CN106929521B

CN106929521B - 一种醛酮还原酶基因重组共表达载体、工程菌及其应用

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Publication number: CN106929521B
Application number: CN201710049997.3A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 王亚军; 沈炜; 喻寒
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2017-01-21
Filing date: 2017-01-21
Publication date: 2020-08-21
Anticipated expiration: 2037-01-21
Also published as: CN106929521A

Abstract

本发明公开了一种醛酮还原酶基因重组共表达载体、工程菌及其应用，所述重组共表达载体以质粒pET‑28b、质粒pETDuet‑1或质粒pCDFDuet‑1为基础，包含核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示醛酮还原酶突变体基因和核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示葡萄糖脱氢酶基因。本发明方法在双酶分开单独表达后组合催化方法的最大底物投料量50g/L(已在专利申请(201610124451.5)中公开)的基础上进一步提高到60g/L以上，同时双酶共表达体系有利于全细胞固定化，更具工业化应用前景。

Description

一种醛酮还原酶基因重组共表达载体、工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌，并使用醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯催化合成阿托伐他汀钙双手性侧链6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。

(二)背景技术

心血管疾病是当今对人类最具威胁的疾病之一，其发病率和死亡率均已超过肿瘤性疾病而跃居第一。血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平上升是诱发心血管疾病的一个重要因素，3-羟基-3-甲基辅酶A(HMG-CoA)还原酶是胆固醇合成的关键限速酶。阿托伐他汀钙能竞争性抑制胆固醇合成的关键限速酶—HMG-CoA还原酶活性，减少胆固醇的合成，控制体内LDL-C浓度，是临床上广泛使用的降血脂药。

各国药监部门对手性药物的光学纯度设置了严苛的限制(e.e.值>99.5％，d.e.值>99％)。阿托伐他汀钙是重大手性药物品种，6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯是阿托伐他汀钙合成的关键手性合成前体，开发绿色、低生产成本6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯合成工艺意义重大。传统的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯化学合成法存在诸多缺陷：安全性差；环境不友好；双手性合成控制复杂，产物手性纯度低；产物收率低，生产成本高。生物催化具有反应条件温和、选择性高等优势，因此，开发6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯手性生物合成技术具有重要的研究意义及社会经济效益。

利用醛酮还原酶不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯往往需要偶联葡萄糖脱氢酶催化辅酶再生体系。常见的醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶分开表达后再协同催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯工艺细胞培养批次多，在不同的细胞内进行辅酶氧化和还原需要多次跨膜转运，这增加了传质阻力。构建醛酮还原酶基因-葡萄糖脱氢酶双酶共表达体系，利用醛酮还原酶基因-葡萄糖脱氢酶双酶共表达菌体催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯能够减少一半的细胞培养批次，且辅酶的氧化和再生在同一个宿主细胞内进行，这提高了反应效率，增加过程的经济性。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种活性高、立体选择性好的醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达体重组菌，开发其在不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯上的应用。其中醛酮还原酶来自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)及其突变体，葡萄糖脱氢酶来自西伯利亚微杆菌(Exiguobacterium sibiricum)。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种醛酮还原酶基因重组共表达载体，所述重组共表达载体以质粒pET-28b、质粒pETDuet-1或质粒pCDFDuet-1为基础，包含核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示醛酮还原酶突变体基因和核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示葡萄糖脱氢酶基因。

本发明所述的重组表达载体可以通过本领域常规方法将本发明的突变醛酮还原酶基因与葡萄糖脱氢酶基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的载体可以为本领域常规的各种载体，如pETDuet-1，pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1、pCOLADuet-1、pGEX(all)、pMAL(all)等，所述质粒仅代表部分质粒。本发明所述重组载体优选pET-28b、pETDuet-1、pCDFDuet-1质粒。

更优选，所述重组共表达载体以核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示醛酮还原酶突变体基因和核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示葡萄糖脱氢酶基因为目的基因，以粒pET-28b(+)和质粒pETDuet-1为基础构建而成。

