGTGGACGCGGTTTTCGATTTTGTTGGCGCGGGTCCGACCCTGGAGACCGCGCGTGCGGCGGTGGCGGTTGATGGCCACATCGAAATTGTTGGTATCGGTGGCGGTACCCTGACCGCGGGCTTCTTTGCGACCCCGTTTGGTGCGACCGTGCGTGCGCCGTACTGGGGCAGCCGTAGCGAGCTGATGGAAGTTCTGGACCTGGCGCGTGCGGGTGCGATCAGCGTGCACGTTGAGACCTTTGGCATTGACGATGCGGTGACCGCGTATGGTAAGCTGCACGATGGCACCGTTCGTGGTCGTGCGGTGATTGTTCCGTAA(SEQ ID NO:2)。

在一种优选的实施方式中，反应体系中添加有异丙醇和辅酶NADP+(β-烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，辅酶II)或NAD+(β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，即辅酶I)，以便促进还原反应。例如，NADP+的作用是，作为氧化剂掠夺电子，羰基还原酶利用异丙醇将NADP+还原为NADPH，产生充足的NADPH作为生物合成的还原剂，从而促进还原反应。

在另一种实施方式中，反应可以在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和辅酶NADP+或NAD+的存在下进行。

上述反应体系pH值可以为6.0-8.0，优选pH6.5-7.5，例如为pH6.9-7.1，反应温度可以为25-45℃。

本发明提供的羰基还原酶酶SEQ ID NO:1具有较高的酶活，能够高度立体选择性地催化底物I生成高光学纯度的产物II，产物ee值不低于98％，且不含(2R,3S)-异构体和(2S,3S)-异构体，具有开发应用前景。

具体实施方式

羰基还原酶又称酮还原酶(KRED)，属于具有酮基还原功能的酶，其种类繁多，不同来源的羰基还原酶用于催化底物化合物反应具有各自不同的特点，原因在于酶蛋白一般具有三级或四级结构，对于底物分子的大小和结构具有选择性，许多酶还具有立体特异性，因此同一种酶催化不同大小和结构的同类底物分子转化的反应速度往往存在显著差异，不同的酶催化同一个底物分子转化的反应速度也往往存在显著差异。对于具有一个以上手性中心的还原产物而言，酶的差异还体现在催化产物的光学活性纯度方面，比如具有高立体选择性的酶的催化产物具有高光学活性纯度，但许多同类酶由于立体选择性低、甚至无立体选择性，导致催化得到的还原产物往往是外消旋体，即高光学活性纯度很低甚至没有。

2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-氧代丁酸酯(化合物I)具有数个羰基，这就对羰基还原酶的作用位置选择性提出了一种较高的要求，要求其仅仅还原3-位羰基而不作用于其他几个位置的羰基；进一步地，还要求其将3-位羰基立体选择性地还原为R-构型羟基、同时形成2-位基团的S-构型。显然，这种(2S,3R)-构型还原产物II对于羰基还原酶的筛选而言是一种高要求的挑战。

为了寻找能够将底物I立体选择性地还原为(2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸酯(化合物II)的还原酶，发明人运用生物信息学技术对不同来源的羰基还原酶进行了广泛分析，并通过对比实验进行筛选。首先根据生物信息学预测构建出能催化R为甲基的底物I(2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-氧代丁酸甲酯)的羰基还原酶集合，再通过测试，从该酶集合中挑选出确实能够发生催化反应的酶子集，进一步考察酶子集中还原产物的手性情况和催化反应速度，然后从这些酶成员中筛选出产物II((2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸甲酯)光学活性纯度高且发酵酶活高的目标酶。

经过上述程序逐级筛选，从已知氨基酸序列的羰基还原酶中挑选出符合本发明设计要求的目标酶，其来源于巧克力色微杆菌(Microbacterium chocolatum)，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，下文中简称为MCADH。

该羰基还原酶MCADH同样适用于催化R为C2-C4烷基比如乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基的底物I进行还原反应并生成(2S,3R)-构型化合物II。

本文中，有时将术语“式X所示(化合物)”表述为“式X”、“底(产)物X”或“化合物X”，这是本领域技术人员能够理解的。比如，式I所示化合物和底物I都是指代相同的化合物2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-氧代丁酸酯。

容易理解，氨基酸序列与MCADH具有高度同源性、基本相同3D模型结构(三级结构)的同工酶预期也可以催化底物I还原反应并得到(2S,3R)-构型产物II。

原料化合物I和产品化合物II常态下都是固体，方便结晶纯化，使整个酶促还原工艺简单，后处理方便。具有两个手性中心的化合物II可以用作许多手性药物中间体的原料，在其后续反应中，邻苯二甲酰亚胺基可以作为手性保护基。

