CN108251465A - 一种埃索美拉唑的酶法制备方法 - Google Patents

一种埃索美拉唑的酶法制备方法 Download PDF

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CN108251465A CN201611235281.4A CN201611235281A CN108251465A CN 108251465 A CN108251465 A CN 108251465A CN 201611235281 A CN201611235281 A CN 201611235281A CN 108251465 A CN108251465 A CN 108251465A
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张敏
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Abstract

本发明公开了一种埃索美拉唑的酶法制备方法，其包括下述步骤：以奥美拉唑硫醚为底物，在单加氧酶、辅助组分和相转移催化剂的作用下，于溶剂中与氧化剂进行反应，生成埃索美拉唑，即可。本发明的制备方法使用酶催化法高效制备埃索美拉唑，同时采用了相转移催化剂，不仅提高了酶催化反应的效率，反应时间大幅下降，并且提高了反应底物的浓度，转化率最高可达99.8％，降低了生产成本，大幅提高单批产量，具有优越的工业化应用价值。

Description

一种埃索美拉唑的酶法制备方法
技术领域
本发明涉及制药和生物化工技术领域,尤其涉及一种埃索美拉唑的酶法制备方法。
背景技术
两相体系的酶催化氧化还原反应已有较多报道。于瑶(溴过氧化物酶催化环己烯环氧化反应，于瑶、靳艳、吴佩春、张卫，催化学报，2007年，第28卷第10期，第915-918页)研究了溴过氧化物酶在水-有机两相体系中催化环己烯环氧化的反应，反应收率达到41.5％，选择性为82.2％。杨忠华(水-有机溶剂两相体系中面包酵母不对称还原苯乙酮合成手性苯乙醇的研究，杨忠华、曾嵘、吴高明等，高校化学工程学报，2009年，第23卷第3期，第450-454页)报道了水-有机溶剂两相体系促进面包酵母细胞催化芳香酮的不对称还原，底物浓度为30mmol/L时，产物得率可达到45％，这较在水相中反应有显著的提高。
埃索美拉唑生物酶法合成具有反应收率高，产物手性选择性较好，且无需重金属手性配体的优势。科德克希斯(拉唑化合物的合成，CN201080054980.3)开发了一种单加氧酶，可在两相进行催化反应，单次可转化的底物浓度为30g/L，如果要催化100g/L的底物，反应时间长为69h，且需要补加酶5次，投酶量大。另外，CN201410695734.6公开了一种环己酮单加氧酶及其在合成埃索美拉唑中的应用，其反应收率较高，但是反应底物浓度和单次产量仍然很低，无法满足工业化生产的需要。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于克服了现有的酶法合成埃索美拉唑的方法在底物浓度大的情况下，反应时间过长，且投酶量大，产量无法进一步提升等的缺陷，提供一种埃索美拉唑的酶法制备方法。本发明的制备方法使用酶催化法高效制备埃索美拉唑，同时采用了相转移催化剂，不仅提高了酶催化反应的效率，提高了反应产物的浓度，降低了生产成本，具有优越的工业化应用价值。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种埃索美拉唑的酶法制备方法，其包括下述步骤：以奥美拉唑硫醚为底物，在单加氧酶、辅助组分和相转移催化剂的作用下，于溶剂中与氧化剂进行反应，生成埃索美拉唑，即可。
其中，所述奥美拉唑硫醚为5-甲氧基-2-(4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基硫代-1H-苯并咪唑。所述奥美拉唑硫醚与溶剂的质量体积比较佳地为10-170g/L，优选地为40-170g/L，更佳地为70-170g/L，最佳地为130-170g/L。
其中，所述单加氧酶的使用形式不限，可以是酶粉、酶液和基因工程菌中的一种或多种。所述单加氧酶可为本领域常规使用的单加氧酶，较佳地为环己酮单加氧酶。应当理解，基于现有技术的水平和认识，基因工程所得到的环己酮单加氧酶具有更好的催化转化奥美拉唑硫醚的效果，优选采用基因工程所得到的非天然的环己酮单加氧酶，例如CN201080054980.3中所公开的“工程化CHMO多肽”。按本领域常识，所述环己酮单加氧酶的基因工程菌的基因一般来自于Lysinibacillus sp.、Ustilago sp.、Arthrobacter sp.、Brevibacterium sp.、Acinetobacter sp.、Mycobacterium sp.、Aspergillus sp.或者Cunninghamella sp.。在本发明中，较佳地，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列为SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4或者SEQ ID NO.6。更佳地，所述环己酮单加氧酶的核苷酸序列为SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3或者SEQ ID NO.5。所述单加氧酶的用量可根据其添加的类型不同，按本领域常规的方式进行选择。在本发明的一实施方式中，所述单加氧酶以酶粉的形式使用，酶粉与所述溶剂的质量体积比为3.8-4.0g/L。
