KR20110134890A - 케토 화합물의 입체선택적 효소적 환원 방법 - Google Patents

케토 화합물의 입체선택적 효소적 환원 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20110134890A
KR20110134890A KR1020117022944A KR20117022944A KR20110134890A KR 20110134890 A KR20110134890 A KR 20110134890A KR 1020117022944 A KR1020117022944 A KR 1020117022944A KR 20117022944 A KR20117022944 A KR 20117022944A KR 20110134890 A KR20110134890 A KR 20110134890A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
ala
gly
val
leu
Prior art date
Application number
KR1020117022944A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101780510B1 (ko
Inventor
안트제 구프타
마리아 밥코바
안케 트쉔트세르
Original Assignee
이에페 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이에페 게엠베하 filed Critical 이에페 게엠베하
Publication of KR20110134890A publication Critical patent/KR20110134890A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101780510B1 publication Critical patent/KR101780510B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/16—Butanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

케토 화합물의 입체선택적 효소적 환원을 위한 방법
케토 화합물의 해당 키랄 하이드록시 화합물로의 입체선택적, 특히 거울상선택적 효소적 환원 방법에서, 케토 화합물은 거울상선택적, NADH-특이적 산화환원효소로 환원되고, 케토 화합물의 환원을 위해 폴리펩티드를 사용하고 이것은 204-208 위치에서 R-ADH-시그니처 H-[P; A]-[I; A; Q; V; L]-[G; K]-R 및 그들 전체에서 하기의 추가 구조적 특징을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법:
(i) N-말단 로스만-폴드 GxxxGxG,
(ii) 87 위치에서 NAG-모티프,
(iii) S 139, Y 152 및 K 156으로 이루어진 세작용기 촉매(catalytic triad),
(iv) 37 위치에서 음으로 하전된 아미노산 부분,
(v) 이합체화 도메인 [A; S]-S-F 및 [V; I]-DG-[G; A]-Y-[T; C; L]-[A; T; S]-[Q; V; R; L; P]에서 2개의 C-말단 모티프,
(vi) 159 위치에서 Val 또는 Leu (K 156의 하류의 4 위치),
(vii) 178 위치에서 Asn, 및
(viii) 188 위치에서 프롤린 부분.