羰基还原酶MCADH及其同工酶可以通过基因工程菌发酵方法得到，基于SEQ IDNO:1或其同工酶的氨基酸序列，本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。

本领域技术人员通过所熟知的基因工程构建方式可以容易地获得这些基因、表达盒、质粒、转化体。

为了在微生物宿主例如基因工程中最常用的大肠杆菌中最佳地表达羰基还原酶SEQ ID NO:1，本发明对其表达基因进行了密码子优化。

密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。例如，经过密码子优化，羰基还原酶SEQ ID NO:1的编码基因可以是SEQ ID NO:2。

在催化底物I进行手性还原的反应体系中，羰基还原酶MCADH既可以呈现酶的形式，也可以呈现菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。

生物催化领域公知，与游离酶法相比，应用固定化酶技术具有生产过程简化、生产效率提高等优点。同时，由于酶可多次使用，且酶的稳定性提高，从而有效提高了单位酶的生产力；其次，固定化酶极易与底物、产物分开，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。

本领域技术人员容易理解，菌体本身就是一种天然的酶固定化形式，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。

另一方面，相比分离出的酶的催化，本发明利用微生物的简单发酵就可以源源不断、取之不尽地提供酶或的供应，无需进一步提取、纯化分离酶等操作，经济效益明显，为工业化应用创造条件。

在一种实施方式中，本发明的羰基还原酶可以与葡萄糖脱氢酶(GDH)联用。其中葡萄糖脱氢酶用于催化葡萄糖氧化，同时将NADP⁺还原为NADPH、或者将NAD+还原为NADH，从而再生NADPH或者NADH。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

实施例

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，pH7.2，121℃高温高压灭菌20min；

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K₂HPO₄.3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5，121℃高温高压灭菌20min；

斜面培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、20g/L琼脂粉，混匀后按30-40mL装液量分装到茄子瓶，竖立放置于121℃高温高压灭菌20min，降温后加入100μg/mL硫酸卡那霉素，摆放成斜面，待冷凝成固体即可。

实施例的底物I为2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-氧代丁酸甲酯，目标产物II为(2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸甲酯。

TLC检测方法：用石油醚：乙酸乙酯＝2:1展开剂在硅胶片上进行薄层色谱(TLC)；在紫外光下观察TLC斑点。

GC检测条件参照文献Tetrahedron:Asymmetry 2004,15,3511-3517：使用安捷伦6850气相色谱仪进行GC分析，HP5毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。

还原反应产物的手性测定方法参照文献Adv.Synth.Catal.2007,349,1111-1118。具体操作如下：使用Agilent 1200型高效液相色谱仪进行HPLC分析Chiralcel OD(Daicel)手性色谱柱，正己烷/2-丙醇＝98:2作为流动相，流速1毫升/分钟，检测波长230纳米。

实施例1：利用生物信息学技术建立备选酶集合

基于现有技术公开的各种羰基还原酶的氨基酸序列，结合建立的3D结构模型，形成具有催化2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-氧代丁酸甲酯发生还原反应潜力的备选酶库。该酶库中重点考察对象包括列于表1中的羰基还原酶(酮还原酶)。

表1：备选的部分羰基还原酶

实施例2：构建表达备选羰基还原酶的重组大肠杆菌

1.对于备选酶库中的羰基还原酶品种，构建其表达大肠杆菌工程菌。例如，根据在NCBI数据库中获得Microbacterium chocolatum来源羰基还原酶MCADH的氨基酸序列SEQID NO:1(GenBank:WP_053546729.1)，进行适于大肠杆菌表达的密码子优化，优化后的基因序列为SEQ ID NO:2。全基因合成该基因序列，在两端设计酶切位点NdeI和BamHII，亚克隆到表达载体pET-24a(+)(购自Novagen)上相应位点，酶切位点为NdeI和BamHI，将MCADH基因的表达置于T7启动子和lacI阻遏基因的控制下，获得重组质粒pET24a-MCADH。使用氯化钙法将质粒pET24a-MCADH转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态中，得到表达羰基还原酶SEQ ID NO:1的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET24a-MCADH。

