CN112175916B - 一种l-氨基酸连接酶突变体、重组载体、重组菌及其应用 - Google Patents

一种l-氨基酸连接酶突变体、重组载体、重组菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种L‑氨基酸连接酶突变体、重组载体、重组菌及其应用。所述L‑氨基酸连接酶突变体是将如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第110位进行突变获得；或者将如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第108位、第110位同时进行突变获得。所述的L‑氨基酸连接酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID NO.5所示。一种采用所述的L‑氨基酸连接酶突变体编码基因构建的重组载体，含有该重组载体的基因工程菌表达的L‑氨基酸连接酶突变体在催化合成Ala‑Gln过程中其酶活比野生型BacD提高1.87倍，为232.45±17.4U·(mg·h)‑1；反应26h后，该突变体可以使释放的产物磷浓度达到694.47μM，相比于野生型BacD积累量571.95μM，提高了21.4％。通过计算，单位质量的双突变体NFLY的催化产物Ala‑Gln的产量可达2.59mM‑1·L‑1·mg‑1。

Description

一种L-氨基酸连接酶突变体、重组载体、重组菌及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和生物技术领域，尤其涉及及一种催化活性提高且底物专一性提高的L-氨基酸连接酶突变体、重组载体、重组菌及其应用。
背景技术
L-氨基酸连接酶(Lal)是ATP-grasp酶超家族中的重要一员，能够以无保护的L-氨基酸为底物合成二肽，因而在二肽的生物合成过程中具有重要的应用价值。目前已发现多种来源不同的Lal(例如：Ywf E，RizA，BL00235，PSPPH 4299及TabS等)，其分别能够催化合成不同的二肽化合物。
Lals在二肽的生物合成中具有十分重要的潜在应用价值，相比于化学合成或者其它工具酶，具有以下优势：(1)Lals是一种结构较小的可溶性蛋白酶，在常规的实验条件下更容易获得并对其进行相关的分子生物学改造；(2)Lals催化合成丙谷二肽的反应是单向的不可逆过程，有利于反应的进行及反应转化率的提高；(3)相比于其它二肽合成酶,该反应所需的底物均为天然化合物，反应过程中不需要其它保护、脱保护步骤。因此，加强对Lals在二肽化合物生物合成中的研究，将不仅有利于进一步理解其底物识别的分子基础及催化机制，而且将有利于进一步强化其在二肽生物合成中的应用潜力。
研究表明，L-氨基酸连接酶的底物特异性一般比较差，能够吸收不同的L-氨基酸作为底物，催化合成不同结构的α-二肽。特别的是，来源于枯草芽孢杆菌中的YwfE(BacD)，虽然天然情况下能够催化L-丙氨酸和L-anticapsin合成二肽抗真菌化合物-bacilysin，但研究发现其同样能够催化游离的L-丙氨酸和L-谷氨酰胺合成丙谷二肽。BacD能够以无保护的L-氨基酸作为底物合成丙谷二肽，且该反应为单向不可逆的过程，因此利用Lal作为生物催化剂生产丙谷二肽具有巨大的应用潜力。但由于原始的BacD蛋白酶活比较低、底物特异差，因此迫切需要一种底物特异性强，催化活力高的L-氨基酸连接酶突变体，并将其应用到实际的生产当中。
发明内容
针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明提供了一种L-氨基酸连接酶突变体、重组载体、重组菌及其在酶法制备Ala-Gln中的应用。
本发明采用以下技术方案实现：
一种L-氨基酸连接酶突变体，所述L-氨基酸连接酶突变体是将如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第110位进行突变获得；或者将如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第108位、第110位同时进行突变获得。
上述技术方案中，进一步地，所述氨基酸序列的第108位突变为将天冬酰胺突变为苯丙氨酸；第110位突变为将亮氨酸突变为苯丙氨酸或者酪氨酸。
进一步地，所述的L-氨基酸连接酶突变体的氨基酸序列为下列之一：SEQ IDNO.4，SEQ ID NO.5。
一种编码所述L-氨基酸连接酶突变体的基因，该编码基因的制备方法为：是从一株新型解淀粉芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌)基因组中，通过PCR克隆获得L-氨基酸连接酶基因，并对其进行密码子优化，然后人工合成得到L-氨基酸连接酶基因(其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)，针对该基因设计相应的突变位点并采用PCR扩增得到所述L-氨基酸连接酶突变体编码基因。在此基础上，首先将其第108位天冬酰胺突变为苯丙氨酸(N108F)，再将其第110位亮氨酸突变为酪氨酸(N108F/L110Y,NFLY)，即可得到所述的第108位、第110位同时突变的L-氨基酸连接酶突变体。
一种采用上述的L-氨基酸连接酶突变体编码基因构建的重组载体，将上述的L-氨基酸连接酶突变体编码基因克隆到pET28(a)质粒的BamH I和Xho I酶切位点之间，构建重组载体。
一种采用上述重组载体转化制备的重组菌，其构建方法为：将上述重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，培养后提取质粒，经酶切鉴定及测序后，将验证正确的重组质粒转入BL21(DE3)，构建含有相应重组载体的重组菌。
