CN109182286B - 一种改进的氰基还原酶及其在合成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用 - Google Patents
一种改进的氰基还原酶及其在合成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用 Download PDFInfo
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- C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
Abstract
本发明公开了一种改进的氰基还原酶及其在合成3‑氯吡嗪‑2甲胺中的应用，其特征在于：所述改进的氰基还原酶是以SEQ ID No.2所示氨基酸序列为出发序列，将第120位丙氨酸突变为亮氨酸，并将第155位的谷氨酸突变为赖氨酸得到的突变体；在pH6～8的磷酸钾缓冲液中，分别添加葡萄糖、辅酶NADP、2‑氯‑3‑氰基吡嗪、葡萄糖脱氢酶以及改进的氰基还原酶组成反应混合液，在30～40℃下进行还原反应24h，生成3‑氯吡嗪‑2甲胺，本发明反应条件温和，有机溶剂用量小，反应体系更绿色环保，转化率高，大大提高了3‑氯吡嗪‑2甲胺的制备效率，具有较好的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物催化领域，具体涉及一种改进的氰基还原酶及其在合成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用。
背景技术
3-氯吡嗪-2甲胺是阿卡拉布替尼(Acalabrutinib)的关键中间体，阿卡拉布替尼是由Acerta公司研发的第二代布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂，能促进慢性淋巴性白血病(CLL)患者体内的持久的高应答率。2017年，该药物获FDA批准上市，适应症为套细胞淋巴瘤。
目前，利用化学方法合成3-氯吡嗪-2甲胺的报道较多，主要以2-氯-3-氰基吡嗪为原料，经还原而制得3-氯吡嗪-2甲胺，此类方法有机溶剂使用量大，操作环节较多，制备周期较长，产率较低，且存在重金属污染，生产成本较高等缺陷。与化学方法相比，生物催化具有反应条件温和、效率高、立体选择性强、环境友好等优点。利用分子改造技术对生物催化剂进行改进优化，提高催化效率和稳定性，使其能够更好地满足生产工艺需求。因此，生物催化在药物合成方面具有较好的应用前景。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种改进的氰基还原酶及其在合成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种改进的氰基还原酶，其特征在于：所述改进的氰基还原酶是以SEQ ID No.2所示氨基酸序列为出发序列，将第120位丙氨酸突变为亮氨酸，并将第155位的谷氨酸突变为赖氨酸得到的突变体，氨基酸序列为SEQ ID No.4所示。
作为本发明所述的氰基还原酶的一种优选方案，其中：所述改进的氰基还原酶，还包括，以SEQ ID No.2所示氨基酸序列为出发序列，将第59位酪氨酸突变为丙氨酸，第120位的丙氨酸突变为亮氨酸，第155位的谷氨酸突变为赖氨酸，第211位的谷氨酸突变为精氨酸，氨基酸序列为SEQ ID No.6所示。
作为本发明所述的氰基还原酶的一种优选方案，其中：所述改进的氰基还原酶，还包括，以SEQ ID No.2所示氨基酸序列为出发序列，将第59位酪氨酸突变为丙氨酸，第75位的甘氨酸突变为脯氨酸，第120位的丙氨酸突变为亮氨酸，第137位的苏氨酸突变为丝氨酸，第155位的谷氨酸突变为赖氨酸，第169位的丙氨酸突变为苏氨酸，第211位的谷氨酸突变为精氨酸，氨基酸序列为SEQ ID No.8所示。
本发明的再一个目的是提供改进的氰基还原酶在催化2-氯-3-氰基吡嗪发生还原反应生成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用。
作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述的改进的氰基还原酶在催化2-氯-3-氰基吡嗪发生还原反应生成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用是在pH6～8的磷酸钾缓冲液中，分别添加葡萄糖、辅酶NADP、2-氯-3-氰基吡嗪、葡萄糖脱氢酶以及权利要求1～3任一所述改进的氰基还原酶组成反应混合液，进行还原反应生成3-氯吡嗪-2甲胺。
作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述进行还原反应生成3-氯吡嗪-2甲胺，反应温度为30～40℃，反应时间为24h。
作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述反应混合液，其中葡萄糖浓度为25～50g/L、辅酶NADP浓度为3～7mg/L、2-氯-3-氰基吡嗪浓度为20～50mmol/L、葡萄糖脱氢酶的浓度为2～4g/L、氰基还原酶的浓度为0.6～1.4g/L、磷酸钾缓冲液的浓度为50～100mmol/L。