其中，所述辅助组分可为本领域常规使用的辅助组分(或称辅助因子)，通常可以是还原型辅酶，例如CN201080054980.3中所公开的NADPH和/或NADH，或者，所述辅助组分也可以是氧化型辅酶、脱氢酶和脱氢酶对应底物的组合。所述氧化型辅酶较佳地为NADP+和/或NAD+。所述脱氢酶的使用形式不限，可以是酶粉、酶液和基因工程菌中的一种或多种。所述脱氢酶可为本领域常规使用的脱氢酶，较佳地为酮还原酶(又称醇脱氢酶)，更佳地为异丙醇脱氢酶。按本领域常识，所述酮还原酶的基因工程菌的基因一般来自于Lactobacillussp.、Yarrowia lipolytica sp.或者Gluconobacter oxydans。较佳地，所述酮还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10或者SEQ ID NO.12。更佳地，所述酮还原酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或者SEQ ID NO.11。此外，所述酮还原酶也可为市售产品，例如尚科生物医药上海有限公司的ES-KRED-104或苏州汉酶生物技术有限公司的KRED-127。
按本领域常识，还原型辅酶可以无需再生，但也可以采用额外的辅助组分来实现还原型辅酶的再生。所述额外的辅助组分可以是适当的脱氢酶，例如葡萄糖脱氢酶、葡萄糖-磷酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、亚磷酸脱氢酶和酮还原酶以及相应的底物，例如分别是葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、甲酸、亚磷酸或醇。其中，所述脱氢酶较佳地为前述所说的酮还原酶。
在本发明的一些实施方式中，所述辅助组分为还原型辅酶。在本发明的另一些实施方式中，所述辅助组分为酮还原酶、NADP+和仲醇。在本发明的另一些实施方式中，所述辅助组分为酮还原酶、NADPH和仲醇。在本发明的另一些实施方式中，反应体系中是全细胞反应的，由于全细胞中自带辅酶NADPH或NADP+，因而使用的额外辅助组分为酮还原酶和仲醇。在本发明的另一些实施方式中，反应体系是环己酮单加氧酶和酮还原酶的全细胞反应，由于全细胞中自带辅酶NADPH或NADP+，并且同时还自带了酮还原酶，因而使用的额外辅助组分为仲醇。
在本发明的一优选实施方式中，所述环己酮单加氧酶和所述酮还原酶均以基因工程菌的形式进行使用。按本领域常识，可以采用环己酮单加氧酶和酮还原酶分别表达的两株基因工程菌，或者也可以直接采用共表达的基因工程菌。
所述辅助组分中含有还原型辅酶时，所述还原型辅酶与所述溶剂的质量体积比较佳地为0.09-1g/L。所述辅助组分中含有氧化型辅酶时，所述氧化型辅酶与所述溶剂的质量体积比较佳地为0.09-0.4g/L。所述脱氢酶和脱氢酶的对应底物的用量只需满足氧化型辅酶能够再生为还原型辅酶即可。
其中，所述相转移催化剂可为常规使用的相转移催化剂，较佳地为苄基三乙基氯化铵(TEBAC)、四丁基溴化铵(TBAB)、四丁基氯化铵(TBAC)、四丁基硫酸氢铵、三辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、甲基三苯基溴化膦、乙基三苯基溴化膦、四苯基溴化膦和苄基三苯基氯化膦中的一种或者几种，更佳地为TEBAC、TBAB、TBAC或甲基三苯基溴化膦。所述相转移催化剂和溶剂的质量体积比较佳地为0.1-4g/L，更佳地为0.18-3.8g/L，最佳地为1.6-3.8g/L。
其中，按本领域常识，所述溶剂可为水相溶剂，或者水相溶剂和有机相溶剂。所述水相溶剂较佳地为磷酸钾缓冲溶液和/或Tris-HCl缓冲溶液，更佳地为磷酸钾缓冲溶液。所述水相溶剂的pH值较佳地为7-10，更佳地为8-9。此外，当所用的环己酮单加氧酶以酶液的形式使用时，所述水相溶剂即为酶液中除环己酮单加氧酶以外的部分，按本领域常识，其中还可以含有通常制备酶液时可添加的其他物质，例如在Tris-HCl缓冲液中还可以含有MgCl2。
所述有机相溶剂较佳地包括苯、甲苯、二甲亚砜、丙二醇和乙酸异丙酯中的一种或多种，其中优选甲苯、丙二醇和异丙醇中的一种或多种。在脱氢酶使用酮还原酶(或醇脱氢酶)的情况下，所述有机相溶剂优选至少包括异丙醇。在本发明的一优选实施方式中，所述有机相溶剂为异丙醇，或者异丙醇和丙二醇，此时所述溶剂为均相体系。在本发明的另一优选实施方式中，所述有机相溶剂为异丙醇和甲苯，此时所述溶剂为两相体系。
其中，所述氧化剂可为本领域常规使用的氧化剂，较佳地为氧气。按本领域常识，当所述氧化剂为氧气时，可通过连续通入氧气、连续通入空气或者氧气保压等方式来将氧气引入反应体系。
其中，所述反应的其他方法和条件为本领域常规的方法和条件。所述反应的温度较佳地为10-40℃，更佳地为20-30℃，最佳地为25-30℃。
按本领域常识，在所述反应之后还可以进行后处理的步骤。所述后处理步骤均为本领域常规操作，包括但不限于去溶剂、过滤、清洗和干燥等步骤。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料药均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的制备方法使用酶催化法高效制备埃索美拉唑，同时采用了相转移催化剂，不仅提高了酶催化反应的效率，反应时间大幅下降，并且提高了反应底物的浓度(可高达160g/L)，转化率达到92.4％以上，最高可达99.8％，降低了生产成本，大幅提高单批产量，具有优越的工业化应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，高效液相色谱的条件如下：
纯度检测条件：
Shimadzu液相色谱，Phenomenex色谱柱，流动相为10mM磷酸盐(pH 7.6):乙腈(60:40)，流速1mL/min，柱温35℃，紫外检测波长300nm，检测时长15min。
保留时间：产物(3.8min)，底物(8.2min)。
手性ee值检测条件：
Angilent 1260液相色谱仪器，DAICEL CHIRAL AGP色谱柱，流动相为pH6.0磷酸盐缓冲液:乙腈(85:15)，流速0.6mL/min，柱温25℃，紫外检测波长300nm。
出峰时间：埃索美拉唑(3.726min)，异构体杂质(2.649min)。
式中：AAPI：产物埃索美拉唑的峰面积；
AIMP：异构体杂质的峰面积。