Description

케토 화합물의 입체선택적 효소적 환원 방법{METHOD FOR STEREOSELECTIVELY AND ENZYMATICALLY REDUCING KETO COMPOUNDS}
본 발명은 케토 화합물의 해당 키랄 하이드록시 화합물로의 입체선택적, 특히 거울상선택적 효소적 환원 방법에 관한 것이며, 여기서 케토 화합물은 거울상선택적, NADH-특이적 산화환원효소로 환원된다. 본 발명은 특히 이 방법에서 선택된 산화환원효소의 용도에 관한 것이다.
광학적 활성 하이드록시 화합물은 약학적 활성 화합물, 방향 물질, 페로몬, 농업 화학물질 및 효소억제제의 합성에 널리 적용할 수 있는 가치있는 카이런(chiron)이다. 그로 인하여, 키랄 화합물에 대한 수요는 증가하고 있으며, 특히 약학 분야에서 키랄 합성 기술이 주목될 수 있고, 미래에는 라세미 화합물이 약학 제제로서 거의 이용되지 않을 것이다.
프로키랄 케토 화합물의 비대칭적인 환원은 입체선택적 촉매작용의 분야이며, 여기서 생촉매작용(biocatalysis)은 화학적 촉매작용에 대해 강력하고 경쟁적인 기술이다. 화학적 비대칭적인 수소화는 높은 독성을 지니고 환경적으로 유해한 중금속 촉매의 이용 및 다량의 유기 용매는 물론이고, 극도의 따라서 에너지 집중적인 반응 조건을 요한다. 또한, 이들 방법은 종종 부반응과 불충분한 거울상 초과량(enantiomeric excess)이 특징이다.
자연에서 프로키랄 케토 화합물의 하이드록시 화합물로의 환원과 그 반대로 진행하는 산화는 모든 유기체에서 일차 물질대사와 이차 물질대사를 포함하는 다양한 생화학적 경로에서 발생하며, 상이한 종류의 이차 알코올 탈수소화효소(ADH)와 산화환원효소에 의하여 촉매된다. 보통 이러한 효소들은 보조인자 의존적이다.
다양한 서열화 프로젝트에서, 각 경우에 많은 아미노산 서열이 상이한 유기체에서 발견되었고, 이는 아마도 각각 알려지지 않은 활성, 기능 및 거울상 선택성 및 화학적 선택성의 산화환원효소일 것이다. 산업상 프로세스에서 사용하기 위한 산화환원효소의 기본적 적합성은 최근 많은 예에 기반하여 입증되었다.
최근 유기용매를 이용한 수상/유기상 2상(two phase) 시스템에서 분리된 산화환원효소의 사용은 매우 효과적이고 경제적이며, 높은 농도(>5%)도 역시 이용 가능하다는 것을 나타낼 수 있다. 설명된 시스템에서 일반적으로 환원되는 케토 화합물은 물에 잘 녹지 않아 유기 용매와 함께 유기상을 형성하게 된다. 또한 유기 용매 자체는 부분적으로 분리될 수 있다. 그러한 경우 환원되는 케토 화합물로부터 유기상이 형성된다(EP 1 383 899). 조효소의 재생은 이차 알코올의 동시 산화에 의하여 실현되며, 이를 위해서 대부분의 경우 저렴한 물-혼화성 2-프로판올이 사용된다 (WO 2006/087235). 보조인자 NADH 또는 NADPH의 재생을 위해 2-메틸-4-펜탄올 또는 2-옥탄올의 사용이 마찬가지로 유리하다 (WO 2007/036257).
다른 특이성 및 선택성의 많은 산화환원효소를 최근 특허 문헌에서 발견할 수 있다. 높은 거울상 선택성의 S-특이적 산화환원효소 및 탈수소효소에 대한 다양한 예를 발견할 수 있으며, 대부분 예외 없이 보조인자로서 NADH를 사용하고 따라서 상술한 프로세스 조건하에서 매우 경제적으로 사용할 수 있다. 이러한 S-특이적 산화환원효소의 예는 Candida parapsilosis (CPCR) (US 5,523,223 및 US 5,763,236; Enzyme Microb. Technol. 1993 Nov; 15(11):950-8) 및 Pichia capsulata (DE 10327454.4)로부터의 카르보닐 리덕타아제, Rhodococcus erythropolis (RECR) (US 5,523,223), Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10) (1999), p. 1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003 Sept; 62(4):380-6; Epub 2003 Apr 26) 및 Rhodococcus ruber (J. Org. Chem. 2003 Jan 24; 68(2):402-6)로부터의 카르보닐 리덕타아제가 있다. 또한, Rhodotorula mucillaginosa, Microbacterium spec., Gordonia rubripertincta, Pichia stipitis 및 Pichia trehalophila로부터의 S-특이적 카르보닐 리덕타아제 (WO 2007/012428)가 설명된다.
R-특이적 이차 알코올 탈수소효소의 예는 Lactobacillus: Lactobacillus kefir (US 5,200,335), Lactobacillus brevis (DE 19610984 A1; Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12:1696-8), Lactobacillus minor (DE 10119274) 및 Leuconostoc carnosum (WO 2007/012428) 속의 유기체로부터 확인된다. 이들 모든 효소는 보조인자로서 NADPH가 필요한데, 이것은 실질적으로 NADH 보다 더 고가이며 따라서 비교적 높은 프로세스 비용과 관련된다는 점에서 불리하다.
"R-특이적" 산화환원효소는 예컨대 2-부타논, 2-옥타논 또는 아세토페논과 같은 미치환 카르보닐 화합물을 해당 R-하이드록시 화합물, 즉 R-2-부탄올, R-2-옥탄올 및 R-2-페닐 에탄올로 환원시키는 것으로 이해된다. 4-할로-3-옥소부티르산 에스테르는 예컨대 R-특이적 산화환원효소에 의해 S-4-할로-3-하이드록시부티르산 에스테르로 환원된다.
"S-특이적" 산화환원효소는 예컨대 2-부타논, 2-옥타논 또는 아세토페논과 같은 미치환 카르보닐 화합물을 해당 S-하이드록시 화합물, 즉 S-2-부탄올, S-2-옥탄올 및 S-2-페닐 에탄올로 환원시키는 ADH이다. 4-할로-3-옥소부티르산 에스테르는 예컨대 S-특이적 산화환원효소에 의해 R-4-할로-3-하이드록시부티르산 에스테르로 환원된다.
본 명세서에서, 용어 "특이적"은 해당 거울상체가 >95%로 형성되는 것으로 이해된다.
또한, Candida magnoliae 속의 효모로부터의 많은 미특이적 NADPH-의존 효소가 가장 최근 특허 문헌에 설명되어 있다 (EP 1152054 A1, WO 2007/033928, WO 2006/046455, WO 2005/033094). 그들의 NADPH-의존성 외에, 그들은 기질-결합 조효소 재생이 있는 방법에서 사용될 수 없고 항상 조효소 재생을 위해 제2 효소 시스템이 필요하다는 주요 단점이 있다. 바람직하게는 보조기질로서 글루코스를 갖는 글루코스 탈수소효소가 이 목적으로 사용된다. 또한, 이들 효소는 보통 비특이적이라는 단점을 가지는데, 즉 예컨대 2-부타논, 2-옥타논 또는 아세토페논과 같은 미치환 카르보닐 화합물의 환원이 보통 라세미 알코올을 유도하고; 오직 예외적인 경우 이들 효소는 선택적으로 작동한다. 그러므로, 4-할로-3-옥소부티르산 에스테르, 3-옥소에스테르 또는 지방족 케톤, 예컨대 2-옥타논과 같은 기질의 거울상선택적 환원은 보통 이들 효소로 가능하지 않다.
보조기질로서 이차 알코올, 바람직하게는 2-프로판올로 기질-결합 조효소 재생이 있는 방법에서 사용가능한, 오직 매우 제한된 수의 강력한, NADH-의존적 및 명백히 R-특이적 산화환원효소가 사용가능하다.
NADH-의존적 R-특이적 산화환원효소는 예컨대 Pichia finlandica로부터 확인된다(EP 1179 595 A1). 그러나, 이것은 2-프로판올과 매우 작은 활성을 나타내므로 기질-결합 조효소 재생이 있는 방법에는 부적합하다.
Pichia farinosa 및 Candida nemodendra로부터의 두가지 다른 NADH-의존적 R-특이적 산화환원효소가 WO 2007/012428에 설명되어 있다. 여기서 Pichia farinosa로부터의 효소에 대해서는 2-프로판올로의 조효소 재생도 가능하지만 단지 최대 15% (v/v) 이소프로판올의 농도에서만 가능하다는 것을 나타낼 수 있었다.
또한, Leifsonia (US 7,172,894 B2, Biosci. Biotechnol. Biochem.,70 (2),2006, pages 418-426) 및 Devosia (WO 2004/027055)로부터의 NADH-의존적 효소가 알려져 있고, 여기서 적어도 Leifsonia로부터의 효소는 R-특이적이고 기질-결합 조효소 재생이 가능하다.
그러나, 현재 알려진 산화환원효소, 특히 명백한 R-특이적 효소는 케토 화합물의 입체선택적 환원의 전체 시장 잠재력을 활용하는데 거의 충분하지 않다. 한편, 이것은 개별 효소가 기질 스펙트럼, pH 최적뿐만 아니라 온도 및 용매 안정성에 대하여 매우 다른 특성을 가지며, 종종 서로 보충되는 점에서 설명될 수 있다. 그러므로, 비교적 유사한 상동 효소도 하나의 특정 기질에 대하여 완전히 다른 전환 거동을 나타낼 수 있다. 한편, 설명한 거의 모든 효소가 충분한 정도로 복제되고 과발현되지 않는데, 이는 이들 효소가 산업상 용도로 이용가능하지 않다는 것을 의미한다.
그러므로 가능한 한 광범위하게 효소적 비대칭 수소화의 합성 가능성을 활용하기 위해서, 가능한 넓은 다른 산업상 접근가능한 산화환원효소의 포트폴리오의 보유가 필요하다. 한편, 산업상 유리하게 사용가능한 효소에 대한 요구가 명백히 정의될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 목적은 기질-결합 조효소 재생을 사용하는, 케토 화합물의 키랄 알코올로의 환원 방법에 적합한 안정한 NADH-의존적 및 R-특이적 산화환원효소를 확인하고 제공하는 것이다.
이 목적을 위해서, 이차 알코올, 특히 이소프로판올에 대하여 가능한 높은 안정성을 갖는 산화환원효소를 제공하는 것이 필요하다. 또한, 제공되는 효소는 Escherichia coli에서 좋은 발현성을 특징으로 하여야 한다(>500 units/g E. coli 습윤 바이오매스).
E.coli에서의 안정성 및 발현성에 대한 높은 요구 때문에, 본 발명에서 박테리아 효소가 효모로부터의 효소에 비하여 바람직하다.
또한, 본 발명의 목적은 재조합 발현 상태에서 안정한 NADH-의존적, (R)-특이적 산화환원효소를 구성하고 효소-결합 조효소 재생이 사용된다면 방법 엔지니어링에 적합한 아미노산 서열 및 유전자 서열을 각각 확인하는 것이다.
본 발명자들은 이러한 서열이 일반적으로, 보조인자 결합에 대하여 "단쇄" 탈수소효소, 예컨대 N-말단 로스만-폴드 GxxxGxG, 중심 β-병풍 구조의 안정화를 제공하는 87 위치에서 NAG-모티프, 및 활성 중심에서 S 139, Y 152 및 K 156를 구성하는 매우 보존된 세작용기 촉매(catalytic triad)의 공지된 특징을 나타낸다는 것을 발견하였다. 본 발명의 목적을 위해서, 단백질 서열 중 개별 상동 아미노산 부분의 수치 할당은 스코어 매트릭스 BLOSUM62 및 기준으로서 Streptomyces hydrogenans로부터의 3알파,20베타-하이드록시스테로이드 탈수소효소, Accession Code 2bhd_Strex을 갖는 "멀티-웨이 단백질 배열 알고리즘"으로 행한다. .
이 시그니처를 나타내는 인터넷에서 이용가능한 복수의 아미노산 서열과 함께, 이 서열 풀을 제한하기 위해서 다른 특징의 정의가 요구되었다. 그러므로 본 발명자들은 설명한 특성을 갖는 (R)-특이적 산화환원효소가 또한 하기 서열 특징 및 패턴을 나타내어야 한다는 것을 주장하였다:
·37 위치에서 음으로 하전된 아미노산 부분
·이합체화 도메인에서 두개의 C-말단 모티프: [A; S]-S-F 및 [V; I]-DG-[G;A]-Y-[T; C; L]-[A; T; S]-[Q; V; R; L; P]
·204 내지 208 위치에서 R-ADH-시그니처: H-[P; A]-[I; A; Q; V; L]-[G; K]-R
·159 위치에서 Val 또는 Leu (K 156의 하류의 4 위치)
·178 위치에서 Asn
·188 위치에서 프롤린 부분.
이 패턴에 따라, 하기 서열은 현존하는 기능적 분류 없이 서열화 프로젝트로부터 이용가능한 서열 풀로부터 선택되었고, 복제되었으며, 그들의 기능에 관하여 특징화되었다.
SEQ ID NO 기원 길이 입수 번호 가장 가까운 상동성
SEQ ID NO:1 Bacillus cereus ATCC 14579 247 aa NP-833194 Lysinibacillus로부터의 글루코스-1-탈수소효소
59% 동일성
SEQ ID NO:2 Methylibium petroleiphilum Pm1 257 aa YP-001020081 단쇄 탈수소효소 Flavobacterium
59% 동일성
SEQ ID NO:3 Mesorhizobium sp. 251 aa YP-676781 추정상 산화환원효소
Sinorhizobium
62% 동일성
SEQ ID NO:4 Streptomyces coelicolor 263 aa NP-631416 단쇄 탈수소효소 Comamonas testosteroni 57% 동일성
SEQ ID NO:5 Ralstonia 253 aa YP-299653
(에피머라아제/디히드라타아제/리덕타아제 SDR)
 단쇄 탈수소효소
Bacillus
54% 동일성
SEO ID NO:6 Herpentosiphon aurantiacus
ATCC 23779		 252 aa YP-001544828 단쇄 탈수소효소 Comamonas testosteroni 54% 동일성
SEQ ID NO:7 Paracoccus denitrificans 249 aa ZP-00631061 단쇄 탈수소효소, Pedobacter
57% 동일성
Figure pct00001
Figure pct00002
선택된 단백질의 멀티-웨이 아미노산 서열 비교. 매트릭스 BLOSUM 62 스코어링. 음영 형태로 나타냄: 위치 특이적 동일 아미노산 부분, Streptomyces hydrogenans로부터의 3알파,20베타-하이드록시스테로이드 탈수소효소, Accession Code 2bhd_Strex의 기준 서열과 비교. 발명자에 의해 주장된 서열 모티프를 프레임.
놀랍게도, 모든 7개의 서열에 대하여, 이들이 특히 2-프로판올에 대하여 충분한 안정성을 지닌 NADH-의존적 R-ADH이라는 것을 나타낼 수 있었다. 또한, 모든 7개의 효소에 대하여, 이들이 보조기질-결합 조효소 재생이 있는 효소적 환원 방법에 적합하다는 것을 나타낼 수 있었다.
특히 서열은 서로 현저히 낮은 정도의 상동성을 나타내고(표 2), 서열 비교에서도(Pubmed/Blast), 이 방향에서 기능적 힌트를 주는 관련 서열을 확인할 수 없었기 때문에(표 1) 이것은 놀랍고 예상하지 않은 결과이다.
한편, 본 효소는 결국 그들의 효소적 특성이 충분히 다르고 그들의 방법 적합성, 특히 특이적 타겟에 대하여 서로 보완한다는 것을 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 방법에서 상술한 산화환원효소의 용도는 종래 확립된 것에 대안적인 동등물을 나타내지 않지만 현존하는 스펙트럼의 확장이다.
선택된 산화환원효소의 투-바이-투(two-by-two) 아미노산 서열 비교
　 　 SEQ ID NO:1 SEQ ID
NO:2		 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 SEQID NO:5 SEO ID NO:6 SEQ ID NO:7
SEQ ID NO 유기체 Bacillus cereus ATCC 14579 Methylibium petro-leiphilum Pm1 Meso-rhizobium sp. Strepto-myces coelicolor Ralstonia Herpento-siphon aurantiacus Paracoccus denitrifi-cans
SEQ ID NO:1 Bacillus cereus ATCC 14579 100 37 / 5 41 / 2 40 / 6 54 / 2 41 / 3 38 / 2
SEQ ID NO:2 Methylibium petro-leiphilum Pm1 37 / 5 100 37 / 6 33 / 8 41 / 5 39 / 4 43 / 4
SEQ ID NO:3 Meso-rhizobium sp. 41 / 2 37 / 6 100 56 / 6 41 / 2 56 / 0 64 / 0
SEQ ID NO:4 Strepto-myces coelicolor 40 / 6 33 / 8 56 / 6 100 43 / 3 53 / 5 54 / 5
SEQ ID NO:5 Ralstonia 54 / 2 41 / 5 41 / 2 43 / 3 100 45 / 1 46 / 4
SEO ID NO:6 Herpento-siphon aurantiacus 41 / 3 39 / 4 56 / 0 53 / 5 45 / 1 100 53 / 1
SEQ ID NO:7 Paracoccus denitrificans 38 / 2 43 / 4 64 / 0 54 / 5 46 / 4 53 / 1 100
표 2에서 상동성의 정도는 동일한 아미노산 부분의 퍼센트 및 최적 쌍별 배열(pairwise alignment)에서의 쉬프트 수로서 나타낸다. 최적 배열은 BLAST-알고리즘 (Basic Local Alignement Search Tool)에 의해 결정된다 (Altschul et al. 1990, Proc. Natl. Acd. Sci. USA. 87: 2264-2268).
기본적으로, PAM30 매트릭스가 서열 유사성 평가에 스코어링 매트릭스로서 사용된다 (Dayhoff; M.O., Schwarz, R.M., Orcutt, B.C. 1978. "A model of evolutionary change in Proteins" in "Atlas of Protein Sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoff (ed) 345-352, National Biomedical Research foundation).
본 발명의 목적은 방법 기술적 조건하에서 넓은 기질 스펙트럼을 커버하고 높은 전환율을 산출하는, 케토 화합물의 해당 키랄 하이드록시 화합물로의 거울상선택적 효소적 환원 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 목적은 처음에 설명한 종류의 방법에 의해 달성되며, 케토 화합물의 환원을 위해 폴리펩티드를 사용하며, 이것은 204-208 위치에서 R-ADH-시그니처 H-[P; A]-[I; A; Q; V; L]-[G; K]-R 및 그들 전체에서 하기의 추가 구조적 특징을 나타낸다:
(i) N-말단 로스만-폴드 GxxxGxG,
(ii) 87 위치에서 NAG-모티프,
(iii) S 139, Y 152 및 K 156으로 이루어진 세작용기 촉매(catalytic triad),
(iv) 37 위치에서 음으로 하전된 아미노산 부분,
(v) 이합체화 도메인 [A; S]-S-F 및 [V; I]-DG-[G; A]-Y-[T; C; L]-[A; T; S]-[Q; V; R; L; P]에서 2개의 C-말단 모티프,
(vi) 159 위치에서 Val 또는 Leu (K 156의 하류의 4 위치),
(vii) 178 위치에서 Asn, 및
(viii) 188 위치에서 프롤린 부분.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시형태에 따르면, 폴리펩티드가 케토 화합물 환원에 사용되며, 이는
(a) 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7 중 하나를 포함하거나, 또는
(b) 아미노산의 적어도 70%가 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7 중 하나의 아미노산과 동일하거나, 또는
(c) SEQ ID NO:8 내지 SEQ ID NO:14로 이루어진 군으로부터의 핵산 서열이 암호화하거나, 또는
(d) 긴축 조건하에서 (c)에서 설명한 핵산 서열 중 하나에 혼성화하는 핵산 서열이 암호화한다.
긴축 조건하에서 예컨대 SEQ ID NO:14에 혼성화하는 핵산 서열에 의해, 폴리뉴클레오티드는 DNA 탐침으로서 SEQ ID NO:14 또는 SEQ ID NO:14의 부분 서열을 사용하여 콜로니 혼성화법, 플라크 혼성화법, 서던 혼성화법 또는 유사한 방법을 통해 확인할 수 있는 것으로 이해된다. 이 목적을 위해, 필터 상에 고정된 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 65℃에서 0.7-1 M NaCl 용액 중에서 SEQ ID NO:14에 혼성화된다. 혼성화는 예를 들어, Protocol 32 of Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 또는 이와 유사한 간행물에 기재된 바와 같이 수행된다. 후속적으로, 상기 필터는 65℃에서 0.1 내지 2배 SSC 용액으로 세척되며, 여기서 1배 SSC 용액은 150 mM NaCl 및 15 mM 구연산나트륨으로 구성된 혼합물인 것으로 이해된다.
상술한 긴축 조건하에서 폴리뉴클레오티드 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:14에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:14에 각각 적어도 68% 서열 동일성을 나타내어야 하고, 바람직하게는 적어도 80%의 동일성, 보다 바람직하게는 95%의 동일성이다.
더욱 바람직한 실시형태에 따르면, 일반식 I의 케토 화합물이 사용된다.
Figure pct00003
(I)
여기서 R1, R2 및 R3은 서로 독립적으로 하기 군에서 선택되고,
1) -H, 단 R1은 H가 아님,
2) -(C1-C20)-알킬, 여기서 알킬은 직쇄 또는 분기됨,
3) -(C2-C20)-알케닐, 여기서 알케닐은 직쇄 또는 분기되고 선택적으로 최대 4개 이중 결합을 포함,
4) -(C2-C20)-알키닐, 여기서 알케닐은 직쇄 또는 분기되고 선택적으로 최대 4개 삼중 결합을 포함,
5) -(C6-C24)-아릴,
6) -(C1-C8)-알킬-(C6-C14)-아릴,
7) -(C5-C14)-헤테로사이클,
8) -(C3-C7)-시클로알킬,
여기서 2) 내지 8) 하에서 상기 설명한 부분은 미치환되거나 서로 독립적으로 -OH, 할로겐, -NO2, -NH2, -NHP 및/또는 -M에 의해 1회, 2회 또는 3회 치환되고, 여기서 P는 -(C1-C7)-알킬, -(C2-C7)-알케닐, -(C2-C7)-알키닐, -(C6-C14)-아릴, 또는 벤질옥시 카르보닐, 트리페닐 메틸 및 t-부틸 카르보닐로부터 선택된 보호기를 나타내고, M은 -(C1-C7)-알킬, -(C2-C7)-알케닐, -(C2-C7)-알키닐, -(C6-C14)-아릴 또는 -(C1-C8)-알킬-(C6-C14)-아릴을 나타내고, 여기서 -(C1-C8)-알킬-(C6-C14)-아릴 중의 -(C6-C14)-아릴은 미치환되거나 할로겐에 의해 1회, 2회 또는 3회 치환되고,
9) -CH2-X-R, 여기서 X는 O 또는 S를 나타내고 R은 -(C1-C7)-알킬, 페닐 및 벤질로부터 선택되고, 여기서 페닐 및 벤질은 -(C1-C7)-알킬, -S(C1-C3)-알킬, -O(C1-C3)-알킬, -NO2, -SCF3, 할로겐, -C(O)(C1-C3)-알킬 및/또는 -CN에 의해 1회, 2회 또는 3회 치환되고,
또는 R1은 R2와 함께, R1과 R3 또는 R2과 R3는 3-6 C-원자를 포함하는 고리를 형성하며, 이는 미치환되거나 -OH, 할로겐, -NO2, -NH2, -NHP 및/또는 -M에 의해 서로 독립적으로 1회, 2회 또는 3회 치환되고, 나머지 부분은 1) 내지 9) 하에 상기 설명한 부분으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 일반식 II의 디케톤이 사용되고,
Figure pct00004
(II)
여기서
R5는 (CH2)n(n = 0 - 20), -(C6-C14)-아릴 또는 -(C5-C14)-헤테로사이클을 나타내고,
R4 및 R6는 서로 독립적으로 -(C1-C20)-알킬 또는 에스테르기를 나타내고,
여기서 R4, R5 및 R6는 미치환되거나 -(C1-C4)-알킬, -OH, 할로겐, -NO2 및/또는 -NH2에 의해 서로 독립적으로 1회, 2회 또는 3회 치환된다.
본 발명에 따른 방법에서 다음이 보다 바람직하다.
- 산화환원효소/탈수소효소에 의해 형성된 산화된 보조인자 NAD가 연속적으로 재생되고,
- 일반식 RXRYCHOH을 갖는 이차 알코올이 보조인자 재생에 사용됨, 여기서 RX 및 RY는 서로 독립적으로 분기되거나 미분기된 C1-C8-알킬기이고 Ctotal≥3임.
