TWI589696B - 立體選擇性酶催化還原酮基化合物之方法 - Google Patents
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Description
本發明關於一種立體選擇性(特定地鏡像選擇性)酶催化還原酮基化合物成為對應之手性羥基化合物之方法,其中該酮基化合物係經鏡像選擇性NADH特異性氧化還原酶還原。本發明特定地關於經選擇之氧化還原酶於該方法中之用途。
具光學活性之羥基化合物係廣泛地適用於合成藥理活性化合物、芳香性物質、費洛蒙、農業化學物及酶抑制劑之重要手性子(chiron)。因此,特別地在醫藥產業中可注意到對手性化合物及手性合成技術之需求增加,因為未來外消旋化合物將難以被用來作為醫藥製劑。
前手性酮基化合物之不對稱還原是立體選擇性催化作用的一部分,其中生物催化相較於化學催化構成強力之競爭技術。化學不對稱氫化作用需要使用具有高度毒性且對環境有害之重金屬催化劑、極端且能源密集之反應條件以及大量之有機溶劑。另外,該些方法通常具有副反應及鏡像超越值不足之特徵。
在天然中,前手性酮基化合物還原成羥基化合物及以相反方向進行之氧化發生在每一種有機體之許多生化途徑包括初級代謝及次級代謝中,且係由不同類型之二級醇去氫酶(ADH)及氧化還原酶所催化。正常來說,該等酶類係輔因子依賴性。
在不同的定序計畫中,不同有機體中之許多胺基酸序列已在各種情況中被鑑定,該等胺基酸序列據推測分別為活性、功能、鏡像選擇性及化學選擇性未知之氧化還原酶。近來氧化還原酶用於工業方法之基本適合性可根據一些實例被證實。
近年來的研究可能顯示,在含有有機溶劑之水性/有機雙相系統中使用經分離之氧化還原酶係非常有效、經濟且可行的,即使在高濃度(>5%)下。在該描述之系統中,將被還原之酮基化合物由於通常難溶於水,因此與有機溶劑一起形成有機相。另外,該有機溶劑本身可部分地被免除。在該情況下,該有機相係自將被還原之酮基化合物形成(EP 1 383 899)。輔酶再生係藉由同步氧化二級醇加以實現,在大多數情況下,使用不昂貴之水混溶性2-丙醇作為二級醇(WO 2006/087235)。使用2-甲基-4-戊醇或2-辛醇以再生輔因子NADH或NADPH同樣係有利的(WO 2007/036257)。
許多具有不同特異性及敏感性之氧化還原酶可在最近幾年之專利文獻中找到。可以找到許多具有高鏡像選擇性S-特異性氧化還原酶及去氫酶之實例,該等酶類幾乎無例外地使用NADH作為輔因子,因此可在上述製程條件下被非常經濟地使用。該等S-特異性氧化還原酶之實例係源自拉平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)(CPCR)(US 5,523,223及US 5,763,236;Enzyme Microb. Technol. 1993 Nov;15(11):950-8)及莢膜畢赤酵母(Pichia capsulata)(DE 10327454.4)之羰基還原酶、源自紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)(RECR)(US 5,523,223)、褐色諾卡氏菌(Norcardia fusca)(Biosci. Biotechnol. Biochem.,63(10)(1999),p. 1721-1729;Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003 Sept;62(4):380-6;Epub 2003 Apr 26)及紅色紅球菌(Rhodococcus ruber)(J. Org. Chem. 2003 Jan 24;68(2):402-6)之羰基還原酶。另外,源自膠紅酵母(Rhodotorula mucillaginosa)、細桿菌屬(Microbacterium spec.)、暗紅戈登氏菌(Gordonia rubripertincta)、樹幹畢赤酵母(Pichia stipitis)及喜海藻糖畢赤酵母(Pichia trehalophila)(WO 2007/012428)之S-特異性羰基還原酶係經描述。
R-特異性二級醇去氫酶之實例係鑑別自乳酸桿菌屬(Lactobacillus)之有機體:克菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)(US 5,200,335)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)(DE 19610984 A1;Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2000 Dec;56 Pt 12:1696-8)、微小乳桿菌(Lactobacillus minor)(DE 10119274)及肉色明串珠菌(Leuconostoc carnosum)(WO 2007/012428)。所有該等酶類具有需要NADPH作為輔因子之缺點,NADPH相較於NADH貴上許多,因此涉及相對較高之製程成本。
「R-特異性」氧化還原酶被理解為該等將未經取代之羰基化合物(諸如舉例來說2-丁酮、2-辛酮或苯乙酮)還原成為對應之R-羥基化合物(意即R-2-丁醇、R-2-辛醇或R-2-苯乙醇)者。舉例來說,4-鹵基-3-側氧丁酸酯被R-特異性氧化還原酶還原成S-4-鹵基-3-羥基丁酸酯。
「S-特異性」氧化還原酶係ADH,該ADH將未經取代之羰基化合物(諸如舉例來說2-丁酮、2-辛酮或苯乙酮)還原成為對應之S-羥基化合物(意即S-2-丁醇、S-2-辛醇及S-2-苯乙醇)。舉例來說,4-鹵基-3-側氧丁酸酯被S-特異性氧化還原酶還原成R-4-鹵基-3-羥基丁酸酯。
