CN108570439A

CN108570439A - 氧化还原酶的融合蛋白、基因工程菌及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN108570439A
Application number: CN201710144986.3A
Authority: CN
Inventors: 张敏洁; 金圣芳; 张敏
Original assignee: SHANGHAI JINGXIN BIOLOGICAL MEDICAL CO Ltd; Zhejiang Jingxin Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI JINGXIN BIOLOGICAL MEDICAL CO Ltd; Zhejiang Jingxin Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-03-13
Filing date: 2017-03-13
Publication date: 2018-09-25

Abstract

本发明公开了一种氧化还原酶的融合蛋白、基因工程菌及其制备方法和用途。该基因工程菌是将重组表达载体转化入受菌体构建而成；重组表达载体中包含由目的蛋白的基因、连接肽的基因与自聚集短肽的基因连接而成的基因片段；目的蛋白为单加氧酶或脱氢酶。本发明的基因工程菌能够产出氧化还原酶的融合蛋白，其能够在酶法合成埃索美拉唑中作为催化剂和/或辅助组分使用，其不仅能大大提高催化反应速度，提升埃索美拉唑的产量，还能够减少后处理过程中杂质的含量及种类。本发明的氧化还原酶的融合蛋白的热稳定性好，对催化条件的适应性和稳定性好，大幅降低了生产成本，具有优越的工业化应用价值。

Description

氧化还原酶的融合蛋白、基因工程菌及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种氧化还原酶的融合蛋白、基因工程菌及其制备方法和用途。

背景技术

埃索美拉唑生物酶法合成具有反应收率高，产物手性选择性较好，且无需重金属手性配体的优势。科德克希斯(拉唑化合物的合成，CN201080054980.3)开发了一种单加氧酶，可在两相进行催化反应，单次可转化的底物浓度为33g/L，但不适合工业化大规模生产。另外，CN201410695734.6公开了一种环己酮单加氧酶及其在合成埃索美拉唑中的应用，其反应收率较高，但是反应底物浓度和单次产量仍然很低，无法满足工业化生产的需要。

CN201611236175.8中公开了一种采用一锅法催化制备埃索美拉唑的方法，其催化底物浓度可达100g/L。然而，当反应过程中使用共表达的环己酮单加氧酶和酮还原酶的全细胞作为催化剂，会发现在催化反应结束之后，反应的后处理过程十分繁琐，全细胞中含有大量杂蛋白和其他杂质，这使得后处理的成本占到整个工艺成本的50％左右。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于克服当前酶法催化合成埃索美拉唑时，后处理过程十分繁琐，后处理成本过高等缺陷，提供一种氧化还原酶的融合蛋白、产其的基因工程菌及其制备方法和用途。所述氧化还原酶的融合蛋白能够在酶法合成埃索美拉唑中作为催化剂或辅助组分使用，其不仅能大大提高催化反应速度，提升埃索美拉唑的产量，还能够减少后处理过程中杂质的含量及种类；此外，所述氧化还原酶的融合蛋白的热稳定性好，对催化条件的适应性和稳定性好，大幅降低了生产成本，具有优越的工业化应用价值。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。

本发明提供了一种基因工程菌，其是将重组表达载体转化入受菌体构建而成；所述重组表达载体中包含由目的蛋白的基因、连接肽的基因与自聚集短肽的基因连接而成的基因片段；所述目的蛋白为单加氧酶或脱氢酶。

其中，所述单加氧酶可为本领域常规的单加氧酶，较佳地为环己酮单加氧酶。按本领域常识，所述环己酮单加氧酶的基因一般来自于Lysinibacillus sp.、Ustilago sp.、Arthrobacter sp.、Brevibacterium sp.、Acinetobacter sp.、Mycobacterium sp.、Aspergillus sp.或者Cunninghamella sp.。在本发明中，较佳地，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5。更佳地，所述环己酮单加氧酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6。

其中，所述脱氢酶可为本领域常规的脱氢酶，较佳地为酮还原酶(又称醇脱氢酶)，更佳地为异丙醇脱氢酶。按本领域常识，所述酮还原酶的基因一般来自于Lactobacillussp.、Yarrowia lipolytica sp.或者Gluconobacter oxydans。较佳地，所述酮还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11，优选为SEQ ID NO.7。更佳地，所述酮还原酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12，优选为SEQ IDNO.8。

其中，所述连接肽连接在两个多肽之间，连接肽的应该有足够的长度和较好的柔韧性，以减轻或避免两个多肽之间二级结构产生不必要的相互作用，或避免多肽间的空间位阻的影响功能。在本发明的优选实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.13；较佳地，编码所述连接肽的核苷酸序列为SEQ ID NO.14。

其中，所述自聚集短肽又称自组装短肽，可为本领域常规的自聚集短肽。所述自聚集短肽较佳地包括18A、R18A、ELK16、EAK16或L6KD。所述18A的氨基酸序列为SEQ ID NO.15；较佳地，编码18A的核苷酸序列为SEQ ID NO.16。

其中，所述由目的蛋白的基因、连接肽的基因与自聚集短肽的基因连接而成的基因片段的连接方法和顺序为本领域常规的方法和顺序，一般为目的蛋白的基因-连接肽的基因-自聚集短肽的基因，或者自聚集短肽的基因-连接肽的基因-目的蛋白的基因。

其中，所述重组表达载体的构建方法和条件均为本领域常规的方法和条件。所述重组表达载体所采用的质粒可为本领域常规使用的质粒，较佳地为pET21a、pET28a或pET30a。

其中，所述受菌体可为本领域常规的受菌体，较佳地为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌BL 21star(DE3)或大肠杆菌BL 21(DE3)plyss。

按本领域常识，所述基因工程菌能够产出本发明的氧化还原酶的融合蛋白。

本发明还提供了所述基因工程菌的制备方法，其可按本领域常规的构建方法构建所述重组表达载体，再将所述重组表达载体转化入受体菌，即得。

在本发明的一些较佳实施方式中，本发明的基因工程菌的制备方法，其包括以下步骤：

(1)按所述目的蛋白的基因-所述连接肽的基因-所述自聚集短肽的基因的连接顺序，构建得到所述重组表达载体；

(2)将所述重组表达载体转化入受体菌，即得所述基因工程菌。

步骤(1)中，所述构建的方法和条件均为本领域常规的方法和条件。较佳地，所述构建方法为：1)将所述连接肽与自聚集短肽的基因连接，得基因片段I，然后在所述基因片段I的两端加上内切酶片段，利用酶切位点将所述基因片段I插入质粒；2)在所述目的蛋白的基因两端加上内切酶片段，利用酶切位点将所述目的蛋白的基因插入所述质粒，即可。步骤1)中，所述连接的方法和条件均为本领域常规的方法和条件；所述内切酶片段较佳地为HindIII和XhoI内切酶片段；所述质粒可为本领域常规使用的质粒，较佳地为pET28a。步骤2)中，所述内切酶片段较佳地为Nde I和HindIII内切酶片段。