一种采用上述重组载体转化制备的重组菌的应用，可用于生产丙谷二肽。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明首次构建了一种高效表达L-氨基酸连接酶突变体的重组菌；该重组菌表达的L-氨基酸连接酶突变体的酶活与野生型BaLal_16相比有显著提高。其中，双突变体NFLY在催化合成Ala-Gln过程中其酶活比野生型BaLal_16提高1.87倍，为232.4±17.4U·(mg·h)-1；反应26h后，该突变体可以使释放的产物磷浓度达到694.47μM，而野生型BaLal_16积累量为571.95μM。通过计算，单位质量的突变体其催化产物Ala-Gln的产量可以达到2.59mM-1·L-1·mg-1(NFLY)。
附图说明
图1CAVER软件分析获得的BacD蛋白内部所有可能存在的疏水通道结构示意图(1)；蛋白内部存在的疏水通道长度与半径的关系(2)；
图2BacD内部底物与产物的转运通道结构示意图；
其中1为Ala进入BacD活性中心的通道，2为谷氨酰胺进入BacD活性中心的通道，3为产物Ala-Gln转出BacD活性中心的通道；
图3为不同的BacD突变体其通道入口的空间结构及谷氨酰胺与其关键氨基酸残基的相互作用示意图；
图4BaLal及NFLY突变体的核酸电泳示意图(1)及蛋白电泳示意图(2)；
图5不同BacD单突变体其催化合成Ala-Gln过程中催化活力；
图6BacD与NFLY在催化合成Ala-Gln过程中产物游离磷酸根含量示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1本实施例新型L-氨基酸连接酶的构建，具体构建过程包括：
①、L-氨基酸连接酶的理性改造提高其底物特异性与催化活性
从解淀粉芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌)基因组中，通过PCR克隆获得来源于枯草芽孢杆菌的L-氨基酸连接酶基因(baLal_16)，在此基础上，进行密码子优化得到适于在大肠杆菌体内表达的核苷酸序列(Balal)，并进行化学合成。将上述合成的L-氨基酸连接酶基因克隆到pET28(a)质粒的BamH I和Xho I酶切位点之间，构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取卡那霉素平板上长出的菌落，提取质粒、经酶切鉴定及测序后，将验证正确的重组质粒命名为：pET-Balal。然后，将该质粒转入BL21(DE3)，构建含有相应重组质粒的基因工程菌，命名为BL001。
②、利用CAVER3.0软件，分析BaLal_16蛋白内部可能存在的疏水性通道，通过分析发现其内部共存在11条可能的疏水通道(图1所示)。进一步分析，这些通道的半径及其长度，最终确认三条途径为底物与产物最有可能的转运通道(图2所示)。由于本发明是在丙谷二肽的生产中的应用，因此本发明的目标集中在提高蛋白酶对C末端底物的特异性。通过分析通道2，发现该通道入口是由G14，G311，E273，F271，S184，S185，A183，E109所组成的疏水区域。其中高保守氨基酸残基E109参与底物识别的过程，其构象的变化能够允许大分子量的不带电氨基酸进入该底物的转运通道。而在该通道入口上方的位置有三个氨基酸L12，N108和L110，由这三个氨基酸所形成的疏水区域会进一步压缩该通道入口的大小，并改变了通道入口的延伸方向，进而会进一步影响所能进入通道的底物种类。因此，发明人推断通过微调氨基酸N108与L110的大小，改变通道入口的尺寸，进而可以使Gln更加顺利的进入通道内部。由于Gln比anticapsin(BacD的天然底物)的分子量小，且体积更小，因此需要增大通道入口的空间位阻效应。因此，本发明分别将N108突变为体积更大的Phe，将L110突变成体积更大的Phe或者Tyr，构建单突变体N108F(其氨基酸序列为SEQ ID NO.3)，L110F，L110Y及双突变体NFLY，并检测其在催化合成Ala-Gln中的酶活力。
③、定点突变采用全质粒突变的方法，通过在引物相应位点上设计突变位点，然后采取PCR的方法扩增目标质粒。
其中，N108F的上游引物为N108F-P1：
5’-TTACCACGAATTTTGAACTGTTTATTGCGCCGATGGCAAAAG-3’；
N108F的下游引物为N108F-P2：
5’-AATAAACAGTTCAAAATTCGTGGTAATCGCATCCACTGCAAAC
L110Y的上游引物为L110F-P1：
5’-GAATAATGAATATTTTATTGCGCCGATGGCAAAAGCTTGT-3’；
L110Y的下游引物为L110F-P2：
5’-GCGCAATAAAATATTCATTATTCGTGGTAATCGCATCCAC-3’；
L110F的上游引物为L110F-P1：
5’-GAATAATGAATTTTTTATTGCGCCGATGGCAAAAGCTTGT-3’；
L110F的下游引物为L110F-P2：
5’-GCGCAATAAAAAATTCATTATTCGTGGTAATCGCATCCAC-3’；
N108F/L110Y的上游引物为NFLY-P1：
5’-TTACCACGAATTTTGAATATTTTATTGCGCCGATGGCAAAAG-3’；
N108F/L110Y的下游引物为NFLY-P2：
5’-CGGCGCAATAAAATATTCAAAATTCGTGGTAATCGCATCCACTGCAAAC-3’；
PCR反应体系为40μL，其中PrimerSTAR Max DNA Polymerase 10μL，上下游引物(10μM)各2μL，模板(pET-Balal或突变质粒，50ng/ml)2μL，ddH2O 14μL；PCR反应程序为：98℃预变性3min；95℃变性1min，Tm退火30s，72℃延伸5s/kb，30个循环；72℃延伸5min，4℃保温。
