CN114774379B

CN114774379B - 一种热稳定性提高的羰基还原酶突变体

Info

Publication number: CN114774379B
Application number: CN202210321566.9A
Authority: CN
Inventors: 吴中柳; 杨玉洁; 刘艳; 裴小琼
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2022-03-29
Filing date: 2022-03-29
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2042-03-29
Also published as: CN114774379A

Abstract

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体公开了一种具有高催化活性的热稳定性羰基还原酶突变体。与野生型酶相比，突变体酶可以耐受更高的温度，在高温下反应具有更高的催化效率。特别是含有8个突变位点的组合突变体M8K，在90℃的高温下的热失活半衰期可以达到110min，在50‑60℃范围内催化活性高于野生型酶，且在55℃时达到最佳的催化效率，具有广阔的工业应用前景。

Description

一种热稳定性提高的羰基还原酶突变体

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及高耐热性的羰基还原酶突变体及其在高温下合成手性醇的应用。

背景技术

手性醇是合成手性药物的重要中间体。目前合成手性醇的方法有化学催化和生物催化，但传统的化学合成工艺存在效率低和污染严重等瓶颈问题；基于酶催化的生物合成工艺，具有绿色环保、立体选择性良好等优势，特别是在创新药物工业化生产中得到了广泛的应用。酶作为生物大分子，其天然地处于条件温和的环境下，对温度和有机溶剂等外界因素的抵抗力有限，因此提高酶的稳定性，特别是热稳定性不仅可以有利于酶的储存，降低生产成本，而且还可以通过提高催化反应的温度来加大反应速率，增加底物的溶解度，从而获得更高的时空产率。

蛋白质工程技术被广泛应用于酶的稳定性改造，其手段多样，效率各异。早期的蛋白质工程主要是以定向进化为改造策略，但随机库的尺寸和高通量筛选方法的建立是其关键制约因素。随着生物信息学和X射线晶体学的发展，半理性/理性设计已经成为了目前最为高效和普遍的酶稳定性改造策略，其中通过挖掘酶分子在一级序列上的进化保守信息，或探索酶三维空间结构与稳定性之间的关联等方法都极大地提高了半理性和理性设计的成功率。

发明内容

本发明利用基于晶体结构和序列进化信息的半理性设计对金黄杆菌Chryseobacterium sp.CA49来源的羰基还原酶ChKRED20(核苷酸序列为SEQ ID NO.1；氨基酸序列为SEQ ID NO.2，PDB ID：5X8H)进行分子改造，将一个或者多个氨基酸进行替换，从而获得热稳定性提高的突变体。

本发明提供了多个具有高催化活性的热稳定性工程化羰基还原酶，其能够进行不对称催化制备多种手性醇类化合物，特别是能实现高浓度的3,5-双三氟甲基苯乙酮的完全转化，且立体选择性优异。

所述羰基还原酶突变体是以SEQ ID NO.2为出发序列，将以下氨基酸位点进行突变得到单点突变体或组合后得到多点突变体：第100位的丙氨酸突变为苏氨酸，第104位的甘氨酸突变为丝氨酸，第112位的亮氨酸突变为异亮氨酸，第127位的亮氨酸突变为异亮氨酸，第128位的谷氨酸突变为脯氨酸，第131位的谷氨酸突变为亮氨酸，第162位的丙氨酸突变为甘氨酸，第211位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸，第232位的丝氨酸突变为丙氨酸。

根据本领域公共知识，构建的能表达上述突变体的载体、基因工程菌等也属于本发明的保护范围。

为了达到上述目的，本发明将序列进化信息和晶体结构信息结合起来挖掘羰基还原酶的潜在热稳定性位点，利用定点突变技术构建突变体，然后分别测定热处理下蛋白三维结构的展开情况和高温下的催化活性，从而筛选到了9个具有热力学或动力学稳定性的突变子。最后通过对9个突变位点的组合得到了5个组合突变体，它们均具有优异的温度耐受性，能够在高温下保持较高的活性，表现出比野生型更高的催化效率。特别是突变体M8K(详见实施例3)，在90℃的高温下处理110min后，其催化活性仍保持原有活性的50％，在50-60℃范围内催化3,5-双三氟甲基苯乙酮的转化率高于野生型酶，在55℃时达到最佳的催化反应效率。