步骤(2)中，所述转化的方法和条件可为本领域常规的方法和条件，一般为热激法、CaCl₂法、电转化法等。

本发明还提供了一种氧化还原酶的融合蛋白，其由依次连接的所述目的蛋白、所述连接肽和所述自聚集短肽组成。

其中，所述的目的蛋白、连接肽和自聚集短肽的定义和优选均同前所述。

本发明还提供了所述氧化还原酶的融合蛋白的制备方法，其包括下述步骤：将所述基因工程菌进行活化培养，然后接种到发酵培养基，发酵培养，加入诱导剂进行诱导表达，即得。

其中，所述活化培养的方法和条件可为本领域常规使用的方法和条件。在本发明的一具体实施方式中，所述活化培养为：将所述基因工程菌接种到液体LB培养基中，于35-37℃下摇床活化8-12小时。

其中，所述发酵培养的方法和条件可为本领域常规的方法和条件。所述发酵培养基较佳地为LB培养基。所述发酵培养的接种量较佳地为0.5％-5％，百分比为活化培养后的培养物相对于发酵培养基的体积比。所述发酵培养的温度较佳地为25-40℃。所述发酵培养的时间较佳地为1-3小时。

其中，所述诱导剂可为本领域常规使用的诱导剂，较佳地为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和/或乳糖。所述诱导剂的浓度较佳地为0.05-2g/L。

其中，所述诱导表达的方法和条件可为本领域常规的方法和条件。所述诱导表达的温度较佳地为15-35℃。所述诱导表达的时间较佳地为2-24小时。

按照本领域常识，在所述诱导表达后即得到本发明的氧化还原酶的融合蛋白，但也可以进行进一步的后处理操作。所述后处理操作一般包括但不限于离心、过滤、超滤、超声破碎等中的一种或多种。通常，在离心和过滤(或者超滤)之后，获得的氧化还原酶的融合蛋白仍存在于菌泥中，还可以对其进行超声破碎和离心，以进行进一步纯化。

本发明还提供了所述氧化还原酶的融合蛋白在酶法合成埃索美拉唑中的用途；所述目的蛋白为单加氧酶，所述氧化还原酶的融合蛋白作为催化剂使用；和/或，所述目的蛋白为脱氢酶，所述氧化还原酶的融合蛋白作为辅助组分使用。

下文中，将目的蛋白为单加氧酶的氧化还原酶的融合蛋白称之为单加氧酶融合蛋白，将目的蛋白为脱氢酶的氧化还原酶的融合蛋白称之为脱氢酶融合蛋白。

其中，所述酶法合成埃索美拉唑的制备方法为本领域公知的方法，具体可参考CN201080054980.3、CN201410695734.6、CN201611235281.4和CN201611236175.8等专利文献。

较佳地，所述酶法合成埃索美拉唑的制备方法包括下述步骤：以奥美拉唑硫醚为底物，在所述单加氧酶融合蛋白和辅助组分的作用下，于溶剂中与氧化剂进行反应，生成埃索美拉唑，即可。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明的基因工程菌能够产出氧化还原酶的融合蛋白，其能够在酶法合成埃索美拉唑中作为催化剂和/或辅助组分使用，其不仅能大大提高催化反应速度，提升埃索美拉唑的产量，还能够减少后处理过程中杂质的含量及种类。

(2)本发明的氧化还原酶的融合蛋白的热稳定性好，对催化条件的适应性和稳定性好，大幅降低了生产成本，具有优越的工业化应用价值。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1：融合片段的构建

委托上海捷瑞生物工程有限公司定制合成连接肽和18A的基因序列，连接这两个基因得到基因片段，然后以该基因片段为模板，通过PCR扩增扩增(基因片段两端加HindIII和XhoI内切酶片段)，并利用HindIII和XhoI内切酶位点将该基因片段插入至pET28a质粒，记为pET28a-18A。

其中，连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.13，核苷酸序列为SEQ ID NO.14；18A的氨基酸序列为SEQ ID NO.15，核苷酸序列为SEQ ID NO.16。

实施例2：环己酮单加氧酶融合片段基因工程菌的构建

委托上海捷瑞生物工程有限公司定制合成环己酮单加氧酶基因片段SEQ ID NO.2(其对应氨基酸序列为S EQ ID NO.1)，然后以该基因片段为模板，通过PCR扩增扩增(基因片段两端加Nde I和HindIII内切酶片段)，并利用Nde I和HindIII内切酶位点将该基因片段分别插入至pET28a质粒和pET28a-18A质粒中，最后将连接获得的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，分别构建包含环己酮单加氧酶基因片段和环己酮单加氧酶基因融合片段的重组大肠杆菌基因工程菌株，分别记为CHMO，CHMO-18A。

其中PCR扩增扩展设计的引物序列如下：

正向引物F1：GGAATTCCATATGAGTACCAAGATGGATTTTGATGC(SEQ ID NO.17)

反向引物R1：CCAAGCTTCGCATTAGCCTGCTGTTTGGT(SEQ ID NO.18)

按上述方法制备CHMO-R18A和CHMO-ELK16。具体的环己酮单加氧酶融合片段基因工程菌构建信息见下表1。

表1

实施例3：酮还原酶融合片段基因工程菌的构建

委托上海捷瑞生物工程有限公司定制合成该酮还原酶基因片段SEQ ID NO.8(其对应氨基酸序列为S EQ ID NO.7)，然后以该基因片段为模板，通过PCR扩增扩展(基因片段两端加Nde I和HindIII内切酶片段)，并利用Nde I和HindIII内切酶位点将该基因片段插入至pET28a质粒和pET28a-18A质粒中，最后将连接获得的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，分别构建包含酮还原酶基因片段和酮还原酶融合片段的重组大肠杆菌基因工程菌株，分别记为KRED和KRED-18A。

其中PCR扩增扩展设计的引物序列如下：

正向引物F2：GGAATTCCATATGACGGATCGTCTGAAAGG(SEQ ID NO.19)

反向引物R2：CCAAGCTTCTGGGCGGTATAGCCGCCATC(SEQ ID NO.20)

按上述方法制备KRED-EAK16和KRED-L6KD。具体的酮还原酶融合片段基因工程菌构建信息见下表2。

表2

实施例4：基因工程菌的发酵培养

将上述实施例2和3获得的基因工程菌CHMO，CHMO-18A，KRED和KRED-18A分别接种到含相应抗性的3-5ml液体LB试管培养基中，于37℃下摇床活化12小时，将活化后得到的培养物按1％(V/V)的接种量转接入LB发酵培养基中，37℃发酵培养3h，再加入终浓度为0.05g/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，并置于32℃下诱导表达16h，离心、过滤或者超滤获得菌泥，置于-80℃冻存备用。

对比实施例1：酶粉的制备

分别称取5g实施例4发酵获得的CHMO和KRED菌泥，悬浮于50ml的细胞破碎缓冲液(10mmol/L，pH＝7.4的Tris-HCL缓冲液中含5mmol/L的MgCl2)中，用300W的功率在冰水浴中进行超声破碎，破碎10s，间隔30s，超声全程40min，反复超声破碎三次。低温条件下离心收集上清液，即获得酶液。将获得的酶液，放入干燥皿中，置于-20℃冰箱内进行预冻结，冷冻时间48h。然后将样品置于冷冻干燥机中进行冻干，冷冻干燥机的冷阱温度为-50℃，干燥室压力100Pa，冷冻干燥24h，获得酶的固体粉末，置于4℃冷藏保存。