进一步，所述重组共表达载体为双质粒，所述双质粒分别将SEQ ID NO：1所示醛酮还原酶突变体基因导入质粒pET-28b，SEQ ID NO：3所示葡萄糖脱氢酶基因导入pETDuet-1构建而成。通过下述方法制得本发明的重组共表达载体：(1)以含SEQ ID NO：1所示醛酮还原酶突变体基因的pET-28b(+)-klakrm为一个质粒。以含SEQ ID NO：3所示葡萄糖脱氢酶基因pET-28b(+)-esgdh为模板，通过上游引物：5’-CCATGGGGCATTGGCGAA-3’，下游引物5’-GCGGCCGCTCAACCACGGCCAGC-3’，进行PCR扩增获得SEQ ID NO：3所示葡萄糖脱氢酶基因产物；(2)将步骤(1)获得的葡萄糖脱氢酶基因产物与pGEM-T Easy载体连接，获得重组载体pGEM-T Easy-esgdh，并利用限制性核酸内切酶NcoI和NotI双酶切，获得葡萄糖脱氢酶基因粘性末端；(3)将步骤(2)获得的葡萄糖脱氢酶基因粘性末端与表达载体pETDuet(MCS1)经相同限制性核酸内切酶双酶切反应形成互补的粘性末端用T4DNA连接酶连接，获得质粒pETDuet-esgdh(MCS1)，进而生成含有本发明的醛酮还原酶突变体基因片段与葡萄糖脱氢酶基因片段的重组共表达载体pETDuet-esgdh(MCS1)/pET-28b(+)-klakrm。

本发明提供一种由所述重组共表达载体(或共表达体系)转化得到的重组基因工程菌。通过将本发明的重组共表达载体转化至宿主微生物发挥应用价值。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物。本发明优选E.coli BL21(DE3)。将本发明前述的各共表达体系(包括单质粒、双质粒)表达载体通过常规转化方法，转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株。

本发明涉及一种共表达醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的基因工程菌制备方法为：构建含有所述醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的共表达体系，获得共表达基因工程菌，并进行接种、转接、诱导、菌体回收，获得醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达菌体。培养基可为本领域任何可使菌体生长并产生本发明的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水溶解，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，例如本发明采用：将菌液接种于含50μg/mL的LB培养基中，种子液于37℃培养9小时，以体积分数5％(v/v)为转接量，当OD₆₀₀达到0.6～0.8时，以乳糖为诱导剂，诱导温度28℃，诱导10小时，即可获得双酶的高效表达，此条件为筛选优势共表达菌株时所用。

本发明还提供一种醛酮还原酶基因重组共表达载体构建的重组基因工程菌在催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原中的应用，具体所述的应用为：以醛酮还原酶基因重组共表达载体构建的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅助底物(以葡萄糖为辅助底物时，在葡萄糖脱氢酶催化作用下将菌体内源性氧化型NAD(P)⁺还原成NAD(P)H，NAD(P)H作为氢供体参与还原反应，或者添加外源性还原型NADH，从成本上而言，选择不添加外源性辅酶)，以pH7.0、200mM磷酸钾缓冲液为反应介质构成反应体系，在30℃、450转/分钟条件下进行转化反应，pH控制在7.0，用pH-stat调控反应体系的pH，反应结束后(pH基本不再发生变化)，获得含6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的转化液，转化液分离纯化，获得6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。

进一步，所述反应体系中，底物初始浓度为20-100g/L(优选60g/L)，辅助底物初始浓度为10-150g/L(优选90g/L)，催化剂用量以菌体干重(DCW)计为10-40g/L(优选20g(DCW)/L)。

进一步，本发明所述生物催化剂(共表达醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶重组细胞)按如下方法制备：将含醛酮还原酶突变体基因与葡萄糖脱氢酶基因的重组基因工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养12小时，获得种子液；再将种子液以体积浓度5％的接种量转接到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD₆₀₀ 0.6～0.8(优选0.6)，然后加入终浓度为12g/L乳糖，28℃诱导培养12小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，弃上清，获得湿菌体用生理盐水洗涤两次，4℃、8000转/分钟离心10分钟，收集菌体细胞，即为生物催化剂。