作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述反应混合液，其中葡萄糖浓度为50g/L、辅酶NADP浓度为7mg/L、2-氯-3-氰基吡嗪浓度为50mmol/L、葡萄糖脱氢酶的浓度为4g/L、氰基还原酶的浓度为1.4g/L。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了一种催化活性高、底物耐受性好的改进的氰基还原酶,与野生型酶相比，改进的酶在底物结合区域、亚基界面及酶分子表面发生氨基酸残基突变，使得酶分子在催化效率和稳定性方面的性能得到显著改善。本发明改进的氰基还原酶可通过构建大肠杆菌基因工程菌和发酵培养大量制备，相对廉价易得。
(2)本发明改进的氰基还原酶在催化2-氯-3-氰基吡嗪发生还原反应生成3-氯吡嗪-2甲胺过程中，转化率较高，转化率能够达89％以上，大大提高了3-氯吡嗪-2甲胺的制备效率；且反应为“一锅煮”式，所有原料同时加入，反应后直接得到终产物3-氯吡嗪-2甲胺，中间无需分离提纯，反应条件温和，有机溶剂用量小，反应体系更绿色环保，具有较好的工业应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为实施例1中突变基因融合PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为实施例2中为野生型氰基还原酶VcNR反应24h后HPLC图谱。
图3为实施例2改进的氰基还原酶VcNRmut1反应24h后HPLC图谱。
图4为实施例3中表达VcNRmut1氰基还原酶细胞破碎液中可溶性和非可溶性蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图5为实施例5改进的氰基还原酶VcNRmut2反应24h后HPLC图谱。
图6为实施例7改进的氰基还原酶VcNRmut3反应24h后HPLC图谱。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：
氰基还原酶突变体库的构建：
全基因合成序列如SEQ ID No.1所示，选择Nde I和Hind III两个酶切位点插入pET-41a(+)表达载体，获得的重组表达载体命名为pET41a-VcNR。根据同源建模和底物对接分析结果发现底物结构部位第120位丙氨酸和第155位谷氨酸与底物距离较近，可能参与酶与底物的结合。为同时在上述两个位点实现饱和突变，我们设计了以下6条引物，并构建突变体库，详参见表1。
表1PCR引物表
以pET41a-VcNR为模板利用上述引物进行PCR扩增，PCR体系为：5×PCR buffer为10μL，2.5mmol/L dNTPs为4μL，
HS DNA聚合酶为0.5μL，pET41a-VcNR模板为0.5μL(含DNA模板0.1μg)，ddH2O为31μL，分别以表1中VcNR-up上游引物(SEQ ID No.9)与A120-down下游引物(SEQ ID No.12)、A120-up上游引物(SEQ ID No.11)与E155-down下游引物(SEQ ID No.14)、E155-up上游引物(SEQ ID No.13)与VcNR-down下游引物(SEQ IDNo.10)各2μL(10mol/L)进行PCR扩增。
PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)95℃，变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收380、120、360bp左右的目标条带。以这三种PCR产物为模板，反应体系如下：5×PCR buffer为10μL，2.5mmol/L dNTPs为4μL，
HS DNA聚合酶为0.5μL，ddH2O为28.5μL，PCR回收片段各1μL，利用VcNR-up上游引物与VcNR-down下游引物各2μL进行PCR扩增，PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)95℃，变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸70s；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收目标条带，大小约850bp(图1)，该片段中则包含了具有两个位点组合突变的所有突变序列。
将上述基因片段和载体pET-41a(+)质粒分别进行酶切反应(Nde I和Hind III，37℃酶切1h)，酶切产物切胶回收后进行连接反应(16℃过夜反应)，转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，通过卡克隆。于96孔板中每孔加入LB培养基0.6mL(含卡那霉素50μg/mL)，每块96孔板挑选那霉素筛选获得阳性单93个阳性克隆和3个BL21(DE3)/pET41a-VcNR作为对照，共挑取10块96孔板，在37℃摇床中震荡培养16h，此即为突变体库。
实施例2：
氰基还原酶突变体的表达、筛选及鉴定:
转接培养过夜的突变体菌液200μL至一个新的96孔板中，该板每孔内含新鲜LB培养基1mL，其中卡那霉素浓度为50μg/mL、IPTG浓度为1.0mmol/L，于25℃诱导培养20h左右，离心弃上清，收集菌体。每孔加入600μL反应液，其中包括：10mmol/L的底物2-氯-3-氰基吡嗪，20g/L葡萄糖，1mg/L的NADP，1g/L葡萄糖脱氢酶，0.5g/L的氰基还原酶，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH＝8.0)，于35℃摇床振荡反应24h后，反应液进行HPLC分析检测突变体转化率。结果显示对照组转化率为9％左右(图2)，而筛选出的活性提高的突变体的转化率接近53％(图3)。
为了从所筛选出表达突变体的细胞中获得氰基还原酶的编码基因，将其所对应的菌种送测序，测序结果显示含有SEQ ID No.3所示核苷酸序列，编码SEQID No.4所示氨基酸序列。该改进的氰基还原酶命名为VcNRmut1，菌种命名为BL21(DE3)/pET41a-VcNRmut1。
实施例3：
转接甘油保藏菌种至5mL含卡那霉素的LB试管培养基中活化培养(37℃培养12h)，按1％接种量转接活化培养物至400mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养菌体浓度A600至0.6-0.8，加入IPTG(终浓度0.1mmol/L)于25℃诱导培养16h，离心收集菌体。取0.1g菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(10mmol/L，pH 7.5)中，冰水浴中超声破碎15min，离心收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况，目的蛋白大小约28kDa(图4，其中，A为细胞破碎液中可溶性蛋白，B为细胞破碎液中非可溶性蛋白)，上清液-20℃预冻后真空冷冻干燥48h后碾碎，即得氰基还原酶酶粉。
实施例4：
在pH6的磷酸钾缓冲液中，分别添加葡萄糖、辅酶NADP、2-氯-3-氰基吡嗪、葡萄糖脱氢酶以及氰基还原酶(VcNRmut1)组成反应混合液，在30℃下进行还原反应24h(反应过程中用1mol/L磷酸氢二钠控制反应pH至6)，生成3-氯吡嗪-2甲胺，通过HPLC分析，测得转化率为89％。
其中，反应混合液：葡萄糖浓度为25g/L、辅酶NADP浓度为3mg/L、2-氯-3-氰基吡嗪浓度为20mmol/L、葡萄糖脱氢酶的浓度为2g/L、氰基还原酶的浓度为0.6g/L。
实施例5：
以pET41a-VcNRmut1为模板进行易错PCR扩增，PCR体系为：10×PCR buffer为5μL，10×易错PCR专用dNTPs为5μL，5mmol/L的MnCl2为5μL，Taq DNA聚合酶为1μL，pET41a-VcNRmut1模板为0.5μL(含DNA模板0.1μg)，ddH2O为29.5μL，利用VcNR-up上游引物与VcNR-down下游引物各2μL进行PCR扩增，PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)95℃，变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸70s；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收目标条带。
易错PCR突变体库的构建及筛选过程同实施例1和例2，最终获得氰基还原酶突变体VcNRmut2转化率为81％(图5)。测序结果显示突变基因含有SEQ ID No.5所示核苷酸序列，编码SEQID No.6所示氨基酸序列。参照实施例3制备氰基还原酶突变体VcNRmut2酶粉。
实施例6：
在pH8的磷酸钾缓冲液中，分别添加葡萄糖、辅酶NADP、2-氯-3-氰基吡嗪、葡萄糖脱氢酶以及氰基还原酶(VcNRmut2)组成反应混合液，在40℃下进行还原反应24h(反应过程中用1mol/L磷酸氢二钠控制反应pH至8)，生成3-氯吡嗪-2甲胺，通过HPLC分析，测得转化率为90％。
其中，反应混合液：
葡萄糖浓度为30g/L、辅酶NADP浓度为5mg/L、2-氯-3-氰基吡嗪浓度为30mmol/L、葡萄糖脱氢酶的浓度为3g/L、氰基还原酶(VcNRmut2)的浓度为1.0g/L。
实施例7：
为进一步提高氰基还原酶的催化效率，以pET41a-VcNRmut2为模板进行新一轮易错PCR，突变体库的构建和筛选过程同实施例5。经筛选获得氰基还原酶突变体VcNRmut3转化达到87％(图6)。测序结果显示突变基因含有SEQ ID No.7所示核苷酸序列，编码SEQIDNo.8所示氨基酸序列。参照实施例3制备氰基还原酶突变体VcNRmut3酶粉。
在pH7的磷酸钾缓冲液中，分别添加葡萄糖、辅酶NADP、2-氯-3-氰基吡嗪、葡萄糖脱氢酶以及氰基还原酶(VcNRmut3)组成反应混合液，在35℃下进行还原反应24h(反应过程中用1mol/L磷酸氢二钠控制反应pH至7.5)，生成3-氯吡嗪-2甲胺，通过HPLC分析，测得转化率为93％。