实施例5：酶活性聚集体的制备

分别称取5g实施例4发酵获得的CHMO-18A和KRED-18A菌泥，悬浮于50ml的细胞破碎缓冲液(10mmol/L，pH＝7.4的Tris-HCL缓冲液中含5mmol/L的MgCl₂)中，用300W的功率在冰水浴中进行超声破碎，破碎10s，间隔30s，超声全程40min，反复超声破碎三次。低温条件下离心收集沉淀，即获得酶活性聚集体，置于-20℃冻存备用。

实施例6：环己酮单加氧酶催化能力测定

分别取实施例4中获得的菌泥5g、对比实施例1获得的酶粉、实施例5中获得的酶活性聚集体；加入35ml磷酸钾缓冲液(50mmol，pH＝8.0)、0.2g/L氧化性辅酶II、50g/L奥美拉唑硫醚、15％异丙醇、0.5g的酮还原酶粉(市售，酶活力为1300U)，漩涡混匀；置于30℃磁力搅拌反应6h，HPLC检测埃索美拉唑的产物生成量。

HPLC检测条件：Shimadzu液相色谱，Phenomenex色谱柱，流动相为10mM磷酸盐(pH7.6):乙腈(60:40)，流速1mL/min，柱温35℃，紫外检测波长300nm，检测时长15min。

出峰时间：产物(3.8min)，底物(8.2min)。

表3

反应	催化剂	产物峰面积比
			1	实施例4-菌泥-CHMO	13.2％
2	实施例4-菌泥-CHMO-18A	36.4％
			3	对比实施例1-酶粉	18.6％
4	实施例5-酶活性聚集体	48.1％

表3为反应产物转化率检测结果，从表3可以看出，与环己酮单加氧酶的菌株相比较，包含自聚集短肽片段的菌株其催化反应产物量提高一倍之多。使用酶粉或酶活性聚集体催化反应，由于底物产物进出细胞的传质限制解除了，测定反应初期催化产物量多于用细胞催化反应产物量。

实施例7：菌泥催化能力比较

分别取实施例4中获得的菌泥KRED 5g和CHMO 5g；菌泥KRED-18A 5g和CHMO-18A5g

加入35ml磷酸钾缓冲液(50mmol，pH＝8.0)、0.2g/L氧化性辅酶II、50g/L奥美拉唑硫醚、15％异丙醇，漩涡混匀；置于30℃磁力搅拌反应6h，HPLC检测埃索美拉唑的产物生成量，结果见表4。

表4

反应	催化剂	产物峰面积比
			1	CHMO+KRED	10.5％
2	CHMO-18A+KRED-18A	38.2％

实施例8：酶催化能力比较

分别取对比实施例1中获得的酶粉，实施例5中获得的酶活性聚集体加入35ml磷酸钾缓冲液(50mmol，pH＝8.0)、0.2g/L氧化性辅酶II、50g/L奥美拉唑硫醚、15％异丙醇，漩涡混匀；置于30℃磁力搅拌反应6h，HPLC检测埃索美拉唑的产物生成量，结果见表5。

表5

对比实施例2：酶粉催化反应后处理

取对比实施例1中获得的酶粉加入35ml磷酸钾缓冲液(50mmol，pH＝8.0)、0.2g/L氧化性辅酶II、50g/L奥美拉唑硫醚、15％异丙醇，漩涡混匀；氧气环境下保温30±2℃反应，液相中控奥美拉唑硫醚＜1％，停止反应，将反应体系浓缩至无流量，向反应体系中加入40ml甲醇，打浆1-2小时，过滤，滤饼用甲醇漂洗至淡黄色，将滤液浓缩至无流量，向浓缩物中加入50g甲苯，40℃溶解，过滤，滤液中加入25g水每次，洗有机相2次，萃取后分去有机相，水相再用25g甲苯萃取一次，合并两次有机相，浓缩至无流量，即得埃索美拉唑。检测结果见表4。

实施例10：酶活性聚集体催化反应后处理

取实施例5中获得的酶活性聚集体加入35ml磷酸钾缓冲液(50mmol，pH＝8.0)、0.2g/L氧化性辅酶II、50g/L奥美拉唑硫醚、15％异丙醇，漩涡混匀；氧气环境下保温30±2℃反应，液相中控奥美拉唑硫醚＜1％，停止反应。向反应体系中加入50ml甲苯，过滤清液分层，取上层有机相，旋干，即得埃索美拉唑。检测结果见表6。

表6

对比实施例3：酶粉热稳定性研究

取对比实施例1中获得的酶粉加入35ml磷酸钾缓冲液(50mmol，pH＝8.0)中，于不同温度(30℃、40℃、50℃、60℃)培养，120min后取出再加入0.2g/L氧化性辅酶II、50g/L奥美拉唑硫醚、15％异丙醇，漩涡混匀；置于30℃磁力搅拌反应6h，HPLC检测埃索美拉唑的产物生成量。检测结果见表7。

实施例11：酶活性聚集体热稳定性研究

取实施例5中获得的酶活性聚集体加入35ml磷酸钾缓冲液(50mmol，pH＝8.0)，于不同温度(30℃、40℃、50℃、60℃)培养，120min后取出再加入0.2g/L氧化性辅酶II、50g/L奥美拉唑硫醚、15％异丙醇，漩涡混匀；置于30℃磁力搅拌反应6h，HPLC检测埃索美拉唑的产物生成量。检测结果见表7。

表7

培养温度	对比实施例3	实施例11
			30℃	13.2％	48.5％
40℃	5.1％	46.3％
			50℃	1.3％	38.7％
60℃	0.1％	15.1％

从表7可以看出，本发明的氧化还原酶的融合蛋白的热稳定性远好于常规使用的氧化还原酶。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江京新药业股份有限公司，上海京新生物医药有限公司

<120> 氧化还原酶的融合蛋白、基因工程菌及其制备方法和用途

<130> JX2017006

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 543

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Thr Lys Met Asp Phe Asp Ala Ile Val Ile Gly Ala Gly Phe

1 5 10 15

Gly Gly Leu Tyr Ala Val Lys Lys Leu Arg Asp Glu Leu Glu Leu Lys

20 25 30

Val Lys Ala Phe Asp Lys Ala Thr Asp Val Gly Gly Thr Trp Tyr Trp

35 40 45

Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Thr Asp Thr Glu Thr His Leu Tyr Cys