按照与上述相同的方法，构建表达备选酶库中其他种类的羰基还原酶的重组大肠杆菌。例如：

2.全基因合成专利文件US7531329B2中报道的SEQ ID NO:2的羰基还原酶RDR多核苷酸序列并克隆到表达载体pET-24a(+)，酶切位点为NdeI和BamHI，将该基因的表达置于T7启动子和lacI阻遏基因的控制下。使用标准方法将所得质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态中，得到表达RDR的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET24a-RDR。

3.全基因合成专利文件US8304216B2中报道的SEQ ID NO:1的羰基还原酶RBD多核苷酸序列并克隆到表达载体pET-24a(+)，酶切位点为NdeI和BamHI，将该基因的表达置于T7启动子和lacI阻遏基因的控制下。使用标准方法将所得质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态中，得到表达RBD的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET24a-RBD。

4.全基因合成专利文件CN1993464A中报道的SEQ ID NO:15的羰基还原酶OM5多核苷酸序列并克隆到表达载体pET-24a(+)，酶切位点为NdeI和BamHI，将该基因的表达置于T7启动子和lacI阻遏基因的控制下。使用标准方法将所得质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态中，得到表达OM5的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET24a-OM5。

5.全基因合成专利文件CN101883846A中报道的SEQ ID NO:9的羰基还原酶KRED10多核苷酸序列并克隆到表达载体pET-24a(+)，酶切位点为NdeI和BamHI，将该基因的表达置于T7启动子和lacI阻遏基因的控制下。使用标准方法将所得质粒转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态中，得到表达KRED10的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET24a-KRED10。

6.将专利文件CN113528592A中报道的SEQ ID NO:1的羰基还原酶SsCR氨基酸序列进行大肠杆菌偏好性的密码子优化，得到下述密码子优化的SsCR多核苷酸序列SEQ ID NO:3。全基因合成该编码基因并克隆到表达载体pET-24a(+)，酶切位点为NdeI和BamHI，将SsCR基因的表达置于T7启动子和lacI阻遏基因的控制下。使用标准方法将所得质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态中，得到表达SsCR的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET24a-SsCR。

ATGGCAAAAATCGATAACGCCGTGCTGCCGGAAGGCAGTCTGGTTCTGGTTACCGGTGCAAATGGTTTTGTGGCAAGCCATGTGGTGGAACAGCTGCTGGAACATGGTTATAAAGTTCGTGGCACCGCCCGCAGCGCCAGTAAACTGGCAAATCTGCAGAAACGTTGGGATGCAAAATATCCGGGTCGTTTTGAAACCGCCGTTGTTGAAGATATGCTGAAACAGGGCGCCTATGATGAAGTGATTAAGGGCGCCGCAGGTGTGGCACATATTGCAAGTGTGGTTAGTTTTAGCAATAAGTATGATGAAGTCGTTACCCCGGCAATTGGCGGCACCCTGAATGCACTGCGCGCAGCAGCCGCAACCCCGTCAGTTAAACGCTTTGTGCTGACCAGCAGTACCGTGAGTGCCCTGATTCCGAAACCGAATGTTGAAGGTATCTATCTGGATGAAAAAAGCTGGAATCTGGAAAGTATTGATAAAGCCAAAACCCTGCCGGAAAGCGATCCGCAGAAAAGCCTGTGGGTTTATGCAGCCAGTAAAACCGAAGCCGAACTGGCCGCCTGGAAATTCATGGATGAAAATAAGCCGCATTTTACCCTGAATGCGGTGCTGCCGAATTATACCATTGGCACCATTTTTGATCCGGAAACCCAGAGCGGTAGTACCAGTGGCTGGATGATGAGCCTGTTTAATGGTGAAGTTAGCCCGGCCCTGGCACTGATGCCGCCGCAATATTATGTTAGCGCAGTTGATATTGGTCTGCTGCATCTGGGCTGTCTGGTTCTGCCGCAGATTGAACGTCGTCGCGTTTATGGTACAGCCGGTACATTTGATTGGAATACCGTTCTGGCCACCTTTCGCAAACTGTATCCGAGTAAAACCTTTCCGGCCGATTTTCCGGATCAGGGCCAGGATCTGAGTAAATTTGATACCGCACCGAGTCTGGAAATTCTGAAAAGTCTGGGCCGTCCGGGCTGGCGCAGCATTGAAGAAAGTATTAAGGATCTGGTGGGTAGCGAAACCGCATAA(SEQ ID NO:3)。

