CN110669743A - 来源于抗辐射奇异球菌p450单加氧酶突变体及其应用 - Google Patents

来源于抗辐射奇异球菌p450单加氧酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

源于抗辐射奇异球菌P450单加氧酶突变体以及突变体合成(S)‑2‑氯‑1‑苯乙醇类手性β‑卤代醇化合物的应用。本发明通过对P450单加氧酶进行多轮定向改造，获得不对称羟化活性提高的P450单加氧酶突变体N190D、N190F和N190F/V356L/A486E。其中，P450单加氧酶突变体N190F/V356L/A486E的催化活性相对于野生型P450单加氧酶提高了8.5倍。N190F/V356L/A486E突变体全细胞可应用于催化1‑氯‑2‑苯乙烷及其衍生物发生苄位不对称羟基化反应，得到对应的(S)‑2‑氯‑1‑苯乙醇类手性β‑卤代醇化合物的产率高达88％，光学纯度高达98％ee。

Description

来源于抗辐射奇异球菌P450单加氧酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗辐射奇异球菌P450单加氧酶突变体及其应用。
背景技术
(S)-2-氯-1-苯乙醇类手性β-卤代醇化合物作为重要的合成中间体，可用于多种手性药物的 制备。例如(S)-2-氯-1-苯乙醇可用于抗抑郁药物托莫西汀、氟西汀和尼索西汀的合成 (Tetrahedron:Asymmetry，2005，16，3275-3278)，图1所示。其化学合成方法包括以下 两种：(1)通过动力学拆分由外消旋的卤代醇获取单一构型的卤代醇，但其最大理论收率只 有50％；(2)以α-卤代酮类化合物为底物，通过过渡金属铑、钌、铱等金属催化剂或手性吡 咯烷硼氢化催化剂等有机催化剂催化的不对称还原反应制备手性β-卤代醇。这些不对称合成 方法均能获得高对映选择性的β-卤代醇，为手性β-卤代醇提供了有效的合成途径。但这些 化学方法常以昂贵的过渡金属作为催化剂，在催化过程中需使用有机溶剂作为供氢体，有些 需要高温或高压的苛刻反应条件且后处理阶段涉及过渡金属残留等问题，不合符绿色化学发 展目标。
目前，生物催化合成手性β-卤代醇主要通过动力学拆分和不对称还原两种合成途径实现。 动力学拆分常以脂肪酶做为生物催化剂，早在1989年，Hiratake等人(J.Org.Chem.,1988,53,6130-6133.)就使用源自Pseudomonas fluoreicens菌株的PFL脂肪酶催化拆分外消旋卤代醇获得较高光学纯度的(S)-2-氯-1-苯乙醇(97％ee)。但动力学拆分理论产率 只能达到50％且需要分离副产物，因此越来越多的研究人员通过羰基不对称还原法合成高光 学纯的β-卤代醇。
Diego等人(Tetrahedron,2016,72,3974-3979)报道了来源于P.glucozyma CBS5766的酮 还原酶KRED1-Pglu可实现多种芳族官能化芳族酮的不对称还原制得手性醇，该酶能在10mM 底物浓度下以95％的产率获得手性β-卤代醇。许建和等人(RSC Adv.，2015，5，22703-22711.) 在2015年通过基因挖掘技术得到了两种产物构型互补的酮还原酶DhCR和CgCR，两者均能得 到ee值＞98％的β-卤代醇并且有着极好的底物耐受性。源自Candidaglabrata的酮还原酶CgKR产物符合Prelog规则，但其催化活性与立体选择性均不理想；经理性改造得到的突变 体CgKR1能催化2-氯苯乙酮生成反Prelog规则的(S)-2-氯-1-苯乙醇，其对苯环不同取代基 的底物有着极佳的立体选择性(ACS Catal.，2016,6，6135-6140)。
除通过酮还原酶(KRED)外，醇脱氢酶(ADH)同样可以催化α-卤代酮化合物不对称还原合成手 性β-卤代醇。来自克氏乳酸杆菌的醇脱氢酶LkDH本身具有很好的立体选择性，能生成ee ＞99％的(S)-2-氯-1-苯乙醇；董志伟等人(Appl.Microbiol.Biot.，2016，100，8757-8767) 通过ISM定向进化改造得到的突变体MuDH2产物构型翻转并且能在1M底物浓度下以大于99％ 的收率获得光学纯卤代醇，分子对接显示MuDH2与底物的结合方向发生了反转，这可能是其 逆转对映选择性的原因。
相比羰基还原法，通过P450单加氧酶催化卤代烃不对称羟化合成手性β-卤代醇的方法可以 利用空气中的氧气作为氧化剂，不需要对底物进行氧化官能团化(图2)。因而，P450单加氧 酶方法具有更高的原子经济性，且符合绿色化学发展方向。但目前对羟化法制备β-卤代醇 的研究偏少。2014年，许建和等人对P450LaMO的底物谱进行研究，首次发现P450LaMO可催化 1-氯-2-苯乙烷苄位羟化反应(ChemBioChem,2014，15，2443-2449)。2019年，我们课题组 发现来源于嗜清洁细小杆菌的P450单加氧酶P450PL2可以催化1-氯-2-苯乙烷苄位的不对称 羟化反应(Green Chem.，2019，21，4324)。但目前已报道P450酶对1-氯-2-苯乙烷及其衍 生物的不对称羟化活性较低低，反应的底物浓度较低，极大地限制了P450单加氧酶方法的应 用。因此，利用蛋白质定向进化策略对P450单加氧酶进行分子改造，获得高催化活性的立体 选择性P450单加氧酶突变体，建立P450单加氧酶催化前手性卤代烃合成(S)-2-氯-1-苯乙醇 类手性β-卤代醇化合物的合成路线，可以为β-卤代醇类药物的绿色制造储备关键合成技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种源于抗辐射奇异球菌P450单加氧酶突变体以及该突变体合成 (S)-2-氯-1-苯乙醇类手性β-卤代醇化合物的应用，本发明以野生型P450单加氧酶基因序列 为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2为亲本酶，通过分子改造的方法筛选获得活 性提高的P450单加氧酶突变体，其在催化1-氯-2-苯乙烷类化合物的苄位不对称羟化过程中 显示出了较高的活力。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种来源于抗辐射奇异球菌P450单加氧酶 突变体体，包括SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，其具有选自第190位、第356位、第486位 中的至少一个氨基酸突变。
进一步，所述突变体是将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第190位的天冬酰胺突变为天冬氨 酸。
进一步，所述突变体是将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第190位的天冬酰胺突变为苯丙氨 酸。
进一步，所述突变体是将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第356位的缬氨酸突变为亮氨酸。
进一步，所述突变体是将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第486位的丙氨酸突变为谷氨酸。
本发明还提供一种所述P450单加氧酶突变体为底物制备(S)-2-氯-1-苯乙醇类手性β-卤代 醇化合物中的应用，具体应用为：以含P450单加氧酶突变体编码基因的重组基因工程菌经诱 导培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥获得的干细胞作为催化剂，以1-氯-2-苯乙烷或其 苯环被取代的类似化合物为底物，以pH8.5的磷酸盐缓冲液为反应介质，在30℃，250rpm条 件下进行反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得对应的(S)-2-氯-1-苯乙醇类手性β- 卤代醇化合物。
进一步，所述P450单加氧酶突变体催化剂以干细胞重量计为10-30g/L；所述底物浓度为 5-20mM；反应温度为20-40℃；反应介质的pH为6.5-9.0；反应时间为12-24小时。
优选地，所述P450单加氧酶突变体催化剂以干细胞重量计为20g/L；所述底物浓度为10mM； 反应温度为30℃；反应介质的pH为8.5；反应时间为12小时。
进一步，P450单加氧酶突变体催化剂按如下方法制备：将含有自给型P450酶突变体编码基 因的重组基因工程菌接种至含有终浓度为50μg/L硫酸卡那霉素的TB液体培养基中，37摄 氏度、250rpm培养8h；培养液以体积浓度2％接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡 那霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm/min振荡培养至菌液OD600＝0.6～0.8后，加入终 浓度为0.2mM的IPTG，25℃、250rpm/min诱导培养12h，取诱导培养后的菌液于4℃、8000rpm/min离心5min，收集湿菌体。
本发明以含亲本P450单加氧酶基因的表达质粒为模板，设计并合成对应的PCR引物，利用易 错PCR技术进行随机突变，扩增产物转化宿主细胞，构建随机突变文库。利用高通量筛选方 法，将突变体诱导表达后进行初步筛选，再结合高效液相色谱分析确认，获得催化活性提高 的优良突变体；进一步，以该优良突变体为模板，进行定点饱和突变，用同样的筛选策略获 得催化活性进一步提高的优良突变体；在此基础之上，进行下一轮随机突变和定点饱和突变， 获得活性更高的P450单加氧酶突变体。