④、PCR产物经电泳验证正确后(图4(1))，使用DpnI酶进行PCR模板的消化，提高转化子的阳性率。经测序(上海生工生物工程公司)验证正确后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中。挑取卡那霉素平板上长出的菌落，提取质粒、经酶切鉴定后，将验证正确的含有相应重组质粒的基因工程菌，分别命名为NF002(含N108F突变质粒)、LY003(含L110Y突变质粒)、LF004(含L110F突变质粒)、NFLY005(含N108F/L110Y突变质粒)。
⑤、将各基因工程菌经活化后接种于LB培养基中(5g L-1酵母粉,10g L-1蛋白胨,和10g L-1NaCl)，37℃下培养5h，然后加入0.1mM IPTG，16℃培养14h。完成后离心收集细胞，使用MTris-HCl缓冲液(pH 8.9)重悬，利用超声波破碎仪破胞。利用镍柱亲核层析，纯化目的蛋白；然后利用透析法将纯酶液种的咪唑去除(图4(2))。
酶活的测定方法：总体积为1ml的预混液中含有100mMTris-HCl(pH 8.9)、20mMATP、20mM L-丙氨酸(L-谷氨酰胺)、20mM MgSO4·7H2O加入20μL纯酶液，37℃、400rpm金属浴反应5min。用0.25mL 20％的高氯酸溶液终止酶反应。4℃、13000rpm离心10min后，采用钼锑抗比色法，于710nm最大吸收波长处测定反应体系中游离的磷检测L-氨基酸连接酶的酶活。
1个单位酶活(1U)被定义为单位酶量每小时转化生成游离磷酸根(Pi)的量(μM)。
由图5可知，单独将110位的亮氨酸突变成体积相对更大的Phe和Tyr，都会不同程度的提高突变体的催化活力。这主要是由于L110正好处于底物Gln通道入口的位置，所以突变L110将直接改变通道入口的大小与方向(图3(2))，进而限制进入酶活性位点的氨基酸种类。同时也会发现，突变体L110F和L110Y的酶活力也存在显著的差异，这可能是由于酪氨酸为一个极性氨基酸，其在通道入口处的位置与Gln的相互作用更强，更有利于Gln进入通道，从而进入催化活性中心。
但当仅将108位的天冬酰胺突变成苯丙氨酸，酶活力却会有大幅度的降低。这主要是由于N108则处于通道入口偏下的位置，当将其突变成苯丙氨酸时，通道入口将会被进一步的扩大(图3(3))，空间位阻的降低导致进入活性中心的谷氨酰胺减少；同时可以发现，进入通道的谷氨酰胺其与酶的相互作用也会变弱，形成氢键的数量降低，将进一步削弱整个体系的稳定性，造成酶活力的降低。但同时突变NFLY，可以发现通道入口的空间构型可以较好的契合谷氨酰胺的空间构型(图3(4))，在保证其进入酶活性中心的前提下，限制了其它不同种氨基酸的进入，将大大提高突变体的底物选择性。而通过其在通道内与酶的相互作用方式也可以发现，无论是谷氨酰胺的C末端还是N末端，都可以分别被形成的两个氢键固定住，从而提高整个体系的稳定性，进而提高酶活力。酶学实验表明(图5)，单突变L110Y及双突变体NFLY的催化活力得到了显著提升，其中NFLY的酶活力提高了1.87倍，为232.4±17.4U·(mg·h)-1，这表明其对底物Gln的选择性得到了提高。同时，本发明中也发现野生型BaLal_16的酶活力相对于其它已报道的L-氨基酸连接酶(如BacD)相比，酶活力明显较低，这也为后续该酶的理性改造提供了方向。
实施例2基于L-氨基酸连接酶突变体生产Ala-Gln的应用实例
①将BL001和NFLY005分别加入到5mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、220rpm培养8-12h。再按2％的接种量，转接2mL至100mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中。
②待菌体浓度(OD600)达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃、220rpm培养12h。4℃、6000×g离心10min收集菌体，100mM Tris-HCl(pH 7.0)离心重悬3次后，用100mM Tris-HCl将菌体重悬。
③将重悬的菌体置于冰水浴中超声破胞，4℃、12000×g离心10min，取破胞上清液经纯化、脱盐后，用于验证野生型及突变体生产Ala-Gln的能力。
Ala-Gln积累量的反应体系为：总体积为1mL的预混液含有100mM Tris-HCl(pH8.9)、20mM ATP、20mM L-丙氨酸(L-谷氨酰胺)及20mM MgSO4·7H2O，加入0.1mL纯酶液。为了使反应充分进行，于37℃恒温反应28h，每隔一定时间进行取样，样品用10％三氯乙酸和0.1％SDS溶液终止酶反应。4℃、12000rpm离心5min后，用钼锑抗比色法测上清液中释放的磷浓度。
由图6可知，所构建的突变体NFLY能有效利用Ala、Gln为底物生产Ala-Gln。反应26h后，该突变体可以使释放的产物磷浓度达到694.47μM，而野生型BaLal_16积累量为571.95μM，产量提高了21.4％。通过计算，单位质量的突变体其催化产物Ala-Gln的产量可以达到2.59mM-1·L-1·mg-1(NFLY)。
序列表
<110> 济宁医学院
<120> 一种L-氨基酸连接酶突变体、重组载体、重组菌及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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tacaaaagcg cagccgaaaa atacaacctc gtcagcttta ttccaaggcc ttttgcaatt 120
acagcctctc atgcggcatt aattgaaaaa tactcggtcg cggtcataaa agataaagac 180