与现有技术相比，双酶共表达全细胞催化具有以下优势：本发明方法在双酶分开单独表达后组合催化方法的最大底物投料量50g/L(已在专利申请(201610124451.5)中公开)的基础上进一步提高到60g/L以上，同时双酶共表达体系有利于全细胞固定化，更具工业化应用前景。

(四)附图说明

图1共表达质粒构建示意图。

图2不同共表达体系的蛋白胶图，A中M：标准品，泳道1:E.coli BL 21(DE3)pET-28b(+)-klakrm，泳道2:E.coli BL 21(DE3)pET-28b(+)-esgdh，泳道3:E.coli BL 21(DE3)pET-28b(+)-klakrm/pET-28b(+)-esgdh，泳道4:E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-klakrm(MCS2)/pCDFduet-esgdh(MCS1)，泳道5:E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-klakrm(MCS2)/pET-28b(+)-esgdh，泳道6:E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-esgdh(MCS1)/pET-28b(+)-klakrm，泳道7:E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-esgdh-klakrm，泳道8:E.coli BL 21(DE3)pETDuet-esgdh(MCS1)/pET-28b(+)-klakrm，泳道9:E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-klakrm–esgdh。B中M：标准品，泳道1:E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-esgdh-klakrm/pET-28b(+)-esgdh，泳道2:E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-esgdh(MCS2)/pET-28b(+)-klakrm。

图3诱导剂乳糖浓度对表观比酶活及菌体量的影响(A)；诱导温度对表观比酶活及菌体量的影响(B)。

图4不同诱导时间对表观比酶活及菌体量的影响(A)、对可溶性酶蛋白表达的影响(B)及对不可溶性酶蛋白表达的影响(C)；B中M:标准品；泳道1为8小时；泳道2为10小时；泳道3为12小时；泳道4为14小时；泳道5为16小时；C中M:标准品；泳道1为KlAKRm；泳道2为EsGDH；泳道3为8小时；泳道4为10小时；泳道5为12小时；泳道6为14小时；泳道7为16小时。

图5外源性NADH的添加量对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原的影响。

图6葡萄糖与底物摩尔浓度之比对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原的影响。

图7为6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原反应进程曲线：30℃，pH7.0，450转/分钟，60g/L 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，90g/L葡萄糖，20g DCW/L菌体。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：醛酮还原酶基因(klakrm)与葡萄糖脱氢酶基因(esgdh)克隆及共表达重组体系构建

乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)XP1461(基因序列号：XM_455342.1)。菌株已保藏于中国典型培养物菌种保藏管理中心，保藏日期为2014年8月14日，保藏编号为CCTCC NO:M 2014380，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072，已在专利申请(201410641987.5)中公开。该醛酮还原酶通过分子改造(295位酪氨酸突变为色氨酸，296位色氨酸突变为亮氨酸)，结合密码子优化，获得醛酮还原酶突变体(核苷酸序列为SEQ IDNO：1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示)，突变体酶活较原始提高了14.2倍，对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯表现出严格差向选择性(d.e_p>99％)，已在专利申请(201610124451.5)中公开，并已将突变酶基因连于表达载体pET-28b(+)上，即为pET-28b(+)-klakrm，葡萄糖脱氢酶的基因esgdh(核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示)连于表达载体pET-28b(+)上，即为pET-28b(+)-esgdh。

以pET-28b(+)-klakrm为模板，通过上游引物(引物1)：5’-CCATGGTGACCACCCAGAAAT-3’，下游引物(引物2)5’-GCGGCCGCTTATTTCTGAGATTCAGAGTCGT-3’进行PCR扩增得到突变醛酮还原酶基因产物。以pET-28b(+)-esgdh为模板，通过上游引物(引物3)：5’-CATATGGGCATTGGCGAA-3’，下游引物(引物4)5’-CTCGAGTCAACCACGGCCAGC-3’，进行PCR扩增获得葡萄糖脱氢酶基因产物。