本发明获得了多种P450单加氧酶突变体，以SEQ ID NO:2所示氨基酸序列为参考序列，对第 190位、第356位和第486位氨基酸进行单突变、双突变或三突变，并且这些突变体以1-氯 -2-苯乙烷为底物具有的催化活性比亲本高出至少1.3倍，同时保持区域选择性和立体选择 性。优选的是，所述亲本序列中的第190位的天冬酰胺突变为苯丙氨酸、第356位的缬氨酸 突变为亮氨酸和第486位的丙氨酸突变为谷氨酸的三突变体N190F/V356L/A486E。
本发明所述的P450单加氧酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用。如果需要，也可以是经部 分纯化或完全纯化的酶的形式使用，还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的P450单 加氧酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞形式的固化酶。
通过将含有全长P450单加氧酶基因的质粒转化到适当的宿主细胞，经培养、诱导表达、筛选 出具有高活性的阳性重组菌(图3)。在本发明P450单加氧酶突变体的制备方法中，可以用 pET-28(+)作为载体，以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主细胞。在本发明制备的P450单加氧酶 突变体的方法中，所获得的P450单加氧酶突变体基因可以在原核细胞或真核细胞内表达，也 可以采用本领域已知的任何其他适当方法实现在原核细胞或真核细胞表达。
为了从大量的突变子中快速和准备地筛选活性提高的P450单加氧酶突变体，本发明还建立了 一种基于双酶级联催化偶联氯离子比色检测的高通量筛选方法，该方法可以应用于筛选催化 活性改良的P450单加氧酶突变体。
本发明所用的术语“亲本”系指来源于抗辐射奇异球菌(Deinococcusapachensis)的P450 单加氧酶，其核苷酸序列如序列SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
本发明所用的术语“P450单加氧酶突变体”是指一种以SEQ ID NO:2所示氨基酸序列为参考 序列，对第190位、第356位和第486位氨基酸进行单突变、双突变或三突变，并且这些突 变体以1-氯-2-苯乙烷为底物具有的催化活性比亲本高出至少1.3倍，最高13.5倍的催化活 性的酶。
在发明所用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J. Biochem.,138:9-37，1984)。
本发明以来自抗辐射奇异球菌(Deinococcus apachensis)的P450单加氧酶作为亲本酶，利 用随机突变和定点饱和突变技术构建突变文库，结合高通量筛选方法，获得了一系列活性改 良的P450单加氧酶突变体及其重组菌株；通过发酵培养获得优良P450单加氧酶突变体催化 剂，并将突变体应用于(S)-2-氯-1-苯乙醇类手性β-卤代醇化合物的不对称合成。
采用上述技术方案的有益效果是：
本发明与现有技术相比的有益效果主要体现在：与P450单加氧酶亲本酶相比，本发明提供的 自给型P450单加氧酶突变体催化活性显著提高13.5倍；此外，该生物催化反应所能转化的 底物浓度由2mM提高至20mM，为目前报道的针对该生物催化反应的最高底物浓度。结果表明， 本发明提供的自给型P450单加氧酶突变体即氨基酸序列为SEQ ID NO:5能够在24h内完全将 10mM的1-氯-2-苯乙烷及其类似化合物转化为对应的(S)-2-氯-1-苯乙醇类手性β-卤代醇， 反应的收率最高可达到88％，光学纯度最高可达到98％ee。
附图说明
图1为(S)-2-氯-1-苯乙醇作为中间体合成抗抑郁药物托莫西汀、氟西汀和尼索西汀的应用。
图2为P450单加氧酶催化1-氯-2-苯乙烷类似物合成对应的手性β-卤代醇化合物。
图3为SDS-PAGE分析P450单加氧酶表达。电泳条带M:标准分子量蛋白；电泳条带1：宿主 大肠杆菌BL21(DE3)；电泳条带2：含P450单加氧酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)-P450。
图4为P450单加氧酶亲本酶催化1-氯-2-苯乙烷合成(S)-2-氯-1-苯乙醇的反应进行曲线。
图5为P450单加氧酶突变体P450-M(N190F/V356L/A486E)催化1-氯-2-苯乙烷合成(S)-2- 氯-1-苯乙醇的反应进行曲线。
具体实施方式
以下实施例旨在阐述而不是限制本发明的范围。
实施例1：构建P450单加氧酶突变N190D；
设计突变随机突变引物P1(TAATACGACTCACTATAGGG)和P2(TCGCTTGGAACATTATTAAC)，提取 含有亲本P450基因的质粒作为DNA模板，通过调节PCR体系中Mn2+的浓度，进行易错PCR。 PCR体系(50μL)：2×TaqPCR MaterMix试剂25μL，100μM浓度的P1和P2各1μL，10 μM浓度的MnCl2溶液1μL，模板质粒1μL，去离子水21μL。PCR程序：第一步，95℃/5min； 第二步，98℃/10s,55℃/15s,72℃/10min,共30个循环；第三步72℃/20min。PCR产物进行 纯化之后采用WHOPPCR策略扩增全质粒，得到的PCR产物通过热击(42℃，90s)方法转化到 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。经复苏培养(37℃，1h)后，均匀涂布于含有硫酸卡那霉 素抗生素的LB固体培养基上，在37℃条件下培养过夜。根据建立的比色高通量筛选方法对 随机突变文库的克隆子进行筛选，再结合HPLC分析进行复筛，筛选获得活性提高的克隆子。 提取对应克隆子的质粒，通过基因测序分析确定突变的第190位的天冬酰胺突变为天冬氨酸 (N190D)，得到P450单加氧酶突变体N190D。
实施例2：构建P450单加氧酶突变N190F；
为了在190位点获得更优的突变体，设计针对190位的定点饱和突变引物P3
(TCATACCATGACCATGNNKAGCCGTCCGCC)和P4(CGGACGGCTMNNCATGGTCATGGTATGATGC)，提取突 变体N190D的全质粒作为DNA模板，进行定点饱和突变PCR。PCR体系(50μL)：5×Plusbuffer 试剂10μL，100μM浓度的P1和P2各2μL，模板质粒2μL，dNTP试剂4μL，PrimeSTARDNA聚合酶0.5μL，去离子水29.5μL。PCR程序：第一步，95℃/5min；第二步，98℃/10s, 60℃/5s,72℃/10min,共30个循环；第三步72℃/20min。PCR产物用DpnI消化后直接通过热 击(42℃，90s)方法转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。经复苏培养(37℃，1h)后， 均匀涂布于含有硫酸卡那霉素抗生素的LB固体培养基上，在37℃条件下培养过夜。根据建 立的比色高通量筛选方法对随机突变文库的克隆子进行筛选，再结合HPLC分析进行复筛，筛 选获得活性进一步提高的克隆子。提取对应克隆子的质粒，通过基因测序分析确定突变的第 190位的天冬氨酸进一步突变为苯丙氨酸(N190F)，得到P450单加氧酶突变体D190F。
实施例3：构建P450单加氧酶突变N190F/V356L/A486E；
为了获得活性更高的P450单加氧酶突变体，在P450单加氧酶突变体D190F的基础上进行下 一轮蛋白质分子改造。提取P450单加氧酶突变体D190F的质粒作为DNA模板，以P1(TAATACGACTCACTATAGGG)和P2(TCGCTTGGAACATTATTAAC)作为随机突变引物，通过调节PCR体系中Mn2+的浓度，进行易错PCR。PCR体系(50μL)：2×TaqPCR MaterMix试剂25μL， 100μM浓度的P1和P2各1μL，10μM浓度的MnCl2溶液1μL，模板质粒1μL，去离子水 21μL。PCR程序：第一步，95℃/5min；第二步，98℃/10s,55℃/15s,72℃/10min,共30个 循环；第三步72℃/20min。PCR产物进行纯化之后采用WHOPPCR策略扩增全质粒，得到的PCR 产物通过热击(42℃，90s)方法转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。经复苏培养(37℃， 1h)后，均匀涂布于含有硫酸卡那霉素抗生素的LB固体培养基上，在37℃条件下培养过夜。 根据建立的比色高通量筛选方法对随机突变文库的克隆子进行筛选，再结合HPLC分析进行复 筛，筛选获得活性提高的克隆子。提取对应克隆子的质粒，通过基因测序分析确定突变体的 氨基酸序列相对于野生型P450酶的氨基酸序列发生以下突变，第190位的天冬酰胺突变为苯 丙氨酸，第356位的缬氨酸突变为亮氨酸，第486位的丙氨酸突变为谷氨酸，得到P450单加 氧酶突变体N190F/V356L/A486E。
实施例4：P450单加氧酶突变体N190F/V356L/A486E工程菌株的表达；