tattttaaga gtctggctga ttttgagcat cccgattcga tttactgggc tcatgaagat 240
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ggactgattg aatcagcggc acgatttgcg ggctggaaca tgattccgaa tattaaaaag 1020
gtcttcggcg tcgatatggc gcagctgtta ttggatgttc tctgtttcgg aaaagaagcc 1080
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cctcagcatt tcaaagaaaa cggccagctg cctgagacgg ctgtcgattt cgtcattgaa 1200
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caggcgaagc tgactgcaaa gtatgcgtta ccggtatga 1419
<210> 2
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro
1 5 10 15
Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser
20 25 30
Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile
35 40 45
Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser
50 55 60
Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp
65 70 75 80
His Asp Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Glu Ile Val Lys Val Ala
85 90 95
Gly Met Phe Ala Val Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Leu Phe Ile
100 105 110
Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly
115 120 125
Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Ala Ala
130 135 140
Phe Asn Arg Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr
145 150 155 160
Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Gln Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile
165 170 175
Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Lys
180 185 190
Glu Arg Glu Thr Ala Glu Ala Glu Phe Asn Arg Val Asn Glu Tyr Leu
195 200 205
Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile
210 215 220
Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Asp Asp Trp Tyr Glu Thr Ser
225 230 235 240
Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu
245 250 255
Tyr Phe Pro Val Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr
260 265 270
Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Asp Asp Ala Lys Arg
275 280 285
Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Glu
290 295 300
Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Ala
305 310 315 320
Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro
325 330 335
Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Val Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp
340 345 350
Val Leu Cys Phe Gly Lys Glu Ala Asp Leu Pro Lys Gly Leu Leu Glu
355 360 365
Gln Glu Pro Cys Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe
370 375 380
Lys Glu Asn Gly Gln Leu Pro Glu Thr Ala Val Asp Phe Val Ile Glu
385 390 395 400