PCR反应体系组成(总体积50μL)：10倍Pfu DNA聚合酶缓冲液(含Mg²⁺)10μL，10mmol/L dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mmol/L)0.5μL，上游引物、下游引物各0.5μL，模板质粒1μL，Pfu Taq DNA聚合酶1μL，无核酸水86.5μL。采用Bio-Rad PCR仪，PCR反应条件为：预变性98℃，4分钟；然后进入温度循环98℃，30秒；58℃，30秒；72℃，1.5分钟；共35个循环；72℃终延伸10分钟，终止温度为4℃。

获得PCR扩增产物采用回收试剂盒(购自Axygen，美国爱思进)回收，纯化后的片段分别记为片段klakrm、片段esgdh，分别与pGEM-T Easy载体连接，获得重组载体pGEM-TEasy-klakrm、pGEM-T Easy-esgdh，并利用限制性核酸内切酶NcoI和Not I双酶切，形成的突变醛酮还原酶基因粘性末端与表达载体pCDFduet(MCS1)经相同限制性核酸内切酶双酶切反应形成互补的粘性末端用T4DNA连接酶连接，利用限制性核酸内切酶NdeI和XhoI双酶切，获得质粒pCDFduet-klakrm t(MCS1)；形成的葡萄糖脱氢酶基因粘性末端与表达载体pCDFduet(MCS2)经相同限制性核酸内切酶双酶切反应形成互补的粘性末端用T4DNA连接酶连接，获得质粒pCDFduet-esgdh(MCS2)；即生成含有本发明的突变醛酮还原酶基因片段与葡萄糖脱氢酶基因片段的双质粒重组共表达载体。将klakrm与esgdh交换多克隆位点的位置，得到pCDFduet-esgdh-klakrm，同时考虑到EsGDH酶活及稳定性优于KlAKRm，故利用低拷贝数的质粒将EsGDH插入pETDuet多克隆位点1，如图1所示，采用相同策略构建得到如下共表达体系：pET-28b(+)-klakrm/pET-28b(+)-esgdh、pCDFduet-klakrm(MCS2)/pCDFduet-esgdh(MCS1)、pCDFduet-klakrm(MCS2)/pET-28b(+)-esgdh、pCDFduet-esgdh(MCS1)/pET-28b(+)-klakrm、pCDFduet-esgdh-klakrm、pETDuet-esgdh(MCS1)/pET-28b(+)-klakrm、pCDFduet-klakrm–esgdh、pCDFduet-esgdh-klakrm/pET-28b(+)-esgdh、pCDFduet-esgdh(MCS2)/pET-28b(+)-klakrm。其中包括双质粒、单质粒的共表达体系，并导入E.coli BL21(DE3)。

实施例2：不同共表达体系醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的表达

将上述实施例1获得的不同共表达菌株，接种于含50μg/mL的LB培养基中，于37℃培养9小时，获得的种子液以5％(v/v)接种量转接到新鲜的含50μg/mL LB培养基中，37℃培养2～2.5小时。当OD₆₀₀达到0.6～0.8时，以终浓度9g/L乳糖为诱导剂，诱导温度28℃，诱导10小时，诱导获得的发酵液进行4℃、8000转/分钟离心10分钟，弃上清，获得湿菌体用生理盐水洗涤两次，4℃、8000转/分钟离心10分钟，收集菌体细胞。加入pH7.0，200mM的磷酸缓冲液重悬，并在冰上破碎(超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停1s)8分钟，即可获得粗酶液，作为蛋白电泳的初始样品。不同的共表达体系蛋白表达情况示于图2。由图2可见，E.coli BL 21(DE3)pET-28b(+)-klakrm/pET-28b(+)-esgdh，E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-klakrm(MCS2)/pCDFduet-esgdh(MCS1)，E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-klakrm(MCS2)/pET-28b(+)-esgdh以及E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-klakrm-esgdh几乎没有表达KlAKRm，而E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-esgdh(MCS1)/pET-28b(+)-klakrm，E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-esgdh-klakrm，E.coli BL 21(DE3)pETDuet-esgdh(MCS1)/pET-28b(+)-klakrm，E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-esgdh(MCS2)/pET-28b(+)-klakrm，E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-esgdh-klakrm(MCS1)/pET-28b(+)-esgdh可以发现双酶都得到了表达，从蛋白图中可以发现，这5个菌株表达KlAKRm的量优于EsGDH的量，这也正是我们期望的，通过牺牲EsGDH的表达量和过表达KlAKRm来获得优势的共表达体系，因为EsGDH的酶活及稳定性都优于KlAKRm。