将P450单加氧酶突变体N190F/V356L/A486E工程菌株接种到含有50μg/mL硫酸卡那霉素的 30mL TB液体培养基中，37℃培养12h，得到种子液。按2％体系比将种子液转入新鲜无菌的 100mL TB液体培养基中，加入硫酸卡那霉素至终浓度为50μg/mL。将培养物置于37℃条件 下培养2.5h左右，加入终浓度为0.2mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，25℃条件 下诱导培养12h。使用离心机收集培养物(离心条件为4℃、5000rpm，10min)，获得含有P450 单加氧酶突变体N190F/V356L/A486E蛋白的重组菌细胞，可用于生物催化反应。
实施例5：P450单加氧酶突变体N190F/V356L/A486E重组细胞催化1-氯-2-苯乙烷合成手性 (S)-2-氯-1-苯基乙醇(式1)；
Figure BDA0002265091780000071
向125mL规格的三角烧瓶中加入20mL含有P450单加氧酶突变体N190F/V356L/A486E重组细 胞(20cdw/L)的磷酸盐缓冲液(50mM，pH8.5)，同时加入终浓度为10mM的1-氯-2-苯乙烷。 三角瓶在30℃和250rpm条件下搅拌反应24h。将反应液离心10min(4℃、8000rpm)，除去 菌体。分离的上清液用20mL乙酸乙酯萃取三次，将萃取的有机相分离后合并。用无水硫酸钠 干燥有机相，经过滤得到的滤液通过减压蒸馏进行浓缩。浓缩液通过硅胶柱色谱进行分离， 使用的洗脱溶剂为石油醚：乙酸乙酯＝30:1。最后通过减压蒸馏得到目标产物(S)-2-氯-1-苯 基乙醇，产率为88％，ee值为80％。NMR表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39-7.26(m, 5H),4.90(d,J＝8.7Hz,1H),3.75(d,J＝11.1Hz,1H),3.65(t,J＝10.0Hz,1H), 2.77(s,1H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ140.0,128.8,128.6,126.2,74.2,51.0。
实施例6：P450单加氧酶突变体N190F/V356L/A486E重组细胞催化1-氯-2-间溴苯乙烷合成 手性(S)-2-氯-1-间溴苯基乙醇(式2)；
Figure BDA0002265091780000081
向125mL规格的三角烧瓶中加入20mL含有P450单加氧酶突变体N190F/V356L/A486E重组细 胞(20cdw/L)的磷酸盐缓冲液(50mM，pH8.5)，同时加入终浓度为10mM的1-氯-2-间溴苯 乙烷。三角瓶在30℃和250rpm条件下搅拌反应24h。将反应液离心10min(4℃、8000rpm)， 除去菌体。分离的上清液用20mL乙酸乙酯萃取三次，将萃取的有机相分离后合并。用无水硫 酸钠干燥有机相，经过滤得到的滤液通过减压蒸馏进行浓缩。浓缩液通过硅胶柱色谱进行分 离，使用的洗脱溶剂为石油醚：乙酸乙酯＝30:1。
最后通过减压蒸馏得到目标产物(S)-2-氯-1-间溴苯基乙醇，产率为63％，ee值为98％。NMR 表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.54(s,1H),7.44(d,J＝7.7Hz,1H),7.29(d,J＝7.4Hz,1H),7.26-7.20(m,1H),4.85(d,J＝8.6Hz,1H),3.71(d,J＝11.2Hz, 1H),3.59(t,J＝10.0Hz,1H),2.77(s,1H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ142.2,131.6, 130.3,129.3,124.8,122.9,73.4,50.8。
实施例7：P450单加氧酶突变体N190F/V356L/A486E重组细胞催化1-氯-2-间甲基苯乙烷合 成手性(S)-2-氯-1-间甲基苯基乙醇(式3)；
Figure BDA0002265091780000082
向125mL规格的三角烧瓶中加入20mL含有P450单加氧酶突变体N190F/V356L/A486E重组细 胞(20cdw/L)的磷酸盐缓冲液(50mM，pH8.5)，同时加入终浓度为10mM的1-氯-2-间甲基 苯乙烷。三角瓶在30℃和250rpm条件下搅拌反应24h。将反应液离心10min(4℃、8000rpm)， 除去菌体。分离的上清液用20mL乙酸乙酯萃取三次，将萃取的有机相分离后合并。用无水硫 酸钠干燥有机相，经过滤得到的滤液通过减压蒸馏进行浓缩。浓缩液通过硅胶柱色谱进行分 离，使用的洗脱溶剂为石油醚：乙酸乙酯＝30:1。最后通过减压蒸馏得到目标产物(S)-2-氯-1- 间溴苯基乙醇，产率为44％，ee值为97％。NMR表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.26-7.23 (m,1H),7.18-7.10(m,3H),4.84(d,J＝8.6Hz,1H),3.71(d,J＝11.1Hz,1H),3.62 (t,J＝9.9Hz,1H),2.67(s,1H),2.34(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ139.9, 138.6,129.3,128.7,126.8,123.3,74.2,51.1,21.6。
序列表
<110> 遵义医科大学
<120> 来源于抗辐射奇异球菌P450单加氧酶突变体及其应用
<141> 2019-11-07
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3213
<212> DNA
<213> 抗辐射奇异球菌(Deinococcus apachensis)
<400> 1
catatgaccc ggattttagc cccgattccg agcccgccga agcaccctca gtatggtcac 60
ctgcactatt tagcaggcga cgccccggtg ctgaactttt ttcagctggc ccggcagatt 120
ccggaaggtc tgtttcagct ggacattcag ggtcgtaccc tgattcaggc atacgatcct 180
aacctggttg cagaactgac cgatgagcgt cgttttcaga aacgtgttca ccccgcctat 240
accaatattc gtaatctggg tggtgatggt ttatttacca gcgatagttt tgaacccaac 300
tggggtaaag cacatagaat actgttacct gcctttagcc aacgtgcaat gaaaggttac 360
tttgggcaga tgcttgaagt ggcacaggca ctggttggga agtgggaaag aacccaaggt 420
caggatgttc gtgttgcaga tgatatgacc cgtctgacat tagataccat cagccttagt 480
ggttttgact atagatttcg tagctttgat aaggatgaac tgcatccgtt tttacaggca 540
ctggcccgtg caatgcatca taccatgacc atgaatagcc gtccgccggt tttaaccccg 600
gaaatggagg aagccgatcg cgcctattgg gcagatattg catccatgaa tgaactggtt 660
gatgaagtaa tccgtgaacg gcgcggccac gggggaggtg gtggtgactt actgggtctg 720
atgctgaatg caaccgatcc ggagaccggt gaaagactga gcgatgaaaa tattcgttat 780
caggtgatga cctttctgat tgcaggtcat gaaacaacaa gcggtctgct tgcattcacc 840
ctttatttac tgctgcgtca tccacatgta ctggctcagg cgtatgcaga ggttgaccgt 900
ctgttaccgg gtgatgcggt tccgacctat gacaccgtta tgcgtctgga tgttattccg 960
cgtattctgg atgaagcatt acgtttttgg agtaccattc ctaattatgc agttaccgct 1020
ctgcaggatg aagttattgg tggtaaatat gaaatccgta aaggtcagca ggttgcactt 1080
ttaattccgg cactgcatcg tcatccggcc gcctggacta acccggatga atttgatatt 1140
gatcgttgga ccagcgagaa tcgccgcacc caccatccgg cagcctataa gccgtttggg 1200
aacggtatgc gtgcatgtat tggtagacaa tttgcactga cagaagcaaa actggccctg 1260
ttactgattt tacagaaatt tgcactgagc gacccttatg attaccatct taaagtgaaa 1320
cagtccttaa ccattaaacc ggaagacttt gcattacgcg tgcgtgaacg tcgtcctcat 1380