50 55 60

Tyr Ser Trp Asp Lys Glu Met Leu Gln Ser Leu Glu Ile Lys Lys Lys

65 70 75 80

Tyr Val Gln Gly Pro Asp Val Arg Lys Tyr Leu Gln Gln Val Ala Glu

85 90 95

Lys His Asp Leu Lys Lys Ser Tyr Gln Phe Asn Thr Ala Val Thr Ser

100 105 110

Ala His Tyr Asn Glu Ala Asp Ala Leu Trp Glu Val Thr Thr Glu Tyr

115 120 125

Gly Asp Lys Tyr Thr Ala Arg Phe Leu Ile Thr Ala Val Gly Leu Leu

130 135 140

Ser Ala Pro Asn Trp Pro Asn Ile Lys Gly Ile Asn Gln Phe Lys Gly

145 150 155 160

Glu Leu His His Thr Ser Arg Trp Pro Asp Asp Val Ser Ile Glu Gly

165 170 175

Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Val Gln Val Ile

180 185 190

Thr Ala Val Ala Pro Leu Ala Lys His Leu Thr Val Phe Gln Arg Ser

195 200 205

Pro Gln Tyr Ser Val Pro Ile Gly Asn Asp Pro Leu Ser Glu Glu Asp

210 215 220

Val Lys Lys Ile Lys Asp Asn Tyr Asp Lys Ile Trp Asp Gly Val Lys

225 230 235 240

Asn Ser Ala Leu Ala Tyr Gly Val Asn Glu Ser Thr Val Pro Ala Met

245 250 255

Ser Val Ser Ala Glu Glu Arg Lys Ala Val Phe Glu Lys Ala Trp Gln

260 265 270

Thr Gly Gly Gly Met Arg Phe Met Phe Glu Thr Phe Gly Asp Ile Ile

275 280 285

Thr Asn Met Glu Ala Asn Ile Glu Ala Gln Asn Phe Ile Lys Gly Lys

290 295 300

Ile Ala Arg Ile Val Lys Asp Pro Ala Ile Ala Gln Lys Leu Met Pro

305 310 315 320

Gln Asp Leu Tyr Ala Cys Arg Pro Leu Cys Asp Ser Gly Tyr Tyr Asn

325 330 335

Thr Phe Asn Arg Glu Asn Val Arg Leu Glu Asp Val Lys Ala Asn Pro

340 345 350

Ile Val Glu Ile Thr Glu Asn Gly Val Lys Leu Glu Asn Gly Asp Phe

355 360 365

Val Glu Leu Asp Met Leu Ile Cys Ala Thr Gly Phe Asp Ala Gly Asp

370 375 380

Gly Asn Tyr Lys Arg Ile Asp Ile Gln Gly Lys Asn Gly Leu Ala Ile

385 390 395 400

Lys Asp Tyr Trp Lys Glu Gly Pro Ser Ser Tyr Met Gly Val Ala Val

405 410 415

Asn Asn Tyr Pro Asn Met Phe Met Val Phe Gly Pro Asn Gly Pro Leu

420 425 430

Ala Asn Thr Pro Pro Ile Ile Glu Ser Gln Val Glu Trp Ile Ser Val

435 440 445

Phe Ile Gln Tyr Thr Val Glu Asn Asn Val Glu Ser Ile Glu Ala Asp

450 455 460

Lys Glu Ala Glu Glu Gln Trp Thr Gln Thr Cys Ala Asn Ile Ala Glu

465 470 475 480

Lys Thr Leu Phe Pro Lys Ala Lys Cys Arg Ile Phe Gly Ala Asn Ile

485 490 495

Pro Gly Lys Lys Asn Thr Val Tyr Leu Tyr Leu Gly Gly Leu Lys Glu

500 505 510

Tyr Arg Ser Val Leu Ala Asn Cys Lys Asn His Ala Tyr Val Gly Phe

515 520 525

Asp Ile Gln Leu Gln Arg Ser Asp Thr Lys Gln Gln Ala Asn Ala

530 535 540

<210> 2

<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagtacca agatggattt tgatgcaatt gtgatcggtg ccggctttgg cggcctgtat 60

gccgttaaaa aactgcgcga tgaactggaa ctgaaagtta aagcctttga taaagcaacg 120

gatgtgggcg ggacctggta ttggaatcgc tatccgggcg cactgacgga tacggaaacc 180

catctgtatt gctattcttg ggataaagaa atgctacaga gtttagaaat caaaaagaaa 240

tatgtgcagg gcccagatgt tcgcaaatac ttacagcagg ttgcagaaaa acatgatctg 300

aaaaaatctt atcagtttaa taccgccgtg acgagtgctc attataacga ggcggatgcc 360

ctgtgggaag tgacaaccga atatggcgat aaatataccg cacgctttct gattaccgcc 420

gtgggtctgc tgtctgcacc taattggcct aatatcaaag gcatcaatca gtttaaaggt 480

gaactgcatc atacgtcacg ctggccggat gatgtgagca tcgaaggcaa gagagtgggt 540

gtgatcggta cgggtagtac gggcgttcag gttattacag cagttgctcc attagccaaa 600

catctgaccg tgtttcagcg tagtccacag tatagtgttc cgatcggcaa tgatccactg 660

agcgaagaag atgttaagaa gattaaagat aattatgata aaatctggga tggtgtgaaa 720

aatagcgcct tagcctatgg tgtgaatgag tctacagttc cagccatgag cgtgagtgca 780

gaagaacgta aagccgtgtt tgaaaaggca tggcagacgg gtggcgggat gcgctttatg 840

tttgaaacct ttggggacat aattaccaat atggaagcta atatcgaagc acagaatttt 900

atcaaaggca aaattgcccg catcgttaaa gatcctgcca ttgcacagaa actgatgcct 960

caggatctgt atgcttgtcg cccgctgtgc gattcaggct attataatac ctttaatcgc 1020

gaaaatgttc gtctggaaga tgttaaagct aatccgatcg tggaaatcac cgaaaatggc 1080

gttaaactgg aaaatggcga ttttgtggaa ttagatatgc tgatttgcgc gaccggcttt 1140

gatgcgggcg atggcaacta caagcgcatc gacatacagg ggaaaaatgg cttagccatc 1200

aaagattatt ggaaagaagg tcctagtagc tatatgggcg ttgcggttaa caactatccg 1260

aatatgttta tggtttttgg tccgaatggt ccactggcca atactcctcc tatcatcgaa 1320

tctcaggttg agtggatttc agtgtttatc cagtataccg ttgaaaacaa tgttgaatct 1380

atcgaagccg ataaagaagc ggaagaacag tggacccaga cctgcgccaa tattgccgaa 1440

aaaaccctgt ttcctaaagc caaatgtcgc atctttggtg ccaatattcc gggcaagaaa 1500

aacacggtgt atctgtacct cggcggtctg aaagaatatc gtagcgtttt agctaattgc 1560

aaaaatcatg cgtatgtggg ctttgatatt cagttacagc gctcagatac caaacagcag 1620

gctaatgcgt aa 1632

<210> 3

<211> 542

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ser Thr Lys Met Glu Phe Asp Ala Ile Val Ile Gly Ala Gly Phe

1 5 10 15

Gly Gly Ile Tyr Ala Val Lys Lys Leu Arg Glu Glu Leu Asp Leu Lys

20 25 30

Val Gln Ala Phe Asp Lys Gly Thr Asp Val Ala Gly Ser Trp Tyr Trp

35 40 45

Gln Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Thr Glu Thr Glu Thr His Val Tyr Cys