实施例3：不同共表达菌株不对称还原的效率及比酶活对比

酶活定义：在标准条件下，每分钟每生成1μmol 6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯所需的酶量为1单位酶活，表观比酶活即为每克干菌体所具有的酶活单位数。样品检测方法：6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯在高效液相色谱下进行检测，其中色谱柱为Hypersil ODS C18柱(250×4.6mm,5μm；Thermo,美国)，流动相乙腈比水体积之比＝1:3(v/v)，流速1.0mL/min，进样量20μL，检测波长210nm，柱温40℃。在上述条件下，6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯的保留时间分别为8.0分钟、8.5分钟和12分钟。

优势菌株的筛选：反应体系为50.0g/L底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，75.0g/L葡萄糖，20g DCW/L菌体(实施例2获得的各个菌体)，于pH7.0、100mM磷酸缓冲液中构成50ml反应体系，在30℃、450转/分钟的条件下催化反应4h，使用pH-stat(梅特勒，瑞士)控制反应液的pH值在7.0左右。反应结束后，移取1mL反应液，12000转/分钟离心5分钟，获得上清液。取500μL上清液与500μL无水乙醇混合，-20℃静置过夜，12000转/分钟离心5分钟，上清液过0.22μm微滤膜，透过液用于液相色谱分析。具体测定结果示于表1。

成功表达双基因且催化效率高的共表达菌株如下：E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-esgdh(MCS1)/pET-28b(+)-klakrm，E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-esgdh-klakrm，E.coliBL 21(DE3)pETDuet-esgdh(MCS1)/pET-28b(+)-klakrm，E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-esgdh(MCS2)/pET-28b(+)-klakrm，E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-esgdh-klakrm(MCS1)/pET-28b(+)-esgdh，通过表观比酶活及以还原50g/L底物的催化性能来衡量共表达菌株的优劣。发现，E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-esgdh(MCS2)/pET-28b(+)-klakrm与E.coli BL21(DE3)pETDuet-esgdh(MCS1)/pET-28b(+)-klakrm表达情况及比酶活最佳，分别达到221.6U/g和210.0U/g；在反应4小时内，产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯浓度分别达到148.5mM、142.0mM。但是E.coli BL 21(DE3)pCDFduet-esgdh(MCS2)/pET-28b(+)-klakrm在后期中表达不稳定，因此被舍弃，故选择E.coli BL 21(DE3)pETDuet-esgdh(MCS1)/pET-28b(+)-klakrm为优选工程菌用于后续研究。

表1不同共表达体系构建菌株的催化性能

注：a表示在反应体系为50.0g/L底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，75.0g/L葡萄糖，20g DCW/L菌体，于pH7.0、100mM磷酸缓冲液中构成50ml反应体系，在30℃、450转/分钟的条件下催化反应4h

b表示在标准条件下测得的表观比酶活

实施例4：E.coli BL 21(DE3)pETDuet-esgdh(MCS1)/pET-28b(+)-klakrm菌株的诱导条件优化

标准反应条件为，10mL反应体系：10.0g DCW/L菌体，25g/L的底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯及37.5g/L的葡萄糖，pH7.0，100mM磷酸缓冲液，30℃，200转/分钟反应15分钟。

优化E.coli BL 21(DE3)pETDuet-esgdh(MCS1)/pET-28b(+)-klakrm产酶条件，选择表观比酶活和菌体量为考察指标，其中表观比酶活作为首要考察因素。首先优化了诱导剂乳糖的用量。乳糖(在发酵液OD值到0.6-0.8时才加入到发酵液中去的，通常是预培养2小时左右后添加的)添加量分别为3.0、6.0、9.0、12.0、15.0g/L，诱导温度30℃，诱导培养9小时后，12g/L乳糖的诱导效果最佳(图3中A)。