在本申請案中,用語「特異性」被理解為對應之鏡像異構物係由>95%形成。
另外,一些源自木蘭假絲酵母屬(Candida magnoliae)之酵母菌的非特異性NADPH依賴性酶係描述於最近之專利文獻中(EP 1152054 A1,WO 2007/033928,WO 2006/046455,WO 2005/033094)。除了NADPH依賴性之外,彼等之主要缺點在於無法被使用於利用受質偶聯性輔酶再生之製程中,而是一定需要第二酶系統以進行輔酶再生。以葡萄糖作為輔受質之葡萄糖去氫酶係較佳地供此目的使用。此外,該等酶類之缺點在於彼等通常是非特異性的,也就是未經取代之羰基化合物(諸如舉例來說2-丁酮、2-辛酮或苯乙酮)之還原通常導致外消旋醇類;該等酶類只有在例外的情況中才選擇性地作用。因此,該等酶類通常不可能鏡像選擇性還原受質諸如4-鹵基-3-側氧丁酸酯、3-側氧酯類或脂族酮類(例如2-辛酮)。
可被使用於以二級醇(較佳地2-丙醇)作為輔受質之受質偶聯性輔酶再生之製程中的強力、NADH依賴性且明確地R-特異性氧化還原酶只有非常有限的數量。
NADH依賴性R-特異性氧化還原酶係鑑別自例如芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)(EP 1179 595 A1)。然而,該酶對於2-丙醇的活性非常小,因此不適合用於受質偶聯性輔酶再生製程。
另外二種源自粉狀畢赤酵母(Pichia farinosa)及尼莫假絲酵母(Candida nemodendra)之NADH依賴性R-特異性氧化還原酶係描述於WO 2007/012428。在該專利中有可能顯示源自粉狀畢赤酵母之酶也可能利用2-丙醇進行輔酶再生,但是異丙醇之濃度至多15%(體積/體積)。
另外,源自利夫森氏菌(Leifsonia)(US 7,172,894 B2,Biosci. Biotechnol. Biochem.,70(2),2006,pages 418-426)及德沃斯氏菌(Devosia)(WO 2004/027055)之NADH依賴性酶類係為已知,其中至少源自利夫森氏菌之酶應為R-特異性且能進行受質偶聯性輔酶再生。
然而,目前已知之氧化還原酶(特別是明顯地R-特異性酶類)幾乎不足以用來開發立體選擇性還原酮基化合物之整個市場潛力。一方面,此可由各種酶在受質範圍、理想pH值及溫度與溶劑穩定性方面具有非常不同之性質的事實解釋,該些特性之間通常彼此互補。因此,即使同源性相對類似之酶類可能對特定受質具有完全不同之轉換行為。另一方面,不是幾乎所有被描述之酶類能被選殖及以足夠之程度過度表現,這表示該等酶類無法被用於工業用途。
為了盡可能廣泛地探討酶催化性不對稱氫化之合成潛力,因此必須獲得盡可能廣泛之不同之工業級氧化還原酶。同時,對於可有利地在工業上使用之酶類的需求可被清楚地定義。
因此,本發明之目的在於鑑別及提供穩定、NADH依賴性及R-特異性氧化還原酶,該等酶類適合用於利用受質偶聯性輔酶再生以將酮基化合物還原成手性醇之製程。
為達此目的,必須提供對二級醇(特定地異丙醇)具有儘可能高穩定性之氧化還原酶。另外,本發明將提供之酶類應具有在大腸桿菌中之良好表現性之特徵(>500單位/克大腸桿菌濕生物質)。
由於對於大腸桿菌中之穩定性及表現性的高度需求,本發明假設細菌性酶類優於來自酵母菌之酶類。
另外,本發明之目的係分別鑑別胺基酸序列及基因序列,該等序列以重組表現狀態構成穩定之NADH依賴性、(R)-特異性氧化還原酶且若使用酶偶聯性輔酶再生可適用於製程工程。
發明人發現該等序列通常具有「短鏈」去氫酶之已知特徵,諸如舉例來說供輔因子結合之N端羅士曼摺疊(Rossmann-Fold) GxxxGxG、提供中間β-褶板結構之穩定性的位置87之NAG模體及由活性中心之S 139、Y 152及K 156組成之高度保留性催化三元體。為達本申請案之目的,在蛋白質序列中個別同源性胺基酸基團之數字配置係由使用計分矩陣布洛森62(BLOSUM62)之「多向蛋白質排比演算法」進行,及使用源自氫鏈黴菌(Streptomyces hydrogenans)之3α,20β-羥基類固醇去氫酶(登記號2bhd_Strex)作為參考物。
由於在網路上可取得眾多具有該記號之胺基酸序列,因此需要其他特徵之定義以限制該序列池。發明人因此請求具有該描述特性之(R)-特異性氧化還原酶必須另外具有下列序列特徵及模式:
‧位置37之負電荷胺基酸基團,
‧在二聚化結構域中之二個C端模體:[A;S]-S-F及[V;I]-DG-[G;A]-Y-[T;C;L]-[A;T;S]-[Q;V;R;L;P],
‧位置204至208之R-ADH-記號:H-[P;A]-[I;A;Q;V;L]-[G;K]-R,
‧位置159之纈胺酸或白胺酸(在K 156下端4個位置處),
‧位置178之天冬醯胺酸,及
‧位置188之脯胺酸基團。
根據該模式,下列不具有現有功能性分類之序列係選自由定序計畫獲得之序列池,並根據彼等之功能選殖及特徵化。
經選擇之蛋白質的多向胺基酸序列比較。計分矩陣布洛森62。以陰影形式表示:與源自氫鏈黴菌之3α,20β-羥基類固醇去氫酶(登記號2bhd_Strex)之參照序列比較時,特定位置相同之胺基酸基團。由發明人主張權利之序列模體係以方框圈起。
令人意外的是,有可能顯示所有7個序列均為具有足夠穩定性(特別地對2-丙醇)之NADH依賴性R-ADH。另外,有可能顯示所有7種酶均適用於輔受質偶聯性輔酶再生之酶催化還原製程。