Ser Ile Asp Ile Pro Gly Gly Val Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val
405 410 415
Ser Phe Ser Ala Ala Glu Ala Gly Thr Ser Val Asp Leu Arg Leu Phe
420 425 430
Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser
435 440 445
Gly Asp Val Ala Glu Ser Ile Lys Gln Ile Gln Gln Gln Ala Lys Leu
450 455 460
Thr Ala Lys Tyr Ala Leu Pro Val
465 470
<210> 3
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro
1 5 10 15
Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser
20 25 30
Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile
35 40 45
Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser
50 55 60
Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp
65 70 75 80
His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala
85 90 95
Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Phe Glu Leu Phe Ile
100 105 110
Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly
115 120 125
Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala
130 135 140
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145 150 155 160
Leu Glu Asp Phe Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ile Gly Thr Pro Leu Ile
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Lys Ser Ile Asn Val Pro Lys Ala Val Thr Phe Glu Ala Pro Phe Ile
210 215 220
Ala Glu Glu Phe Leu Gln Gly Glu Tyr Gly Asp Trp Tyr Gln Thr Glu
225 230 235 240
Gly Tyr Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Glu Gly Ile Met Ala Asp Gly Glu
245 250 255
Tyr Phe Pro Ile Ala Ile His Asp Lys Thr Pro Gln Ile Gly Phe Thr
260 265 270
Glu Thr Ser His Ile Thr Pro Ser Ile Leu Asp Glu Glu Ala Lys Lys
275 280 285
Lys Ile Val Glu Ala Ala Lys Lys Ala Asn Glu Gly Leu Gly Leu Gln
290 295 300
Asn Cys Ala Thr His Thr Glu Ile Lys Leu Met Lys Asn Arg Glu Pro
305 310 315 320
Gly Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Phe Ala Gly Trp Asn Met Ile Pro
325 330 335
Asn Ile Lys Lys Val Phe Gly Leu Asp Met Ala Gln Leu Leu Leu Asp
340 345 350
Val Leu Cys Phe Gly Lys Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Leu Leu Asp
355 360 365
Gln Glu Pro Tyr Tyr Val Ala Asp Cys His Leu Tyr Pro Gln His Phe
370 375 380
Lys Gln Asn Gly Gln Ile Pro Glu Thr Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu
385 390 395 400
Ala Ile Asp Ile Pro Asp Gly Leu Leu Lys Gly Asp Thr Glu Ile Val
405 410 415
Ser Phe Ser Ala Ala Ala Pro Gly Thr Ser Val Asp Leu Thr Leu Phe
420 425 430
Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser
435 440 445
Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu
450 455 460
Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val
465 470
<210> 4
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro
1 5 10 15
Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser
20 25 30
Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile
35 40 45
Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Ile Lys Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Ser
50 55 60
Leu Ala Asp Phe Glu His Pro Asp Ser Ile Tyr Trp Ala His Glu Asp
65 70 75 80
His Asn Lys Pro Glu Glu Glu Val Val Glu Gln Ile Val Lys Val Ala
85 90 95
Glu Met Phe Gly Ala Asp Ala Ile Thr Thr Asn Asn Glu Tyr Phe Ile
100 105 110
Ala Pro Met Ala Lys Ala Cys Glu Arg Leu Gly Leu Arg Gly Ala Gly
115 120 125
Val Gln Ala Ala Glu Asn Ala Arg Asp Lys Asn Lys Met Arg Asp Ala
130 135 140
Phe Asn Lys Ala Gly Val Lys Ser Ile Lys Asn Lys Arg Val Thr Thr
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Ile Gly Val Thr Leu Ile Thr
180 185 190
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195 200 205
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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325 330 335
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370 375 380
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385 390 395 400
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420 425 430
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435 440 445
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465 470
<210> 5
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Glu Arg Lys Thr Val Leu Val Ile Ala Asp Leu Gly Gly Cys Pro
1 5 10 15
Pro His Met Phe Tyr Lys Ser Ala Ala Glu Lys Tyr Asn Leu Val Ser
20 25 30
Phe Ile Pro Arg Pro Phe Ala Ile Thr Ala Ser His Ala Ala Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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195 200 205
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Glu Ala Phe Asn Ser Ile Ala Ala Phe Glu Leu Lys Gly Ser Asn Ser
435 440 445
Gln Asp Val Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ile Gln Gln His Ala Lys Leu
450 455 460
Thr Ala Lys Tyr Val Leu Pro Val
465 470

Claims (5)

1.一种L-氨基酸连接酶突变体，其特征在于，所述L-氨基酸连接酶突变体是将如SEQID NO.2所示氨基酸序列的第110位进行突变获得；或者将如SEQ ID NO .2所示氨基酸序列的第108位、第110位同时进行突变获得；
所述的L-氨基酸连接酶突变体的氨基酸序列为下列之一：SEQ ID NO .4、SEQ ID NO.5。
2.一种编码如权利要求1所述L-氨基酸连接酶突变体的基因，其特征在于，该编码基因的制备方法为：是对如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行突变得到的。
3.一种采用如权利要求2所述的L-氨基酸连接酶突变体编码基因构建的重组载体。
4.一种如权利要求3所述重组载体转化制备的重组菌。
5.一种如权利要求4所述的重组载体转化制备的重组菌的应用，其特征在于，可用于生产丙谷二肽。
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