gaacgttttt cagttcccgt tcctgttgtt gaagaaccgc agcaggatct gagtcgggtt 1440
tcagtggcag ggaccggtgt ggcactgaca gttgcctatg gtagcaattt aggtaccacg 1500
gaagatttag catctcgtgt tgcagattat gcaacccgta gcggttttca gacccgttta 1560
accccgctgg atgatttagt taataatgtt ccaagcgaag gactgctgtt tgttaccaca 1620
gcgacgtata atggtgcggc accggacaat gcaggtcggt ttgatgcatg gacccaggaa 1680
ggtggtttag cagaaggttc cctggataat ttaagatttg cattactggg gacgggcaat 1740
acccagtggg caacatatca ggcatttccg aaaagagttg aggcagcctt attaaaggcg 1800
ggtgcgcagc cgtttgttcc gcgtggtgag gcagatgcaa atggtgattt tgatggtatg 1860
gtaagtgcat ggtttcagac cctgttacag aaggtgagcg aagaatttgg taccgcagca 1920
caggaaagca cggggcctcg ttatgaatta gatttactga ccgaagccga tgtgcgtccg 1980
gcagttatta gcgaaaaagc atacggtctg aaagttgtga gttcggaaga attagttggt 2040
gatgcagcag gtttatggga ttttgggaag gagccgcccc gtccgagcac caaagcaata 2100
acctttgaat taccggaagg tgtgacttac gataccggcg atcatattgc agtttttgcg 2160
aaaaatgaac cgcgtctggt tgaatgggca gcacataaat taagactgaa accgggccag 2220
gttgtgcgcc tgcgtcaggg tggaaatcgt aaaagccatc ttccgttaaa tacgcctgtt 2280
accgtggaag ttctgctgag cgaatttgtt gaactgcagg atgttgcaac acgttcaaat 2340
attgagacta tgcttgcaca taccccttgc ccgtggacca cccgtcagct gggagcatat 2400
ctggaagatg atgcaaaata tgaggcagaa attcgtaaac cgggtctgag cgttttaggc 2460
ctgctggacc gtttcccggc agttgaatta ccgttagcag tttttcttga actgtgtcct 2520
ccgattcgtc cgcgctatta tagtataagc agtagccctc tggttgcacc gcgtacacct 2580
tctctgaccg ttggtttact ggaagcccct tcgtgggctg gtgctgggca gtttcgtggt 2640
ctggcatcag catacctgaa tcgcgtgcgt ccgggtgata ccgtttttgg ttacgttcgt 2700
aaaccgaatc cgccgtttcg tccgcctgtt gatcctcgta ccccgatgat tttagttggt 2760
ccgggtaccg gcattgcacc tctgcgtggt tttgttgagg aacgtgcagc acagcgtgcc 2820
gcaggccaga cagttggttt atcaaaggtt ttttatggct gtcgtcatcc ggaacatgat 2880
tttttttatc gtgaagattt cggtgcatgg cagagagagg gagtagcaga attacataca 2940
gcatatagcg cggttgctgg tcacccgtat cgttatgttc aggacgcaat tttaggggat 3000
caggaaggag tgtgggctct gattgaaagc ggggcaagca tttatgtttg tggtgatggt 3060
gttcgtatgg cgccggcagt tcgtcagacc attcgtgatt tatatcgtga gaagaccggt 3120
gcaagcgcag gtgaagcgga tgcatggtta gcagggttaa tgcaggaggg tcgttatcag 3180
caggatgttt ttggtgcaag taaataactc gag 3213
<210> 2
<211> 1067
<212> PRT
<213> 抗辐射奇异球菌(Deinococcus apachensis)
<400> 2
Met Thr Arg Ile Leu Ala Pro Ile Pro Ser Pro Pro Lys His Pro Gln
1 5 10 15
Tyr Gly His Leu His Tyr Leu Ala Gly Asp Ala Pro Val Leu Asn Phe
20 25 30
Phe Gln Leu Ala Arg Gln Ile Pro Glu Gly Leu Phe Gln Leu Asp Ile
35 40 45
Gln Gly Arg Thr Leu Ile Gln Ala Tyr Asp Pro Asn Leu Val Ala Glu
50 55 60
Leu Thr Asp Glu Arg Arg Phe Gln Lys Arg Val His Pro Ala Tyr Thr
65 70 75 80
Asn Ile Arg Asn Leu Gly Gly Asp Gly Leu Phe Thr Ser Asp Ser Phe
85 90 95
Glu Pro Asn Trp Gly Lys Ala His Arg Ile Leu Leu Pro Ala Phe Ser
100 105 110
Gln Arg Ala Met Lys Gly Tyr Phe Gly Gln Met Leu Glu Val Ala Gln
115 120 125
Ala Leu Val Gly Lys Trp Glu Arg Thr Gln Gly Gln Asp Val Arg Val
130 135 140
Ala Asp Asp Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Ser Leu Ser Gly
145 150 155 160
Phe Asp Tyr Arg Phe Arg Ser Phe Asp Lys Asp Glu Leu His Pro Phe
165 170 175
Leu Gln Ala Leu Ala Arg Ala Met His His Thr Met Thr Met Asn Ser
180 185 190
Arg Pro Pro Val Leu Thr Pro Glu Met Glu Glu Ala Asp Arg Ala Tyr
195 200 205
Trp Ala Asp Ile Ala Ser Met Asn Glu Leu Val Asp Glu Val Ile Arg
210 215 220
Glu Arg Arg Gly His Gly Gly Gly Gly Gly Asp Leu Leu Gly Leu Met
225 230 235 240
Leu Asn Ala Thr Asp Pro Glu Thr Gly Glu Arg Leu Ser Asp Glu Asn
245 250 255
Ile Arg Tyr Gln Val Met Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr
260 265 270
Ser Gly Leu Leu Ala Phe Thr Leu Tyr Leu Leu Leu Arg His Pro His
275 280 285
Val Leu Ala Gln Ala Tyr Ala Glu Val Asp Arg Leu Leu Pro Gly Asp
290 295 300
Ala Val Pro Thr Tyr Asp Thr Val Met Arg Leu Asp Val Ile Pro Arg
305 310 315 320
Ile Leu Asp Glu Ala Leu Arg Phe Trp Ser Thr Ile Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Val Thr Ala Leu Gln Asp Glu Val Ile Gly Gly Lys Tyr Glu Ile Arg
340 345 350
Lys Gly Gln Gln Val Ala Leu Leu Ile Pro Ala Leu His Arg His Pro
355 360 365
Ala Ala Trp Thr Asn Pro Asp Glu Phe Asp Ile Asp Arg Trp Thr Ser