此為意外且非預期之結果,特別是因為該等序列彼此之間顯示明顯低程度之同源性(表2),即使進行序列比較(Pubmed/Blast)亦無可在此方向給予功能提示之相關序列可被鑑別(表1)。另一方面,接著有可能顯示本發明之酶類在彼等之酶催化特性上充分地不同,因此在彼等之製程適用性上(特別地對特定目標而言)彼此互補。因此,在本發明之製程中使用前述之氧化還原酶並不是已建立之先前技術的相等替代物,而是現有範圍之擴展。
表2之同源性程度係以相同胺基酸基團之百分比及最佳雙序列排比中之位移數顯示。該最佳排比因此係藉由BLAST演算法(基本區域排比搜尋工具)測定(Altschul et al. 1990,Proc. Natl. Acd. Sci. USA. 87:2264-2268)。
使用PAM30矩陣作為基礎計分矩陣以評估序列相似性(Dayhoff;M.O.,Schwarz,R.M.,Orcutt,B.C. 1978. “A model of evolutionary change in Proteins”in“Atlas of Protein Sequence and structure”5(3) M.O. Dayhoff(ed) 345-352,National Biomedical Research foundation)。
本發明之目的係提供一種立體選擇性酶催化還原酮基化合物成為對應之手性羥基化合物之方法,該方法涵蓋廣泛之受質範圍,且在製程技術條件下產生高轉換率。
本發明之目的係藉由一開始提及類型之方法達成,其中該酮基化合物係經鏡像選擇性NADH特異性氧化還原酶還原,其特徵為多肽被用於還原該酮基化合物,該多肽在位置204至208具有R-ADH-記號H-[P;A]-[I;A;Q;V;L]-[G;K]-R且具有下列全部之進一步結構特徵:
(i)N端羅士曼摺疊(Rossmann-Fold) GxxxGxG,
(ii)位置87之NAG模體,
(iii)由S 139、Y 152及K 156組成之催化三元體,
(iv)位置37之負電荷胺基酸基團,
(v)在二聚化結構域中之二個C端模體[A;S]-S-F及[V;I]-DG-[G;A]-Y-[T;C;L]-[A;T;S]-[Q;V;R;L;P],
(vi)位置159之纈胺酸或白胺酸(在K 156下端4個位置處),
(vii)位置178之天冬醯胺酸,及
(viii)位置188之脯胺酸基團。
根據本發明之方法的較佳實施態樣,多肽被用於還原該酮基化合物,
(a)該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中之一者,或
(b)該多肽中至少70%之胺基酸係與該胺基酸序列SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 7中之一者的胺基酸相同,或
(c)該多肽係由選自SEQ ID NO: 8至SEQ ID NO: 14之核酸序列所編碼,或
(d)該多肽係由在嚴謹條件下與(c)中提及之核酸序列中之一者雜交的核酸序列所編碼。
藉由在嚴謹條件下與例如SEQ ID NO: 14雜交之核酸序列可理解多核苷酸,該多核苷酸可利用SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:14之部分序列作為DNA探針,以經由菌落雜交法、噬菌斑雜交法、南方雜交法或相等方法鑑別。為達此目的,被固定在濾紙上之多核苷酸係於65℃之0.7-1 M NaCl溶液中與例如SEQ ID NO:14雜交。雜交係根據例如Molecular CIoning,A Laboratory Manual, Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中之Protocol 32或類似出版物中所述進行。接著,用0.1至2倍SSC溶液於65℃中清洗該濾紙,其中1倍SSC溶液被認為是由150 mM NaCl及15 mM檸檬酸鈉所組成之混合物。
在如上述之嚴謹條件下與多核苷酸SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14雜交之多核苷酸應與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14之多核苷酸序列分別具有至少68%之序列一致性,較佳地至少80%之一致性,甚至更佳地95%之一致性。
根據另一較佳之實施態樣,使用通式I之酮基化合物,
其中R1、R2及R3係各自獨立地選自
1)-H,前提為其R1不是H,
2)-(C1-C20)-烷基,其中烷基係直鏈或支鏈,
3)-(C2-C20)-烯基,其中烯基係直鏈或支鏈且隨意地含有至多4個雙鍵,
4)-(C2-C20)-炔基,其中炔基係直鏈或支鏈且隨意地含有至多4個三鍵,
5)-(C6-C24)-芳基,
6)-(C1-C8)-烷基-(C6-C14)-芳基,
7)-(C5-C14)-雜環,
8)-(C3-C7)-環烷基,
其中上述2)至8)之基團係未經取代或各自獨立地經-OH、鹵素、-NO2、-NH2、-NHP及/或-M取代一次、二次或三次,其中P代表-(C1-C7)-烷基、-(C2-C7)-烯基、-(C2-C7)-炔基、-(C6-C14)-芳基或選自苄氧羰基、三苯甲基或三級丁基羰基之保護基,且M代表-(C1-C7)-烷基、-(C2-C7)-烯基、-(C2-C7)-炔基、-(C6-C14)-芳基或-(C1-C8)-烷基-(C6-C14)-芳基,其中在-(C1-C8)-烷基-(C6-C14)-芳基中之-(C6-C14)-芳基係未經取代或經鹵素取代一次、二次或三次,或