实施例1：环己酮单加氧酶基因工程菌的构建
委托上海捷瑞生物工程有限公司定制合成环己酮单加氧酶基因片段SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5，相应编码的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.6。然后以该基因片段为模板，通过PCR扩增扩展(基因片段两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因片段插入至pET28a质粒中，最后将连接获得的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建包含该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，分别记为菌株1#、菌株2#和菌株3#。
其中PCR扩增扩展设计的引物序列如下：
正向引物F1：GGAATTCCATATGAGTACCAAGATGGATTTTGATGC(SEQ ID NO.13)
反向引物R1：CGCGGATCCTTACGCATTAGCCTGCTGTTTGG(SEQ ID NO.14)
实施例2：酮还原酶基因工程菌的构建
委托上海捷瑞生物工程有限公司定制合成酮还原酶基因片段SEQ ID NO.7、SEQID NO.9和SEQ ID NO.11，相应编码的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10和SEQID NO.12。然后以该基因片段为模板，通过PCR扩增扩展(基因片段两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因片段插入至pET28a质粒中，最后将连接获得的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建包含该酮还原酶的重组大肠杆菌基因工程菌株，分别记为菌株4#、菌株5#和菌株6#。
菌株4#PCR扩增扩展设计的引物序列如下：
正向引物F2：GGAATTCCATATGACGGATCGTCTGAAAGG(SEQ ID NO.15)
反向引物R2：CGCGGATCCTTACTGGGCGGTATAGCCG(SEQ ID NO.16)
菌株5#PCR扩增扩展设计的引物序列如下：
正向引物F3：GGAATTCCATATGGCTTCCGTTTCCATTCC(SEQ ID NO.17)
反向引物R3：CGCGGATCCTCACTTGGTAACGGTGGGGTC(SEQ ID NO.18)
菌株6#PCR扩增扩展设计的引物序列如下：
正向引物F4：GGAATTCCATATGTCGTCACAGGTTCCATC(SEQ ID NO.19)
反向引物R4：CGCGGATCCTCAGAATTTCGCCGTATTCG(SEQ ID NO.20)
实施例3：共表达基因工程菌的构建
参照《Molecular Cloning-A laboratory Mannual》(第三版，2001年)进行下述的酶切、连接或感受态细胞的制备、转化等试验。
设计以下引物F5和R5，以SEQ ID NO.1环己酮单加氧酶的基因片段为模板，通过PCR扩增扩展所述环己酮单加氧酶基因片段(片段两端加Nde I和BamH I内切酶片段)；并利用Nde I和BamH I内切酶位点将所述基因插入至pET-21a质粒中，将连接后载体转入大肠杆菌Trans-T1中，构建获得重组质粒，命名为pETC。用引物T7/R3进行菌落PCR验证，提取重组质粒，进行测序，获得结果无误的重组质粒pETC。
正向引物F5：GGCCATATGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAATGAGTACCAAGATGGATTTTG(SEQ ID NO.21)
反向引物R5：CGCGGATCCTTACGCATTAGCCTGCTGTTTGG(SEQ ID NO.22)
设计引物F6和R6，再以SEQ ID NO.7的异丙醇脱氢酶基因片段为模板，通过PCR扩增扩展该异丙醇脱氢酶基因片段(片段两端加BamH I和Xho I内切酶片段)；并利用BamH I和Xho I内切酶位点将基因插入至相应的pETC质粒中，将连接后载体转入大肠杆菌Trans-T1中，构建获得重组质粒，命名为pETCK-01。用引物F6/T7term进行菌落PCR验证，提取重组质粒，进行测序，获得结果无误的重组质粒pETCK-01。将构建获得的重组质粒转化至全式金生物技术有限公司的表达感受态细胞，Escherichia coli BL21(DE3)，即获得含两个基因的共表达基因工程菌株，记为菌株7#。
正向引物F6：CGCGGATCCAAGCTTAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAATGACGGATCGTCTGAAAGGC(SEQ ID NO.23)
反向引物R6：CCGCTCGAGTTACTGGGCGGTATAGCCGCC(SEQ ID NO.24)
实施例4：基因工程菌的制备
将上述的重组大肠杆菌基因工程菌株，菌株1#、菌株2#、菌株3#、菌株4#、菌株5#、菌株6#和菌株7#分别接种到含相应抗性的3-5ml液体LB试管培养基中，于37℃下摇床活化12小时，将活化后得到的培养物按0.5％-5％(V/V)的接种量转接入发酵培养基中，25-40℃发酵培养1-3h，再加入终浓度为0.05-2g/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，并置于15-35℃下诱导表达2-24h，离心、过滤或者超滤获得菌泥，置于-80℃冻存。
实施例5：酶液的制备
分别称取10-20g发酵获得的菌株1#、菌株2#、菌株3#、菌株4#、菌株5#、菌株6#和菌株7#的菌泥，悬浮于100-200ml的细胞破碎缓冲液(10mmol/L，pH7.4Tris-HCl缓冲液中含5mmol/L的MgCl2)中，用100-650W的功率，在冰水浴中进行超声破碎，破碎4-20s，间隔4-60s，超声全程20-60min，反复超声破碎三次。低温条件下离心收集上清液即获得相应的菌株的酶液，置于-20℃冻存。