本发明的优点：本发明的耐热性突变体能够在55℃反应条件下，催化400g/L的3,5-双三氟甲基苯乙酮，5h的转化率达到90％以上，其产物(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的对映选择性达到99.9％。和野生型羰基还原酶ChKRED20一样，本发明的耐热性突变体也能够以异丙醇为辅底物进行辅酶NADH自循环，因此特别适合工业应用。(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇是药物阿瑞匹坦的关键手性中间体，具有极大的应用价值，利用本发明获得的突变体酶能提高催化效率，显著降低生产成本。

附图说明

图1，21个单点突变体的残余活力和熔解温度T_m与野生型的比较，ΔT_m＝T_m(突变体)-T_m(野生型)；

图2，5个组合突变体的熔解温度T_m、半失活温度T₅₀、半衰期t_1/2；

图3，野生型ChKRED20(●)和突变体M8K(○)的最适反应温度；

图4，野生型ChKRED20(●)和突变体M8K(○)在55℃下催化400g/L的3,5-双三氟甲基苯乙酮的时间反应曲线。

具体实施方式

实施例1、突变位点的预测和筛选

A)羰基还原酶ChKRED20构建的重组质粒pET-28a(+)-ChKRED20为先前构建，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示(中国专利，CN103497911A)。

B)通过对羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列和三维空间结构进行分析，预测并筛选潜在的稳定性突变位点，所选择的位点如表1所示。

首先我们以野生型羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列SEQ ID NO.2为探针在NCBI数据库中进行序列相似性搜索，选择序列相似性分别在30-60％和60-90％之间的同源序列，然后通过ClusterW多序列比对得到在不同位点出现频率高于50％的氨基酸，将其作为第一轮突变位点的预测。

接着我们通过对野生型羰基还原酶ChKRED20的四聚体结构进行分析，重点分析位于亚基与亚基接触界面上的氨基酸位点，然后在第一轮突变位点的基础上选择位于亚基接触界面上的氨基酸位点，并对他们之间参与的相互作用进行分析，剔除侧链上已参与分子间相互作用力的位点后，最终得到了21个潜在的稳定性突变位点。

C)设计突变引物(表1)，利用常规方法以重组质粒pET-28a(+)-ChKRED20为模板进行定点突变，获得一系列含突变位点的重组质粒，并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，从而获得突变体酶。

D)酶的表达与纯化：野生型ChKRED20和所有突变体的异源表达条件，粗酶制备以及蛋白质纯化都按照已发表的文献方法进行(Appl Microbiol Biotechnol，2017，101：1945-1952)。

表1设计的突变引物如下

实施例2、羰基还原酶单点突变体的稳定性分析

热力学稳定性检测：采用差示扫描荧光法对酶蛋白的熔解温度(T_m)进行测定：10×的SYPRO Orange染液与20mM的突变体纯酶混合后，加入100mM、pH 8.0的磷酸钾缓冲液使整个体系的体积为20μL。在CFX96实时定量PCR仪中以1℃/min的速度从5℃进行温度升温至95℃，通过观测整个升温过程中的荧光强度变化来测定酶蛋白的熔解温度(T_m)。

动力学稳定性检测：以3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物来设置催化体系，测定酶对底物的催化活性，反应体系为1mL，其中含有1.6mg/mL的粗酶液，30mM的底物，3mM的NAD⁺，40％(v/v)的异丙醇和100mM、pH 8.0的磷酸钾缓冲液，40℃下反应20min。粗酶液在反应前先在60℃下进行热处理20min，然后以未处理的粗酶液作为对照，用乙酸乙酯终止反应并萃取产物，通过气相色谱检测底物的转化率(检测条件：Cyclodex-B柱，美国安捷伦，柱温：115℃)。将酶热处理前的底物转化率定义为100％，热处理后的转化率与之的比值为残余活力。通过比较酶残余活力来衡量酶在催化过程中的动力学稳定性。

经过上述稳定性分析，获得了9个热力学或动力学稳定的突变位点，其分别为A100T、G104S、L112I、L127I、E128P、E131L、A162G、M211I、S232A，突变体稳定性的结果见说明书附图1。