용어 "NAD"는 니코틴아미드 아데닌 디튜클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide)를 의미하고, 용어 "NADH"는 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(reduced nicotinamide adenine dinucleotide)를 의미한다.
이차 알코올 (= 보조기질)은 사용하는 산화환원효소 및 NAD의 보조로 해당 케톤 및 NADH로 전환되고, 이에 의해 NADH의 재생이 일어난다. 따라서, 재생을 위한 보조기질의 부분은 총 부피를 기준으로 5 내지 95부피% 범위이고, 바람직하게는 10 내지 70부피%, 특히 바람직하게는 20 내지 50부피% 범위이다.
특히 바람직하게는, 2-프로판올 또는 2-부탄올이 보조인자 재생을 위한 이차 알코올로서 사용된다. 바람직하게는, 2-프로판올의 경우 10-70% (v/v), 특히 바람직하게는 20-50% (v/v)이 사용된다.
용어 "아릴"은 고리 내에/(어닐레이티드 및 완전히 콘주게이티드된) 고리에 6 내지 24개 탄소 원자를 포함하는 방향족 탄소 부분인 것으로 이해된다. -(C6-C24)-아릴 부분은 예컨대 페닐, 나프틸, 예를 들어 1-나프틸, 2-나프틸, 비페닐릴, 예를 들어 2-비페닐릴, 3-비페닐릴 및 4-비페닐릴, 안트라실, 플루오레닐, 펜안트릴 또는 시클로펜타노퍼하이드로펜안트릴이다. 비페닐릴 부분, 나프틸 부분 및 특히 페닐 부분이 바람직한 아릴 부분이다.
용어 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드의 군으로부터의 원소인 것으로 이해된다.
용어 "-(C1-C20)-알킬"은 탄화수소 부분이 직쇄 또는 분기이고 1 내지 20개 탄소 원자를 포함하는 탄소쇄인 것으로 이해되며, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 터셔리 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데카닐 등이다.
용어 "-(C3-C7)-시클로알킬"은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 또는 시클로헵틸과 같은 환상 탄화수소 부분인 것으로 이해된다.
용어 "-(C5-C14)-헤테로사이클"은 부분적으로 또는 완전히 포화된 모노시클릭 또는 비시클릭 5원 내지 14원 헤테로시클릭 고리이다. 헤테로원자의 예는 N, O 및 S 이다. 용어 "-(C5-C14)-헤테로사이클"의 예는 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 이속사졸, 티아졸, 이소티아졸, 테트라졸, 1,2,3,5-옥사티아디아졸-2-옥사이드, 트리아졸론, 옥사디아졸론, 이속사졸론, 옥사디아졸리딘디온, 트리아졸, (F, -CN, -CF3 또는 -C(O)-O-(C1-C4)-알킬에 의해 치환됨), 3-하이드록시피로-2,4-디온, 5-옥소-1,2,4-티아디아졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 인돌, 이소인돌, 인다졸, 프탈라진, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 카르볼린 및 상기 헤테로사이클의 벤즈-아닐레이트화된, 시클로펜타-, 시클로헥사- 또는 시클로헵타-아닐레이티드된 유도체로부터 유래된 부분이다. 특히, 2- 또는 3-피롤릴, 4- 또는 5-페닐-2-피롤릴과 같은 페닐피롤릴, 2-푸릴, 2-티에닐, 4-이미다졸릴, 메틸이미다졸릴, 예를 들면 1-메틸-2, -4- 또는 -5-이미다졸릴, 1,3-티아졸-2-일, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-, 3- 또는 4-피리딜-N-옥사이드, 2-피라지닐, 2-, 4- 또는 5-피리미디닐, 2-, 3- 또는 5-인돌릴, 치환된 2-인돌릴, 예를 들면 1-메틸, 5-메틸, 5-메톡시-, 5-벤질옥시-, 5-클로로- 또는 4,5-디메틸-2-인돌릴, 1-벤질-2- 또는 -3-인돌릴, 4,5,6,7-테트라하이드로-2-인돌릴, 클로로헵타[b]-5-피롤릴, 2-, 3- 또는 4-퀴놀릴, 1-,3- 또는 4-이소퀴놀릴, 1-옥소-1,2-다이하이드로-3-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 2-벤조푸라닐, 2-벤조티에닐, 2-벤족사졸릴 또는 벤조티아졸릴 또는 다이하이드로피리디닐, 피롤리디닐, 예를 들면 2- 또는 3-(N-메틸피롤리디닐), 피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 테트라하이드로티에닐 또는 벤조디옥솔라닐이 바람직하다.
식 I의 바람직한 화합물은, 예를 들어 에틸-4-클로로아세토아세테이트, 메틸아세토아세테이트, 에틸-8-클로로-6-옥소옥탄산, 에틸-3-옥소발레리에이트, 4-하이드록시-2-부타논, 에틸-2-옥소발레리에이트, 에틸-2-옥소-4-페닐부티르산, 에틸피루베이트, 에틸페닐글리옥실레이트, 1-페닐-2-프로파논, 2-클로로-1-(3-클로로페닐)에탄-1-온, 아세토페논, 2-옥타논, 3-옥타논, 2-부타논, 1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]에탄-1-온, 1,4-디클로로-2-부타논, 아세톡시아세톤, 펜아실 클로라이드, 에틸-4-브로모아세토아세테이트, 1,1-디클로로아세톤, 1,1,3-트리클로로아세톤 또는 1-클로로아세톤이다.
일반식 R-CO-CH2-X의 방향족 또는 헤테로방향족 화합물이 특히 바람직한 화합물이며, 여기서 X = 할로겐이고 R은 상기 식 I의 정의에 따른 부분을 나타낸다.
더욱 바람직한 화합물은 2,5-헥산디온, 2,4-펜탄디온, 2,7-옥탄디온, 2,7-디메틸-3,6-옥탄디온 또는 디아세틸과 같은 디케톤이다.
본 발명에 따른 방법에서, 산화환원효소는 완전히 정제된 또는 부분적으로 정제된 상태로 사용될 수 있거나, 또는 방법을 상술한 산화환원효소를 함유하는 세포와 함께 행할 수 있다. 따라서, 사용되는 세포는 원래 상태 그대로, 투과화된 상태 또는 용해된 상태(lysed state)로 제공될 수 있다. 바람직하게는, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 및 그것의 동종체에 따른 복제된 산화환원효소가 각각 사용된다.
전환되는 케토 화합물의 kg 당 산화환원효소 5.000 내지 10 Mio U이 사용된다(상한 없음). 효소 단위 1U은 분당(min) 케토 화합물 1 μmol을 전환시키는데 필요한 효소량에 해당한다.
본 발명에 따른 방법에서, 케토 화합물은 총 부피를 기준으로 3% 내지 50% 범위 양으로 사용되고, 바람직하게는 5% 내지 40% 범위, 특히 10% 내지 30% 범위이다.
본 발명에 따른 방법에서 달성되는 TTN(총 턴오버 수 = 환원된 케토 화합물의 mol/사용한 보조인자의 mol)은 보통 102 내지 105, 바람직하게는 ≥103의 범위이다.
보조인자의 재생을 위해서, 알코올 탈수소효소를 추가적으로 첨가할 수 있고, 바람직하게는 그러나 방법은 오직 산화환원효소로 행한다 (기질-결합 조효소 재생).
효소적 환원을 진행하는 반응 혼합물의 수성 부분은 바람직하게는 완충액, 예컨대 pH가 5 내지 10인, 바람직하기로는 6 내지 9인, 포타슘 포스페이트, 트리스/HCl 또는 트리에탄올아민 완충액을 함유할 수 있다. 또한, 완충액은 효소를 안정화시키거나 또는 활성화시키기 위한 이온, 예컨대 아연 이온 또는 마그네슘 이온을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 행하는 동안, 온도는 적절하게 약 10℃ 내지 70℃, 바람직하게는 20℃ 내지 45℃ 범위이다.
본 발명에 따른 방법의 다른 가능한 실시형태에서, 효소적 전환은 물과 혼화되지 않거나 제한된 정도로 물과 혼화가능하고, 보조인자 재생과 관련되지 않는, 즉 어떤 산화가능한 하이드록시기를 함유하지 않는 유기 용매의 존재하에서 행한다. 상기 용매는 예를 들어 대칭 또는 비대칭 디(C1-C6)알킬 에테르, 직쇄 또는 분기 알칸 또는 시클로알칸일 수 있다. 바람직하게는, 디에틸 에테르, 터셔리 부틸 메틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 헵탄, 헥산, 톨루엔, 디클로로메탄, 시클로헥산 또는 그것의 혼합물이 추가 유기 용매로서 사용된다.
수성상 중의 보조인자 NAD(H)의 농도는 일반적으로 0.001 mM 내지 1 mM, 특히 0.01 mM 내지 0.1 mM 범위이다.
본 발명에 따른 방법에서, 산화환원효소/탈수소효소의 안정화제를 사용할 수도 있다. 적절한 안정화제는 예컨대 글리세롤, 소르비톨, 1,4-DL-디티오트레이톨 (DTT) 또는 디메틸 술폭시드 (DMSO)이다.
효소적 환원은 그 자체로 마일드 조건하에서 진행하여 생성된 알코올이 더 반응하지 않는다. 본 발명에 따른 방법은 긴 사용 기간, 일반적으로 생성된 키랄 알코올의 95%를 초과하는 거울상체 순도 및 사용된 케토 화합물의 양을 기준으로 높은 수율을 갖는다.
본 발명에 따른 방법은 예컨대 유리 또는 금속으로 만들어진 밀폐된 반응 용기에서 행한다. 이 목적을 위해서 성분들은 개별적으로 반응 용기로 옮겨지고 예컨대 질소 또는 공기 분위기하에서 교반한다. 반응 시간은 1시간 내지 48시간, 특히 2시간 내지 24시간 범위이다.
계속해서, 반응 혼합물이 가공된다. 이를 위해서, 수성상은 분리되고 유기상은 여과된다. 선택적으로, 수성상은 다시 한번 추출될 수 있고 유기상과 마찬가지로 추가로 가공될 수 있다. 그 결과, 용매는 여과된 유기상으로부터 선택적으로 증발된다.
하기 실시예에 의해 본 발명은 더욱 상세히 설명되고 종래 기술과 비교하여 확인된 산화환원효소의 예외적인 특성이 설명된다.
실시예 1: 산화환원효소 SEQ ID NO:5의 복제 및 발현
A) Ralstonia eutropha JMP134의 배양
Ralstonia eutropha DSM 4048의 세포를 하기 배지(pH 7.0)에서 30℃에서 박테리아 인큐베이터에서 배양하였다: 0.5% 펩톤, 0.3% 육류(meat) 추출물. 배양 3일째, 세포를 원심분리하여 배양 배지로부터 분리하고 -80℃에서 보관하였다.
B) 선택적 산화환원효소를 암호화하는 유전자의 증폭
Manniatis & Sambrook의 "Molecular Cloning"에 기재된 방법에 따라서 게놈 DNA를 추출하였다(상기 참조). 결과물인 핵산은, NCBI 데이터 베이스에서 53760931 번호로 간행된 유전자 서열로부터 유도된 특이적인 프라이머와 관련된 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 대한 주형으로서 기능했다. 따라서, 발현 벡터로의 후속 클로닝을 위하여 프라이머가 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Xho에 대한 제한 부위를 갖는 5'-말단 위치에 제공되었다.
증폭은 하기 온도 사이클 및 500 ng의 게놈 DNA와 함께 PCR 완충액[10 mM tris-HCl, (pH 8.0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO4; 1 mM dNTP Mix; 20 pMol의 각 프라이머 및 2.5 U의 Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen)] 중에서 행하였다.
사이클 1: 94℃, 2분
사이클 2 x 30: 94℃, 30초
55℃, 30초
68℃, 60초
사이클 3: 68℃, 7분
4℃, ∞
결과물인 약 750 bp의 크기를 갖는 PCR 생성물을, 1% 아가로오스 겔을 통한 상 정제 후 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Xho I로 제한하고, 동일한 엔도뉴클레아제로 처리된 백본(backbone)인, pET21a 벡터(Novagen)의 백본으로 각각 결찰하였다. 2 μl의 결찰 배치를 E.coli Top 10 F' 세포(Invitrogen)로 형질전환 후, 암피실린-내성 콜로니의 플라스미드 DNA를, 각각 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Xho I로 제한 분석(restriction analysis)하여, 750 bp의 크기를 갖는 삽입물의 존재에 대해 테스트하였다. 상기 단편에 대해 양성인 클론으로부터의 플라스미드 제제는 서열 분석을 행하고, 후속적으로 Escherichia coli BL21 Star (Invitrogen)로 형질전환하였다.
실시예 2: E.coli에서 재조합 산화환원효소의 발현
발현 구조체로 형질전환된 각각의 Escherichia coli 균주 BL21 Star (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) 및 RB791(E.coli genetic stock, Yale, USA)을 암피실린 (50 ㎍/ml) 또는 카르베니실린 (50 ㎍/ml)이 각각 첨가된 200ml LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl)에서 550 nm에서 광학밀도가 0.5가 될 때가지 배양하였다. 여기에 이소프로필티오갈락토시드(IPTG)를 0.1mM의 농도로 첨가하여 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 25℃, 220 rpm에서 각각 8시간 및 16시간 유도한 후, 세포를 회수하여 -20 ℃에서 동결시켰다. 활성 테스트를 위해서 세포 10 mg을 500㎕의 100mM TEA 완충액 pH = 7.0 및 500㎕의 글래스 비드와 혼합하고 글로브 밀을 사용하여 10분 동안 분해시켰다. 그 다음 얻어진 용해물을 희석된 상태에서 각 측정에 사용하였다. 활성 테스트는 다음과 같이 구성되었다: 870㎕의 100 mM TEA 완충액 pH 7.0, 160 ㎍ NAD(P)H, 10㎕ 희석된 세포 용해물. 반응 혼합물에 100㎕의 100 mM 기질 용액을 첨가하여 반응을 시작하였다.
본 발명의 산화환원효소는 Escherichia coli에서 매우 효과적으로 발현될 수 있었다. 표 3은 발현에서 얻어진 개별 효소의 활성을 나타낸다.
발현 벡터 발현 균주 참조 활성 U/g
SEQ ID NO:1 pET21a BL21 Star 2-옥타논 2650 U/g
SEQ ID NO:2 pET21a BL21 Star 메틸 아세토아세테이트 1570 U/g
SEQ ID NO:3 pQE70 BL21 Star CLAEE 3130 U/g
SEQ ID NO:4 pET21a BL21 Star 에틸-2-옥소-4-페닐부타노에이트 400 U/g
SEQ ID NO:5 pET21a BL21 Star CLAEE 2890 U/g
SEQ ID NO:6 pQE70 BL21 Star 메틸 아세토아세테이트 840 U/g
SEQ ID NO:7 pET21a BL21 Star 메틸 아세토아세테이트 3295 U/g
실시예 3: 재조합 산화환원효소 SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:7의 특징화
3a: pH-최적
표 4에 열거된 완충액을 제조하였다. 각 완충액 성분의 농도는 각 경우 50 mM이었다.
pH-값 완충액 시스템 pH-값 완충액 시스템
4 Na-아세테이트/아세트산 7.5 KH2PO4/K2PO4
4.5 Na-아세테이트/아세트산 8 KH2PO4/K2PO4
5 Na-아세테이트/아세트산 8.5 KH2PO4/K2PO4
5.5 KH2PO4/K2PO4 9 글리신/NaOH
6 KH2PO4/K2PO4 9.5 글리신/NaOH
6.5 KH2PO4/K2PO4 10 글리신/NaOH
7 KH2PO4/K2PO4 11 글리신/NaOH
배치(30℃)-pH 최적 환원 측정:
표 3에 나타낸 완충액 시스템 각각의 870 ㎕
NADH 10 mM의 20 ㎕
희석 효소의 10 ㎕
약 2 내지 3분의 인큐베이션 후,
기질 용액 (100mM)의 100 ㎕
을 첨가하였다.
각각의 참조 기질 (표 3)은 각 산화환원효소에 대한 기질로서 사용하였다. 반응은 1분 동안 340 nm에서 진행하였다. pH-최적을 결정하기 위해서, 표 4에 열거한 각 완충액에서의 효소적 반응을 결정하였다. 산화 반응에 대한 pH-최적을 결정하기 위해서, 보조인자로서 NAD를 사용하고 기질로서 2-프로판올 또는 2-옥탄올을 사용하였다.
산화환원효소 SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:7에 대한 결과를 표 5에 나타낸다.
SEQ ID NO pH-Opt. Red. pH-Opt. Ox.
SEQ ID NO:1 5.5-6.5 9.0-9.5
SEQ ID NO:2 5.0-5.5 9-10
SEQ ID NO:3 5.5 10-11
SEQ ID NO:4 5.5 9-10
SEQ ID NO:5 7.0-7.5 9.5-10
SEQ ID NO:6 5.5-6.5 7.5
SEQ ID NO:7 5.5 10-11
3b: pH 안정성
표 4에 열거한 완충액 시스템에서 재조합 산화환원효소를 보관함으로써 그들의 안정성을 시험하였다. 이 목적으로 위해서, 상이한 완충액(50mM)을 pH 4 내지 11 범위에서 제조하고, 실시예 4에 따라 제조한 산화환원효소를 그것으로 희석하였다. 인큐베이션의 30, 60 및 120분 후, 배치로부터 10 ㎕을 취하고 실시예 3a에 따라 활성 테스트에서 사용하였다.
이에 의해 포타슘 포스페이트 완충액 50 mM pH = 7.0에서 효소의 희석(1:20) 직후 얻어진 초기값을 측정하였다. 주어진 조건하에서, 상기 값은 약 0.70 /min의 소멸 변화(extinction change)에 해당하였고, 100% 값으로 설정하였다. 모든 후속의 측정값은 이 값과 관련된다.
표 6에서, 효소가 120분의 인큐베이션으로 초기 활성의 50% 이상을 나타내는 pH 범위를 명명된 산화환원효소에 대하여 나타낸다.
SEQ ID NO pH-범위 안정성
SEQ ID NO:1 4.5-9.5
SEQ ID NO:2 7.0-10
SEQ ID NO:3 5.5-11
SEQ ID NO:4 5.5-9.5
SEQ ID NO:5 7.5-11
SEQ ID NO:6 6-11
SEQ ID NO:7 5-11
3c: 온도 최적
최적 테스트 온도를 결정하기 위해서, 본 발명에 따라 사용되는 산화환원효소에 대한 효소 활성을 표준 측정 배치에서 15℃ 내지 70℃ 범위 온도에서 측정하였다.
결정된 온도 최적을 표 7에 나타낸다.
SEQ ID NO T opt
SEQ ID NO:1 55℃
SEQ ID NO:2 65℃
SEQ ID NO:3 n.d
SEQ ID NO:4 n.d
SEQ ID NO:5 45℃
SEQ ID NO:6 50℃
SEQ ID NO:7 45℃
3d: 온도 안정성
실시예 3c에서 설명한 것과 유사한 방법으로, 15℃ 내지 70℃ 범위에서 온도 안정성을 결정하였다. 이 목적을 위해서, 본 발명에 따라 사용된 산화환원효소의 희석액을 각 경우 각각 60분 및 180분 동안 각 온도에서 인큐베이션하고 이어서 상술한 테스트 배치에서 30℃에서 측정하였다. 표 8에서, 효소가 120분의 인큐베이션으로 초기 활성의 50% 이상을 나타내는 온도 범위를 산화환원효소에 대하여 나타낸다.
SEQ ID NO 온도 범위
SEQ ID NO:1 15-45℃
SEQ ID NO:2 15-35℃
SEQ ID NO:3 n.d
SEQ ID NO:4 n.d
SEQ ID NO:5 15-35℃
SEQ ID NO:6 15-35℃
SEQ ID NO:7 15-45℃
3e: 2-프로판올에 대한 안정성
2-프로판올에 대하여 시험하는 산화환원효소의 안정성을 실시예 2에서 (재조합 발현으로부터) 얻어진 용해물을 해당 퍼센트의 2-프로판올(약 10 units/ml 완충액)을 함유하는 완충액(KPP 100 mM, pH=7.0)에 희석하여 테스트하였다. 배치를 실온에서 일정한 전체 혼합(써모믹서(thermomixer), 170 rpm)과 함께 인큐베이션하였다. 24시간 인큐베이션 후, 각 10 ㎕을 수성상으로부터 취하고 표준 테스트 배치(포타슘 포스페이트 완충액 (KPP) 100 mM, pH = 7.0, 0.2 mM NADH, 10 mM 기질)에서 효소 활성의 결정에 사용하였다. 또한 이 경우, 완충액에서의 희석 직후 초기 값을 100%로 설정하고, 모든 다른 값을 여기에 관련시켰다.
2-프로판올을 함유하는 혼합물과 24시간 인큐베이션 후 효소 활성
SEQ ID NO 완충액 10% 2-프로판올 20% 2-프로판올 30% 2-프로판올 40% 2-프로판올
SEQ ID NO:1 100% 100% 100% 100% 30%
SEQ ID NO:2 100% 100% 100% 100% 30%
SEQ ID NO:3 100% 80-100% 50-75% 25-30% 0%
SEQ ID NO:4 100% 80-100% 50-75% 0% 0%
SEQ ID NO:5 100% 100% 100% 100% 0%
SEQ ID NO:6 100% 80-100% 50-75% 50-75% 50-75%
SEQ ID NO:7 100% 80-100% 50-75% 25-30% 25-30%
표 9로부터 알 수 있듯이, 모든 시험한 서열은 2-프로판올에서 놀라운 안정성을 나타내며, 즉 모든 산화환원효소는 20% 이소프로판올에서 적어도 24시간 동안 안정하고, 대부분의 효소는 40% (v/v)에서 24시간 후에도 최대 75%의 실질적인 잔여 활성을 여전히 나타낸다.
이는 서열 SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:7이 기질-결합 방법에서 2-프로판올과 함께 사용하기에 특히 적절하다는 것을 나타낸다.
3f: 산화환원효소 SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:7의 기질 스펙트럼의 비교
특징화할 서열의 기질 스펙트럼을 다수의 케톤 및 알코올로의 산화 및 환원에 대한 효소 활성을 측정함으로써 결정하였다. 이 목적을 위해서, 실시예 2에 따른 표준 측정 배치를 다른 기질과 함께 사용하였다.
메틸 아세토아세테이트와의 활성을 모든 효소에 대한 100%로 설정하였고, 모든 다른 기질을 여기에 관련시켰다.
기질 스펙트럼/환원
기질
 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:7
1-페닐-2-
프로파논		 15% 7% 70% 37% <1% <1% 16%
펜아실 클로라이드 3.4% 1% 50% <1% <1% 15% 10%
아세토페논 3.5% 6% 30% <1% <1% 3.5% 32%
아세토나프톤 3% 9% 30% 7% <1% 25% 17%
부티로페논 3% 1% < % <1% <1% <1% <1%
2-옥타논 92% 2% 33% 70% 26% 23% 49%
3-옥타논 22% 2% 15% 5% 13% 2% 15%
2-부타논 8.5% 4.5% 30% 5% <1% 7% 6%
에틸-2-옥소발레레이트 3% 60% 70% 17% <1% 15% <1%
에틸-2-옥소-
4-페닐 부티르산		 3% 50% 118% 35% 45% 18% 10%
에틸 피루베이트 140% 70% 100% 64% 13% 116% 160%
에틸 페닐 글리옥실레이트 4.8% 53% 7.5% 3% <1% <1% <1%
에틸-4-클로로-아세토아세테이트 12.5% 20% 21% 100% 50% 10% <1%
메틸 아세토아세테이트 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%
에틸-3-옥소발레레이트 3.5% 30% 76% 11% <1% 10% 12%
아세톤 4.5% 16% 38% 5% <1% 3.5% 8%
선택한 기질에 대하여 거울상체 초과량을 결정하였다. 이를 위해 하기 반응 배치를 사용하였다:
·160㎕ 완충액
·100㎕ NAD (0.4 mg/ml)
·20-50 ㎕ 2-프로판올
·50 ㎕ 효소 용액
·2 mg 기질
·반응 조건: 28℃, 24h
인큐베이션 기간의 종료시, 기질에 따라 용매로 시료를 추출하고 원심분리하였다. 하나의 분획을 선정하고, 선택적으로, 추출제를 완전히 제거하고, 이어서, 시료를 적절한 용매에 용해하고 거울상체 초과량을 GC로 결정하였다.
선택된 기질에 대한 거울상선택성
기질
 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:7
펜아실 클로라이드 ≥99.9% S ≥99.9% S ≥99.9% S 97.5% S 60-80% S ≥99.9% S ≥99.9% S
아세토페논 99.0% R 98.5% R 99.0% R 99.0% R 98.5% R
2-펜타논 ≥99.9% R 98% R 98% R 95% R 99.0% R 97% R 99.5% R
2-옥타논 ≥99.9% R ≥99.9% R ≥99.9% R ≥99.9% R ≥99.9% R ≥99.9% R ≥99.9% R
2-부타논 ≥96.0% R n.d n.d n.d n.d rac 50% R