实施例6：酶粉的制备
分别量取10-50ml菌株1#、菌株2#、菌株3#、菌株4#、菌株5#、菌株6#和菌株7#的酶液，放入干燥皿中，置于-20℃冰箱内进行预冻结，冷冻时间24-48h。然后将样品置于冷冻干燥机中进行冻干，冷冻干燥机的冷阱温度为-50℃，干燥室压力100Pa，冷冻干燥24h，获得酶的固体粉末，置于4℃冷藏保存。
对比实施例1：加入两种基因工程菌的催化反应
将45g奥美拉唑硫醚溶于70g甲苯和20g异丙醇的混合溶液中，依次加入75g菌株1#、75g菌株4#和420g磷酸钾缓冲溶液(pH值9.0，50mM)，加入0.05g NADP+，氧气环境下保温30±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为74.2％，产物ee值为99.1％。
实施例7：加入TEBAC和两种基因工程菌的催化反应
将45g奥美拉唑硫醚溶于70g甲苯和20g异丙醇的混合溶液中，依次加入75g菌株1#、75g菌株4#和420g磷酸钾缓冲溶液(pH值9.0，50mM)，加入1g TEBAC和0.05g NADP+，氧气环境下保温30±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为96.1％，产物ee值为99.1％。
对比实施例2：共表达基因工程菌的催化反应
将75g奥美拉唑硫醚溶于70g甲苯和30g异丙醇的混合溶液中，依次加入150g菌株7#和420g磷酸钾缓冲溶液(pH值9.0，50mM)，连续通入氧气条件下保温25±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为68.2％，产物ee值为99.0％。
实施例8：加入TBAB和共表达基因工程菌的催化反应
将75g奥美拉唑硫醚溶于70g甲苯和30g异丙醇的混合溶液中，依次加入150g菌株7#和420g磷酸钾缓冲溶液(pH值8.0，100mM)，加入1g TBAB，连续通入氧气条件下保温25±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为95.2％，产物ee值为99.0％。
对比实施例3：酶液的催化反应
将80g奥美拉唑硫醚溶于70g甲苯和30g异丙醇的混合溶液中，依次加入200g菌株2#酶液和200g菌株6#酶液，加入0.2g NADP+，连续通入氧气条件下保温25±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为78.3％，产物ee值为99.0％。
实施例9：加入甲基三苯基溴化膦和酶液的催化反应
将80g奥美拉唑硫醚溶于70g甲苯和30g异丙醇的混合溶液中，依次加入200g菌株2#酶液和200g菌株6#酶液，加入2g甲基三苯基溴化膦和0.2g NADP+，连续通入氧气条件下保温25±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为99.3％，产物ee值为99.0％。
对比实施例4：酶粉的催化反应
将20g奥美拉唑硫醚溶于80g甲苯和20g异丙醇的混合溶液中，依次加入2g菌株3#酶粉和2g菌株5#酶粉与400mLTris-HCl缓冲溶液(pH值7.5，50mM)，加入0.05g NADPH，在氧气保压条件下保温30±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为73.5％，产物ee值为99.0％。
实施例10：加入TBAC和酶粉的催化反应
将20g奥美拉唑硫醚溶于80g甲苯和20g异丙醇的混合溶液中，依次加入2g菌株3#酶粉、2g菌株5#酶粉与400mL Tris-HCl缓冲溶液(pH值7.5，50mM)，加入0.5g TBAC和0.05gNADPH，在氧气保压条件下保温30±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为92.4％，产物ee值为99.0％。
对比实施例5：共表达基因工程菌的单相催化反应
将75g奥美拉唑硫醚、30g异丙醇和150g菌株7#依次加入420g磷酸钾缓冲溶液(pH9.0，20mM)中，连续通入氧气条件下保温25±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为43.5％，产物ee值为99.0％。
实施例11：加入TBAB和共表达基因工程菌的单相催化反应
将75g奥美拉唑硫醚、30g异丙醇和150g菌株7#依次加入420g磷酸钾缓冲溶液(pH9.0，20mM)中，加入1g TBAB，连续通入氧气条件下保温25±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为97.1％，产物ee值为99.0％。
对比实施例6：酶粉的单相催化反应
将75g奥美拉唑硫醚、30g异丙醇、2g菌株1#酶粉和2g ES-KRED-104酶粉(采购自尚科生物医药上海有限公司)依次加入420g磷酸钾缓冲溶液(pH9.0，50mM)中，加入0.05gNADP+，连续通入氧气条件下保温25±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为54.2％，产物ee值为99.0％。
实施例12：加入TBAB的酶粉的单相催化反应
将75g奥美拉唑硫醚、30g异丙醇、2g菌株1#酶粉和2g ES-KRED-104酶粉(采购自尚科生物医药上海有限公司)依次加入420g磷酸钾缓冲溶液(pH9.0，50mM)中，加入1g TBAB和0.05g NADP+，连续通入氧气条件下保温25±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为96.8％，产物ee值为99.0％。
对比实施例7：酶粉的催化反应