实施例3、单点突变位点的组合以及组合突变体的稳定性分析

通过对单点突变位点的热力学或动力学稳定性两方面的不同分为三组：热力学稳定突变体、动力学稳定突变体和兼具动力学和热力学稳定的突变体。然后对组内或组间的突变位点进行组合得到了5个稳定性显著提高的组合突变体，分别为M3TK、M4T、M6K、M8K、M9TK，其特征如下：

M3TK：第104位的甘氨酸突变为丝氨酸、第112位的亮氨酸突变为异亮氨酸、第131位的谷氨酸突变为亮氨酸。

M4T：第104位的甘氨酸突变为丝氨酸、第112位的亮氨酸突变为异亮氨酸、第131位的谷氨酸突变为亮氨酸、第232位的丝氨酸突变为丙氨酸。

M6K：第100位的丙氨酸突变为苏氨酸、第104位的甘氨酸突变为丝氨酸、第112位的亮氨酸突变为异亮氨酸、第131位的谷氨酸突变为亮氨酸、第162位的丙氨酸突变为甘氨酸、第211位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸。

M8K：第100位的丙氨酸突变为苏氨酸、第104位的甘氨酸突变为丝氨酸、第112位的亮氨酸突变为异亮氨酸、第127位的亮氨酸突变为异亮氨酸、第128位的谷氨酸突变为脯氨酸、第131位的谷氨酸突变为亮氨酸、第162位的丙氨酸突变为甘氨酸、第211位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸。

M9TK：第100位的丙氨酸突变为苏氨酸、第104位的甘氨酸突变为丝氨酸、第112位的亮氨酸突变为异亮氨酸、第127位的亮氨酸突变为异亮氨酸、第128位的谷氨酸突变为脯氨酸、第131位的谷氨酸突变为亮氨酸、第162位的丙氨酸突变为甘氨酸、第211位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸、第232位的丝氨酸突变为丙氨酸。

接下来对上述5个组合突变体进行热力学和动力学稳定性的分析；其中热力学稳定性的分析方法同单点突变体的分析方法，而动力学稳定性分析除了对其80℃热处理后的残余活性进行测定外，还将组合突变体在65℃或90℃下处理不同时间，对其热失活半衰期(t_1/2)进行测定；此外将突变体置于65-70℃或90-95℃下处理30min对其半失活温度(T₅₀)进行测定。催化反应体系和产物的测定方法同单点突变体，结果见说明书附图2。

最适反应温度的测定：从5个组合突变体选取稳定性最高的突变体M8K，将其置于25-65℃下进行催化反应，反应体系同上，反应20min后用等体积的乙酸乙酯萃取并用气相色谱检测底物的转化率。以不同的反应温度为横坐标，底物的转化率为纵坐标，绘制酶催化活力随反应温度变化的曲线，结果见说明书附图3。突变体M8K在55℃具有最大的催化效率，比野生型提高了5℃。

实施例4、组合突变体M8K的催化效率测定

在最适反应温度下对M8K的动力学参数进行测定，1mL反应体系中含有0.025mg的纯酶，0.1-20mM的底物，10mM的NADH和100mM、pH 8.0的磷酸钾缓冲液。反应20min后，用乙酸乙酯终止并萃取产物，通过气相色谱检测产物得率，从而计算反应速率。以Michaelis-Menten方程进行拟合，最后计算酶的米氏常数K_m和反应转换数k_cat，结果见表2。M8K的k_cat和k_cat/Km值分别是野生型1.9倍和1.4倍，显著提高了催化效率。

表2野生型ChKRED20与组合突变体M8K的动力学参数测定

实施例5、组合突变体M8K催化高浓度底物的能力

反应体系为10mL，含100mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)、4g/L粗酶、0.2g/LNAD⁺、40％(v/v)异丙醇和400g/L底物3,5-双三氟甲基苯乙酮。反应温度为55℃。结果表明，M8K反应5h后，底物的转化率达到90％以上。相比之下，野生型酶在相同条件下反应3h后活性迅速丧失，转化率仅达到14％左右，后续延长反应时间转化率也几乎没有变化，结果见说明书附图4。因此，耐热性突变体M8K能够显著提高对高浓度底物的催化能力，具有工业应用潜力。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种热稳定性提高的羰基还原酶突变体