9)-CH2-X-R,其中X代表O或S且R係選自-(C1-C7)-烷基、苯基或苄基,其中苯基及苄基係經-(C1-C7)-烷基、-S(C1-C3)-烷基、-O(C1-C3)-烷基、-NO2、-SCF3、鹵素、-C(O)(C1-C3)-烷基及/或-CN取代一次、二次或三次,
或R1與R2、R1與R3或R2與R3形成包含3至6個C原子之環,該環係未經取代或各自獨立地經-OH、鹵素、-NO2、-NH2、-NHP及/或-M取代一次、二次或三次,且其餘基團係選自上述1)至9)之基團。
根據另一較佳實施態樣,使用通式II之二酮,
其中R5代表(CH2)n(其中n=0至20)、-(C6-C14)-芳基或-(C5-C14)-雜環,R4及R6各自獨立地代表-(C1-C20)-烷基或酯基團,其中R4、R5及R6係未經取代或各自獨立地經-(C1-C4)-烷基、-OH、鹵素、-NO2及/或-NH2取代一次、二次或三次。
在本發明之方法中,另外較佳的是
-由該氧化還原酶/去氫酶形成之氧化輔因子NAD係連續地再生,且
-具有通式RXRYCHOH之二級醇係用於輔因子再生,其中RX及RY各自獨立地係支鏈或非支鏈之C1-C8-烷基且C總數≧3。
用語「NAD」係指菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸,用語「NADH」係指經還原之菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸。
二級醇(=輔受質)在所使用之氧化還原酶及NAD之作用下被轉換成對應之酮類及NADH,藉此發生NADH之再生。在進行該反應時,供再生之輔受質之部分係介於總體積之5至95%,較佳地介於10至70%,特定較佳地介於20至50%。
特定較佳地,使用2-丙醇或2-丁醇作為輔因子再生之二級醇。較佳地在2-丙醇之例中,使用10至70%(體積/體積)及特定較佳地20至50%(體積/體積)。
用語「芳基」係指在環中/在(稠及完全共軛)環中包含6至24個碳原子之芳香族碳基團。舉例來說,-(C6-C24)-芳基係苯基、萘基(例如1-萘基、2-萘基)、聯苯基(例如2-聯苯基、3-聯苯基或4-聯苯基)、蒽基、茀基、菲基或環戊環多氫菲基。聯苯基、萘基及特定地苯基係較佳之芳基。
用語「鹵素」係指源自氟、氯、溴或碘之家族的元件。
用語「-(C1-C20)-烷基」係指碳氫基團,該基團係直鏈或支鏈且包含1至20個碳原子之碳鏈,舉例來說甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、三級丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。用語「-(C3-C7)-環烷基」係指環狀碳氫基團,諸如環丙基、環丁基、環戊基、環己基或環庚基。
用語「-(C5-C14)-雜環」係指部分或完全飽和之單環或雙環之5元至14元雜環。N、O及S係雜原子之實例。源自吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、異噁唑、噻唑、異噻唑、四唑、1,2,3,5-噁噻二唑-2-氧化物、三唑酮、噁二唑酮、異噁唑酮、噁二唑烷二酮、經例如F、-CN、-CF3或-C(O)-O-(C1-C4)烷基取代之三唑、3-羥基吡咯-2,4-二酮、5-側氧-1,2,4-噻二唑、吡啶、吡嗪、吡嘧啶、吲哚、異吲哚、吲唑、酞嗪、喹啉、異喹啉、喹噁啉、喹唑啉、辛啉、咔啉及該等雜環之苯并-稠合、環戊并-、環己并-或環庚并-稠合衍生物之基團係用語「-(C5-C14)-雜環」之實例。2-或3-吡咯基、苯吡咯基諸如4-或5-苯-2-吡咯基、2-呋喃基、2-噻吩基、4-咪唑基、甲基咪唑基(例如1-甲基-2-,-4-或-5-咪唑基)、1,3-噻唑-2-基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-,3-或4-吡啶基-N-氧化物、2-吡嗪基、2-,4-或5-吡嘧啶基、2-,3-或5-吲哚基、經取代之2-吲哚基(例如1-甲基-,5-甲基-,5-甲氧基-,5-苄氧基-,5-氯-或4,5-二甲基-2-吲哚基)、1-苄基-2-或-3-吲哚基、4,5,6,7-四氫-2-吲哚基、環庚并[b]-5-吡咯基、2-,3-或4-喹啉基、1-,3-或4-異喹啉、1-側氧-1,2-二氫-3-異喹啉基、2-喹噁啉基、2-苯并呋喃基、2-苯并噻吩基、2-苯并噁唑基或苯并噻唑基或二氫吡啶基、吡咯烷基(例如2-或3-(N-甲基吡咯烷基))、哌嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、四氫噻吩基或苯并二噁烷基係特定地較佳。
式I之較佳化合物係例如4-氯乙醯乙酸乙酯、乙醯乙酸甲酯、乙基-8-氯-6-側氧辛酸、3-側氧戊酸乙酯、4-羥基-2-丁酮、2-側氧戊酸乙酯、乙基-2-側氧-4-苯基丁酸、丙酮酸乙酯、苯甲醯甲酸乙酯、1-苯-2-丙酮、2-氯-1-(3-氯苯)乙-1-酮、苯乙酮、2-辛酮、3-辛酮、2-丁酮、1-[3,5-雙(三氟甲)苯]乙-1-酮、1,4-二氯-2-丁酮、乙醯氧丙酮、苯醯甲基氯、4-溴乙醯乙酸乙酯、1,1-二氯丙酮、1,1,3-三氯丙酮或1-氯丙酮。
通式R-CO-CH2-X之芳香性或雜芳香性化合物係特定較佳之化合物,其中X=鹵素且R代表如上述式I定義之基團。
其他較佳之化合物係二酮類諸如2,5-己二酮、2,4-戊二酮、2,7-辛二酮、2,7-二甲基-3,6-辛二酮或聯乙醯。