将40g奥美拉唑硫醚溶于80g甲苯和20g异丙醇的混合溶液中，依次加入2g菌株3#酶粉与400mLTris-HCl缓冲溶液(pH7.5，50mM)的混合溶液，加入0.5g NADPH，氧气保压条件下保温30±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为75.6％，产物ee值为99.0％。
实施例13：加入TBAC和酶粉的催化反应
将40g奥美拉唑硫醚溶于80g甲苯和20g异丙醇的混合溶液中，依次加入2g菌株3#酶粉与400mLTris-HCl缓冲溶液(pH7.5，50mM)的混合溶液，加入0.5g TBAC和0.5g NADPH，氧气保压条件下保温30±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为99.8％，产物ee值为99.0％。
对比实施例8：酶粉的催化反应
依次将40g奥美拉唑硫醚、2g菌株2#酶粉与90g NADPH加入250mL Tris-HCl缓冲溶液(pH值7.5，100mM)，在氧气保压条件下保温30±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为67.4％，产物ee值为99.0％。
实施例14：加入十二烷基三甲基氯化铵和酶粉的催化反应
依次将40g奥美拉唑硫醚、2g菌株2#酶粉、0.4g十二烷基三甲基氯化铵与90gNADPH加入250mL Tris-HCl缓冲溶液(pH值7.5，100mM)，在氧气保压条件下保温30±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为98.4％，产物ee值为99.0％。
实施例15：加入苄基三苯基氯化膦和酶粉的单相催化反应
将75g奥美拉唑硫醚、30g异丙醇、2g菌株2#酶粉和2g KRED-127(来源：苏州汉酶生物技术有限公司)依次加入420g磷酸钾缓冲溶液(pH9.0，100mM)中，加入1g苄基三苯基氯化膦和0.5g NADPH，连续通入氧气条件下保温20±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为96.3％，产物ee值为99.0％。
实施例16：加入四丁基硫酸氢铵的共表达两相催化反应
将75g奥美拉唑硫醚溶于70g甲苯和30g异丙醇的混合溶液中，依次加入150g菌株7#和420g磷酸钾缓冲溶液(pH值9.0，100mM)，加入0.1g四丁基硫酸氢铵，连续通入氧气条件下保温25±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为97.3％，产物ee值为99.0％。
实施例17：加入三辛基甲基氯化铵的共表达两相催化反应
将75g奥美拉唑硫醚溶于70g甲苯和30g异丙醇的混合溶液中，依次加入150g菌株7#和420g磷酸钾缓冲溶液(pH值9.0，100mM)，加入2g三辛基甲基氯化铵，氧气保压条件下保温25±2℃反应，24h高效液相色谱监控反应转化率为98.1％，产物ee值为99.0％。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江京新药业股份有限公司，上海京新生物医药有限公司
<120> 一种埃索美拉唑的酶法制备方法
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<170> PatentIn version 3.5
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gatgtgggcg ggacctggta ttggaatcgc tatccgggcg cactgacgga tacggaaacc 180
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ctgtgggaag tgacaaccga atatggcgat aaatataccg cacgctttct gattaccgcc 420
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gaactgcatc atacgtcacg ctggccggat gatgtgagca tcgaaggcaa gagagtgggt 540
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aatagcgcct tagcctatgg tgtgaatgag tctacagttc cagccatgag cgtgagtgca 780
gaagaacgta aagccgtgtt tgaaaaggca tggcagacgg gtggcgggat gcgctttatg 840
tttgaaacct ttggggacat aattaccaat atggaagcta atatcgaagc acagaatttt 900
atcaaaggca aaattgcccg catcgttaaa gatcctgcca ttgcacagaa actgatgcct 960
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Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gln
195 200 205
Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala
210 215 220
Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
<210> 9
<211> 858
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atggcttccg tttccattcc tcttcgagcg ctgtcaagcg gttataacat ccctgccatt 60