370 375 380
Glu Asn Arg Arg Thr His His Pro Ala Ala Tyr Lys Pro Phe Gly Asn
385 390 395 400
Gly Met Arg Ala Cys Ile Gly Arg Gln Phe Ala Leu Thr Glu Ala Lys
405 410 415
Leu Ala Leu Leu Leu Ile Leu Gln Lys Phe Ala Leu Ser Asp Pro Tyr
420 425 430
Asp Tyr His Leu Lys Val Lys Gln Ser Leu Thr Ile Lys Pro Glu Asp
435 440 445
Phe Ala Leu Arg Val Arg Glu Arg Arg Pro His Glu Arg Phe Ser Val
450 455 460
Pro Val Pro Val Val Glu Glu Pro Gln Gln Asp Leu Ser Arg Val Ser
465 470 475 480
Val Ala Gly Thr Gly Val Ala Leu Thr Val Ala Tyr Gly Ser Asn Leu
485 490 495
Gly Thr Thr Glu Asp Leu Ala Ser Arg Val Ala Asp Tyr Ala Thr Arg
500 505 510
Ser Gly Phe Gln Thr Arg Leu Thr Pro Leu Asp Asp Leu Val Asn Asn
515 520 525
Val Pro Ser Glu Gly Leu Leu Phe Val Thr Thr Ala Thr Tyr Asn Gly
530 535 540
Ala Ala Pro Asp Asn Ala Gly Arg Phe Asp Ala Trp Thr Gln Glu Gly
545 550 555 560
Gly Leu Ala Glu Gly Ser Leu Asp Asn Leu Arg Phe Ala Leu Leu Gly
565 570 575
Thr Gly Asn Thr Gln Trp Ala Thr Tyr Gln Ala Phe Pro Lys Arg Val
580 585 590
Glu Ala Ala Leu Leu Lys Ala Gly Ala Gln Pro Phe Val Pro Arg Gly
595 600 605
Glu Ala Asp Ala Asn Gly Asp Phe Asp Gly Met Val Ser Ala Trp Phe
610 615 620
Gln Thr Leu Leu Gln Lys Val Ser Glu Glu Phe Gly Thr Ala Ala Gln
625 630 635 640
Glu Ser Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Leu Asp Leu Leu Thr Glu Ala Asp
645 650 655
Val Arg Pro Ala Val Ile Ser Glu Lys Ala Tyr Gly Leu Lys Val Val
660 665 670
Ser Ser Glu Glu Leu Val Gly Asp Ala Ala Gly Leu Trp Asp Phe Gly
675 680 685
Lys Glu Pro Pro Arg Pro Ser Thr Lys Ala Ile Thr Phe Glu Leu Pro
690 695 700
Glu Gly Val Thr Tyr Asp Thr Gly Asp His Ile Ala Val Phe Ala Lys
705 710 715 720
Asn Glu Pro Arg Leu Val Glu Trp Ala Ala His Lys Leu Arg Leu Lys
725 730 735
Pro Gly Gln Val Val Arg Leu Arg Gln Gly Gly Asn Arg Lys Ser His
740 745 750
Leu Pro Leu Asn Thr Pro Val Thr Val Glu Val Leu Leu Ser Glu Phe
755 760 765
Val Glu Leu Gln Asp Val Ala Thr Arg Ser Asn Ile Glu Thr Met Leu
770 775 780
Ala His Thr Pro Cys Pro Trp Thr Thr Arg Gln Leu Gly Ala Tyr Leu
785 790 795 800
Glu Asp Asp Ala Lys Tyr Glu Ala Glu Ile Arg Lys Pro Gly Leu Ser
805 810 815
Val Leu Gly Leu Leu Asp Arg Phe Pro Ala Val Glu Leu Pro Leu Ala
820 825 830
Val Phe Leu Glu Leu Cys Pro Pro Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile
835 840 845
Ser Ser Ser Pro Leu Val Ala Pro Arg Thr Pro Ser Leu Thr Val Gly
850 855 860
Leu Leu Glu Ala Pro Ser Trp Ala Gly Ala Gly Gln Phe Arg Gly Leu
865 870 875 880
Ala Ser Ala Tyr Leu Asn Arg Val Arg Pro Gly Asp Thr Val Phe Gly
885 890 895
Tyr Val Arg Lys Pro Asn Pro Pro Phe Arg Pro Pro Val Asp Pro Arg
900 905 910
Thr Pro Met Ile Leu Val Gly Pro Gly Thr Gly Ile Ala Pro Leu Arg
915 920 925
Gly Phe Val Glu Glu Arg Ala Ala Gln Arg Ala Ala Gly Gln Thr Val
930 935 940
Gly Leu Ser Lys Val Phe Tyr Gly Cys Arg His Pro Glu His Asp Phe
945 950 955 960
Phe Tyr Arg Glu Asp Phe Gly Ala Trp Gln Arg Glu Gly Val Ala Glu
965 970 975
Leu His Thr Ala Tyr Ser Ala Val Ala Gly His Pro Tyr Arg Tyr Val
980 985 990
Gln Asp Ala Ile Leu Gly Asp Gln Glu Gly Val Trp Ala Leu Ile Glu
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Ser Gly Ala Ser Ile Tyr Val Cys Gly Asp Gly Val Arg Met Ala Pro
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Ala Val Arg Gln Thr Ile Arg Asp Leu Tyr Arg Glu Lys Thr Gly Ala
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Ser Ala Gly Glu Ala Asp Ala Trp Leu Ala Gly Leu Met Gln Glu Gly
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<210> 3
<211> 1067
<212> PRT
<213> 抗辐射奇异球菌(Deinococcus apachensis)
<400> 3
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Tyr Gly His Leu His Tyr Leu Ala Gly Asp Ala Pro Val Leu Asn Phe
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Phe Gln Leu Ala Arg Gln Ile Pro Glu Gly Leu Phe Gln Leu Asp Ile
35 40 45
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50 55 60
Leu Thr Asp Glu Arg Arg Phe Gln Lys Arg Val His Pro Ala Tyr Thr
65 70 75 80
Asn Ile Arg Asn Leu Gly Gly Asp Gly Leu Phe Thr Ser Asp Ser Phe
85 90 95
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Gln Arg Ala Met Lys Gly Tyr Phe Gly Gln Met Leu Glu Val Ala Gln