에틸 피루베이트 98.0% R ≥99.9% R ≥99.9% R ≥99.9% R ≥99.9% R ≥99.9% R ≥99.9% R
에틸-4-클로로-아세토아세테이트 99.0% S ≥99.9% S ≥99.9% S ≥99.9% S ≥99.9% S ≥99.9% S ≥99.9% S
메틸 아세토아세테이트 ≥99.9% R ≥99.9% R ≥99.9% R 98.5% R ≥99.9% R ≥99.9% R ≥99.9% R
"rac": 미선택적 환원, 즉 두 거울상체가 거의 동일한 비율로 형성됨.
n.d = 결정하지 않음, 전환 없음.
거울상 초과량은 하기와 같이 계산하였다:
ee(%) = ((R-알코올 - S-알코올)/(R-알코올 + S-알코올)) x 100.
산화에 대한 상술한 산화환원효소의 잠재력 및 따라서 재생에 대한 적합성은 하기 활성 테스트를 사용하여 비교하였다: 870 ㎕의 100 mM TEA 완충액, pH 8.0, 160 ㎍ NAD, 10 ㎕ 희석된 세포 용해물. 반응 혼합물에 100 ㎕의 100 mM 기질 용액을 첨가함으로써 반응을 시작하였다.
이 경우, 가장 높은 활성을 갖는 기질을 100%로 설정하였다.
기질 스펙트럼/산화
기질 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6* SEQ ID NO:7
S-2-옥탄올 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
R-2-옥탄올 100% 31% 100% 100% 100% 100% 100%
S-2-부탄올 1% 20% 30% 2% 2.5% <2% 0%
R-2-부탄올 3% 100% 58% 18% 14% 60% 50%
S-페닐-2-프로판올 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
R-페닐-2-프로판올 <1% 20% 50% 2% 25% 0% 50%
2-메틸-4-펜탄올 <1% 20% 10% 1% 2.5% 0% 0%
2-프로판올 1.6% 20% 100% 7% 7% 60% 20%
시클로헥산올 0% 20% 0% 0% 0% 0% 0%
*산화가 거의 검출되지 않음
표 10-12로부터 볼 수 있듯이, 모든 7개 서열은 명백히 R-특이적 산화환원효소이다. 그러나, 시험한 효소는 바람직한 기질의 스펙트럼 및 산화 거동이 명백히 다르다. 그 차이는 장쇄 카르보닐 화합물에 대한 저분자 기질보다는 단쇄에 대한 선호와 관련되어 발생하고, 유사하게 상이한 방향족 시스템 또는 상이한 치환체(예컨대 할로겐)는 상이한 정도로 용인된다.
따라서 원칙적으로 유사한 반응을 사실상 촉매하는 다양한 효소가 이용가능하지만, 타겟 반응을 매우 효과적으로 촉매하는 효소와 타겟 반응을 전혀 촉매하지 않는 효소 모두를 이들 개별 기질 중에서 발견할 수 있다는 것을 발견하였다.
또한, 거울상선택성의 차이는 처음에는 사실상 경미한 것으로 보이지만 ee>99.0-99.9%의 특이성이 주어진 특이적 환원 방법에 대한 개별 효소의 적용성에 대해서는 전적으로 결정적일 수 있다는 것이 관찰되며, 이것은 현재 약학 용도에 일반적이다.
또한, 산화 특성 및 따라서 기질-결합 조효소 재생이 있는 상이한 방법에서의 적용성은 시험한 효소들 간에 뿐만 아니라 종래 기술과 비교해서 다양하다.
따라서, 본 발명에 따른 방법에서 명명된 산화환원효소의 용도는 확립된 종래 기술에 대안적인 동등물을 나타내지 않지만, 현존하는 스펙트럼의 확장이다.
실시예 4: 특이적 방법에서 산화환원효소 SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:7의 비교
하기 열거한 실시예를 기반하여, 효소 SEQ ID NO:1 내지 7이 현존하는 종래 기술을 명백히 능가하는 구체적인 문제에 대한 특별한 해법을 제공할 수 있는 몇몇의 특이적 방법에 대하여 나타낸다.
4.a 3,6-옥탄디온의 R,R-3,6-옥탄디올로의 환원
3,6-옥탄디온을 R,R-3,6-옥탄디올로 환원하기 위한 기질-결합 조효소 재생이 있는 방법의 개발을 위한 적절한 효소에 대한 스크리닝을 목적으로, 모든 효소를 하기 반응 배치에서 시험하였다:
450 ㎕ 완충액, pH =7.0
0.05 mg NAD
50 ㎕ 2-프로판올
10 mg 3,6-옥탄디온
25℃에서 24시간 인큐베이션 후, 디클로로메탄을 사용하여 시료를 추출하고 GC로 분석했다.
표 13에, 전환 및 얻어진 반응 생성물을 나타낸다.
SEQ ID NO 3,6-옥탄디온 한번 환원된 생성물 (S) 한번 환원된 생성물 (R) S,S-3,6-옥탄디올 R,R-3,6-옥탄디올
SEQ ID NO:1 95% 0% 5% 0% 0%
SEQ ID NO:2 3% 0% 17% 0% 80%
SEQ ID NO:3 10% 0% 45% 0% 45%
SEQ ID NO:4 76% 0% 24% 0% 0%
SEQ ID NO:5 95% 0% 5% 0% 0%
SEQ ID NO:6 24% 0% 59% 0% 17%
SEQ ID NO:7 43% 0 47% 0 10%
WO 2007/012428
Pichia farinosa 		85% 0% 15% 0% 0%
WO 2007/012428
Candida nemodendra 		95% 0% 5% 0% 0%
EP 1179 595 A1
Pichia finlandica 		3% 0% 17% 0% 80%
WO 2004/027055
Devosia 		40% 0% 50% 0% 10%
표 13으로부터 알 수 있듯이, 사용가능한 효소 중에서, 상술한 반응 조건하에서 3,6-옥탄디온을 원하는 R,R-옥탄디올로 매우 잘 환원할 수 있는 것 (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 및 P.finlandica), 실제로 기질을 전혀 수용하지 않는 것 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5 및 C. nemodendra) 및 한번 환원된 화합물을 생성하도록 의도하였다면 바람직하게 사용할 수 있는 것 (SEQ ID NO:4)을 발견할 수 있다.
4.b 2,7-디메틸-3,6-옥탄디온의 (S,S)-2,7-디메틸 옥탄-3,6-디올로의 환원
2,7-디메틸-3,6-옥탄디온을 (S,S)-2,7-디메틸 옥탄-3,6-디올로 환원하기 위한 기질-결합 조효소 재생이 있는 방법을 위한 적합한 효소를 스크리닝할 목적으로, 하기 반응 배치에서 효소를 시험하였다:
450 ㎕ 완충액, pH =7.0
0.05 mg NAD
50 ㎕ 2-프로판올
10 mg 2,7-디메틸-3,6-옥탄디온
25℃에서 24시간 인큐베이션 후, 디클로로메탄을 사용하여 시료를 추출하고 GC로 분석하였다.
표 14에서, 전환율 및 얻어진 반응 생성물을 나타낸다.
SEQ ID NO 2,7-디메틸-3,6-옥탄디온 메조 (S,S)-2,7-디메틸 옥탄-3,6-디올 (R,R)-2,7-디메틸-3,6-옥탄디올
SEQ ID NO:1 100% 0% 0% 0%
SEQ ID NO:2 23% 0 77% 0%
SEQ ID NO:3 100% 0% 0% 0%
SEQ ID NO:4 100% 0% 0% 0%
SEQ ID NO:5 100% 0% 0% 0%
SEQ ID NO:6 100% 0% 0% 0%
SEQ ID NO:7 100% 0% 0% 0%
WO 2007/012428
Pichia farinosa 		100% 0% 0% 0%
WO 2007/012428
Candida nemodendra 		100% 0% 0% 0%
EP 1179 595 A1
Pichia finlandica 		100% 0% 0% 0%
WO 2004/027055
Devosia 		100% 0% 0% 0%
표 14로부터 알 수 있듯이, SEQ ID NO:2는 이 특이적 문제에 대한 해법을 제공하며, 그에 반해 종래 기술로부터의 효소는 원하는 반응을 촉매하지 않는다.
4.c 2,4-펜탄디온의 R,R-2,4-펜탄디올로의 환원
2,4-펜탄디온을 R,R-2,4-펜탄디올로 환원하기 위한 기질-결합 조효소 재생이 있는 프로세스를 위한 적합한 효소를 스크리닝할 목적으로, 하기 반응 배치에서 효소를 시험하였다:
450 ㎕ 완충액, pH =7.0
0.05 mg NAD
50 ㎕ 2-프로판올
10 mg 2,4-펜탄디온
25℃에서 24시간 인큐베이션 후, 디클로로메탄을 사용하여 시료를 추출하고 GC로 분석하였다.
표 15에서, 전환율 및 얻어진 반응 생성물을 나타낸다.
SEQ ID NO 2,4-펜탄디온 한번 환원된 화합물 (R) (S,S)-2,4-펜탄디올 (R,R)-2,4-펜탄디올
SEQ ID NO:1 0% 70% 0% 30%
SEQ ID NO:2 0% 19% 0% 81%
SEQ ID NO:3 2% 95% 0% 3%
SEQ ID NO:4 6% 93% 0% 1%
SEQ ID NO:5 60% 40% 0% 0%
SEQ ID NO:6 100% 0% 0% 0%
SEQ ID NO:7 7% 91% 0% 2%
WO 2007/012428
Pichia farinosa 		100% 0% 0% 0%
WO 2007/012428
Candida nemodendra 		55% 45% 0% 0%
EP 1179 595 A1
Pichia finlandica 		30% 70% 0% 0%
WO 2004/027055
Devosia 		43% 57% 0% 0%
표 15로부터 볼 수 있듯이, 2,4-펜탄디온의 R,R-2,4-펜탄디올로의 전환은 산화환원효소 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2로 가능하다. 대부분의 효소는 이 기질을 단일-환원 화합물로에 한하여 전환한다. 종래 기술은 이에 대한 해법을 제공하지 않는다.
한편, 단일-환원 화합물의 효과적인 회수를 위해서, 산화환원효소 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:7은 종래 기술보다 더욱 추천할 수 있다.
4.e 1,1,1-트리플루오로아세톤의 R-1,1,1-트리플루오로프로판올로의 환원
1,1,1-트리플루오로아세톤을 R-1,1,1-트리플루오로프로판올로 재생하기 위한 기질-결합 조효소 재생이 있는 방법을 위한 적합한 효소를 스크리닝할 목적으로, 하기 나타낸 반응 배치에서 효소를 시험하였다:
그렇게 해서, 반응 배치는 이 매우 휘발성인 기질의 가공 및 전환에 이루어지는 특정 요구를 설명한다. 이 경우, 사실상 이소프로판올로의 재생은 불가능하고, 한편으로 휘발성 기질 (bp = 22℃)이 반응 동안 빠져 나가는 것을 방지하고 또 다른 한편으로는 반응 생성물 R-1,1,1-트리플루오로프로판올 (bp =80℃)의 리프로세싱을 가능하게 하기 위해 메틸 펜탄올의 사용이 바람직하다. (2-프로판올의 분리는 동일한 비점때문에 불가능할 수 있다.)
450 ㎕ 완충액, pH =7.0
0.05 mg NAD
500 ㎕ 2-메틸-4-펜탄올
20 ㎕ 1,1,1-트리플루오로아세톤
25℃에서 24시간 인큐베이션 후, 시료를 GC로 분석하였다.
표 16에서, 전환율 및 얻어진 반응 생성물을 나타낸다.
SEQ ID NO 1,1,1-트리플루오로아세톤 R-1,1,1-트리플루오로프로판올 S-1,1,1-트리플루오로프로판올
SEQ ID NO:1 0% 99% 1%
SEQ ID NO:2 20% 60% 40%
SEQ ID NO:3 2% 70% 30%
SEQ ID NO:4 15% 80% 20%
SEQ ID NO:5 50% 85% 15%
SEQ ID NO:6 n.d n.d n.d
SEQ ID NO:7 n.d n.d n.d
WO 2007/012428
Pichia farinosa 		0% 97% 3%
WO 2007/012428
Candida nemodendra 		50% 99% 1%
EP 1179 595 A1
Pichia finlandica 		50% 99% 1%
WO 2004/027055
Devosia 		n.d n.d n.d
표 16으로부터 볼 수 있듯이, 이 경우, 산화환원효소 SEQ ID NO:1은 전환율과 선택성 사이에 최적 타협을 제공한다. 놀랍게도, 대부분의 효소는 이 기질을 만족스러운 거울상선택성으로 모두 환원시키지 않고, 이에 의해 기본적으로 동일한 기능성에도 불구하고 설명한 효소의 다양성이 다시 강조된다.
4.f 2-클로로-1-(3-하이드록시페닐)에탄-1-온의 (1S)-2-클로로-1-(3-하이드록시페닐)에탄-1-올로의 환원
2-클로로-1-(3-하이드록시페닐)에탄-1-온의 (1S)-2-클로로-1-(3-하이드록시페닐)에탄-1-올로의 환원을 위한 기질-결합 조효소 재생이 있는 방법을 위한 적합한 효소에 대하여 스크리닝할 목적으로, 하기 반응 배치에서 효소를 시험하였다:
400 ㎕ 완충액, pH =7.0
0.02 mg NAD
100 ㎕ 2-프로판올
25 mg 2-클로로-1-(3-하이드록시페닐)에탄-1-온
25℃에서 24시간의 인큐베이션 후, 시료를 추출하고 GC로 분석하였다.
표 17에서, 전환율 및 얻어진 반응 혼합물을 나타낸다.
SEQ ID NO 2-클로로-1-(3-하이드록시페닐)에탄-1-온 (1R)-2-클로로-1-(3-하이드록시페닐)에탄-1-올 (1S)-2-클로로-1-(3-하이드록시페닐)에탄-1-올
SEQ ID NO:1 100% n.d n.d
SEQ ID NO:2 55% 0% 45%
SEQ ID NO:3 40% 0% 60%
SEQ ID NO:4 99% n.d n.d
SEQ ID NO:5 100% n.d n.d
SEQ ID NO:6 25% 0% 75%
SEQ ID NO:7 83% 0% 17%
WO 2007/012428
Pichia farinosa 		100% n.d n.d
WO 2007/012428
Candida nemodendra 		100% n.d n.d
EP 1179 595 A1
Pichia finlandica 		98% n.d n.d
WO 2004/027055
Devosia 		100% n.d n.d
표 17로부터 볼 수 있듯이, 2-클로로-1-(3-하이드록시페닐)에탄-1-온의 (1S)-2-클로로-1-(3-하이드록시페닐)에탄-1-올로의 전환은 기본적으로 산화환원효소 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:7로 가능하고, 이들 효소는 기질을 전적으로 선택적으로 전환한다. 종래 기술로부터의 효소는 이 특정 기질을 환원할 수 없다.
4.g 에틸-4-클로로아세토아세테이트의 (S)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 환원
하기에서, 시험할 효소 SEQ ID NO:1-7을 에틸-4-클로로아세토아세테이트의 (S)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 환원을 위한 산업 방법에서 테스트하고 종래 기술과 비교한다.
이 목적을 위해서, 종래 기술 (WO 2006/087235)에 따라 기질 에틸-4-클로로아세토아세테이트를 높은 농도 (200 g/l)로 사용하였고, 2-프로판올과의 기질-결합 재생이 있는 방법에서 효소의 효과를 비교하였다.
600 ㎕ 완충액, pH =8.0
0.2 mg NAD
200 ㎕ 2-프로판올
200 ㎕ 에틸-4-클로로아세토아세테이트
240 ㎕ 효소 재조합 E.coli (20-60 유닛)로부터
25℃에서 24시간의 인큐베이션 후, 샘플을 추출하고 GC로 분석하였다.
표 18에서, 전환율 및 얻어진 반응 생성물을 나타낸다.
SEQ ID NO 에틸-4-클로로아세토아세테이트 (S)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부티레이트 (R)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부티레이트
SEQ ID NO:1 90% 10% 0%
SEQ ID NO:2 0% 100% 0%
SEQ ID NO:3 0% 100% 0%
SEQ ID NO:4 70% 30% 0%
SEQ ID NO:5 85% 15% 0%
SEQ ID NO:6 60% 40% 0%
SEQ ID NO:7 75% 25% 0%
WO 2007/012428
Pichia farinosa 		100% n.d n.d
WO 2007/012428
Candida nemodendra 		100% n.d n.d
EP 1179 595 A1
Pichia finlandica 		80% 20% 0%
WO 2004/027055
Devosia 		75% 25% 0%
표 18로부터 볼 수 있듯이, 특히 효소 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3은 현존하는, 대개 NADPH-의존적 방법에 대안으로 NADH-의존적 방법을 제공하며, 이 대안은 에틸-4-클로로아세토아세테이트의 (S)-에틸-4-클로로-3-하이드록시부티레이트로의 환원에 관심이 있다. 반대로, 종래 기술로부터의 효소는 각각 방법 조건하에서 단지 불충분한 전환을 나타내거나 전혀 전환을 나타내지 않기 때문에 부적합하다.
SEQUENCE LISTING <110> IEP GmbH <120> Process for the Stereoselective Enzymatic Reduction of Keto Compounds <130> <160> 14 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 247 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 1 Met Lys Leu Lys Asp Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly Ala Ser Gly 1 5 10 15 Ile Gly Glu Ser Thr Val Arg Leu Phe Ile Glu Glu Gly Ala Lys Val 20 25 30 Val Ile Ala Asp Phe Ser Glu Arg Gly Lys Glu Leu Ser Asp Glu Leu 35 40 45 Asn Ala His Gly Tyr Asn Thr Leu Phe Ile Lys Thr Asp Val Thr Lys 50 55 60 Glu Ala Asp Ile Lys Gln Leu Ile His Glu Thr Val Ser Thr Tyr Gly 65 70 75 80 Lys Leu Asp Ile Met Tyr Ala Asn Ala Gly Val Ala Asp Asp Ala Pro 85 90 95 Ala Asn Glu Leu Ser Tyr Glu Lys Trp Lys Arg Thr Ile Asp Ile Asn 100 105 110 Leu Ser Gly Val Phe Leu Ser Asp Lys Tyr Ser Ile Glu Gln Phe Leu 115 120 125 Lys Gln Gly Thr Gly Gly Val Ile Val Asn Ala Gly Ser Ile His Ser 130 135 140 Phe Val Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ala Tyr Ser Ser Ala Lys Gly Gly 145 150 155 160 Val Lys Leu Leu Thr Gln Asn Leu Cys Thr Ala Tyr Ala Lys Tyr Gly 165 170 175 Ile Arg Ile Asn Ala Val Cys Pro Gly Tyr Ile Asp Thr Pro Leu Leu 180 185 190 Gly Ser Val Asn Pro Gln Gln Lys Glu Tyr Leu Ala Ser Leu His Pro 195 200 205 Gln Gly Arg Leu Gly Thr Pro Glu Glu Val Ala Lys Ala Val Leu Phe 210 215 220 Leu Ala Ser Asp Asp Ala Ser Phe Val Asn Gly Thr Thr Leu Leu Val 225 230 235 240 Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Arg 245 <210> 2 <211> 257 <212> PRT <213> Methylibium petroleiphilum <400> 2 Met Gly Arg Val Asp Asn Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Gly Ala Lys 1 5 10 15 Gly Ile Gly Arg Ala Ser Ala Leu Met Leu Ala Arg Glu Gly Ala Arg 20 25 30 Val Val Leu Thr Asp Val Glu Glu Ala Gln Gly Ser Ala Val Ala Lys 35 40 45 Glu Ile Glu Arg Ala Gly Gly Lys Ala Leu Phe Leu Thr Gln Asp Val 50 55 60 Thr Asp Glu Ser Arg Trp Val Glu Val Val Glu Lys Ala Arg Ala Gln 65 70 75 80 Phe Gly Gly Leu Asn Ile Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Thr Ala 85 90 95 Gly Ser Ala Glu Asp Glu Thr Leu Glu Ala Trp Arg Arg Leu Met Ser 100 105 110 Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Lys His Ala Ile Arg Ala 115 120 125 Met Lys Asn Gly Pro Gly Thr Gly Ser Ile Ile Asn Ile Ser Ser Ile 130 135 140 Glu Gly Ile Val Ala Asp Pro Lys Leu Ala Ser Tyr Asn Ala Ser Lys 145 150 155 160 Gly Gly Val Arg Ile Phe Ser Lys Ser Ala Ala Leu His Cys Ala Gln 165 170 175 Ala Gly Tyr Arg Ile Arg Val Asn Thr Ile His Pro Gly Tyr Ile Trp 180 185 190 Thr Pro Met Val Glu Gly Tyr Leu Thr Ser Leu Gly Asp Val Glu Gly 195 200 205 Gly Arg Gln Val Ile Ser Lys Met His Pro Ile Gly Arg Met Gly Glu 210 215 220 Pro Asp Asp Ile Ala Tyr Gly Val Leu Tyr Leu Gly Ser Asp Glu Ser 225 230 235 240 Ser Phe Met Thr Gly Ser Glu Leu Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Ala 245 250 255 Gln <210> 3 <211> 251 <212> PRT <213> Mezorhizobium sp. <400> 3 Met Thr Gly Glu Phe Lys Asp Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ile Gly Ala Ala Ile Ala Arg Glu Leu Ala Thr Gly Gly Ala 20 25 30 Glu Leu Val Val Ala Asp Leu Glu Arg Glu Ser Ala Asn Arg Ile Val 35 40 45 Glu Gly Ile Arg Ala Ser Gly Gly Arg Ala His Ala Phe Ala Val Asp 50 55 60 Val Ala Asp Ala Glu Ala Val Glu Arg Met Val Asp Phe Ala Val Arg 65 70 75 80 Thr Cys Gly Asp Leu His Leu Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly 85 90 95 Pro Ser Glu Pro Thr Ala Asp Tyr Pro Leu Asp Gly Trp Arg Lys Val 100 105 110 Ile Asp Val Asn Leu Asn Gly Val Phe Tyr Gly Met Lys Tyr Glu Ile 115 120 125 Ala Ala Ile Leu Lys Ser Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser 130 135 140 Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Ala Cys Ala Tyr Val Ser Ala 145 150 155 160 Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Lys Thr Ala Ala Met Glu Tyr Ala 165 170 175 Ala Gln Gly Val Arg Ile Asn Ala Val Gly Pro Ala Phe Ile Asp Thr 180 185 190 Pro Leu Leu Ser Lys Asn Leu Asp Asp Gln Val Leu Gly Gln Leu Ala 195 200 205 Gly Leu His Pro Ile Gly Arg Leu Gly Thr Pro Glu Glu Val Ser Ala 