实施例3：筛选催化反应速度快的羰基还原酶

1.羰基还原酶基因工程菌的发酵及酶液制备

种子活化：取各种羰基还原酶的表达菌株比如BL21(DE3)/pET24a-MCADH的种子甘油保藏管，取100μL种子保藏液，用接种环均匀涂抹于茄子瓶斜面，然后置于37℃培养箱培养过夜(18h)。

种子培养：取100mL无菌水导入茄子瓶做成菌悬液，取菌悬液50μL接入装有50mlTB培养基的250mL摇瓶(含100μg/mL硫酸卡那霉素)，30℃，220rpm培养16h。

发酵：将一级种子培养液接入装有1L TB培养基的5L摇瓶(含100μg/mL硫酸卡那霉素)，37℃，220rpm培养4-6h后，加入0.3mM IPTG并降温至28℃，220rpm诱导培养12h。

菌体收集：收集发酵液，置于离心机4000rpm离心30min，弃上清后收集菌体，放置于-20℃冷冻备用。

粗酶液制备：取适量冷冻菌体加水配制成200g/L菌溶液，用超声波细胞粉碎机冰水浴超声破碎(电压400W，工作时间3s，间隔时间5s，工作10min)，即得羰基还原酶的酶液。

2.葡萄糖脱氢酶的制备

使用发明人在专利CN110387359B说明书实施例2中构建的葡萄糖脱氢酶GDH表达菌种BL21(DE3)/pET24a-GDH，按照与上述步骤1相同的方法进行种子活化、种子培养、发酵、菌体收集、粗酶液制备，得到葡萄糖脱氢酶GDH的酶液。

3.羰基还原酶的酶活测定

向100mL摇瓶中加入底物(2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-氧代丁酸甲酯)1.5g、异丙醇6ml、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或者β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐(NADP+)0.0012g，再加入羰基还原酶的酶液1.5mL，加入纯净水使得最终反应体积为30mL，1.0M碳酸钠溶液调节pH值为6.9-7.1之间，40℃恒温，200rpm反应，反应4小时取100μl反应液用900μl乙酸乙酯萃取，通过TLC方法鉴定具有催化活性的重组酶。

对于有催化活性的重组酶，其催化反应样品再用乙酸乙酯稀释5倍经过气相(GC)测定产物含量，按照产物含量计算酶活，1min转化产生1μmol产物为1U(1μmol/min)。

通过TLC分析，发现其中MCADH、SSCR、RDR、OM5、RBD和KRED10能快速催化底物(2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-氧代丁酸甲酯)转化。按照产物生成量计算酶活，MCADH每克菌体酶活245.50U，SSCR每克菌体酶活21.73U，RDR每克菌体酶活19.51U，OM5每克菌体酶活169.53U，RBD每克菌体酶活66.05U，KRED10每克菌体酶活38.55U，其中羰基还原酶MCADH的酶活力最高。

实施例4：筛选具有立体选择性的羰基还原酶

对于实施例3中筛选得到的6种酶(MCADH，SSCR，RDR，OM5，RBD和KRED10)，考察每种酶的催化产物的立体构型。

向100mL烧杯中加入底物(2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-氧代丁酸甲酯)1.5g，葡萄糖1.32g，葡萄糖脱氢酶酶液0.5ml，β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐(NADP+)0.0012g，再加入羰基还原酶的酶液1.5mL，加入纯净水使得最终反应体积为30mL，1.0M碳酸钠溶液调节pH值为6.9-7.1之间，40℃恒温，200rpm搅拌反应，转化18小时，取样测定产物的手性，6种酶催化的还原产物2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸甲酯的光学活性列于表2中。

表2：部分羰基还原酶的催化还原产物的光学活性

羰基还原酶	2S,3R	2R,3S	2R,3R	2S,3S
					MCADH	98.82％	0	1.18％	0
RDR	97.12％	0.53％	2.26％	0.09％
					OM5	0.05％	31.02％	0.02％	68.91％
RBD	35.18％	11.46％	31.86％	21.50％
					SSCR	14.28％	25.66％	31.05％	29.01％
KRED10	64.30％	1.53％	16.87％	17.3％

通过该轮的对比，发现MCADH的还原产物的立体构型符合本发明产物II的(2S,3R)-构型。虽然RDR催化还原产物的立体构型也符合(2S,3R)-构型，但酶活力有待于提高。