其中，反应混合液：葡萄糖浓度为50g/L、辅酶NADP浓度为7mg/L、2-氯-3-氰基吡嗪浓度为50mmol/L、葡萄糖脱氢酶的浓度为4g/L、氰基还原酶(VcNRmut3)的浓度为1.4g/L。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 泰州学院
<120> 一种改进的氰基还原酶及其在合成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用
<141> 2021-06-24
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 846
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtctaaat actctgacgc taaagaactg gcttctctga ccctgggtaa aaaaaccgaa 60
tacgctaacc agtacgaccc gtctctgctg cagccggttc cgcgttctct gaaccgtaac 120
gacctgcacc tgtctgctac cctgccgttc cagggttgcg acatctggac cctgtacgaa 180
ctgtcttggc tgaaccagaa aggtctgccg caggttgcta tcggtgaagt ttctatcccg 240
gctacctctg ctaacctgat cgaatctaaa tctttcaaac tgtacctgaa ctcttacaac 300
cagacccgtt tcgcttcttg ggacgaagtt cagacccgtc tggttcacga cctgtctgct 360
tgcgctggtg aaaccgttac cgttaacgtt aaatctctga acgaatacac cgctgaaccg 420
atcgttacca tgcagggtga atgcatcgac gaccaggaca tcgaaatcgc taactacgaa 480
ttcgacgacg ctctgctgca gggtgctgct cagggtgaag aagtttctga agttctgcac 540
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atcgcttacc acggtgctaa aatgaaccgt gaagctctgc tgcgttacct ggtttctttc 660
cgtgaacaca acgaattcca cgaacagtgc gttgaacgta tcttcaccga catcatgcgt 720
tactgccagc cgcagtcgct caccgtatac gcacgttaca cccgtcgtgg tggtctggac 780
atcaacccgt tccgttcttc tcaccagtct gctccgaacc acaaccagcg tatggctcgt 840
cagtaa 846
<210> 2
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Lys Tyr Ser Asp Ala Lys Glu Leu Ala Ser Leu Thr Leu Gly
1 5 10 15
Lys Lys Thr Glu Tyr Ala Asn Gln Tyr Asp Pro Ser Leu Leu Gln Pro
20 25 30
Val Pro Arg Ser Leu Asn Arg Asn Asp Leu His Leu Ser Ala Thr Leu
35 40 45
Pro Phe Gln Gly Cys Asp Ile Trp Thr Leu Tyr Glu Leu Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gln Lys Gly Leu Pro Gln Val Ala Ile Gly Glu Val Ser Ile Pro
65 70 75 80
Ala Thr Ser Ala Asn Leu Ile Glu Ser Lys Ser Phe Lys Leu Tyr Leu
85 90 95
Asn Ser Tyr Asn Gln Thr Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Val Gln Thr
100 105 110
Arg Leu Val His Asp Leu Ser Ala Cys Ala Gly Glu Thr Val Thr Val
115 120 125
Asn Val Lys Ser Leu Asn Glu Tyr Thr Ala Glu Pro Ile Val Thr Met
130 135 140
Gln Gly Glu Cys Ile Asp Asp Gln Asp Ile Glu Ile Ala Asn Tyr Glu
145 150 155 160
Phe Asp Asp Ala Leu Leu Gln Gly Ala Ala Gln Gly Glu Glu Val Ser
165 170 175
Glu Val Leu His Ser His Leu Leu Lys Ser Asn Cys Leu Ile Thr Asn
180 185 190