115 120 125
Ala Leu Val Gly Lys Trp Glu Arg Thr Gln Gly Gln Asp Val Arg Val
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Ala Asp Asp Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Ser Leu Ser Gly
145 150 155 160
Phe Asp Tyr Arg Phe Arg Ser Phe Asp Lys Asp Glu Leu His Pro Phe
165 170 175
Leu Gln Ala Leu Ala Arg Ala Met His His Thr Met Thr Met Asp Ser
180 185 190
Arg Pro Pro Val Leu Thr Pro Glu Met Glu Glu Ala Asp Arg Ala Tyr
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Glu Arg Arg Gly His Gly Gly Gly Gly Gly Asp Leu Leu Gly Leu Met
225 230 235 240
Leu Asn Ala Thr Asp Pro Glu Thr Gly Glu Arg Leu Ser Asp Glu Asn
245 250 255
Ile Arg Tyr Gln Val Met Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr
260 265 270
Ser Gly Leu Leu Ala Phe Thr Leu Tyr Leu Leu Leu Arg His Pro His
275 280 285
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Ile Leu Asp Glu Ala Leu Arg Phe Trp Ser Thr Ile Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Val Thr Ala Leu Gln Asp Glu Val Ile Gly Gly Lys Tyr Glu Ile Arg
340 345 350
Lys Gly Gln Gln Val Ala Leu Leu Ile Pro Ala Leu His Arg His Pro
355 360 365
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370 375 380
Glu Asn Arg Arg Thr His His Pro Ala Ala Tyr Lys Pro Phe Gly Asn
385 390 395 400
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Leu Ala Leu Leu Leu Ile Leu Gln Lys Phe Ala Leu Ser Asp Pro Tyr
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435 440 445
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485 490 495
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580 585 590
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770 775 780
Ala His Thr Pro Cys Pro Trp Thr Thr Arg Gln Leu Gly Ala Tyr Leu
785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
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945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
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1045 1050 1055
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1060 1065
<210> 4
<211> 1067
<212> PRT
<213> 抗辐射奇异球菌(Deinococcus apachensis)
<400> 4
Met Thr Arg Ile Leu Ala Pro Ile Pro Ser Pro Pro Lys His Pro Gln
1 5 10 15
Tyr Gly His Leu His Tyr Leu Ala Gly Asp Ala Pro Val Leu Asn Phe
20 25 30
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35 40 45
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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245 250 255
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260 265 270
Ser Gly Leu Leu Ala Phe Thr Leu Tyr Leu Leu Leu Arg His Pro His
275 280 285
Val Leu Ala Gln Ala Tyr Ala Glu Val Asp Arg Leu Leu Pro Gly Asp
290 295 300
Ala Val Pro Thr Tyr Asp Thr Val Met Arg Leu Asp Val Ile Pro Arg
305 310 315 320
Ile Leu Asp Glu Ala Leu Arg Phe Trp Ser Thr Ile Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Val Thr Ala Leu Gln Asp Glu Val Ile Gly Gly Lys Tyr Glu Ile Arg
340 345 350
Lys Gly Gln Gln Val Ala Leu Leu Ile Pro Ala Leu His Arg His Pro
355 360 365
Ala Ala Trp Thr Asn Pro Asp Glu Phe Asp Ile Asp Arg Trp Thr Ser
370 375 380
Glu Asn Arg Arg Thr His His Pro Ala Ala Tyr Lys Pro Phe Gly Asn
385 390 395 400
Gly Met Arg Ala Cys Ile Gly Arg Gln Phe Ala Leu Thr Glu Ala Lys
405 410 415
Leu Ala Leu Leu Leu Ile Leu Gln Lys Phe Ala Leu Ser Asp Pro Tyr
420 425 430
Asp Tyr His Leu Lys Val Lys Gln Ser Leu Thr Ile Lys Pro Glu Asp
435 440 445
Phe Ala Leu Arg Val Arg Glu Arg Arg Pro His Glu Arg Phe Ser Val
450 455 460
Pro Val Pro Val Val Glu Glu Pro Gln Gln Asp Leu Ser Arg Val Ser
465 470 475 480
Val Ala Gly Thr Gly Val Ala Leu Thr Val Ala Tyr Gly Ser Asn Leu
485 490 495
Gly Thr Thr Glu Asp Leu Ala Ser Arg Val Ala Asp Tyr Ala Thr Arg
500 505 510
Ser Gly Phe Gln Thr Arg Leu Thr Pro Leu Asp Asp Leu Val Asn Asn
515 520 525
Val Pro Ser Glu Gly Leu Leu Phe Val Thr Thr Ala Thr Tyr Asn Gly
530 535 540
Ala Ala Pro Asp Asn Ala Gly Arg Phe Asp Ala Trp Thr Gln Glu Gly
545 550 555 560
Gly Leu Ala Glu Gly Ser Leu Asp Asn Leu Arg Phe Ala Leu Leu Gly
565 570 575
Thr Gly Asn Thr Gln Trp Ala Thr Tyr Gln Ala Phe Pro Lys Arg Val
580 585 590
Glu Ala Ala Leu Leu Lys Ala Gly Ala Gln Pro Phe Val Pro Arg Gly