实施例5：羰基还原酶MCADH考察

向1000mL烧杯中加入底物(2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-氧代丁酸甲酯)100g，葡萄糖87.5g，葡萄糖脱氢酶酶液10ml，纯净水360ml，β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐(NADP+)0.04g，再加入MCADH酶液37.5mL，饱和碳酸钠溶液调节pH值为6.9-7.1之间，40℃恒温，300rpm搅拌反应，反应24小时，反应体系用1.0mol/L的稀盐酸调节pH＝4.0，直接减压浓缩至300ml左右，加入1000ml乙酸乙酯升温至50℃打浆30分钟，静止分层后分出下层水相，再用200ml乙酸乙酯重复萃取一次，乙酸乙酯液合并后用37.5ml饱和碳酸氢钠和112.5ml饱和盐水的混合溶液洗一次，有机相浓缩至200ml左右，升温至65℃，搅拌30分钟，降温至5℃析晶2小时，过滤，滤饼50℃真空烘干得到白色固体81,.5g。经过HPLC测定该固体的化学纯度为99.2％，(2S,3R)-构型产物的占比为99.9％，(2R,3R)-构型产物占比0.1％，其他异构体无检出。

该实验结果表明，羰基还原酶SEQ ID NO:1能够高效地催化2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-氧代丁酸酯仅在3-位羰基发生还原而不还原其他几个位置的羰基，从而得到(2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸酯，具有开发应用前景。

序列表

<110> 湖州颐盛生物科技有限公司

<120> 制备(2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸酯的方法

<130> SHPI2210107

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 344

<212> PRT

<213> Microbacterium chocolatum

<400> 1

Met Lys Ala Val Gln Tyr Arg Glu Val Gly Lys Gly Pro Gln Val Val

1 5 10 15

Glu Val Asp Val Pro Glu Pro Gly Pro Gly Gln Ile Arg Leu Lys Val

20 25 30

Thr Ala Ala Gly Leu Cys His Ser Asp Trp Phe Val Met Asp Leu Pro

35 40 45

Ala Glu Gln Tyr Ser Tyr Gly Leu Pro Leu Thr Leu Gly His Glu Gly

50 55 60

Val Gly Val Val Asp Lys Leu Gly Ala Gly Val Glu Gly Ile Glu Val

65 70 75 80

Gly Gly Ser Tyr Ala Val Tyr Gly Pro Trp Gly Cys Gly Leu Cys His

85 90 95

Ala Cys Ala Thr Gly Arg Glu Asn Tyr Cys Pro Asn Ala Ala Glu Leu

100 105 110

Gly Ile Ala Pro Pro Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ala Met Ala Glu Tyr

115 120 125

Met Ile Val Asp Asp Lys Arg His Leu Ile Pro Leu Gly Asp Leu Asp

130 135 140

Pro Val Gln Thr Val Ser Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His

145 150 155 160

Ala Val Lys Asn Ala Leu Pro Lys Leu Arg Pro Gly Ser Thr Val Leu

165 170 175

Val Ile Gly Val Gly Gly Leu Gly His Val Gly Ile Gln Ile Ile Arg

180 185 190

Ala Leu Ser Gln Ala Arg Val Ile Ala Ala Asp Leu Gly Glu Asp Lys

195 200 205

Leu Ala Leu Ala Arg Glu Val Gly Ala His Glu Thr Leu Ile Ser Gly

210 215 220

Ala Asp Thr Ala Asp Arg Val Arg Glu Met Thr Gly Gly Arg Gly Val

225 230 235 240

Asp Ala Val Phe Asp Phe Val Gly Ala Gly Pro Thr Leu Glu Thr Ala

245 250 255

Arg Ala Ala Val Ala Val Asp Gly His Ile Glu Ile Val Gly Ile Gly

260 265 270

Gly Gly Thr Leu Thr Ala Gly Phe Phe Ala Thr Pro Phe Gly Ala Thr

275 280 285

Val Arg Ala Pro Tyr Trp Gly Ser Arg Ser Glu Leu Met Glu Val Leu

290 295 300

Asp Leu Ala Arg Ala Gly Ala Ile Ser Val His Val Glu Thr Phe Gly

305 310 315 320

Ile Asp Asp Ala Val Thr Ala Tyr Gly Lys Leu His Asp Gly Thr Val

325 330 335

Arg Gly Arg Ala Val Ile Val Pro

340

<210> 2

<211> 1035

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaggcgg tgcagtaccg tgaggttggc aaaggtccgc aagtggttga ggtggatgtt 60