Gln Pro Asp Trp Gly Ser Val Glu Ile Ala Tyr His Gly Ala Lys Met
195 200 205
Asn Arg Glu Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Val Ser Phe Arg Glu His Asn
210 215 220
Glu Phe His Glu Gln Cys Val Glu Arg Ile Phe Thr Asp Ile Met Arg
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Pro Gln Ser Leu Thr Val Tyr Ala Arg Tyr Thr Arg Arg
245 250 255
Gly Gly Leu Asp Ile Asn Pro Phe Arg Ser Ser His Gln Ser Ala Pro
260 265 270
Asn His Asn Gln Arg Met Ala Arg Gln
275 280
<210> 3
<211> 846
<212> DNA
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<211> 281
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1 5 10 15
Lys Lys Thr Glu Tyr Ala Asn Gln Tyr Asp Pro Ser Leu Leu Gln Pro
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Val Pro Arg Ser Leu Asn Arg Asn Asp Leu His Leu Ser Ala Thr Leu
35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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260 265 270
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<211> 846
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Claims (8)
1.一种改进的氰基还原酶，其特征在于：所述改进的氰基还原酶是以SEQ ID No.2所示氨基酸序列为出发序列，将第120位丙氨酸突变为亮氨酸，并将第155位的谷氨酸突变为赖氨酸得到的突变体，氨基酸序列为SEQ ID No.4所示。
2.一种改进的氰基还原酶，其特征在于：所述改进的氰基还原酶，包括，以SEQ ID No.2所示氨基酸序列为出发序列，将第59位酪氨酸突变为丙氨酸，第120位的丙氨酸突变为亮氨酸，第155位的谷氨酸突变为赖氨酸，第211位的谷氨酸突变为精氨酸，氨基酸序列为SEQ IDNo.6所示。
3.一种改进的氰基还原酶，其特征在于：所述改进的氰基还原酶，包括，以SEQ ID No.2所示氨基酸序列为出发序列，将第59位酪氨酸突变为丙氨酸，第75位的甘氨酸突变为脯氨酸，第120位的丙氨酸突变为亮氨酸，第137位的苏氨酸突变为丝氨酸，第155位的谷氨酸突变为赖氨酸，第169位的丙氨酸突变为苏氨酸，第211位的谷氨酸突变为精氨酸，氨基酸序列为SEQ ID No.8所示。
4.权利要求1~3中任一所述的改进的氰基还原酶在催化2-氯-3-氰基吡嗪发生还原反应生成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的改进的氰基还原酶在催化2-氯-3-氰基吡嗪发生还原反应生成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用是在pH6~8的磷酸钾缓冲液中，分别添加葡萄糖、辅酶NADP、2-氯-3-氰基吡嗪、葡萄糖脱氢酶以及权利要求1~3任一所述改进的氰基还原酶组成反应混合液，进行还原反应生成3-氯吡嗪-2甲胺。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述进行还原反应生成3-氯吡嗪-2甲胺，反应温度为30~40℃，反应时间为24 h。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述反应混合液，其中葡萄糖浓度为25~50g/L、辅酶NADP浓度为3~7 mg/L、2-氯-3-氰基吡嗪浓度为20~50 mmol/L、葡萄糖脱氢酶的浓度为2~4 g/L、氰基还原酶的浓度为0.6~1.4 g/L、磷酸钾缓冲液的浓度为50~100 mmol/L。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述反应混合液，其中葡萄糖浓度为50 g/L、辅酶NADP浓度为7 mg/L、2-氯-3-氰基吡嗪浓度为50 mmol/L、葡萄糖脱氢酶的浓度为4 g/L、氰基还原酶的浓度为1.4 g/L。
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