在本發明之方法中,該氧化還原酶被以完全純化或部分純化之狀態使用,或該方法可利用包含該描述之氧化還原酶之細胞進行。在如此進行時,該被使用之細胞可以天然、透性化或溶解狀態提供。較佳的是,如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7之經選殖之氧化還原酶及彼等之同源物可分別被使用。
每公斤將被轉換之酮基化合物(無上限)使用5.000至10 Mio U之氧化還原酶。1 U酶單位對應每分鐘(分)轉換1微莫耳之酮基化合物所需之酶的量。
在本發明之方法中,該酮基化合物之使用量係介於總體積之3%至50%,較佳地介於5%至40%,特定地10%至30%。
在本發明之方法中所達成之TTN(總轉換數=經還原之酮基化合物莫耳數/使用之輔因子莫耳數)通常介於102至105,但是較佳地係≧103。
為使輔因子再生可額外較佳地添加醇去氫酶,但是該方法係僅由氧化還原酶進行(受質偶聯性輔酶再生)。
該反應混合物之水性部分(酶催化還原在其中進行)較佳地包含緩衝劑,例如磷酸鉀、tris/HCl或三乙醇胺緩衝劑,該緩衝劑之pH值介於5至10,較佳地pH值介於6至9。此外,該緩衝劑可包含用於穩定或活化該等酶類之離子,舉例來說鋅離子或鎂離子。
在進行本發明之方法時,該溫度適當地介於約10℃至70℃,較佳地介於20℃至45℃。
在本發明之方法的其他可能之實施態樣中,該酶催化轉換係於有機溶劑存在時進行,該有機溶劑不混溶於水或僅以有限程度混溶於水,且該有機溶劑不涉及輔因子再生,意即不包含任何可氧化之羥基。該溶劑可舉例來說為對稱或不對稱之二(C1-C6)烷基醚、直鏈烷、支鏈烷或環烷。較佳地使用二乙醚、三級丁基甲醚、二異丙醚、二丁醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、己烷、甲苯、二氯甲烷、環己烷或彼等之混合物作為額外之有機溶劑。
輔因子NAD(H)在水性相中之濃度通常介於0.001毫莫耳至1毫莫耳,特定地介於0.01毫莫耳至0.1毫莫耳。
在本發明之方法中,亦可使用氧化還原酶/去氫酶之穩定劑。適當之穩定劑舉例來說係甘油、山梨醇、1,4-DL-二硫蘇糖醇(DTT)或二甲基亞碸(DMSO)。
該酶催化還原反應在溫和條件下自行進行,以使該產製之醇類不再繼續反應。本發明之方法具有長期使用壽命、所產製之手性醇的鏡像異構物純度通常超過95%及高產率(根據所使用之酮基化合物之量而定)。
本發明之方法係於例如以玻璃或金屬製成之封閉反應容器中進行。為達此目的,該等成分被個別轉移至該反應容器中並在例如氮氣或空氣之環境中攪拌。該反應時間介於1小時至48小時,特定地介於2小時至24小時。
接著,該反應混合物係經再處理。為達此目的,該水性相係經分離,該有機相係經過濾。可選擇地,該水性相再被萃取一次且如該有機相進一步再處理。於是,該溶劑可選擇地自該經過濾之有機相蒸發。
藉由下列實施例進一步詳細說明本發明,且該經鑑別之氧化還原酶的優秀品質藉由與先前技術比較而加以證實。
真氧羅爾斯頓氏菌DSM4048之細胞係於30℃之細菌培養箱中以下列培養基(pH 7.0)培養:0.5%蛋白及0.3%肉萃取物。在培養第3天時,將細胞從該培養基中藉由離心分離並儲存於-80℃。
根據“Molecular Cloning”by Manniatis & Sambrook(見上)中描述之方法萃取基因組DNA。以該形成之核酸作為聚合酶鏈鎖反應(PCR)之模板,使用源自NCBI資料庫中公布號碼53760931之基因序列的特定引子。在這種情況下,該等引子係提供於5’端位置並具有供核酸內切酶Nde I及Xho I切割之限制位點以供後續選殖至表現載體。
放大係於PCR緩衝液[10毫莫耳tris-HCl(pH 8.0);50毫莫耳KCl;10毫莫耳MgSO4;1毫莫耳dNTP混合物;20皮莫耳之各引子及2.5 U之Platinum Pfx DNA聚合酶(英維傑基(Invitrogen)公司)]中以500奈克之基因組DNA及下列溫度周期進行:
週期1:94℃,2分鐘
週期2 x 30:94℃,30秒
55℃,30秒
68℃,60秒
週期3:68℃,7分鐘
4℃,∞
該形成之PCR產物經1%洋菜凝膠純化及核酸內切酶Nde I及Xho I切割成約750 bp之大小,並與已利用該相同之核酸內切酶處理之pET21a載體(諾華建(Novagen)公司)的骨架連接。在2微升之連接批量被轉形至大腸桿菌Top 10 F細胞(Invitrogen)中後,利用核酸內切酶Nde I及Xho I進行限制酶分析,以測試安比西林抗性菌落之質體DNA中是否存在750 bp大小之插入片段。對來自片段陽性之菌落的質體製劑進行序列分析,接著轉形至大腸桿菌BL21 Star(Invitrogen)。
已分別經該表現建構物轉形之大腸桿菌BL21 Star(德國喀斯魯Invitrogen公司)及RB791菌株(美國耶魯大學大腸桿菌菌株庫)被分別培養於添加安比西林(50微克/毫升)或卡比西林(carbenicillin)(50微克/毫升)之200毫升LB培養基(1%胰蛋白腖、0.5%酵母菌萃取物、1% NaCl)直到達到以550奈米波長測量之0.5之光學密度。該重組蛋白質之表現係藉由添加0.1毫莫耳濃度之異丙基硫代半乳糖(IPTG)加以誘導。在25℃及220 rpm之條件下,分別經過8及16小時之誘導後,收集該等細胞並冷凍於-20℃。在活性測試部分,取10毫克細胞與500微升之100 mM TEA緩衝液pH 7.0及500微升之玻璃微珠混合,並利用球狀研磨機消化10分鐘。所獲得之細胞裂解液接著以稀釋狀態被用於個別測試。活性測試包含下列:870微升之100 mM TEA緩衝液pH 7.0、160微克NAD(P)H、10微升經稀釋之細胞裂解液。該反應係藉由添加100微升之100 mM受質溶液至該反應混合物開始。