595 600 605
Glu Ala Asp Ala Asn Gly Asp Phe Asp Gly Met Val Ser Ala Trp Phe
610 615 620
Gln Thr Leu Leu Gln Lys Val Ser Glu Glu Phe Gly Thr Ala Ala Gln
625 630 635 640
Glu Ser Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Leu Asp Leu Leu Thr Glu Ala Asp
645 650 655
Val Arg Pro Ala Val Ile Ser Glu Lys Ala Tyr Gly Leu Lys Val Val
660 665 670
Ser Ser Glu Glu Leu Val Gly Asp Ala Ala Gly Leu Trp Asp Phe Gly
675 680 685
Lys Glu Pro Pro Arg Pro Ser Thr Lys Ala Ile Thr Phe Glu Leu Pro
690 695 700
Glu Gly Val Thr Tyr Asp Thr Gly Asp His Ile Ala Val Phe Ala Lys
705 710 715 720
Asn Glu Pro Arg Leu Val Glu Trp Ala Ala His Lys Leu Arg Leu Lys
725 730 735
Pro Gly Gln Val Val Arg Leu Arg Gln Gly Gly Asn Arg Lys Ser His
740 745 750
Leu Pro Leu Asn Thr Pro Val Thr Val Glu Val Leu Leu Ser Glu Phe
755 760 765
Val Glu Leu Gln Asp Val Ala Thr Arg Ser Asn Ile Glu Thr Met Leu
770 775 780
Ala His Thr Pro Cys Pro Trp Thr Thr Arg Gln Leu Gly Ala Tyr Leu
785 790 795 800
Glu Asp Asp Ala Lys Tyr Glu Ala Glu Ile Arg Lys Pro Gly Leu Ser
805 810 815
Val Leu Gly Leu Leu Asp Arg Phe Pro Ala Val Glu Leu Pro Leu Ala
820 825 830
Val Phe Leu Glu Leu Cys Pro Pro Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile
835 840 845
Ser Ser Ser Pro Leu Val Ala Pro Arg Thr Pro Ser Leu Thr Val Gly
850 855 860
Leu Leu Glu Ala Pro Ser Trp Ala Gly Ala Gly Gln Phe Arg Gly Leu
865 870 875 880
Ala Ser Ala Tyr Leu Asn Arg Val Arg Pro Gly Asp Thr Val Phe Gly
885 890 895
Tyr Val Arg Lys Pro Asn Pro Pro Phe Arg Pro Pro Val Asp Pro Arg
900 905 910
Thr Pro Met Ile Leu Val Gly Pro Gly Thr Gly Ile Ala Pro Leu Arg
915 920 925
Gly Phe Val Glu Glu Arg Ala Ala Gln Arg Ala Ala Gly Gln Thr Val
930 935 940
Gly Leu Ser Lys Val Phe Tyr Gly Cys Arg His Pro Glu His Asp Phe
945 950 955 960
Phe Tyr Arg Glu Asp Phe Gly Ala Trp Gln Arg Glu Gly Val Ala Glu
965 970 975
Leu His Thr Ala Tyr Ser Ala Val Ala Gly His Pro Tyr Arg Tyr Val
980 985 990
Gln Asp Ala Ile Leu Gly Asp Gln Glu Gly Val Trp Ala Leu Ile Glu
995 1000 1005
Ser Gly Ala Ser Ile Tyr Val Cys Gly Asp Gly Val Arg Met Ala Pro
1010 1015 1020
Ala Val Arg Gln Thr Ile Arg Asp Leu Tyr Arg Glu Lys Thr Gly Ala
1025 1030 1035 1040
Ser Ala Gly Glu Ala Asp Ala Trp Leu Ala Gly Leu Met Gln Glu Gly
1045 1050 1055
Arg Tyr Gln Gln Asp Val Phe Gly Ala Ser Lys
1060 1065
<210> 5
<211> 1067
<212> PRT
<213> 抗辐射奇异球菌(Deinococcus apachensis)
<400> 5
Met Thr Arg Ile Leu Ala Pro Ile Pro Ser Pro Pro Lys His Pro Gln
1 5 10 15
Tyr Gly His Leu His Tyr Leu Ala Gly Asp Ala Pro Val Leu Asn Phe
20 25 30
Phe Gln Leu Ala Arg Gln Ile Pro Glu Gly Leu Phe Gln Leu Asp Ile
35 40 45
Gln Gly Arg Thr Leu Ile Gln Ala Tyr Asp Pro Asn Leu Val Ala Glu
50 55 60
Leu Thr Asp Glu Arg Arg Phe Gln Lys Arg Val His Pro Ala Tyr Thr
65 70 75 80
Asn Ile Arg Asn Leu Gly Gly Asp Gly Leu Phe Thr Ser Asp Ser Phe
85 90 95
Glu Pro Asn Trp Gly Lys Ala His Arg Ile Leu Leu Pro Ala Phe Ser
100 105 110
Gln Arg Ala Met Lys Gly Tyr Phe Gly Gln Met Leu Glu Val Ala Gln
115 120 125
Ala Leu Val Gly Lys Trp Glu Arg Thr Gln Gly Gln Asp Val Arg Val
130 135 140
Ala Asp Asp Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Ser Leu Ser Gly
145 150 155 160
Phe Asp Tyr Arg Phe Arg Ser Phe Asp Lys Asp Glu Leu His Pro Phe
165 170 175
Leu Gln Ala Leu Ala Arg Ala Met His His Thr Met Thr Met Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Pro Val Leu Thr Pro Glu Met Glu Glu Ala Asp Arg Ala Tyr
195 200 205
Trp Ala Asp Ile Ala Ser Met Asn Glu Leu Val Asp Glu Val Ile Arg
210 215 220
Glu Arg Arg Gly His Gly Gly Gly Gly Gly Asp Leu Leu Gly Leu Met
225 230 235 240
Leu Asn Ala Thr Asp Pro Glu Thr Gly Glu Arg Leu Ser Asp Glu Asn
245 250 255
Ile Arg Tyr Gln Val Met Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr
260 265 270
Ser Gly Leu Leu Ala Phe Thr Leu Tyr Leu Leu Leu Arg His Pro His
275 280 285
Val Leu Ala Gln Ala Tyr Ala Glu Val Asp Arg Leu Leu Pro Gly Asp
290 295 300
Ala Val Pro Thr Tyr Asp Thr Val Met Arg Leu Asp Val Ile Pro Arg
305 310 315 320
Ile Leu Asp Glu Ala Leu Arg Phe Trp Ser Thr Ile Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Val Thr Ala Leu Gln Asp Glu Val Ile Gly Gly Lys Tyr Glu Ile Arg
