CN110172454B - 一种s-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及其高通量筛选方法 - Google Patents

一种s-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及其高通量筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于S‑腺苷甲硫氨酸合成酶催化活性改造的高通量筛选方法，并通过该高通量筛选方法获得一株催化活性明显提高的eMAT突变体。该突变体比酶活从野生型eMAT的1.82U/mg增加至4.15U/mg。与已报道的303位突变进行组合突变，获得的突变体相比于SEQ ID NO.1编码的eMAT催化活性提高，从而能够在相同反应条件下使1mM底物完全转化的时间提前5min。

Description

一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及其高通量筛选方法
技术领域
本发明涉及一种催化活性提高S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及其高通量筛选方法，属于酶工程领域。
背景技术
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是一种重要的生理活性物质，参与生物体内转甲基、转硫基、转氨丙基等40多种生化反应。临床上，SAM对肝病、抑郁症、关节炎等均具有显著的治疗效果，因此市场需求量巨大。
目前，SAM主要通过微生物发酵法生产，但该法存在生产周期长、底物转化率低、提取过程复杂、产物自消旋等问题。相比较而言，酶催化法因催化效率高、分离提纯简单，因而能够克服这些问题。
S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethioninesynthetase，简称MAT，EC2.5.6.1)，是生物体内唯一一种直接合成SAM的酶，能够催化ATP和L-甲硫氨酸生成SAM，同时生成副产物正磷酸(Pi)和焦磷酸(PPi)。通过比较不同来源MAT的酶学性质，我们发现MAT普遍存在催化活性较低的问题。
目前，分子改造技术已成功应用于MAT催化性能的改善。Dippe等对来源于枯草芽孢杆菌的MAT进行理性设计时发现，将317位异亮氨酸突变为缬氨酸时能增加MAT的催化活性(Chem.Commum(Camb).51(2015)3637-3640)(US Patent20160264945A1)。以此为基础，Yin等在对来源于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的MAT氨基酸残基序列进行对比后，将来源于大肠杆菌MAT(eMAT)的303位异亮氨酸突变为缬氨酸，使eMAT的催化活性有所提高(Molecules22(2017)1365-1377)。
为进一步提高eMAT的催化活性，本发明根据检测Pi的分光光度法成功构建了适合于催化活性改造的高通量筛选方法。同时，将获得的突变位点与已报道的位点进行组合突变，获得一个催化活性更高的突变体。
发明内容
本发明的目的是提供一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体、编码基因、重组载体、重组菌以及用于MAT催化活性改造的高通量筛选方法。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第74位进行点突变获得。
进一步，先将eMAT303位异亮氨酸突变为缬氨酸(I303V),再在303位突变的基础上将74位精氨酸突变为组氨酸(I303V/R74H)。
更进一步，所述突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
本发明还涉及一种编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的基因。
本发明还涉及一种携带所述基因的重组载体。
本发明还涉及一种由重组载体转化制备的重组菌。
本发明还涉及一种eMAT催化活性改造的高通量筛选方法。具体步骤为：以eMAT编码基因为模板，在0.04mM Mn2+下进行易错PCR，构建metK的突变体文库，获得足够多的突变体；然后将携带有突变碱基的重组菌单菌落挑取至96孔板中诱导表达，获得表达S-腺苷合成酶的全细胞；接着利用全细胞催化1mM ATP和1mM L-甲硫氨酸合成SAM，同时生成正磷酸；最后，加入显色液，3min后于620nm处测量吸光值，并从中挑取吸光值改变最大的突变体进行复筛。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明成功建立了一种用于eMAT催化活性改造的高通量筛选方法，通过该筛选方法，筛选得到一个催化活性提高的eMAT突变体，比酶活从野生型1.82U/mg增加至4.15U/mg。通过与已报道的303位突变组合，使得突变体比酶活增加至4.28U/mg。
附图说明
图1metK基因片段核酸电泳图，1泳道为DNA Maker，2泳道为metk基因PCR扩增产物。
图2ATP对显色法测磷酸的影响。
图3显色法测磷酸的标准曲线。
图4野生型eMAT及突变体SDS-PAGE电泳图，泳道1位Maker，泳道2为野生型eMAT纯酶，泳道3为R74H纯酶，泳道4为I303V纯酶，泳道5为I303V/R74H纯酶。
图5不同反应时间L-甲硫氨酸的转化率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行描述，但本发明的保护范围并非仅限于此：
实施例1：eMAT重组菌的构建
选取Escherichia coli K12来源的MAT，利用PCR技术，以E.coli K12基因组为模板，以