本發明之氧化還原酶在大腸桿菌中被非常有效地表現。表3顯示在該表現中達成之個別酶之活性。
製備表4之緩衝液。個別緩衝液成分之濃度在各例中係50毫莫耳。
測量批量(30℃)-理想pH值還原:
870微升 表3提到之各緩衝液系統
20微升 NADH 10毫莫耳
10微升 經稀釋之酶。
在經大約2至3分鐘之培養後,添加
100微升 受質溶液(100毫莫耳)。
個別參考受質(表3)係用來作為各氧化還原酶之受質。該反應於340奈米處進行1分鐘。為了測定理想pH值,測定表4所列之個別緩衝液中之酶催化反應。為了測定氧化反應之理想pH值,使用NAD作為輔因子及使用2-丙醇或2-辛醇作為受質。
氧化還原酶SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:7之結果彙編於表5。
重組氧化還原酶之穩定性係藉由將彼等儲存於表4所列之緩衝液系統中加以測定。為達此目的,製備pH介於4至11之不同緩衝液(50 mM),並利用該等緩衝液稀釋根據實施例4所產製之氧化還原酶。在經30、60及120分鐘之培養後,自該批量取出10微升並用於如實施例3a所述之活性測試。
初始值因此係在該酶經磷酸鉀緩衝液50微莫耳pH=7.0稀釋(1:20)後立即獲得之測量值。在該給定條件下,該值對應約0.70/分之消光變化且被設定為100%之值。所有後續測量值與此值比較。
表6收集該指定氧化還原酶在經培養120分鐘後彼之活性不低於初始活性50%之pH範圍。
為了測定理想測試溫度,於15℃至70℃之溫度範圍測量本發明所使用之氧化還原酶標準測量批量的酶活性。
表7收集該測定之溫度理想值:
以實施例3c所描述之類似方式,測定15℃至70℃之範圍內的溫度穩定性。為達此目的,本發明所使用之氧化還原酶的稀釋液在各例中係以個別溫度培養60分鐘及180分鐘,接著於30℃測量上述之測量批量。表8收集該等氧化還原酶在培養120分鐘後活性不低於初始活性50%之溫度範圍。
欲測試之氧化還原酶對2-丙醇之穩定性係藉由以含有對應百分比之2-丙醇(約10單位/毫升緩衝液)的緩衝液(KPP 100 mM,pH=7.0)稀釋實施例2(由重組表現)所獲得之細胞裂解液加以測試。該批量係於室溫中持續完全混合地(恆溫混合器170 rpm)培養。經24小時培養後,自該水性相各取出10微升並用於在標準測量批量(磷酸鉀緩衝液(KPP)100mM,pH=7.0,0.2mM NADH,10mM受質)中測定該酶之活性。另外在此例中,以緩衝液稀釋後立即測得之初始值被設定為100%,所有後續測量值與該值比較。
從表9可知,所有測試之序列在2-丙醇中具有令人驚訝之穩定性,意即所有氧化還原酶在20%異丙醇中至少穩定24小時,但是大部分酶類即使在40%(體積/體積)中24小時後仍具有高達75%之實質殘留活性。此顯示序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:7特別適用於使用2-丙醇之受質偶聯方法。
要被特徵化之序列的受質範圍係藉由測量該酶對多種酮類及醇類進行還原及氧化之活性加以測定。為達此目的,使用實施例2之標準測量批量與不同受質。
所有酶類對乙醯乙酸乙酯之活性被設定為100%,所有其他受質與該值比較。
測定經選擇之受質的鏡像超越值。使用下列反應批量:
‧160微升 緩衝液
‧100微升 NAD(0.4毫克/毫升)
‧20-50微升 2-丙醇
‧50微升 酶溶液
‧2毫克 受質
‧反應條件 28℃,24小時
當培養期間結束時,利用依受質而定之溶劑萃取該樣本並進行離心。抽取一等分,可選擇地完全移除該萃取劑,接著將該樣本溶解於適當溶劑中,並藉由GC測定鏡像超越值。
鏡像超越值係如下計算:
ee(%)=((R-醇-S-醇)/(R-醇+S-醇))×100。
上述氧化還原酶進行氧化之潛力及因此再生之適合性係藉由採用下列活性測試加以比較:870微升之100毫莫耳TEA緩衝液pH 8.0、160微克NAD、10微升經稀釋之細胞裂解液。該反應係藉由添加100微升之100毫莫耳受質溶液至該反應混合物開始。
在此例中,具有最高活性之受質被設定為100%。
自表10至12可得知,所有7個序列均為明顯的R-特異性氧化還原酶。然而,該經測試之酶類在較佳之受質範圍以及氧化行為上有明顯差異。差異在於以短鏈不如說是低分子受質為首選而非長鏈羰基化合物,類似地對不同之芳香系統或亦不同之取代基(諸如鹵素)有不同之耐受程度。
雖然因此可獲得原則上確實酶催化類似反應之多種酶類,但是我們發現在該等個別受質之間可找到極度有效地酶催化該目標反應與完全不酶催化該目標反應之二種酶類。
另外亦觀察到鏡像選擇性之差異,該差異乍看之下似乎確實不大,但是對於個別酶類於以超過99.0至99.9%之鏡像超越值為規格之特定還原方法之適用性可有絕對決定性,該規格係常見於現今之製藥產業。
另外,該經測試之酶類之間的氧化性質及因此於受質偶聯性輔酶再生之不同製程中的適用性不同,相較於先前技術亦不同。因此,在本發明之方法中使用該被鑑別之氧化還原酶不代表已建立之先前技術的相等替代技術,而是該現有範圍之擴大。
由下列實施例應可顯示在一些特定製程中,該等酶類SEQ ID NO:1至7可對具體問題提供特別解決方案,該解決方案亦明顯地超越現存之先前技術。
為了篩選適當酶類以發展將3,6-辛二酮還原成R,R-3,6-辛二醇之受質偶聯性輔酶再生製程之目的,所有酶類係於下列反應批量中檢測:
450微升緩衝液,pH=7.0
0.05毫克NAD
50微升2-丙醇
10毫克3,6-辛二酮。
於25℃培養24小時後,該等樣本利用二氯甲烷萃取並以GC分析。
表13顯示該等轉換及所得到之反應產物。