进一步优化了诱导温度。诱导温度分别为20、28、30、37℃，诱导剂乳糖浓度12g/L，诱导表达10小时后，28℃诱导培养的诱导效果最佳(图3中B)。

最后，考察了12g/L乳糖、28℃诱导培养条件下的产酶和菌体生长曲线，诱导时间分别为8、10、12、14、16小时，图4数据揭示，诱导时间12小时的酶活最高(图4)。获得优化的诱导培养条件：诱导剂乳糖浓度12g/L，诱导温度28℃，诱导培养时间12小时，优势菌的最大表观比酶活达到249.9U/g DCW，菌体密度2.0g DCW/L。

实施例5：辅助底物对不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的影响

10mL反应体系条件：10.0g(DCW)/L菌体，25g/L的底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，pH7.0，100mM磷酸缓冲液，30℃，200转/分钟反应15分钟。

固定底物浓度在25g/L，比较了辅助底物葡萄糖与底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯比例对其还原效率的影响。还原型辅酶NADH的添加对不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的影响，其中葡萄糖的添加量(0.069mol/L、0.138mol/L、0.207mol/L、0.276mol/L、0.345mol/L)，NADH的添加量(0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125mM)。本发明发现，葡萄糖添加量为37.5g/L时，6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原效率最高(图6)；NADH的添加对反应有促进作用，但并不显著(图5)。综合成本因素，选择不额外添加外源性辅酶。

实施例6：利用全细胞不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯

将E.coli BL 21(DE3)pETDuet-esgdh(MCS1)/pET-28b(+)-klakrm接种于含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃培养9小时，种子液采用5％(v/v)接种量转接到新鲜的含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养2-2.5小时，当OD₆₀₀达到0.6～0.8时，以12g/L乳糖为诱导剂，诱导温度28℃，诱导12小时，诱导获得的发酵液进行4℃、8000转/分钟离心10分钟，弃上清，获得湿菌体用生理盐水洗涤两次，4℃、8000转/分钟离心10分钟，收集菌体细胞，作为生物催化剂。

反应体系50mL：底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、葡萄糖、20g(DCW)/L全细胞，pH7.0、100mM磷酸缓冲液，30℃、450转/分钟的条件下进行催化反应，使用pH-stat反应液pH值维持在7.0左右。反应结束后，移取1mL反应液，12000转/分钟离心5分钟，获得上清液，并取500μL上清加500μL的无水乙醇稀释，-20℃过夜，离心12000转/分钟，5分钟，过0.22μm的微滤膜，即可获得样品。所述底物的初始浓度分别为50、60、75、100g/L反应体系，所述葡萄糖的对应用量为75、90、112.5、150g/L反应体系，制备的样品6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯且d.e.值大于99.5％。如表2所示，在最优条件下，最高底物投料量60g/L，4小时左右反应结束，底物完全转化，产物产量达到178.2mM，时空产率达到244.8g/L·d(图7)，而底物的初始浓度分别为50、60、75、100g/L对应的产率及产量见表2。

表2不同底物浓度对E.coli BL 21(DE3)pETDuet-esgdh(MCS1)/pET-28b(+)-klakrm催化反应的产物累积浓度及转化率的影响

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

<120> 一种醛酮还原酶基因重组共表达载体、工程菌及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 930