210 215 220 Leu Thr Cys Phe Leu Leu Ser Gly Arg Ala Ser Phe Ile Thr Gly Ser 225 230 235 240 Tyr His Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Thr Arg 245 250 <210> 4 <211> 263 <212> PRT <213> Streptomyces coelicolor <400> 4 Met Ser Thr Thr Gly Thr Thr Pro Ala Thr Thr Gly Tyr Ala Ala Glu 1 5 10 15 Phe Ala Gly Arg Thr Ala Leu Val Thr Gly Ala Ala Ser Gly Ile Gly 20 25 30 Leu Ala Thr Ala Arg Arg Leu Gly Ala Gly Gly Ala Arg Val Val Val 35 40 45 Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Ala Glu Lys Ala Ala Ala Glu Leu Arg 50 55 60 Ala Gly Gly Val Glu Ala Ala Ala Val Glu Leu Asp Val Thr Arg Pro 65 70 75 80 Glu Ser Val Glu Ala Ala Val Gly Phe Ala Val Asp Thr Phe Gly Ser 85 90 95 Leu Asp Leu Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly Pro Ser Ala Pro 100 105 110 Thr Gly Glu Tyr Asp Val Ala Ala Tyr Gln Arg Val Val Arg Thr Asn 115 120 125 Leu Asp Gly Val Phe Tyr Ser Met Arg Tyr Glu Leu Pro Ala Ile Glu 130 135 140 Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ser Ile Val Asn Val Ala Ser Ile Leu Gly 145 150 155 160 Ser Val Gly Phe Ala Gly Ser Pro Ala Tyr Val Ala Ala Lys His Gly 165 170 175 Val Val Gly Leu Thr Lys Ala Ala Ala Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Gly 180 185 190 Ile Arg Ile Asn Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Asp Thr Pro Leu Leu 195 200 205 Lys Thr Met Asp Glu Ala Ala Tyr Lys Gly Leu Val Ala Leu His Pro 210 215 220 Ala Gly Arg Leu Gly Arg Ser Glu Glu Val Ala Glu Leu Ile Ala Phe 225 230 235 240 Leu Leu Ser Asp Arg Ala Ser Phe Val Ala Gly Ser Tyr His Leu Val 245 250 255 Asp Gly Ala Tyr Thr Ala Val 260 <210> 5 <211> 253 <212> PRT <213> Ralstonia eutropha <400> 5 Met Glu Tyr Ile Asp Met Lys Leu Lys Asp Lys Val Ala Ile Val Thr 1 5 10 15 Gly Gly Ala Ser Gly Ile Gly Glu Ala Thr Val Arg Leu Phe Ala Ser 20 25 30 Gln Gly Ala Ser Val Val Ile Ala Asp Arg Ser Ala Leu Gly Glu Lys 35 40 45 Leu Ala Arg Glu Leu Ser Glu Ser Ser Leu Ala Ala His Tyr Ser Glu 50 55 60 Val Asp Val Ser Arg Glu Asp Asp Thr Arg Arg Leu Ile Asp Asp Thr 65 70 75 80 Val Ser Arg Phe Gly Arg Leu Asp Ile Met Val Ala Asn Ala Gly Ile 85 90 95 Ala His Pro Ser Ala Pro Val Glu Asp Val Ser Val Glu Gln Trp Gln 100 105 110 Gln Met Ile Asp Val Asn Leu Thr Gly Val Phe Leu Ser Asn Lys Leu 115 120 125 Ala Ile Val Gln Met Lys Lys Gln Gly Thr Gly Gly Ala Ile Val Asn 130 135 140 Met Ala Ser Ile Leu Gly His Val Gly Met Pro Gly Ala Ala Ser Tyr 145 150 155 160 Asn Ala Ala Lys Gly Gly Val Val Asn Leu Thr Arg Ser Leu Gly Val 165 170 175 Ser His Ala Gln Asp Gly Ile Arg Val Asn Ala Val Cys Pro Gly Phe 180 185 190 Val Ala Thr Pro Leu Ile Glu Arg Ala Thr Glu Glu Ala Arg Ala Arg 195 200 205 Leu Val Ala Ala His Pro Ile Gly Arg Leu Gly His Ala Asp Glu Val 210 215 220 Ala Lys Ala Val Leu Phe Leu Ala Ser Asp Asp Ala Ser Phe Ile Val 225 230 235 240 Gly Thr Ser Leu Met Val Asp Gly Gly Tyr Cys Ala Gln 245 250 <210> 6 <211> 252 <212> PRT <213> Herpentosiphon aurantiacus <400> 6 Met Asn Gln Tyr Asp Phe Arg Gly Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Ser Gly Ile Gly Ala Ala Cys Val His Thr Phe Ala Arg Gly Gly 20 25 30 Ala Lys Val Ala Ile Val Asp Arg Asn Gln Asp Leu Gly Ala Gln Thr 35 40 45 Val Ala Ala Val Arg Glu Ala Gly Gly Asp Ala Ile Phe Leu Pro Val 50 55 60 Asp Val Ala Gln Ser Gly Ala Val Glu Ala Met Val Thr Asp Thr Ile 65 70 75 80 Thr Ala Phe Gly Gln Leu Asp Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly 85 90 95 Gly Glu Ser Asn Pro Thr Gly Thr Tyr Ser Ile Glu Gly Trp Gln Thr 100 105 110 Val Ile Asp Val Asn Leu Asn Gly Val Phe Tyr Cys Met Arg Tyr Glu 115 120 125 Ile Pro Ala Met Leu Ala Gln Gly Gly Gly Val Ile Val Asn Met Ala 130 135 140 Ser Ile Leu Gly Thr Val Gly Phe Ala Ser Ser Pro Ala Tyr Val Ala 145 150 155 160 Ala Lys His Ala Val Val Gly Leu Thr Lys Ala Ala Ala Leu Asp Tyr 165 170 175 Gly Arg Gln Gly Leu Arg Ile Asn Ser Val Gly Pro Gly Phe Ile Lys 180 185 190 Thr Pro Leu Leu Asp Gly Gly Leu Asp Asp Gln Thr Gln Thr Tyr Leu 195 200 205 Ser Gly Leu His Ala Val Gly Arg Met Gly Glu Ser Ala Glu Val Ala 210 215 220 Ala Leu Val Ala Phe Leu Cys Ser Ala Glu Ala Ser Phe Leu Thr Gly 225 230 235 240 Gly Tyr Tyr Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln 245 250 <210> 7 <211> 249 <212> PRT <213> Paracoccus denitrificans <400> 7 Met Asp Ile Arg Phe Asp Asn Lys Ile Ala Leu Val Thr Gly Ala Gly 1 5 10 15 Ser Gly Leu Gly Glu Ala Ile Ala Leu Glu Leu Ala Ala Ser Gly Ala 20 25 30 Thr Val Val Ala Ala Asp Leu His Glu Ala Thr Ala Arg Ala Thr Ala 35 40 45 Asp Arg Ile Val Ala Ala Gly Gly Lys Ala Lys Ala Val Ala Gly Asp 50 55 60 Val Ser Asp Pro Asp Ala Val Arg Lys Ala Val Glu Val Ala Lys Gly 65 70 75 80 Leu Gly Gly Leu His Leu Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly Pro 85 90 95 Ser Ala Pro Val Gly Asp Tyr Pro Leu Asp Gly Trp Lys Lys Val Ile 100 105 110 Asp Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Arg Tyr Gly Ile Pro 115 120 125 Ala Met Leu Asp Ala Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser Ile 130 135 140 Leu Gly Ser Val Gly Phe Asn Gly Ala Gly Ala Tyr Val Ser Ala Lys 145 150 155 160 His Ala Val Val Gly Met Thr Lys Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala Gln 165 170 175 Lys Gly Ile Arg Val Asn Ser Val Gly Pro Ala Phe Ile Asp Thr Pro 180 185 190 Leu Leu Asp Gln Leu Asp Ser Asp Thr Arg Gln Ala Leu Val Gly Arg 195 200 205 His Pro Ile Gly Arg Leu Gly Arg Ala Asp Glu Val Ala Gly Leu Val 210 215 220 Val Phe Leu Leu Ser Asp Arg Ala Ser Phe Ile Thr Gly Ser Tyr His 225 230 235 240 Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Leu 245 <210> 8 <211> 744 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 8 atgaaattaa aagacaaagt agcaatcata actggtggtg caagtggaat tggcgaatct 60 actgttcgtc tttttatcga agaaggtgca aaagtagtta ttgctgactt ttctgaacgt 120 ggaaaagaac tatcagatga attgaatgca catggatata atacgttatt tattaaaacc 180 gatgtaacaa aagaggcaga tattaaacag ctaattcatg agacagtaag tacatacggt 240 aaattagata ttatgtatgc caatgccggc gttgctgatg atgcaccggc aaacgaatta 300 tcctatgaaa agtggaaaag aactattgat attaatttgt ctggggtatt cctttctgat 360 aaatattcga ttgaacaatt tcttaaacaa ggtacaggtg gtgtcatcgt taacgctggt 420 tcgattcata gttttgtttc attacctaca ccaacagcat actcctctgc aaaaggtggt 480 gtgaaactat taactcaaaa tttatgtact gcctacgcta aatatggaat acgtattaac 540 gcggtgtgcc ctggttatat tgacacccct ttactaggta gtgttaatcc tcaacagaaa 600 gaatatttag cttcacttca tccacaaggc agacttggaa caccagaaga agtcgctaaa 660 gctgtcttat ttttagcaag tgatgatgct agttttgtta acggcacaac acttcttgtt 720 gatggaggct atactgcacg ttaa 744 <210> 9 <211> 774 <212> DNA <213> Methylibium petroleiphilum <400> 9 atgggacgtg tggacaacaa ggtggcgctg gtgaccggtg gtgccaaggg catcggccgg 60 gccagcgcac tgatgctggc gcgcgaaggt gcccgcgtgg tgctgaccga cgtggaagag 120 gcgcagggca gcgcggtggc gaaggagatc gagcgcgccg gcggcaaggc gctgttcctc 180 acgcaggacg tgaccgacga gagccgctgg gtcgaggtgg tcgagaaggc ccgcgcgcag 240 ttcggcggcc tgaacatcgt cgtcaacaac gccggcatcg gcaccgctgg cagcgccgag 300 gacgagacgc tggaggcctg gcgccgcctg atgtccgtca acctcgacgg cgtcttcctc 360 ggcaccaagc acgcgatccg ggcgatgaag aacgggcccg gcacgggctc gatcatcaac 420 atctcgtcga tcgagggcat cgtcgccgac cccaagctcg cgtcctacaa cgccagcaag 480 ggcggcgtgc gcatcttctc gaagtcggcg gcactgcatt gcgcgcaggc gggctaccgc 540 atccgggtta acaccatcca tccgggctac atctggacgc cgatggtcga aggctatctg 600 accagcctcg gcgatgtcga gggtgggcgc caggtcatct cgaagatgca cccgatcggg 660 cggatgggtg agcccgacga catcgcctac ggtgtgctct acctgggctc cgacgagtcc 720 tcgttcatga cgggcagcga gctggtcatc gacggcggct acaccgcgca atag 774 <210> 10 <211> 756 <212> DNA <213> Mesorhizobium sp. <400> 10 atgactggtg aattcaagga caaggttgcg ctcgtcacag gagccggctc ggggataggg 60 gccgcaatcg ctcgcgaact ggccacagga ggcgccgagc tggtcgtcgc cgacctggag 120 cgggagtctg cgaacaggat cgtggaagga atccgagcga gtggaggccg agcccacgcc 180 tttgccgtgg atgtagccga cgccgaggcg gtcgagcgca tggtggattt tgccgttcgc 240 acgtgcggtg accttcatct ggcggtcaat aatgctggga tcggcggccc aagcgaaccg 300 accgccgact atccgctcga cggctggcgc aaggtgatcg atgtcaatct gaatggcgtc 360 ttctatggca tgaaatatga gatcgcagcg atactgaaat ccggcggcgg cgccatcgtg 420 aacatggcat ccatcctcgg ttcagtggga tttgcgaatg cctgcgccta tgtctccgcg 480 aaacacgcgc tgctgggact gacaaaaacg gcggcgatgg agtatgcggc acaaggcgtg 540 cgcatcaatg cggtcgggcc agctttcatc gacacgccgc ttctgtcgaa aaacctcgac 600 gaccaagtcc tcggccagct cgcgggactt catcccatcg gccggctcgg cacgcctgag 660 gaggtctcgg cgctcacctg tttcttgctt tccggacgcg cgagcttcat caccggcagt 720 tatcatctcg tcgatggcgg ctacaccacc cggtaa 756 <210> 11 <211> 792 <212> DNA <213> Streptomyces coelicolor <400> 11 atgagcacca ccggaaccac ccccgccacc accgggtacg ccgccgagtt cgccggccgt 60 accgccctcg tcaccggtgc cgcctccggt atcggcctgg ccaccgcccg ccggctcggc 120 gccggcggcg cccgggtcgt cgtcgccgac ttcaacgccg agggcgccga gaaggccgcc 180 gccgagctgc gggccggtgg cgtcgaggcc gccgcggtcg agctggacgt cacccgtccg 240 gagtccgtcg aggcggccgt cgggttcgcc gtcgacacgt tcggctcgct ggacctcgcc 300 gtcaacaacg ccggcatcgg cggccccagc gccccgaccg gcgagtacga cgtggcggcc 360 taccagcgcg tcgtgcgcac caacctcgac ggcgtcttct actcgatgcg ctacgaactg 420 cccgccatcg aggcggccgg caagggcggc tcgatcgtga acgtcgcctc catcctcggc 480 tcggtcggct tcgccggctc ccccgcctac gtcgccgcca agcacggcgt ggtcgggctg 540 acgaaggcgg ccgccgccga gtacgccgcc cgcggcatcc ggatcaacgc ggtcggtccg 600 ggcttcatcg acacccccct gctcaagacc atggacgagg ccgcctacaa ggggctggtc 660 gccctgcacc cggccggccg cctcgggcgc tccgaggagg tcgcggagct gatcgccttc 720 ctgctgtccg accgcgcgtc cttcgtcgcg ggcagctatc acctggtcga cggcgcctac 780 accgccgtct ga 792 <210> 12 <211> 762 <212> DNA <213> Ralstonia eutropha <400> 12 atggagtaca tcgacatgaa gctcaaggac aaggtcgcca tcgtaacggg cggtgccagc 60 ggtattggcg aggcaacggt tcggctgttc gcttcccaag gtgccagcgt cgtcattgcc 120 gaccgctcgg cactcggcga gaagctcgcg cgtgaactga gcgaaagcag cttggccgcg 180 cactacagcg aagtcgatgt gtcgcgcgag gacgacacgc gcaggctcat cgatgacacc 240 gtgagccgct tcgggcggct cgacatcatg gtcgccaatg ccggcattgc gcatccgtct 300 gcaccagtcg aggatgtcag tgtcgagcaa tggcagcaga tgatcgacgt caacctgacc 360 ggcgtcttcc tgagcaacaa gcttgccatt gtgcagatga agaagcaggg caccggcggc 420 gcgatcgtca acatggcatc gatactcggg catgtcggga tgccgggcgc ggcgtcctac 480 aacgcggcaa agggcggcgt ggtcaacctc acgcgctctc tcggcgtctc gcatgcacag 540 gacggcatac gcgtcaacgc ggtatgtccg ggtttcgtgg caacaccgct gatcgaacgt 600 gccactgagg aagcccgtgc gcgcctggtg gcggcgcatc cgattggccg cctgggtcac 660 gccgatgagg tcgcgaaggc cgtgctgttt ctcgcgagcg acgatgcatc gttcatcgtc 720 ggtacgagcc tgatggtcga tggagggtat tgcgcgcaat ga 762 <210> 13 <211> 759 <212> DNA <213> Herpentosiphon aurantiacus <400> 13 atgaaccagt atgactttcg tggaaaagtg gcgcttgtca ccggcggcgc ctcggggatt 60 ggtgcggcgt gcgtgcatac ctttgcgcgt ggcggcgcga aggtcgcgat tgttgatcgc 120 aatcaggatc tgggcgcaca aaccgtggcg gcggtccgcg aggccggcgg cgatgcgatc 180 tttctcccgg tggatgtcgc ccaatcaggg gccgttgagg cgatggttac cgacaccatc 240 acggcctttg gacagctgga tattgcggtc aataatgccg ggatcggcgg cgagtctaat 300 cctaccggca cctacagcat tgaaggttgg cagacggtca ttgatgtgaa cctcaacggt 360 gtcttctatt gcatgcgcta cgaaattcca gccatgctgg cgcagggcgg cggcgtgatc 420 gtgaatatgg cctcgatcct agggactgtc ggatttgcgt cctccccagc ctatgtcgcc 480 gccaagcacg cggtggttgg tctcaccaag gccgccgccc tggactatgg gcgccaaggg 540 ctgcggatca actcggtcgg gccgggcttt atcaaaacac cactgcttga cggtggcctg 600 gacgatcaga cccaaaccta tctgagcggg ctccacgccg tcggacgcat gggcgagtca 660 gcggaagtcg cggcgctggt cgcctttctc tgctccgctg aggcctcatt cctgacgggt 720 ggctattatc tggtcgatgg tggatacacg gcgcaataa 759 <210> 14 <211> 750 <212> DNA <213> Paracoccus denitrificans <400> 14 atggacattc gtttcgacaa caagatcgcc cttgtgaccg gcgccggctc ggggctgggc 60 gaggcgatag cgctggagct tgccgcctcg ggcgccacgg tggtggccgc cgacctgcat 120 gaagcgacag cccgcgccac cgccgacagg atcgtcgcgg cgggcggcaa ggccaaggcc 180 gtggcgggcg atgtctccga tcctgatgcg gtgcgcaagg ccgtcgaggt cgccaagggg 240 ctgggcgggc tgcacctgct ggtgaacaat gccggcatcg gcggccccag cgcgccggtc 300 ggggactatc cgctggacgg ctggaaaaag gtcatcgacg tcaacctgaa cgcggtcttc 360 tacggcatgc gctacgggat tccggcgatg ctggacgcgg gcggcggggc gatcgtgaac 420 atggcctcga tcctgggctc ggtcgggttc aacggcgcgg gcgcctatgt ctcggccaag 480 catgccgtgg tgggcatgac caagaacgcg gcgctggaat atgcgcaaaa gggcatccgg 540 gtgaactcgg tcggcccggc cttcatcgac acgccgctgc tcgaccagtt ggacagcgac 600 accaggcagg cgctggtcgg ccgccatccc atcggccggc tgggccgggc ggacgaggtt 660 gcggggcttg tcgtgttcct gctttcggac cgcgccagct tcatcaccgg cagctatcac 720 ctggtggatg gcggctatac ggcgctgtga 750