目表13可知,在上述之反應條件下,在該些可取得之酶類中可找到能非常有效地將3,6-辛二酮還原成所欲之R,R-辛二醇者(SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3及芬蘭畢赤酵母)、基本上完全不接受該受質者(SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:5及尼莫假絲酵母)以及若意圖產製經還原一次之化合物將被優先使用者(SEQ ID NO:4)。
為了篩選在受質偶聯性輔酶再生製程中用於將2,7-二甲基-3,6-辛二酮還原成(S,S)-2,7-二甲基辛-3,6-二醇之適當酶類,該等酶類係於下列反應批量中檢測:
450微升緩衝液,pH=7.0
0.05毫克NAD
50微升2-丙醇
10毫克2,7-二甲基-3,6-辛二酮。
於25℃培養24小時後,該等樣本利用二氯甲烷萃取並以GC分析。
表14顯示該等轉換及所得到之反應產物。
自表14可知,SEQ ID NO:2提供對該特定問題之解決方案,相反地,先前技術中之酶無法酶催化該所欲之反應。
為了篩選在受質偶聯性輔酶再生製程中用於將2,4-戊二酮還原成R,R-2,4-戊二醇之適當酶類,該等酶類係於下列反應批量中檢測:
450微升緩衝液,pH=7.0
0.05毫克NAD
50微升2-丙醇
10毫克2,4-戊二酮。
於25℃培養24小時後,該等樣本利用二氯甲烷萃取並以GC分析。
表15顯示該等轉換及所得到之反應產物。
由表15可知,氧化還原酶SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2可將2,4-戊二酮轉換成R,R-2,4-戊二醇。大部分酶類只能將該受質轉換成單一還原之化合物。先前技術對此亦無提供解決方案。
另一方面,若要有效回收單一還原之化合物,氧化還原酶SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:7相較於先前技術甚至更適合推薦。
為了篩選在受質偶聯性輔酶再生製程中將1,1,1-三氟丙酮還原成R-1,1,1-三氟丙醇之適當酶類,該等酶類係於下列所示之反應批量中檢測。這樣做時,該反應批量說明對於再處理及轉換此高度揮發性受質之特定需求。在這種情況下,利用異丙醇再生係不可能的,事實上,使用甲基戊醇係首選,一方面為了防止該揮發性受質(沸點=22℃)在反應期間逸散,另一方面使該反應產物R-1,1,1-三氟丙醇(沸點=80℃)能被再處理。(不可能分離2-丙醇因為有相同的沸點。)
450微升緩衝液,pH=7.0
0.05毫克NAD
500微升2-甲基-4-戊醇
20微升1,1,1-三氟丙酮
於25℃培養24小時後,該等樣本利用GC分析。
表16顯示該等轉換及所得到之反應產物。
由表16可知,在此例中,氧化還原酶SEQ ID NO:1在轉換及選擇性上提供最佳結果。意外的是,大部分酶類完全無法以滿意的鏡像選擇性將此受質還原,因此雖然具有基本上相同之功能但該等描述酶類之廣泛性再度被強調。
為了篩選在受質偶聯性輔酶再生製程中用於將2-氯-1-(3-羥基苯)乙-1-酮還原成(1S)-2-氯-1-(3-羥基苯)乙-1-醇之適當酶類,該等酶類係於下列反應批量中檢測:
400微升緩衝液,pH=7.0
0.02毫克NAD
100微升2-戊醇
25毫克2-氯-1-(3-羥基苯)乙-1-酮
於25℃培養24小時後,該等樣本係經萃取及利用GC分析。
表17顯示該等轉換及所得到之反應產物。
由表17可知,基本上利用氧化還原酶SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7以將2-氯-1-(3-羥基苯)乙-1-酮轉換成(1S)-2-氯-1-(3-羥基苯)乙-1-醇是可能的,該等酶類以絕對選擇性轉換這些受質。先前技術之酶無法還原該特定受質。
在下列實施例中,欲被檢測之該等酶類SEQ ID NO:1-7係於工業製程中測試以將4-氯乙醯乙酸乙酯還原成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯並與先前技術比較。
為達此目的,根據先前技術(WO 2006/087235)使用高濃度(200克/升)之該受質4-氯乙醯乙酸乙酯,並比較該等酶類於使用2-丙醇之受質偶聯性再生製程中之效率。
600微升緩衝液,pH=8.0
0.2毫克NAD
200微升2-丙醇
200微升4-氯乙醯乙酸乙酯
240微升自大腸桿菌重組合成之酶(20-60單位)
於25℃培養24小時後,該等樣本係經萃取及利用GC分析。
表18顯示該等轉換及所得到之反應產物。
由表18可得知,特定地SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3之酶為現有製程(通常係NADPH依賴性)提供NADH依賴性之選擇,該選擇對於將4-氯乙醯乙酸乙酯還原成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯係有趣的。相反地,來自先前技術之酶並不適合,因為彼等在該製程條件下分別僅能不充分地轉換或完全無法轉換。
<110> IEP有限公司
<120> 立體選擇性酶催化還原酮基化合物之方法
<130>
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 247
<212> PRT
<213> 仙人掌桿菌(Bacillus cereus)
<400> 1
<210> 2
<211> 257
<212> PRT