340 345 350
Lys Gly Gln Gln Leu Ala Leu Leu Ile Pro Ala Leu His Arg His Pro
355 360 365
Ala Ala Trp Thr Asn Pro Asp Glu Phe Asp Ile Asp Arg Trp Thr Ser
370 375 380
Glu Asn Arg Arg Thr His His Pro Ala Ala Tyr Lys Pro Phe Gly Asn
385 390 395 400
Gly Met Arg Ala Cys Ile Gly Arg Gln Phe Ala Leu Thr Glu Ala Lys
405 410 415
Leu Ala Leu Leu Leu Ile Leu Gln Lys Phe Ala Leu Ser Asp Pro Tyr
420 425 430
Asp Tyr His Leu Lys Val Lys Gln Ser Leu Thr Ile Lys Pro Glu Asp
435 440 445
Phe Ala Leu Arg Val Arg Glu Arg Arg Pro His Glu Arg Phe Ser Val
450 455 460
Pro Val Pro Val Val Glu Glu Pro Gln Gln Asp Leu Ser Arg Val Ser
465 470 475 480
Val Ala Gly Thr Gly Val Glu Leu Thr Val Ala Tyr Gly Ser Asn Leu
485 490 495
Gly Thr Thr Glu Asp Leu Ala Ser Arg Val Ala Asp Tyr Ala Thr Arg
500 505 510
Ser Gly Phe Gln Thr Arg Leu Thr Pro Leu Asp Asp Leu Val Asn Asn
515 520 525
Val Pro Ser Glu Gly Leu Leu Phe Val Thr Thr Ala Thr Tyr Asn Gly
530 535 540
Ala Ala Pro Asp Asn Ala Gly Arg Phe Asp Ala Trp Thr Gln Glu Gly
545 550 555 560
Gly Leu Ala Glu Gly Ser Leu Asp Asn Leu Arg Phe Ala Leu Leu Gly
565 570 575
Thr Gly Asn Thr Gln Trp Ala Thr Tyr Gln Ala Phe Pro Lys Arg Val
580 585 590
Glu Ala Ala Leu Leu Lys Ala Gly Ala Gln Pro Phe Val Pro Arg Gly
595 600 605
Glu Ala Asp Ala Asn Gly Asp Phe Asp Gly Met Val Ser Ala Trp Phe
610 615 620
Gln Thr Leu Leu Gln Lys Val Ser Glu Glu Phe Gly Thr Ala Ala Gln
625 630 635 640
Glu Ser Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Leu Asp Leu Leu Thr Glu Ala Asp
645 650 655
Val Arg Pro Ala Val Ile Ser Glu Lys Ala Tyr Gly Leu Lys Val Val
660 665 670
Ser Ser Glu Glu Leu Val Gly Asp Ala Ala Gly Leu Trp Asp Phe Gly
675 680 685
Lys Glu Pro Pro Arg Pro Ser Thr Lys Ala Ile Thr Phe Glu Leu Pro
690 695 700
Glu Gly Val Thr Tyr Asp Thr Gly Asp His Ile Ala Val Phe Ala Lys
705 710 715 720
Asn Glu Pro Arg Leu Val Glu Trp Ala Ala His Lys Leu Arg Leu Lys
725 730 735
Pro Gly Gln Val Val Arg Leu Arg Gln Gly Gly Asn Arg Lys Ser His
740 745 750
Leu Pro Leu Asn Thr Pro Val Thr Val Glu Val Leu Leu Ser Glu Phe
755 760 765
Val Glu Leu Gln Asp Val Ala Thr Arg Ser Asn Ile Glu Thr Met Leu
770 775 780
Ala His Thr Pro Cys Pro Trp Thr Thr Arg Gln Leu Gly Ala Tyr Leu
785 790 795 800
Glu Asp Asp Ala Lys Tyr Glu Ala Glu Ile Arg Lys Pro Gly Leu Ser
805 810 815
Val Leu Gly Leu Leu Asp Arg Phe Pro Ala Val Glu Leu Pro Leu Ala
820 825 830
Val Phe Leu Glu Leu Cys Pro Pro Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile
835 840 845
Ser Ser Ser Pro Leu Val Ala Pro Arg Thr Pro Ser Leu Thr Val Gly
850 855 860
Leu Leu Glu Ala Pro Ser Trp Ala Gly Ala Gly Gln Phe Arg Gly Leu
865 870 875 880
Ala Ser Ala Tyr Leu Asn Arg Val Arg Pro Gly Asp Thr Val Phe Gly
885 890 895
Tyr Val Arg Lys Pro Asn Pro Pro Phe Arg Pro Pro Val Asp Pro Arg
900 905 910
Thr Pro Met Ile Leu Val Gly Pro Gly Thr Gly Ile Ala Pro Leu Arg
915 920 925
Gly Phe Val Glu Glu Arg Ala Ala Gln Arg Ala Ala Gly Gln Thr Val
930 935 940
Gly Leu Ser Lys Val Phe Tyr Gly Cys Arg His Pro Glu His Asp Phe
945 950 955 960
Phe Tyr Arg Glu Asp Phe Gly Ala Trp Gln Arg Glu Gly Val Ala Glu
965 970 975
Leu His Thr Ala Tyr Ser Ala Val Ala Gly His Pro Tyr Arg Tyr Val
980 985 990
Gln Asp Ala Ile Leu Gly Asp Gln Glu Gly Val Trp Ala Leu Ile Glu
995 1000 1005
Ser Gly Ala Ser Ile Tyr Val Cys Gly Asp Gly Val Arg Met Ala Pro
1010 1015 1020
Ala Val Arg Gln Thr Ile Arg Asp Leu Tyr Arg Glu Lys Thr Gly Ala
1025 1030 1035 1040
Ser Ala Gly Glu Ala Asp Ala Trp Leu Ala Gly Leu Met Gln Glu Gly
1045 1050 1055
Arg Tyr Gln Gln Asp Val Phe Gly Ala Ser Lys
1060 1065

Claims (6)

1.一种来源于抗辐射奇异球菌P450单加氧酶突变体体，其特征在于：它包括SEQ IDNO:2所示氨基酸序列，其具有选自第190位、第356位、第486位中的至少一个氨基酸突变；
所述第190位的突变位点有：N190D、N190F；
所述第356位的突变位点有：V356L；
所述第486位的突变位点有：A486E。
2.根据权利要求1所述的来源于抗辐射奇异球菌P450单加氧酶突变体体，其特征在于：所述第190位的天冬酰胺突变为天冬氨酸。
3.根据权利要求1所述的来源于抗辐射奇异球菌P450单加氧酶突变体体，其特征在于：所述第190位的天冬酰胺突变为苯丙氨酸。
4.根据权利要求1所述的来源于抗辐射奇异球菌P450单加氧酶突变体体，其特征在于：所述第356位的缬氨酸突变为亮氨酸。
5.根据权利要求1所述的来源于抗辐射奇异球菌P450单加氧酶突变体体，其特征在于：所述第486位的丙氨酸突变为谷氨酸。
6.一种权利要求1-5任一项所述的来源于抗辐射奇异球菌P450单加氧酶突变体体的应用，其特征在于：以P450单加氧酶突变体为底物制备(S)-2-氯-1-苯乙醇类手性β-卤代醇化合物。
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