ggtcttggcg tgtaccagag tgcagacgcc gaaaccattg tctacgaggc cctcaaaaag 120
ggttacagac tggtggacac tgcccaggag tatggcaatg aagctgccac ttgtcggggt 180
atttccaagt tcctgaagga gactggaact aaccgacgag aggtctttta caccaccaag 240
ctggacgacg ccactggagg atatgagggc accatgcagc tggctgaggc tcgcctagct 300
gaggctcgaa agggcggtat tgattacatt gatctgcttc tgatccatgc tcctttctcc 360
aagtctccct acaccgagac ccgactggct gcttggaagg ctcttaccga gctggttgac 420
ggaggagcca ttcgaagcat tggagtgtcc aactacggag ttaagcatct gaaggagttc 480
tgggacgctg atgtcaagta caagcctgtt ctgaaccagg ttgagtcttc tccctggaac 540
gtgcgacaag atatccacga cttttgcaag tctcacaatg tcattgtcga acaatactct 600
cctctgtgtc gaggcaatcg atttaaggag cccggtgttc tcaagctggc tgacaagtac 660
aagaagactc ctgcccagat tctcattcga tggagtctgg ataagggaat gcttcccatt 720
cccaagaccg acaacgtgga ccgtctgagt cctaacctcg acgtctttga tttcaatctg 780
actccccaag aggtcgagga ccttcaggat ctcaactcgt atacttgtta cgagtgggac 840
cccaccgtta ccaagtga 858
<210> 10
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Met Ala Ser Val Ser Ile Pro Leu Arg Ala Leu Ser Ser Gly Tyr Asn
1 5 10 15
Ile Pro Ala Ile Gly Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Asp Ala Glu Thr
20 25 30
Ile Val Tyr Glu Ala Leu Lys Lys Gly Tyr Arg Leu Val Asp Thr Ala
35 40 45
Gln Glu Tyr Gly Asn Glu Ala Ala Thr Cys Arg Gly Ile Ser Lys Phe
50 55 60
Leu Lys Glu Thr Gly Thr Asn Arg Arg Glu Val Phe Tyr Thr Thr Lys
65 70 75 80
Leu Asp Asp Ala Thr Gly Gly Tyr Glu Gly Thr Met Gln Leu Ala Glu
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Glu Ala Arg Lys Gly Gly Ile Asp Tyr Ile Asp Leu
100 105 110
Leu Leu Ile His Ala Pro Phe Ser Lys Ser Pro Tyr Thr Glu Thr Arg
115 120 125
Leu Ala Ala Trp Lys Ala Leu Thr Glu Leu Val Asp Gly Gly Ala Ile
130 135 140
Arg Ser Ile Gly Val Ser Asn Tyr Gly Val Lys His Leu Lys Glu Phe
145 150 155 160
Trp Asp Ala Asp Val Lys Tyr Lys Pro Val Leu Asn Gln Val Glu Ser
165 170 175
Ser Pro Trp Asn Val Arg Gln Asp Ile His Asp Phe Cys Lys Ser His
180 185 190
Asn Val Ile Val Glu Gln Tyr Ser Pro Leu Cys Arg Gly Asn Arg Phe
195 200 205
Lys Glu Pro Gly Val Leu Lys Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Lys Thr Pro
210 215 220
Ala Gln Ile Leu Ile Arg Trp Ser Leu Asp Lys Gly Met Leu Pro Ile
225 230 235 240
Pro Lys Thr Asp Asn Val Asp Arg Leu Ser Pro Asn Leu Asp Val Phe
245 250 255
Asp Phe Asn Leu Thr Pro Gln Glu Val Glu Asp Leu Gln Asp Leu Asn
260 265 270
Ser Tyr Thr Cys Tyr Glu Trp Asp Pro Thr Val Thr Lys
275 280 285
<210> 11
<211> 840
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atgtcgtcac aggttccatc cgccgaggcc cagaccgtga tttcctttca tgacggtcac 60
accatgcccc agatcgggct gggcgtgtgg gaaacgccgc cggatgagac ggccgaggtc 120