Claims (10)

  1. 케토 화합물의 해당 키랄 하이드록시 화합물로의 입체선택적, 특히 거울상선택적 효소적 환원 방법으로서, 케토 화합물은 거울상선택적, NADH-특이적 산화환원효소로 환원되고, 케토 화합물의 환원을 위해 폴리펩티드를 사용하며 이것은 204-208 위치에서 R-ADH-시그니처 H-[P; A]-[I; A; Q; V; L]-[G; K]-R 및 그들 전체에서 하기의 추가 구조적 특징을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) N-말단 로스만-폴드 GxxxGxG,
    (ii) 87 위치에서 NAG-모티프,
    (iii) S 139, Y 152 및 K 156으로 이루어진 세작용기 촉매(catalytic triad),
    (iv) 37 위치에서 음으로 하전된 아미노산 부분,
    (v) 이합체화 도메인 [A; S]-S-F 및 [V; I]-DG-[G; A]-Y-[T; C; L]-[A; T; S]-[Q; V; R; L; P]에서 2개의 C-말단 모티프,
    (vi) 159 위치에서 Val 또는 Leu (K 156의 하류의 4 위치),
    (vii) 178 위치에서 Asn, 및
    (viii) 188 위치에서 프롤린 부분.
  2. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 케토 화합물 환원에 사용되며, 이는
    (a) 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7 중 하나를 포함하거나, 또는
    (b) 아미노산의 적어도 70%가 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7 중 하나의 아미노산과 동일하거나, 또는
    (c) SEQ ID NO:8 내지 SEQ ID NO:14로 이루어진 군으로부터의 핵산 서열이 암호화하거나, 또는
    (d) 긴축 조건하에서 (c)에서 설명한 핵산 서열 중 하나에 혼성화하는 핵산 서열이 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 일반식 I의 케토 화합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
    Figure pct00005