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

atgaccaccc agaaattctt caccctgtct aacggtaaca aaatcccggc tgttgctatc 60

gttggtaccg gtaccgcttg gtacaaatct gaagaaaccg acgctacctt ctctcagccg 120

ctggttgaca tcgttaaaaa aaccctggac accgttccgg gtgttgttca catcgacgct 180

gctgaaatct accgtaccta cccggaactg ggtgctgctc tgaaagacac caaaaaaccg 240

cgtgacgaaa tcttcatcac cgacaaatac tctaccctga aacagctgtc tgaaaacccg 300

aaagttgctc tggaaacctc tctgaaaaaa ctgggtgttg actacgttga cctgtacctg 360

ctgcactctc cgatcatcaa agaatctaaa ctggacgttg aagctaactg gaaatacctg 420

gaagaactgt acaaatctgg taaagctaaa aacatcggtg tttctaactt cgctgttaaa 480

gacctggaaa aactgctggc tgttgctgaa gttaaaccgc aggttaacca gatcgaattc 540

tctccgttcc tgcagaacca gaccccgggt atcgttgaat tctctcagaa aaacggtatc 600

ctgctggaag cttactctcc gctgggtccg ctgcagcgtc gtccggaaga cgctgacaaa 660

ctgccgttct accagtacat cgctgaactg tctaaaaaat acaacaaatc tgaagctcag 720

atcctgctgt cttgggttta cgaacgtggt atcctgccgg ttaccacctc ttctaaaatc 780

gaacgtatcc agcaggctca ggacatcttc tctttctctc tggctaacga agaagttcag 840

aaaatcaccc agctgggtct gcagcacccg gctctgcgtc tctggctcac tgacgtgtac 900

agcaaatacg actctgaatc tcagaaataa 930

<210> 2

<211> 309

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Met Thr Thr Gln Lys Phe Phe Thr Leu Ser Asn Gly Asn Lys Ile Pro

1 5 10 15

Ala Val Ala Ile Val Gly Thr Gly Thr Ala Trp Tyr Lys Ser Glu Glu

20 25 30

Thr Asp Ala Thr Phe Ser Gln Pro Leu Val Asp Ile Val Lys Lys Thr

35 40 45

Leu Asp Thr Val Pro Gly Val Val His Ile Asp Ala Ala Glu Ile Tyr

50 55 60

Arg Thr Tyr Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu Lys Asp Thr Lys Lys Pro

65 70 75 80

Arg Asp Glu Ile Phe Ile Thr Asp Lys Tyr Ser Thr Leu Lys Gln Leu

85 90 95

Ser Glu Asn Pro Lys Val Ala Leu Glu Thr Ser Leu Lys Lys Leu Gly

100 105 110

Val Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Leu His Ser Pro Ile Ile Lys Glu