metK-F:5’-GATCCGAATTCATGGCAAAACACCTTTTTACG-3’(SEQ ID NO.3)和metK-R:5’-GTGCTCGAGTTACTTCAGACCGGCAGCAT(SEQ ID NO.4)为引物，对metK基因进行扩增，并在其5’端和3’端分别引入EcoR I和Xho I限制性内切酶酶切位点(下划线标出)。PCR反应体系(50μL)为：2×PrimeSTAR Max Premix 25μL，模板DNA 1μL，上下游引物各1μL，无菌水22μL。PCR反应条件为：98℃5min；98℃10s，60℃5s，72℃10s，循环30次；72℃5min。以1％琼脂糖凝胶电泳验证PCR扩增产物，当目的条带大小符合编码SEQ ID NO.1大小时(图1)，用PCR产物回收试剂和进行产物回收。将纯化后的PCR产物和质粒pET-28a(+)分别同时用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切反应。酶切结束后，将酶切产物进行大孔琼脂糖凝胶电泳，并从核酸胶上切下正确的条带用于DNA胶回收。回收后的片段测定浓度后按照摩尔比3：1(目的基因：质粒)进行酶连反应。接着，通过热激法将酶连产物转入到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-metK。
实施例2：eMAT催化活性改造高通量筛选方法的建立
在酸性条件下，Pi可以与钼酸铵发生反应，生成蓝色络合物。孔雀绿可以增加络合物的显色反应，使其在620nm处有明显的吸收峰。因此，将该显色法作为高通量筛选的方法。为确保筛选过程的灵敏性和准确性，首先对实验中可能影响显色的因素进行优化。
以100mMTris-HCl为对照显色，发现ATP会对显色造成影响(图2)。当ATP浓度低于2mM时，OD620随着ATP浓度的增加而线性增加。但与Pi的标准曲线(图3)相比，其斜率仅为1/57。根据拟合曲线Y＝0.18X+0.26可知，当ATP变化0.06mM时，OD620变化不超过0.02，而Pi引起的变化超过0.5。且当ATP为1mM时，OD620仅为0.43，因此选择底物浓度为1mM。另外，细胞浓度也会影响显色反应，因此在高通量筛选时，加入的酶液相对于酶活体系减半。最终确定反应体系为：98μL的预混液含有100mMTris-HCl(pH 8.0)、1mM ATP、1mM L-Met、1mM SAM、20mMMgCl2和150mMKCl，加入2μL细胞重悬液，37℃，反应3-5min。反应结束后，加入100μL新鲜配制的显色液，混匀，静置3min后，于620nm测吸光值。显色液组成见表1。实验前，将A液和B液按体积比1:3混合，室温下搅拌30min后用0.45nm的膜过滤，避光保存。
表1显色液的组成
Figure BDA0002070704190000041
1)以5mM盐酸为溶液
实施例3：突变体文库的构建与高通量筛选
以eMAT编码基因为模板，在0.05mM、0.04mM、0.2mM Mn2+下进行易错PCR建库，并分别随机挑10个单菌落测序，发现仅当Mn2+浓度为0.04mM时，碱基突变率满足易错PCR建库要求(表2)。用高通量筛选方法对该突变体库初筛，获得得8个OD620比对照组至少高0.2的突变体。对这8个突变体进行复筛，最终获得1个比酶活比野生型eMAT明显提高的突变体(R74H)。
表2PCR体系中Mn2+浓度与突变率的关系
Figure BDA0002070704190000042
实施例4：eMAT的两点突变
以重组质粒pET-28a(+)-metK为模板，用Fast Mutagenesis system试剂盒将303位突变为缬氨酸，获得突变体I303V,其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。以突变体I303V为模板，对74位进行定点突变。以R74H-F:5’-GATCACCCGTAACACCGTTCATGAAATTGGCTA -3’(SEQ IDNO.5)和R74H-R:5’-ATGAACGGTGTTACGGGTGATCTCTTC-3’(SEQ ID NO.6)为引物，进行全质粒PCR扩增(94℃ 5min；94℃20s，60℃20s，72℃60s，循环30次；72℃ 10min)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证后用限制酶DpnI对模板进行消化，再通过热激法将消化后的产物转入到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得两点突变的重组菌。突变体I303V/R74H的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
实施例5：野生型eMAT和突变体的诱导表达
将eMAT野生型重组菌和突变体重组菌分别加入到5mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基(1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物，pH 7.0)中，37℃、220rpm培养8-12h。再按2％的接种量，转接1mL至50mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中。待菌体浓度(OD600)达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃、220rpm培养12h。4℃、6000×g离心10min收集菌体，100mMTris-HCl离心重悬3次后，用裂解液(100mMTris-HCl，300mMNaCl，10mM咪唑，5％甘油，pH 8.0)将菌体重悬，使OD600浓缩为8。接着，将重悬的菌体置于冰水浴中超声破胞。