    (I)
    여기서 R1, R2 및 R3은 서로 독립적으로 하기 군에서 선택되고,
    1) -H, 단 R1은 H가 아님,
    2) -(C1-C20)-알킬, 여기서 알킬은 직쇄 또는 분기됨,
    3) -(C2-C20)-알케닐, 여기서 알케닐은 직쇄 또는 분기되고 선택적으로 최대 4개 이중 결합을 포함,
    4) -(C2-C20)-알키닐, 여기서 알케닐은 직쇄 또는 분기되고 선택적으로 최대 4개 삼중 결합을 포함,
    5) -(C6-C24)-아릴,
    6) -(C1-C8)-알킬-(C6-C14)-아릴,
    7) -(C5-C14)-헤테로사이클,
    8) -(C3-C7)-시클로알킬,
    여기서 2) 내지 8) 하에서 상기 설명한 부분은 미치환되거나 서로 독립적으로 -OH, 할로겐, -NO2, -NH2, -NHP 및/또는 -M에 의해 1회, 2회 또는 3회 치환되고, 여기서 P는 -(C1-C7)-알킬, -(C2-C7)-알케닐, -(C2-C7)-알키닐, -(C6-C14)-아릴, 또는 벤질옥시 카르보닐, 트리페닐 메틸 및 t-부틸 카르보닐로부터 선택된 보호기를 나타내고, M은 -(C1-C7)-알킬, -(C2-C7)-알케닐, -(C2-C7)-알키닐, -(C6-C14)-아릴 또는 -(C1-C8)-알킬-(C6-C14)-아릴을 나타내고, 여기서 -(C1-C8)-알킬-(C6-C14)-아릴 중의 -(C6-C14)-아릴은 미치환되거나 할로겐에 의해 1회, 2회 또는 3회 치환되고,
    9) -CH2-X-R, 여기서 X는 O 또는 S를 나타내고 R은 -(C1-C7)-알킬, 페닐 및 벤질로부터 선택되고, 여기서 페닐 및 벤질은 -(C1-C7)-알킬, -S(C1-C3)-알킬, -O(C1-C3)-알킬, -NO2, -SCF3, 할로겐, -C(O)(C1-C3)-알킬 및/또는 -CN에 의해 1회, 2회 또는 3회 치환되고,
    또는 R1은 R2와 함께, R1과 R3 또는 R2과 R3는 3-6 C-원자를 포함하는 고리를 형성하며, 이는 미치환되거나 -OH, 할로겐, -NO2, -NH2, -NHP 및/또는 -M에 의해 서로 독립적으로 1회, 2회 또는 3회 치환되고, 나머지 부분은 1) 내지 9) 하에 상기 설명한 부분으로부터 선택된다.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 일반식 II의 디케톤을 케톤 화합물로서 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
    Figure pct00006