<141> 2022-03-28

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 750

<212> DNA

<213> Chryseobacterium sp. CA49

<400> 2

atgggaattt tagacaacaa agtagcactt gttacaggag caggatccgg aatcggatta 60

gctgttgctc attcgtatgc aaaagaaggc gccaaagtta ttgtatccga tattaatgaa 120

gatcacggta acaaagcagt cgaagacatt aaagcacaag gcggggaagc gtcttttgta 180

aaagcagata cttcaaaccc tgaagaagtg gaagctttag taaaaagaac agtagaaatc 240

tacggaagac ttgatattgc atgtaataat gcgggaatcg gtggcgaaca ggcgctggca 300

ggcgattacg gtctcgacag ctggcgaaaa gtattaagca taaatcttga tggcgtattc 360

tacgggtgca aatatgagtt agaacaaatg gaaaaaaacg ggggcggcgt tattgtgaat 420

atggcctcta ttcatggtat tgttgctgca ccgctttcct cagcctacac ttctgcaaag 480

cacgcagtgg tagggcttac taaaaatata ggagcagaat acggacagaa aaatatccgt 540

tgcaatgcgg tggggcctgc ttatattgaa accccgctgt tggaaagcct gacaaaggaa 600

atgaaggaag cactgatttc aaaacatccg atgggaagac tgggaaaacc tgaagaagta 660

gcagaactgg tgttgttcct gagttcagaa aaatcatctt ttatgacggg aggctattat 720

cttgtagatg gtggctacac ggcagtttaa 750

<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<213> Chryseobacterium sp. CA49

<400> 2

Met Gly Ile Leu Asp Asn Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ile Gly Leu Ala Val Ala His Ser Tyr Ala Lys Glu Gly Ala Lys

20 25 30

Val Ile Val Ser Asp Ile Asn Glu Asp His Gly Asn Lys Ala Val Glu

35 40 45

Asp Ile Lys Ala Gln Gly Gly Glu Ala Ser Phe Val Lys Ala Asp Thr

50 55 60

Ser Asn Pro Glu Glu Val Glu Ala Leu Val Lys Arg Thr Val Glu Ile

65 70 75 80

Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Ala Cys Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly Glu

85 90 95

Gln Ala Leu Ala Gly Asp Tyr Gly Leu Asp Ser Trp Arg Lys Val Leu

100 105 110

Ser Ile Asn Leu Asp Gly Val Phe Tyr Gly Cys Lys Tyr Glu Leu Glu

115 120 125

Gln Met Glu Lys Asn Gly Gly Gly Val Ile Val Asn Met Ala Ser Ile

130 135 140

His Gly Ile Val Ala Ala Pro Leu Ser Ser Ala Tyr Thr Ser Ala Lys

145 150 155 160

His Ala Val Val Gly Leu Thr Lys Asn Ile Gly Ala Glu Tyr Gly Gln

165 170 175

Lys Asn Ile Arg Cys Asn Ala Val Gly Pro Ala Tyr Ile Glu Thr Pro

180 185 190

Leu Leu Glu Ser Leu Thr Lys Glu Met Lys Glu Ala Leu Ile Ser Lys

195 200 205

His Pro Met Gly Arg Leu Gly Lys Pro Glu Glu Val Ala Glu Leu Val

210 215 220

Leu Phe Leu Ser Ser Glu Lys Ser Ser Phe Met Thr Gly Gly Tyr Tyr

225 230 235 240

Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Val

245

Claims

1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于以羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列SEQ IDNO.2为出发序列，经突变后特征如下：第104位的甘氨酸突变为丝氨酸、第112位的亮氨酸突变为异亮氨酸且第131位的谷氨酸突变为亮氨酸。

2.一种羰基还原酶突变体，其特征在于：将权利要求1所述的突变体的第232位的丝氨酸突变为丙氨酸。

3.一种羰基还原酶突变体，其特征在于：将权利要求1所述的突变体的第100位的丙氨酸突变为苏氨酸、第162位的丙氨酸突变为甘氨酸且第211位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸。

4.一种羰基还原酶突变体，其特征在于：将权利要求3所述的突变体的第127位的亮氨酸突变为异亮氨酸且第128位的谷氨酸突变为脯氨酸。

5.一种羰基还原酶突变体，其特征在于：将权利要求4所述的突变体的第232位的丝氨酸突变为丙氨酸。