gtgaaggaag ccgtgaagct cggttaccgg tctgtcgata cggcgcgtct gtacaagaac 180
gaggaaggtg tcggcaaagg tctggaagac catccggaaa tcttcctgac gaccaagctc 240
tggaatgacg agcagggcta tgacagcacc ctgcgggcgt atgaagaaag cgcgcgcctg 300
ctgcgtcgtc cggtgctgga cctgtatctg atccactggc cgatgccggc tcaggggcag 360
tatgtcgaga cgtggaaggc actcgtcgag ctgaagaaat ccggtcgtgt gaagtccatc 420
ggcgtgtcca atttcgagtc ggagcatctg gagcggatca tggatgccac gggtgtcgtg 480
ccggtcgtca accagatcga gctgcatccc gatttccagc agcgcgccct gcgggaattc 540
cacgagaagc acaacatccg caccgagtcc tggcgcccgc tgggcaaggg gcgcgtcctg 600
agcgatgagc ggatcgggaa gatcgctgaa aagcacagcc ggactccggc gcaggtcgtg 660
atccgctggc atcttcagaa tggactgatc gtcattccga aatcggtcaa tcccaagcgt 720
ctggctgaaa atctggatgt gttcggcttc gtgctggatg cggatgacat gcaggccatc 780
gaacagatgg accgcaagga tggccggatg ggcgctgatc cgaatacggc gaaattctga 840
<210> 12
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Met Ser Ser Gln Val Pro Ser Ala Glu Ala Gln Thr Val Ile Ser Phe
1 5 10 15
His Asp Gly His Thr Met Pro Gln Ile Gly Leu Gly Val Trp Glu Thr
20 25 30
Pro Pro Asp Glu Thr Ala Glu Val Val Lys Glu Ala Val Lys Leu Gly
35 40 45
Tyr Arg Ser Val Asp Thr Ala Arg Leu Tyr Lys Asn Glu Glu Gly Val
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Asp His Pro Glu Ile Phe Leu Thr Thr Lys Leu
65 70 75 80
Trp Asn Asp Glu Gln Gly Tyr Asp Ser Thr Leu Arg Ala Tyr Glu Glu
85 90 95
Ser Ala Arg Leu Leu Arg Arg Pro Val Leu Asp Leu Tyr Leu Ile His
100 105 110
Trp Pro Met Pro Ala Gln Gly Gln Tyr Val Glu Thr Trp Lys Ala Leu
115 120 125
Val Glu Leu Lys Lys Ser Gly Arg Val Lys Ser Ile Gly Val Ser Asn
130 135 140
Phe Glu Ser Glu His Leu Glu Arg Ile Met Asp Ala Thr Gly Val Val
145 150 155 160
Pro Val Val Asn Gln Ile Glu Leu His Pro Asp Phe Gln Gln Arg Ala
165 170 175
Leu Arg Glu Phe His Glu Lys His Asn Ile Arg Thr Glu Ser Trp Arg
180 185 190
Pro Leu Gly Lys Gly Arg Val Leu Ser Asp Glu Arg Ile Gly Lys Ile
195 200 205
Ala Glu Lys His Ser Arg Thr Pro Ala Gln Val Val Ile Arg Trp His
210 215 220
Leu Gln Asn Gly Leu Ile Val Ile Pro Lys Ser Val Asn Pro Lys Arg
225 230 235 240
Leu Ala Glu Asn Leu Asp Val Phe Gly Phe Val Leu Asp Ala Asp Asp
245 250 255
Met Gln Ala Ile Glu Gln Met Asp Arg Lys Asp Gly Arg Met Gly Ala
260 265 270
Asp Pro Asn Thr Ala Lys Phe
275
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggaattccat atgagtacca agatggattt tgatgc 36
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgcggatcct tacgcattag cctgctgttt gg 32
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggaattccat atgacggatc gtctgaaagg 30
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cgcggatcct tactgggcgg tatagccg 28