50 55 60

Tyr Ser Phe Asp Lys Glu Leu Leu Gln Ser Leu Glu Val Lys Lys Arg

65 70 75 80

Tyr Val Gln Gly Pro Asp Val Arg Lys Tyr Leu Gln Asn Val Ala Glu

85 90 95

Lys His Asp Leu Lys Lys Cys Tyr Gln Phe Asn Thr Ala Val Gln Ser

100 105 110

Ala His Tyr Gln Glu Ala Asp Ala Leu Trp Glu Val Thr Ser Glu Tyr

115 120 125

Gly Asp Lys Tyr Thr Ala Lys Phe Leu Ile Thr Gly Val Gly Leu Leu

130 135 140

Ser Ala Pro Asn Leu Pro Asn Ile Lys Gly Leu Gln Gln Phe Lys Gly

145 150 155 160

Glu Val Lys His Thr Cys Arg Phe Pro Asp Glu Val Ser Phe Glu Gly

165 170 175

Lys Arg Val Gly Leu Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Val Asn Val Ile

180 185 190

Thr Ala Val Ala Pro Leu Ala Lys His Leu Thr Val Trp Gln Arg Ser

195 200 205

Ala Asn Phe Ser Val Pro Ile Gly Gln Glu Pro Leu Cys Glu Asp Glu

210 215 220

Val Lys Lys Leu Lys Glu Gln Tyr Glu Arg Leu Phe Asp Gly Val Phe

225 230 235 240

Gln Cys Ala Leu Ala Trp Gly Val Asn Glu Ser Thr Val Pro Ala Met

245 250 255

Ser Val Ser Ala Glu Asp Arg Arg Ala Val Trp Glu Lys Ala Phe Asn

260 265 270

Thr Gly Ala Ala Phe Arg Phe Met Trp Asp Thr Phe Ala Glu Val Gly

275 280 285

Thr Asn Met Glu Ala Gln Ile Glu Ala Gln Asn Phe Leu Lys Gly Arg

290 295 300

Ile Ala Asp Leu Val Lys Asp Pro Ala Ile Ala Gln Arg Leu Met Pro

305 310 315 320

Gln Glu Leu Tyr Gly Lys Arg Pro Leu Ser Glu Ser Gly Tyr Ala Asn

325 330 335

Thr Phe Asn Arg Asp Asn Val Arg Leu Glu Asp Val Lys Ala Asn Pro

340 345 350

Ile Val Glu Ile Thr Glu Asn Gly Val Arg Leu Glu Asn Gly Glu Phe

355 360 365

Val Glu Leu Asp Met Ile Ile Cys Ala Thr Gly Phe Glu Gly Val Glu

370 375 380

Gly Asn Tyr Val Arg Met Asp Leu Gln Gly Arg Asn Gly Leu Ala Met

385 390 395 400

Arg Glu Tyr Phe Lys Asp Gly Pro Ser Cys Tyr Met Gly Val Thr Val

405 410 415

Asn Gln Tyr Pro Gln Met Phe Met Leu Ile Ala Pro Asn Gly Pro Phe

420 425 430

Thr Gln Leu Pro Pro Cys Ile Glu Ser Gln Val Glu Phe Ile Ser Asp

435 440 445

Thr Ile Gln Tyr Thr Val Glu Asn Gln Val Glu Ser Ile Glu Ala Thr

450 455 460

Lys Glu Gly Glu Glu Gln Trp Thr Gln Thr Cys Gly Asn Ile Ala Asp

465 470 475 480

Met Thr Leu Phe Pro Lys Ala Gln Ser Trp Ile Phe Gly Ala Gln Ile

485 490 495

Pro Gly Lys Arg Asn Thr Val Tyr Phe Tyr Leu Gly Ala Leu Lys Glu

500 505 510

Tyr Arg Cys Ala Leu Ala Asn Cys Lys Asn Lys Ala Tyr Glu Gly Phe

515 520 525

Glu Ile Gln Leu Gln Arg Ser Asp Ile Lys Gln Pro Ala Ala

530 535 540

<210> 4

<211> 1629

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgagcacca agatggaatt cgacgcgatc gttattggtg cgggctttgg tggcatctac 60

gcggtgaaga aactgcgtga ggaactggat ctgaaggtgc aggcgttcga caaaggcacc 120

gatgttgcgg gtagctggta ctggcaacgt tatccgggtg cgctgaccga gaccgaaacc 180

cacgtttact gctatagctt tgacaaagaa ctgctgcaga gcctggaagt gaagaagcgt 240

tatgttcagg gtccggacgt gcgtaagtac ctgcaaaacg tggcggaaaa acacgatctg 300

aagaaatgct atcagttcaa caccgcggtt cagagcgcgc actaccaaga ggcggacgcg 360

ctgtgggaag tgaccagcga gtacggtgat aagtataccg cgaaattcct gatcaccggt 420

gttggtctgc tgagcgcgcc gaacctgccg aacattaagg gcctgcagca atttaagggt 480

gaagtgaaac acacctgccg tttcccggat gaagtgagct ttgagggcaa gcgtgttggt 540

ctgatcggta ccggcagcac cggcgtgaac gttattaccg cggtggcgcc gctggcgaaa 600

cacctgaccg tttggcagcg tagcgcgaac ttcagcgtgc cgatcggtca agaaccgctg 660

tgcgaggacg aagttaagaa actgaaggag cagtacgaac gtctgttcga tggcgtgttt 720

caatgcgcgc tggcgtgggg tgttaacgag agcaccgtgc cggcgatgag cgttagcgcg 780

gaagaccgtc gtgcggtttg ggagaaagcg ttcaacaccg gcgcggcgtt ccgttttatg 840

tgggatacct ttgcggaagt gggtaccaac atggaagcgc agattgaggc gcaaaacttc 900

ctgaagggtc gtatcgcgga cctggttaaa gatccggcga ttgcgcagcg tctgatgccg 960

caagaactgt atggcaagcg tccgctgagc gagagcggtt acgcgaacac ctttaaccgt 1020

gacaacgtgc gtctggaaga tgttaaagcg aacccgatcg tggagattac cgaaaacggc 1080

gttcgtctgg agaacggtga attcgtggag ctggacatga tcatttgcgc gaccggtttt 1140

gaaggcgtgg agggtaacta tgttcgtatg gacctgcagg gccgtaacgg tctggcgatg 1200

cgtgagtact tcaaggatgg cccgagctgc tatatgggtg tgaccgttaa ccagtacccg 1260

caaatgttca tgctgatcgc gccgaacggt ccgtttaccc agctgccgcc gtgcattgaa 1320

agccaagttg agtttatcag cgacaccatt cagtacaccg tggaaaacca agttgaaagc 1380

atcgaggcga ccaaagaggg tgaagaacag tggacccaaa cctgcggtaa cattgcggat 1440

atgaccctgt tcccgaaagc gcagagctgg atctttggcg cgcaaattcc gggcaagcgt 1500

aacaccgtgt acttctatct gggcgcgctg aaagagtatc gttgcgcgct ggcgaactgc 1560

aagaacaaag cgtacgaagg ttttgagatc cagctgcaac gtagcgatat taaacagccg 1620

gcggcgtaa 1629

<210> 5

<211> 570

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Gly Lys Glu Arg Thr His Asp Ala Leu Val Ile Gly Thr Gly Phe