取破胞液上清上样至Ni-NTA亲和柱(购于上海生工生物工程技术服务有限公司)，用裂解液平衡柱成分，用洗杂液(100mMTris-HCl，300mMNaCl，50mM咪唑，5％甘油，pH 8.0)洗去杂质，用洗脱液(100mMTris-HCl，300mMNaCl，250mM咪唑，5％甘油，pH 8.0)洗脱目的蛋白，获得纯酶液。野生型eMAT及突变体纯酶SDS-PAGE电泳图见图4。
实施例6：野生型eMAT和突变体的比酶活测定
酶活的测定方法：总体积为480μL的预混液中含有100mMTris-HCl(pH8.0)、5mMATP、5mM L-甲硫氨酸、20mM MgCl2，150mMKCl，加入20μL纯酶液，37℃、400rpm金属浴反应5min。用0.25mL 20％的高氯酸溶液终止酶反应。4℃、13000rpm离心10min后，用高效液相色谱法测SAM浓度。1个单位酶活(1U)被定义为每分钟转化生成1μmol SAM的酶量。
高效液相色谱法：采用Hypersil BDS C18(250×4.6mm,5μm)色谱柱，以40mM磷酸二氢铵、2mM庚烷磺酸钠和18％(v/v)甲醇水溶液(pH 3.0)为流动相，流动相流速为0.8mL/min，进样量为10μL，在254nm波长下检测SAM出峰面积。
用PierceTM BCA Protein Assay Kit微孔板法测量蛋白质浓度后，计算野生型eMAT和突变体的比酶活，结果见表3。由于突变体I303V/R74H催化活性相较于突变体I303V增加，当底物均为1mM时，突变体I303V/R74H将底物完全转化的时间将比突变体I303V减少(图5)。
表3野生型eMAT和突变体的比酶活
Figure BDA0002070704190000061
实施例7：野生型eMAT和突变体的动力学参数测定
eMAT催化ATP和L-甲硫氨酸转化生成SAM是按照双底物反应机制中的序列机制进行。序列机制的动力学方程为：
Figure BDA0002070704190000062
在测量Km过程，首先将L-甲硫氨酸浓度固定在0.15-0.6mM范围下的某一浓度，测定0-0.2mM ATP的反应速率。再将ATP浓度固定在0.15-0.6mM范围下的某一浓度，测定0-0.2mM L-甲硫氨酸的反应速率。最后根据序列机制Lineweaver-Burk作图法求出Km。野生型eMAT和突变体的动力学参数见表4。
表4野生型eMAT和突变体的动力学参数
Figure BDA0002070704190000063
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及其高通量筛选方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Lys His Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Ser Glu Gly His Pro
1 5 10 15
Asp Lys Ile Ala Asp Gln Ile Ser Asp Ala Val Leu Asp Ala Ile Leu
20 25 30
Glu Gln Asp Pro Lys Ala Arg Val Ala Cys Glu Thr Tyr Val Lys Thr
35 40 45
Gly Met Val Leu Val Gly Gly Glu Ile Thr Thr Ser Ala Trp Val Asp
50 55 60
Ile Glu Glu Ile Thr Arg Asn Thr Val Arg Glu Ile Gly Tyr Val His
65 70 75 80
Ser Asp Met Gly Phe Asp Ala Asn Ser Cys Ala Val Leu Ser Ala Ile
85 90 95
Gly Lys Gln Ser Pro Asp Ile Asn Gln Gly Val Asp Arg Ala Asp Pro
100 105 110
Leu Glu Gln Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr
115 120 125
Asn Glu Thr Asp Val Leu Met Pro Ala Pro Ile Thr Tyr Ala His Arg
130 135 140
Leu Val Gln Arg Gln Ala Glu Val Arg Lys Asn Gly Thr Leu Pro Trp
145 150 155 160
Leu Arg Pro Asp Ala Lys Ser Gln Val Thr Phe Gln Tyr Asp Asp Gly
165 170 175
Lys Ile Val Gly Ile Asp Ala Val Val Leu Ser Thr Gln His Ser Glu
180 185 190
Glu Ile Asp Gln Lys Ser Leu Gln Glu Ala Val Met Glu Glu Ile Ile
195 200 205
Lys Pro Ile Leu Pro Ala Glu Trp Leu Thr Ser Ala Thr Lys Phe Phe
210 215 220
Ile Asn Pro Thr Gly Arg Phe Val Ile Gly Gly Pro Met Gly Asp Cys
225 230 235 240
Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly Gly Met Ala
245 250 255
Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser Lys Val Asp
260 265 270
Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Tyr Val Ala Lys Asn Ile Val Ala
275 280 285
Ala Gly Leu Ala Asp Arg Cys Glu Ile Gln Val Ser Tyr Ala Val Gly