<213> 嗜石油甲基菌(Methylibium petroleiphilum)
<400> 2
<210> 3
<211> 251
<212> PRT
<213>中慢生桿瘤菌屬(Mezorhizobium sp.)
<400> 3
<210> 4
<211> 263
<212> PRT
<213> 天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)
<400> 4
<210> 5
<211> 253
<212> PRT
<213> 真氧羅爾斯頓氏菌(Ralstonia eutropha)
<400> 5
<210> 6
<211> 252
<212> PRT
<213> 橙色滑柱菌(Herpentosiphon aurantiacus)
<400> 6
<210> 7
<211> 249
<212> PRT
<213> 脫氮副球菌(paracoccus denitrificans)
<400> 7
<210> 8
<211> 744
<212> DNA
<213> 仙人掌桿菌(Bacillus cereus)
<400> 8
<210> 9
<211> 774
<212> DNA
<213> 嗜石油甲基菌(Methylibium petroleiphilum)
<400> 9
<210> 10
<211> 756
<212> DNA
<213> 中慢生桿瘤菌屬(Mezorhizobium sp.)
<400> 10
<210> 11
<211> 792
<212> DNA
<213> 天藍色鏈黴菌(streptomyces coelicolor)
<400> 11
<210> 12
<211> 762
<212> DNA
<213> 真氧羅爾斯頓氏菌(Ralstonia eutropha)
<400> 12
<210> 13
<211> 759
<212> DNA
<213> 橙色滑柱菌(Herpentosiphon aurantiacus)
<400> 13
<210> 14
<211> 750
<212> DNA
<213> 脫氮副球菌(paracoccus denitrificans)
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- 一種鏡像選擇性酶催化還原酮基化合物成為對應之手性羥基化合物之方法,其中該酮基化合物係經鏡像選擇性NADH特異性氧化還原酶還原,其特徵為該鏡像選擇性NADH特異性氧化還原酶在位置205至209具有R-ADH-記號H-[P;A]-[I;A;Q;V;L]-[G;K]-R且具有下列全部之進一步結構特徵:(i)N端羅士曼摺疊(Rossmann-Fold)GxxxGxG,(ii)位置87之NAG模體,(iii)由S 139、Y 152及K 156組成之催化三元體,(iv)位置37之負電荷胺基酸基團,(v)在二聚化結構域中之二個C端模體[A;S]-S-F及[V;I]-DG-[G;A]-Y-[T;C;L]-[A;T;S]-[Q;V;R;L;P],(vi)位置159之纈胺酸或白胺酸(在K 156下端4個位置處),(vii)位置178之天冬醯胺酸,及(viii)位置188之脯胺酸基團,其中該R-ADH-記號H-[P;A]-[I;A;Q;V;L]-[G;K]-R和結構特徵(i)至(viii)係指多向胺基酸序列比較之2bhd_Strex,且其中(a)該鏡像選擇性NADH特異性氧化還原酶包含胺基酸序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:7中之一者,或(b)該鏡像選擇性NADH特異性氧化還原酶係由選自 SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:14之核酸序列所編碼,或(c)該鏡像選擇性NADH特異性氧化還原酶係由在嚴謹條件下與(b)中提及之核酸序列中之一者雜交的核酸序列所編碼,且其中該酮基化合物具有通式I,
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中-由該氧化還原酶/去氫酶形成之氧化輔因子NAD係連續地再生,且-具有通式RXRYCHOH之二級醇係用於輔因子再生,其中RX及RY各自獨立地係支鏈或非支鏈之C1-C8-烷基且C總數≧3。
- 如申請專利範圍第2項之方法,其中分別使用選自2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-庚醇或2-辛醇之醇(較佳為2-丙醇)作為輔受質或二級醇。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中該酮基化合物之使用量係介於總體積之3%至50%。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中該TTN(總轉換數=使用之酮基化合物莫耳數/使用之輔因子莫耳數)係≧103。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中該方法係於水性有機雙相系統中進行。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中另使用選自二乙醚、三級丁基甲醚、二異丙醚、二丁醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、己烷或環己烷之有機溶劑。
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