1 5 10 15

Gly Gly Leu Tyr Ala Leu Tyr Leu Leu Lys Gln Gln Gly Leu Asp Val

20 25 30

Lys Ala Ile Asp Thr Ala Ser Asp Val Gly Gly Thr Trp Tyr Trp Asn

35 40 45

Arg Tyr Pro Gly Ala Arg Ser Asp Val Glu Ser His Val Tyr Arg Tyr

50 55 60

Ser Trp Asp Lys Glu Leu Leu Leu Asp Lys Thr Leu Trp Thr Lys Asn

65 70 75 80

Tyr Leu Thr Gln Pro Glu Leu Glu Ser Tyr Phe Gln Lys Val Ala Arg

85 90 95

Lys His Asp Leu Tyr Arg His Ile Gln Phe Asn Thr Asp Leu Val Ala

100 105 110

Ala His Trp Asp Asn Thr Ala Lys Leu Trp Ile Ala Arg Thr Ser Ser

115 120 125

Gly Asp Ile Phe Lys Val Arg Tyr Leu Ile Gly Ala Val Gly Asn Leu

130 135 140

Tyr Lys Pro Asn Leu Pro Asp Trp Pro Gly Leu Asp Asn Asn Thr Phe

145 150 155 160

Arg Gly Gln Ile Val His Ser Ser Gln Trp Asn Pro Arg Glu His Asn

165 170 175

His Ile Asp Lys Arg Val Ala Val Val Gly Ser Gly Ala Ser Gly Val

180 185 190

Gln Leu Val Gly Ala Leu Ala Glu Lys Ala Lys Thr Leu Thr His Phe

195 200 205

Ile Arg His Ala Gln Phe Val Leu Pro Ala Ser Leu Arg Thr Val Ser

210 215 220

Asp Val Glu Arg Gln Thr Ile Asn Asp Asn Tyr Asp Arg Ile Trp Arg

225 230 235 240

Gln Val Phe Thr Ser Leu Ser Gly Met Gly Phe Pro Glu Pro Ala Arg

245 250 255

Thr Val Ala Ser Val Ser Pro Glu Asp Arg Glu Ala Ile Phe Gln Asp

260 265 270

Leu Trp Ile Gln Gly Ser Gly Phe Arg Phe Leu Phe Gly Gly Phe Ser

275 280 285

Asp Leu Val Thr Asp Glu Lys Ala Asn Gln Ala Ala Ile Asp Phe Ile

290 295 300

His Arg Lys Ile Asp Ser Ile Val Thr Asp Pro Lys Lys Ala Gln Val

305 310 315 320

Leu Lys Ser Thr Asp Trp Phe Ala Arg Arg Pro Leu Thr Asp Asp Gln

325 330 335

Tyr Tyr Asn Arg Phe Asn Gln Asp Asn Val Phe Ala Val Asp Leu Lys

340 345 350

Gln Thr Pro Ile Val Arg Leu His Ala Asp Ser Ile Glu Thr Ala Asp

355 360 365

Gly Lys Lys His Gln Val Asp Leu Ile Val Leu Ala Thr Gly Phe Asp

370 375 380

Ala Ala Asp Gly Thr Tyr Tyr Arg Ile Asp Ile Arg Gly Lys Asp Gly

385 390 395 400

Thr Thr Leu Lys Asp His Trp Ser Gln Gly Pro Lys Thr His His Gly

405 410 415

Val Ser Thr Ser Lys Phe Pro Asn Leu Phe Phe Val Asn Gly Pro Gly

420 425 430

Ala Pro Phe Ala Ser Asn Pro Pro Val Thr Glu Glu Gly Ala Arg Phe

435 440 445

Ile Ala Asp Leu Ile Ala Arg Ala Glu Ala His Arg Thr Thr Thr Gly

450 455 460

Ser Gly Thr Asp Asn Val Val Ile Glu Ser Thr Arg Asp Ala Glu Asp

465 470 475 480

Ala Tyr Thr Lys Asp Leu His Asp Ala Ala Asp Pro Thr Leu Phe Pro

485 490 495

Arg Thr Lys Ser Trp Phe Phe Gly Glu Asn Ile Pro Gly Arg His Val

500 505 510

Ala Pro Arg Phe Tyr Phe Gly Gly Leu Ser Arg Tyr Arg Ala Ala Leu

515 520 525

Ala Asp Ile Arg Glu Arg Gly Tyr Ala Gly Phe Asp Ile Glu Thr Thr

530 535 540

Gln Thr Val Gln Asn Gln Asn Gln Thr Gln Asn Gln Ser Arg Thr Leu

545 550 555 560

Pro Val Pro Ala Pro Val Arg Ser His Leu

565 570

<210> 6

<211> 1713

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgggcaaag aaaggaccca cgacgcccta gtcatcggca ccggcttcgg cgggctatat 60

gccctatacc tgctgaagca gcaaggacta gatgtgaaag caattgacac agcctcagac 120

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gtataccgat actcatggga caaagaacta ttactcgaca aaacactctg gacaaagaac 240

tacctgaccc aacccgaact ggaaagctac ttccaaaaag tagcacgcaa gcacgacttg 300

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ctctggatcg cccgtacgag ttccggcgac atattcaaag tccgctacct aatcggcgcc 420

gtgggcaacc tctacaaacc aaacctgccc gactggcccg gtcttgacaa caacacattc 480

cgcggccaaa tagtacacag ctcccaatgg aatccccgcg agcacaacca catcgacaaa 540

cgagtcgccg tagtcggcag cggcgcctcc ggtgtccaac tggtgggcgc gctggcggaa 600

aaagcaaaaa ccctaaccca tttcatccgc cacgcccaat tcgtgcttcc ggcatcccta 660

cgaaccgtca gcgacgtcga acgccagacc atcaacgaca actacgaccg catctggcgg 720

caagtattca cgtccctgtc tgggatgggc tttccggagc ccgcgcgaac cgtcgcctct 780

gtcagtcctg aagaccgcga agcaatcttc caagacctct ggatccaagg cagcggcttc 840

cgattccttt tcggcggctt ttccgatctt gtgactgacg aaaaagccaa ccaagccgcc 900

attgatttca tccatcgcaa aatcgactcg atcgtcaccg atcccaagaa agctcaagtc 960

ctcaaatcga cagactggtt cgctcgtcgt ccactgaccg acgaccagta ctacaatcga 1020

ttcaaccagg acaacgtctt tgccgtcgac ctgaaacaga cacccatagt gcgcctgcac 1080

gccgacagca ttgagacggc ggacgggaag aaacaccaag tcgatctgat cgtgttggct 1140

acgggcttcg acgccgctga cgggacgtac taccgcatcg acatccgcgg aaaagacgga 1200

acaactctca aagatcactg gagccaagga cccaaaacgc accatggcgt ttcgacctca 1260

aaatttccaa atttgttctt tgttaatgga cccggcgccc cattcgcgag taatccgcct 1320

gttacggagg aaggggcgcg ctttattgcc gacctaatcg ctcgtgctga ggcgcatcgg 1380

accaccaccg gcagcggtac cgataatgtg gtcattgaaa gtacccgcga cgccgaagac 1440

gcatacacca aagacctcca cgatgccgcg gacccgactc tctttccaag aacaaaatct 1500

tggttctttg gcgagaatat ccccgggaga cacgtcgcgc cccgctttta tttcggcggg 1560

ttgtcgaggt atcgtgctgc gctggccgat atcagagaaa ggggatatgc tgggtttgat 1620

attgaaacga cccaaactgt gcaaaatcaa aatcaaacac aaaatcagag tcgcacgctg 1680

ccagtgccgg cgcctgttcg tagccatttg tga 1713

<210> 7

<211> 252

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala

35 40 45

Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala

50 55 60

Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala

65 70 75 80

Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Phe Val Tyr

85 90 95

Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser

100 105 110

Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg

115 120 125

Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile

130 135 140

Glu Gly Leu Val Gly Asp Pro Thr Gly Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys

145 150 155 160

Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu

165 170 175

Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys

180 185 190

Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gln

195 200 205

Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala

210 215 220

Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

<210> 8

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgacggatc gtctgaaagg caaagttgcc atcgtgaccg gtggcacgct gggcatcggc 60

ctggccattg ccgataaatt tgtggaagaa ggcgccaaag tggttattac aggtcgtcat 120

gcagatgtgg gcgaaaaagc cgccaaatct atcggcggca ccgatgttat tcgctttgtg 180

cagcatgatg cgtcagatga agcgggttgg acgaaactgt ttgatacaac ggaagaagcc 240

tttggtccag tgacaacggt tgtgaataac gccggtatct ttgtgtacaa gtcagtggaa 300

gatacgacga cagaagaatg gcgcaaactg ctgagtgtta acctggatgg cgtgtttttc 360

ggtacacgtt taggtatcca gcgcatgaaa aataagggct taggtgcgag tatcatcaat 420

atgtcctcaa tcgaaggctt agtgggcgat cctacgggtg gtgcttataa tgcctctaaa 480

ggtgcagttc gcattatgtc taaatcagct gcactggatt gcgctctgaa agattatgat 540

gttcgcgtta ataccgttca tccgggctat atcaaaacac cattagttga tgatctggaa 600

ggtgccgaag aaatgatgtc tcagcgtacc aaaaccccta tgggtcatat cggtgaacct 660

aatgatattg cttggatctg cgtgtatctg gcgtcagatg aatctaaatt tgcaacaggc 720

gcggaatttg tggttgatgg cggctatacc gcccagtaa 759

<210> 9

<211> 280

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Gly Lys His Leu Gln Asp Thr Ile Thr Leu Asn Asn Gly Val Lys

1 5 10 15

Met Pro Trp Phe Gly Leu Gly Val Phe Lys Val Asp Glu Gly Pro Glu

20 25 30

Leu Ile Asn Ala Val Lys Ser Ala Leu Lys His Gly Tyr Arg Ser Ile

35 40 45

Asp Thr Ala Ile Ile Tyr Glu Asn Glu Glu Gly Val Gly Glu Gly Ile

50 55 60

Arg Gln Gly Leu Gln Glu Ala Gly Leu Lys Arg Glu Asp Ile Phe Val

65 70 75 80

Thr Ser Lys Val Phe Asn Ala Asp Leu Gly Tyr Glu Glu Thr Leu Lys

85 90 95

Ala Phe Asp Thr Ser Leu Glu Lys Ala Gly Leu Asp Tyr Leu Asp Leu

100 105 110

Tyr Leu Ile His Trp Pro Ala Glu Gly Lys Tyr Lys Glu Ala Trp Arg

115 120 125

Ala Ile Glu Lys Leu Tyr Lys Asp Gly Arg Val Lys Ala Ile Gly Val

130 135 140

Ser Asn Phe Asn Ile His His Leu Glu Asp Leu Met Gly Glu Ala Glu

145 150 155 160

Ile Lys Pro Met Ile Asn Gln Ile Glu Phe His Pro Tyr Leu Thr Gln

165 170 175

Lys Glu Leu Ile Ser Phe Cys Gln Glu His Gly Ile Gln Leu Glu Ala

180 185 190

Trp Ser Pro Leu Met Asn Gly Gln Leu Leu Asn Asn Glu Val Leu Gln

195 200 205

Glu Ile Ala Asn Lys Tyr Asn Lys Ser Val Ala Gln Val Ile Leu Arg

210 215 220

Trp Asp Leu Gln Asn Gly Val Val Thr Ile Pro Lys Thr Thr Arg Glu

225 230 235 240

Tyr Arg Ile Ser Glu Asn Ala Asn Val Phe Asp Phe Glu Leu Thr Asn

245 250 255

Glu Asp Met Lys Arg Ile Asp Glu Leu Asn Gln Asn Glu Arg Val Gly

260 265 270

Pro Asp Pro Asp Asn Phe Asp Phe

275 280

<210> 10

<211> 843

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgggcaagc acctgcagga taccatcacc ctgaacaacg gtgtgaagat gccgtggttc 60

ggtctgggcg tgtttaaagt tgacgagggc ccggaactga tcaacgcggt taagagcgcg 120

ctgaaacacg gttaccgtag cattgatacc gcgatcattt atgagaacga ggaaggtgtg 180

ggcgaaggta tccgtcaggg cctgcaagag gcgggtctga agcgtgaaga cattttcgtg 240

accagcaaag tttttaacgc ggatctgggc tacgaggaaa ccctgaaggc gttcgacacc 300

agcctggaga aagcgggcct ggactacctg gatctgtatc tgatccactg gccggcggag 360

ggcaagtaca aagaagcgtg gcgtgcgatt gagaagctgt ataaagatgg ccgtgtgaaa 420

gcgatcggtg ttagcaactt taacattcac cacctggaag acctgatggg cgaggcggaa 480

atcaagccga tgatcaacca gattgagttc cacccgtatc tgacccaaaa agaactgatc 540

agcttttgcc aggagcacgg cattcaactg gaagcgtgga gcccgctgat gaacggtcag 600

ctgctgaaca acgaggttct gcaagaaatc gcgaacaagt acaacaaaag cgtggcgcag 660

gttattctgc gttgggacct gcaaaacggc gtggttacca tcccgaagac cacccgtgag 720

tatcgtatta gcgaaaacgc gaacgtgttc gattttgagc tgaccaacga agacatgaaa 780

cgtattgatg agctgaacca aaacgaacgt gttggtccgg acccggataa cttcgacttt 840

taa 843

<210> 11

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Met Thr Gly Ile Thr Asn Val Thr Val Leu Gly Thr Gly Val Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gln Ile Ala Phe Gln Thr Ala Phe His Gly Phe Ala Val Thr Ala