115 120 125

Ser Lys Leu Asp Val Glu Ala Asn Trp Lys Tyr Leu Glu Glu Leu Tyr

130 135 140

Lys Ser Gly Lys Ala Lys Asn Ile Gly Val Ser Asn Phe Ala Val Lys

145 150 155 160

Asp Leu Glu Lys Leu Leu Ala Val Ala Glu Val Lys Pro Gln Val Asn

165 170 175

Gln Ile Glu Phe Ser Pro Phe Leu Gln Asn Gln Thr Pro Gly Ile Val

180 185 190

Glu Phe Ser Gln Lys Asn Gly Ile Leu Leu Glu Ala Tyr Ser Pro Leu

195 200 205

Gly Pro Leu Gln Arg Arg Pro Glu Asp Ala Asp Lys Leu Pro Phe Tyr

210 215 220

Gln Tyr Ile Ala Glu Leu Ser Lys Lys Tyr Asn Lys Ser Glu Ala Gln

225 230 235 240

Ile Leu Leu Ser Trp Val Tyr Glu Arg Gly Ile Leu Pro Val Thr Thr

245 250 255

Ser Ser Lys Ile Glu Arg Ile Gln Gln Ala Gln Asp Ile Phe Ser Phe

260 265 270

Ser Leu Ala Asn Glu Glu Val Gln Lys Ile Thr Gln Leu Gly Leu Gln

275 280 285

His Pro Ala Leu Arg Leu Trp Leu Thr Asp Val Tyr Ser Lys Tyr Asp

290 295 300

Ser Glu Ser Gln Lys

305

<210> 3

<211> 738

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

atgggcattg gcgaagcgat catccgtcgc tatgcagaag aaggcatgcg cgttgttatc 60

aactatcgta gccatccgga ggaagccaaa aagatcgccg aagatattaa acaggcaggt 120

ggtgaagccc tgaccgtcca gggtgacgtt tctaaagagg aagacatgat caacctggtg 180

aaacagactg ttgatcactt cggtcagctg gacgtctttg tgaacaacgc tggcgttgag 240

atgccttctc cgtcccacga aatgtccctg gaagactggc agaaagtgat cgatgttaat 300

ctgacgggtg cgttcctggg cgctcgtgaa gctctgaaat acttcgttga acataacgtg 360

aaaggcaaca ttatcaatat gtctagcgtc cacgaaatca tcccgtggcc tactttcgta 420

cattacgctg cttctaaggg tggcgttaaa ctgatgaccc agactctggc tatggaatat 480

gcaccgaaag gtatccgcat taacgctatc ggtccaggcg cgatcaacac tccaattaat 540

gcagaaaaat tcgaggatcc gaaacagcgt gcagacgtgg aaagcatgat cccgatgggc 600

aacatcggca agccagagga gatttccgct gtcgcggcat ggctggcttc tgacgaagcg 660

tcttacgtta ccggcatcac cctgttcgca gatggtggca tgaccctgta cccgagcttt 720

caggctggcc gtggttaa 738

<210> 4

<211> 245

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

Met Gly Ile Gly Glu Ala Ile Ile Arg Arg Tyr Ala Glu Glu Gly Met

1 5 10 15

Arg Val Val Ile Asn Tyr Arg Ser His Pro Glu Glu Ala Lys Lys Ile

20 25 30

Ala Glu Asp Ile Lys Gln Ala Gly Gly Glu Ala Leu Thr Val Gln Gly

35 40 45

Asp Val Ser Lys Glu Glu Asp Met Ile Asn Leu Val Lys Gln Thr Val

50 55 60

Asp His Phe Gly Gln Leu Asp Val Phe Val Asn Asn Ala Gly Val Glu

65 70 75 80

Met Pro Ser Pro Ser His Glu Met Ser Leu Glu Asp Trp Gln Lys Val

85 90 95

Ile Asp Val Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ala Arg Glu Ala Leu

100 105 110

Lys Tyr Phe Val Glu His Asn Val Lys Gly Asn Ile Ile Asn Met Ser

115 120 125

Ser Val His Glu Ile Ile Pro Trp Pro Thr Phe Val His Tyr Ala Ala

130 135 140

Ser Lys Gly Gly Val Lys Leu Met Thr Gln Thr Leu Ala Met Glu Tyr

145 150 155 160

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Ile Asn Ala Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn

165 170 175

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Glu Asp Pro Lys Gln Arg Ala Asp

180 185 190

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Asn Ile Gly Lys Pro Glu Glu Ile

195 200 205

Ser Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Val Thr

210 215 220

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe

225 230 235 240

Gln Ala Gly Arg Gly

245

Claims

1.一种醛酮还原酶基因重组共表达载体，其特征在于所述重组共表达载体为双质粒，所述双质粒分别将SEQ ID NO：1所示醛酮还原酶突变体基因导入质粒pET-28b，SEQ ID NO：3所示葡萄糖脱氢酶基因导入pETDuet-1构建而成。

2.一种由权利要求1所述醛酮还原酶基因重组共表达载体构建的重组基因工程菌。

3.一种权利要求2所述重组基因工程菌在催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：以醛酮还原酶基因重组共表达载体构建的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅助底物，以pH7.0、200mM磷酸钾缓冲液为反应介质构成反应体系，在30℃、450转/分钟条件下进行转化反应，反应结束后，获得含6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的转化液，转化液分离纯化，获得6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述反应体系中，底物初始浓度为20-100g/L，辅助底物初始浓度为10-150g/L，催化剂用量以菌体干重计为10-40g/L。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将醛酮还原酶基因重组共表达载体构建的重组基因工程菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃培养9小时，获得种子液；再将种子液以体积浓度5％的接种量转接到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD₆₀₀ 0.6～0.8，然后加入终浓度为12g/L乳糖，28℃诱导培养12小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，弃上清，获得湿菌体用生理盐水洗涤两次，4℃、8000转/分钟离心10分钟，收集菌体细胞，即为生物催化剂。