290 295 300
Val Ala Glu Pro Thr Ser Ile Met Val Glu Thr Phe Gly Thr Glu Lys
305 310 315 320
Val Pro Ser Glu Gln Leu Thr Leu Leu Val Arg Glu Phe Phe Asp Leu
325 330 335
Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Gln Met Leu Asp Leu Leu His Pro Ile Tyr
340 345 350
Lys Glu Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Glu His Phe Pro Trp
355 360 365
Glu Lys Thr Asp Lys Ala Gln Leu Leu Arg Asp Ala Ala Gly Leu Lys
370 375 380
<210> 2
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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115 120 125
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130 135 140
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Leu Arg Pro Asp Ala Lys Ser Gln Val Thr Phe Gln Tyr Asp Asp Gly
165 170 175
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180 185 190
Glu Ile Asp Gln Lys Ser Leu Gln Glu Ala Val Met Glu Glu Ile Ile
195 200 205
Lys Pro Ile Leu Pro Ala Glu Trp Leu Thr Ser Ala Thr Lys Phe Phe
210 215 220
Ile Asn Pro Thr Gly Arg Phe Val Ile Gly Gly Pro Met Gly Asp Cys
225 230 235 240
Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly Gly Met Ala
245 250 255
Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser Lys Val Asp
260 265 270
Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Tyr Val Ala Lys Asn Ile Val Ala
275 280 285
Ala Gly Leu Ala Asp Arg Cys Glu Ile Gln Val Ser Tyr Ala Val Gly
290 295 300
Val Ala Glu Pro Thr Ser Ile Met Val Glu Thr Phe Gly Thr Glu Lys
305 310 315 320
Val Pro Ser Glu Gln Leu Thr Leu Leu Val Arg Glu Phe Phe Asp Leu
325 330 335
Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Gln Met Leu Asp Leu Leu His Pro Ile Tyr
340 345 350
Lys Glu Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Glu His Phe Pro Trp
355 360 365
Glu Lys Thr Asp Lys Ala Gln Leu Leu Arg Asp Ala Ala Gly Leu Lys
370 375 380
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatccgaatt catggcaaaa caccttttta cg 32
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgctcgagt tacttcagac cggcagcat 29
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatcacccgt aacaccgttc atgaaattgg cta 33
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgaacggtg ttacgggtga tctcttc 27

Claims (4)

1.一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其特征在于，所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第74位精氨酸进行突变为组氨酸获得。
2.一种编码如权利要求1所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的基因。
3.一种包含如权利要求2所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体编码基因的重组载体。
4.一种包含如权利要求3所述重组载体的重组菌。
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