    (II)
    여기서
    R5는 (CH2)n(n = 0 - 20), -(C6-C14)-아릴 또는 -(C5-C14)-헤테로사이클을 나타내고,
    R4 및 R6는 서로 독립적으로 -(C1-C20)-알킬 또는 에스테르기를 나타내고,
    여기서 R4, R5 및 R6는 미치환되거나 -(C1-C4)-알킬, -OH, 할로겐, -NO2 및/또는 -NH2에 의해 서로 독립적으로 1회, 2회 또는 3회 치환된다.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 산화환원효소/탈수소효소에 의해 형성된 산화된 보조인자 NAD가 연속적으로 재생되고,
    - 일반식 RXRYCHOH(여기서 RX 및 RY는 서로 독립적으로 분기되거나 미분기된 C1-C8-알킬기이고 Ctotal≥3임)을 갖는 이차 알코올이 보조인자 재생에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 2-프로판올, 2-부탄올, 2-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-헵탄올 및 2-옥탄올로 이루어진 군으로부터의 알코올, 바람직하게는 2-프로판올을 보조기질 또는 이차 알코올로서 각각 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 케토 화합물은 총 부피를 기준으로 3% 내지 50%, 바람직하게는 5% 내지 40%, 특히 10% 내지 30% 범위 양으로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, TTN (총 턴오버 수 = 케토 화합물의 mol / 사용한 보조인자의 mol)가 ≥103인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 유기 2상 시스템에서 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 디에틸 에테르, 터셔리 부틸 메틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 헵탄, 헥산 및 시클로헥산으로부터 선택된 유기 용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020117022944A 2009-03-05 2010-03-03 케토 화합물의 입체선택적 효소적 환원 방법 KR101780510B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09450050A EP2226386A1 (de) 2009-03-05 2009-03-05 Verfahren zur stereoselektiven enzymatischen Reduktion von Ketoverbindungen
EP09450050.1 2009-03-05
PCT/EP2010/052701 WO2010100195A1 (de) 2009-03-05 2010-03-03 Verfahren zur stereoselektiven enzymatischen reduktion von ketoverbindungen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110134890A true KR20110134890A (ko) 2011-12-15
KR101780510B1 KR101780510B1 (ko) 2017-09-22

Family

ID=40934907

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117022944A KR101780510B1 (ko) 2009-03-05 2010-03-03 케토 화합물의 입체선택적 효소적 환원 방법

Country Status (15)

Country Link
US (1) US9045780B2 (ko)
EP (2) EP2226386A1 (ko)
JP (1) JP5852885B2 (ko)
KR (1) KR101780510B1 (ko)
CN (1) CN102341501B (ko)
CA (1) CA2753634C (ko)
DK (1) DK2403953T3 (ko)
ES (1) ES2636473T3 (ko)
HU (1) HUE033100T2 (ko)
IL (1) IL214972A (ko)
PL (1) PL2403953T3 (ko)
PT (1) PT2403953T (ko)
SI (1) SI2403953T1 (ko)
TW (1) TWI589696B (ko)
WO (1) WO2010100195A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103276027A (zh) * 2013-05-10 2013-09-04 苏州汉酶生物技术有限公司 一种手性n-保护哌啶醇的生物制备方法
CN106754775B (zh) * 2016-12-23 2019-08-20 华东理工大学 一种羰基还原酶突变体及其基因与应用
CN109576313B (zh) * 2017-09-29 2022-02-22 尚科生物医药（上海）有限公司 一种制备（s）- 2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4014573C1 (ko) 1990-05-07 1991-10-10 Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De
US5523223A (en) 1992-03-13 1996-06-04 Forschungszentrum Julich Gmbh Ketoester reductase for conversion of keto acid esters to optically active hydroxy acid esters
JP3574682B2 (ja) 1993-09-24 2004-10-06 ダイセル化学工業株式会社 新規な酵素、該酵素を製造する方法、該酵素をコードするｄｎａ、該ｄｎａを含む形質転換体、該酵素による光学活性アルコール等の製造方法
DE19610984A1 (de) 1996-03-21 1997-09-25 Boehringer Mannheim Gmbh Alkohol-Dehydrogenase und deren Verwendung zur enzymatischen Herstellung chiraler Hydroxyverbindungen
AU1551701A (en) 1999-12-03 2001-06-12 Kaneka Corporation Novel carbonyl reductase, gene thereof and method of using the same
TWI275645B (en) 2000-02-16 2007-03-11 Daicel Chemical Industries Ltd. (R)-2-octanol dehydrogenases, methods for producing the enzymes, DNA encoding the enzymes, and methods for producing alcohols using the enzymes
US20050089847A1 (en) * 2000-08-07 2005-04-28 Thomas Wilckens Short chain dehydrogenases/reductases(sdr)
DE10119274A1 (de) 2001-04-20 2002-10-31 Juelich Enzyme Products Gmbh Enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Ketoverbindungen
EP1553170B1 (en) 2002-09-19 2012-06-27 Kaneka Corporation Novel carbonyl reductase, gene thereof and method of using the same
JP4366097B2 (ja) 2003-02-28 2009-11-18 住友化学株式会社 還元酵素遺伝子及びその利用
DE10327454A1 (de) 2003-06-18 2005-01-20 Juelich Enzyme Products Gmbh Oxidoreduktase aus Pichia capsulata
DE10345772A1 (de) 2003-10-01 2005-04-21 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von 3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol
WO2006046455A1 (ja) 2004-10-27 2006-05-04 Kaneka Corporation 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法
AT501496B1 (de) 2005-02-21 2007-03-15 Iep Gmbh Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von ketoverbindungen
AT502395B1 (de) * 2005-07-27 2007-03-15 Iep Gmbh Oxidoreduktasen zur stereoselektiven reduktion von ketoverbindungen
DE102005044736A1 (de) 2005-09-19 2007-03-22 Basf Ag Neue Dehydrogenasen, deren Derivate und ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Alkanolen
AT502185B1 (de) 2005-09-23 2007-02-15 Iep Gmbh Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von ketoverbindungen
AT503017B1 (de) * 2005-12-19 2007-07-15 Iep Gmbh Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von hydroxyketoverbindungen

Also Published As

Publication number Publication date
JP2012519473A (ja) 2012-08-30
PT2403953T (pt) 2017-08-09
WO2010100195A1 (de) 2010-09-10
EP2403953B1 (de) 2017-05-10
US9045780B2 (en) 2015-06-02
DK2403953T3 (en) 2017-07-24
IL214972A (en) 2017-04-30
JP5852885B2 (ja) 2016-02-03
HUE033100T2 (en) 2017-11-28
TWI589696B (zh) 2017-07-01
KR101780510B1 (ko) 2017-09-22
CA2753634C (en) 2017-12-05
SI2403953T1 (sl) 2017-08-31
TW201043696A (en) 2010-12-16
PL2403953T3 (pl) 2017-10-31
IL214972A0 (en) 2011-11-30
CN102341501B (zh) 2015-07-08
EP2226386A1 (de) 2010-09-08
ES2636473T3 (es) 2017-10-05
CA2753634A1 (en) 2010-09-10
CN102341501A (zh) 2012-02-01
EP2403953A1 (de) 2012-01-11
US20120040425A1 (en) 2012-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101341392B1 (ko) 케토 화합물의 입체구조 선택적인 환원을 위한산화환원효소
JP4845729B2 (ja) ピキア・カプスラータ由来酸化還元酵素
JP2007523617A6 (ja) ピキア・カプスラータ由来酸化還元酵素
JP2002345479A (ja) 新規な（ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、その製造方法、及びこれを利用した光学活性アルコールの製造方法
KR101780510B1 (ko) 케토 화합물의 입체선택적 효소적 환원 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)