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggaattccat atggcttccg tttccattcc 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgcggatcct cacttggtaa cggtggggtc 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ggaattccat atgtcgtcac aggttccatc 30
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cgcggatcct cagaatttcg ccgtattcg 29
<210> 21
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ggccatatga ataattttgt ttaactttaa gaaggagata taatgagtac caagatggat 60
tttg 64
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cgcggatcct tacgcattag cctgctgttt gg 32
<210> 23
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gcggatccaa cttaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatataatga cggatcgtct 60
gaaaggc 67
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ccgctcgagt tactgggcgg tatagccgcc 30

Claims (10)

1.一种埃索美拉唑的酶法制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：以奥美拉唑硫醚为底物，在单加氧酶、辅助组分和相转移催化剂的作用下，于溶剂中与氧化剂进行反应，生成埃索美拉唑，即可。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述奥美拉唑硫醚与溶剂的质量体积比为10-170g/L，较佳地为40-170g/L，更佳地为70-170g/L，最佳地为130-170g/L。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述单加氧酶为环己酮单加氧酶；所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列较佳地为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或者SEQ ID NO.6；更佳地，所述环己酮单加氧酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或者SEQ ID NO.5。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述辅助组分至少包括还原型辅酶；或者，所述辅助组分至少包括氧化型辅酶、脱氢酶和脱氢酶对应底物；
所述还原型辅酶与所述溶剂的质量体积比较佳地为0.09-1g/L；和/或，所述氧化型辅酶与所述溶剂的质量体积比较佳地为0.09-0.4g/L。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述还原型辅酶为NADPH和/或NADH；
和/或，所述氧化型辅酶为NADP+和/或NAD+；
和/或，所述脱氢酶为酮还原酶，较佳地为异丙醇脱氢酶。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述酮还原酶的氨基酸序列为SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10或者SEQ ID NO.12；较佳地，所述酮还原酶的核苷酸序列为SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.9或者SEQ ID NO.11；
或者，所述酮还原酶为ES-KRED-104或KRED-127。
7.如权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述相转移催化剂为苄基三乙基氯化铵、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵、四丁基硫酸氢铵、三辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、甲基三苯基溴化膦、乙基三苯基溴化膦、四苯基溴化膦和苄基三苯基氯化膦中的一种或者几种。
8.如权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述相转移催化剂和溶剂的质量体积比为0.1-4g/L，较佳地为0.18-3.8g/L，更佳地为1.6-3.8g/L。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为水相溶剂，或者水相溶剂和有机相溶剂；
所述水相溶剂为磷酸钾缓冲溶液和/或Tris-HCl缓冲溶液；所述水相溶剂的pH值较佳地为7-10，更佳地为8-9；
所述有机相溶剂包括苯、甲苯、二甲亚砜、丙二醇和乙酸异丙酯中的一种或多种。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂为氧气；
和/或，所述反应的温度为10-40℃，较佳地为20-30℃，更佳地为25-30℃。
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