ccggaaccgg gtccgggtca gatccgtctg aaagttaccg cggcgggtct gtgccacagc 120

gactggttcg ttatggatct gccggcggag caatacagct atggcctgcc gctgaccctg 180

ggtcatgaag gcgtgggtgt ggttgataaa ctgggcgcgg gtgtggaggg catcgaagtt 240

ggtggcagct acgcggttta tggtccgtgg ggctgcggtc tgtgccatgc gtgcgcgacc 300

ggtcgtgaga actactgccc gaacgcggcg gaactgggta ttgctccgcc gggtctgggt 360

gcgccgggtg cgatggcgga atatatgatc gtggacgata agcgtcacct gattccgctg 420

ggtgacctgg acccggtgca gaccgttagc ctgaccgatg cgggtctgac cccgtatcat 480

gcggttaaga acgcgctgcc gaaactgcgt ccgggcagca ccgtgctggt tatcggtgtg 540

ggtggcctgg gccacgttgg tattcagatc attcgtgcgc tgagccaagc gcgtgtgatt 600

gcggcggacc tgggtgaaga taaactggcg ctggcgcgtg aggttggtgc gcacgaaacc 660

ctgattagcg gtgcggacac cgcggatcgt gtgcgtgaaa tgaccggtgg ccgtggtgtg 720

gacgcggttt tcgattttgt tggcgcgggt ccgaccctgg agaccgcgcg tgcggcggtg 780

gcggttgatg gccacatcga aattgttggt atcggtggcg gtaccctgac cgcgggcttc 840

tttgcgaccc cgtttggtgc gaccgtgcgt gcgccgtact ggggcagccg tagcgagctg 900

atggaagttc tggacctggc gcgtgcgggt gcgatcagcg tgcacgttga gacctttggc 960

attgacgatg cggtgaccgc gtatggtaag ctgcacgatg gcaccgttcg tggtcgtgcg 1020

gtgattgttc cgtaa 1035

<210> 3

<211> 1032

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcaaaaa tcgataacgc cgtgctgccg gaaggcagtc tggttctggt taccggtgca 60

aatggttttg tggcaagcca tgtggtggaa cagctgctgg aacatggtta taaagttcgt 120

ggcaccgccc gcagcgccag taaactggca aatctgcaga aacgttggga tgcaaaatat 180

ccgggtcgtt ttgaaaccgc cgttgttgaa gatatgctga aacagggcgc ctatgatgaa 240

gtgattaagg gcgccgcagg tgtggcacat attgcaagtg tggttagttt tagcaataag 300

tatgatgaag tcgttacccc ggcaattggc ggcaccctga atgcactgcg cgcagcagcc 360

gcaaccccgt cagttaaacg ctttgtgctg accagcagta ccgtgagtgc cctgattccg 420

aaaccgaatg ttgaaggtat ctatctggat gaaaaaagct ggaatctgga aagtattgat 480

aaagccaaaa ccctgccgga aagcgatccg cagaaaagcc tgtgggttta tgcagccagt 540

aaaaccgaag ccgaactggc cgcctggaaa ttcatggatg aaaataagcc gcattttacc 600

ctgaatgcgg tgctgccgaa ttataccatt ggcaccattt ttgatccgga aacccagagc 660

ggtagtacca gtggctggat gatgagcctg tttaatggtg aagttagccc ggccctggca 720

ctgatgccgc cgcaatatta tgttagcgca gttgatattg gtctgctgca tctgggctgt 780

ctggttctgc cgcagattga acgtcgtcgc gtttatggta cagccggtac atttgattgg 840

aataccgttc tggccacctt tcgcaaactg tatccgagta aaacctttcc ggccgatttt 900

ccggatcagg gccaggatct gagtaaattt gataccgcac cgagtctgga aattctgaaa 960

agtctgggcc gtccgggctg gcgcagcatt gaagaaagta ttaaggatct ggtgggtagc 1020

gaaaccgcat aa 1032

Claims

1.一种酶催化制备(2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸酯的方法，包括如下步骤：

以式I所示的2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-氧代丁酸酯为底物，使用氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的羰基还原酶催化还原反应，得到式II所示的(2S,3R)-2-(邻苯二甲酰亚胺基甲基)-3-羟基丁酸酯：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述R为甲基或乙基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中，所述羰基还原酶SEQ ID NO:1呈酶形式或者其表达微生物菌体形式。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述羰基还原酶SEQ ID NO:1为游离酶或者固定化酶。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微生物选自枯草芽孢杆菌、短乳杆菌、大肠杆菌、木兰假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述羰基还原酶SEQ ID NO:1的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中添加有异丙醇和辅酶NADP+或NAD+。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和辅酶NADP+或NAD+的存在下进行。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系pH值为6.9-7.1。