20 25 30

Tyr Asp Ile Asn Thr Asp Ala Leu Asp Ala Ala Lys Lys Arg Phe Glu

35 40 45

Gly Leu Ala Ala Val Tyr Glu Lys Glu Val Ala Gly Ala Ala Asp Gly

50 55 60

Ala Ala Gln Lys Ala Leu Gly Gly Ile Arg Tyr Ser Asp Asp Leu Ala

65 70 75 80

Gln Ala Val Lys Asp Ala Asp Leu Val Ile Glu Ala Val Pro Glu Ser

85 90 95

Leu Asp Leu Lys Arg Asp Ile Tyr Thr Lys Leu Gly Glu Leu Ala Pro

100 105 110

Ala Lys Thr Ile Phe Ala Thr Asn Ser Ser Thr Leu Leu Pro Ser Asp

115 120 125

Leu Val Gly Tyr Thr Gly Arg Gly Asp Lys Phe Leu Ala Leu His Phe

130 135 140

Ala Asn His Val Trp Val Asn Asn Thr Ala Glu Val Met Gly Thr Thr

145 150 155 160

Lys Thr Asp Pro Glu Val Tyr Gln Gln Val Val Glu Phe Ala Ser Ala

165 170 175

Ile Gly Met Val Pro Ile Glu Leu Lys Lys Glu Lys Ala Gly Tyr Val

180 185 190

Leu Asn Ser Leu Leu Val Pro Leu Leu Asp Ala Ala Ala Glu Leu Leu

195 200 205

Val Asp Gly Ile Ala Asp Pro Glu Thr Ile Asp Lys Thr Tyr Arg Ile

210 215 220

Gly Thr Gly Ala Pro Lys Gly Pro Phe Glu Ile Phe Asp Ile Val Gly

225 230 235 240

Leu Thr Thr Ala Tyr Asn Ile Ser Ser Val Ser Gly Pro Lys Gln Arg

245 250 255

Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Lys Glu Asn Tyr Ile Asp Lys Gly Lys Leu

260 265 270

Gly Leu Ala Thr Gly Glu Gly Phe Tyr Arg Tyr

275 280

<210> 12

<211> 852

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atgaccggca tcaccaatgt gacagttctg ggcacgggcg tgctgggtag ccagatcgcg 60

tttcagacgg cctttcatgg ttttgcagtg accgcgtatg acatcaatac ggatgcctta 120

gatgcagcca aaaaacgctt tgaaggctta gccgcagtgt atgaaaaaga agttgccggt 180

gctgccgatg gtgcagctca gaaagccctg ggtggcattc gctattcaga tgatctcgct 240

caggccgtta aagatgcgga tctcgtgatt gaagctgttc cagaatcact ggatctgaaa 300

cgtgacatct ataccaaatt aggcgaactg gctcctgcca aaacaatctt tgcgacgaat 360

agtagcaccc tgttaccgag cgacctagtt ggttatacag gtcgtggaga caaatttctg 420

gccttacatt ttgctaatca tgtgtgggtt aataacaccg cggaagttat gggtacaacc 480

aaaacagatc cagaagtgta tcagcaggtt gtggaatttg caagcgccat tggcatggtt 540

ccgatcgaac tgaaaaaaga aaaagccggc tatgttctga atagtctgtt agttccatta 600

ctggatgcgg ctgcggaact gcttgtagat ggcatcgccg atccggaaac catcgataaa 660

acgtatcgca tcggtacggg cgcacctaaa ggtccgtttg aaatctttga tattgttggc 720

ctgacgaccg cctataatat ctctagtgtg tcaggtccta aacagcgcga atttgcagcg 780

tatctgaaag aaaattatat tgataaaggt aaattaggct tagcaacggg cgaaggcttt 840

tatcgctatt aa 852

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

1 5 10 15

Pro

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccgaccccgc cgaccacccc gaccccgccg actaccccga ccccgacccc g 51

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu Leu Phe

1 5 10 15

<210> 16

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaatggctga aggcgttcta cgagaaagtg ctggaaaagc tgaaagagct gttt 54

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggaattccat atgagtacca agatggattt tgatgc 36

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ccaagcttcg cattagcctg ctgtttggt 29

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggaattccat atgacggatc gtctgaaagg 30

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ccaagcttct gggcggtata gccgccatc 29

Claims

1.一种基因工程菌，其特征在于，其是将重组表达载体转化入受菌体构建而成；所述重组表达载体中包含由目的蛋白的基因、连接肽的基因与自聚集短肽的基因连接而成的基因片段；所述目的蛋白为单加氧酶或脱氢酶。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述单加氧酶为环己酮单加氧酶；较佳地，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5；所述环己酮单加氧酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6；

和/或，所述脱氢酶为酮还原酶，较佳地为异丙醇脱氢酶；更佳地，所述酮还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11；最佳地，所述酮还原酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12。

3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列为SEQ IDNO.13；较佳地，编码所述连接肽的核苷酸序列为SEQ ID NO.14；

和/或，所述自聚集短肽包括18A、R18A、ELK16、EAK16或L6KD；所述18A的氨基酸序列为SEQ ID NO.15；较佳地，编码18A的核苷酸序列为SEQ ID NO.16。

4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述重组表达载体所采用的质粒为pET21a、pET28a或pET30a；

和/或，所述受菌体为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌BL 21star(DE3)或大肠杆菌BL 21(DE3)plyss。

5.一种如权利要求1-4任一项所述基因工程菌的制备方法，其特征在于，按本领域常规的构建方法构建所述重组表达载体，再将所述重组表达载体转化入受体菌，即得。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述构建方法为：1)将所述连接肽与自聚集短肽的基因连接，得基因片段I，然后在所述基因片段I的两端加上内切酶片段，利用酶切位点将所述基因片段I插入质粒；2)在所述目的蛋白的基因两端加上内切酶片段，利用酶切位点将所述目的蛋白的基因插入所述质粒，即可；

步骤1)中，所述内切酶片段较佳地为HindIII和XhoI内切酶片段；和/或，步骤2)中，所述内切酶片段较佳地为Nde I和HindIII内切酶片段。

8.一种氧化还原酶的融合蛋白，其特征在于，其由依次连接的目的蛋白、连接肽和自聚集短肽组成；所述目的蛋白为权利要求1-4任一项中所述的目的蛋白；所述连接肽为权利要求1-4任一项中所述的连接肽；所述自聚集短肽为权利要求1-4任一项中所述的自聚集短肽。

9.一种如权利要求8所述氧化还原酶的融合蛋白的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：将如权利要求1-4任一项所述基因工程菌进行活化培养，然后接种到发酵培养基，发酵培养，加入诱导剂进行诱导表达，即得；

其中，所述活化培养较佳地为：将所述基因工程菌接种到液体LB培养基中，于35-37℃下摇床活化8-12小时；

其中，所述发酵培养基较佳地为LB培养基；所述发酵培养的接种量较佳地为0.5％-5％，百分比为活化培养后的培养物相对于发酵培养基的体积比；所述发酵培养的温度较佳地为25-40℃；所述发酵培养的时间较佳地为1-3小时；

其中，所述诱导剂；较佳地为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷和/或乳糖；所述诱导剂的浓度较佳地为0.05-2g/L。

其中，所述诱导表达的温度较佳地为15-35℃；所述诱导表达的时间较佳地为2-24小时。

10.如权利要求8所述氧化还原酶的融合蛋白在酶法合成埃索美拉唑中的用途；

所述目的蛋白为单加氧酶，所述氧化还原酶的融合蛋白作为催化剂使用；和/或，所述目的蛋白为脱氢酶，所述氧化还原酶的融合蛋白作为辅助组分使用。