CN113025592B

CN113025592B - 一种高性能多聚磷酸激酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN113025592B
Application number: CN202110465643.3A
Authority: CN
Inventors: 王金刚; 韦炎龙; 梁岩
Original assignee: Shanghai Banglin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Banglin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-04-28
Filing date: 2021-04-28
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2041-04-28
Also published as: CN113025592A

Abstract

本发明公开了一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5或SEQID NO:7，该突变体的酶活力比野生酶提高了至少4倍，能够用于构建催化生产谷胱甘肽的菌株。

Description

一种高性能多聚磷酸激酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于酶催化和基因工程技术领域，具体地说，涉及一种多聚磷酸激酶突变体及其在构建用于催化生产谷胱甘肽的菌株中的用途。

背景技术

腺嘌呤核苷三磷酸(又称三磷酸腺苷，简称ATP)由1分子腺嘌呤、1分子核糖和3分子磷酸基团组成，是一种高能化合物，是生命代谢过程中重要的能量来源。在活细胞中，它与二磷酸腺苷(简称ADP)进行贮能和放能的相互转化，从而保证酶催化等生命活动的能量供应。在工业酶催化过程中，ATP参与很多重要的活性物质或药物的合成，但因ATP原料价格昂贵，极大限制了ATP耦联的酶促反应的商业化应用，因此酶促反应中ATP的循环再生是当前急需解决的问题。

目前，ATP的再生技术主要有以下三种：1)以葡萄糖为底物，利用酵母细胞糖酵解作用生成ATP。Jun Lin等人(Enzyme and Microbial Technology,44(5,6):269-273)利用酿酒酵母ATP再生系统偶联大肠杆菌催化谷胱甘肽合成，谷胱甘肽产量达到7.82mM。该方法较早应用到工业化酶反应，但需向反应体系中加入大量的旺盛酵母活细胞，导致副产物较多，提高了工业化成本。2)无机磷化合物和ADP在光照条件下生成ATP。由于该方法需要光照参与反应，难以放大生产。3)磷酸转移酶催化高能磷酸化合物和ADP生成ATP。该方法具有工业化应用价值，是ATP再生系统领域的研究重点。

乙酸激酶和多聚磷酸激酶是ATP再生系统中常用的磷酸转移酶。乙酸激酶催化乙酰磷酸合成ATP，催化效率高，但是底物乙酰磷酸盐稳定性差，易分解，导致底物利用率低、副产物多、生产成本高。多聚磷酸激酶催化多聚偏磷酸合成ATP，底物价格低廉且稳定性好，易于工业化生产。2016年，李元等(生物工程学报,2016,12:1745-1749)构建了共表达ATP再生和L-茶氨酸合成酶的重组大肠杆菌菌株，并将其应用于L-茶氨酸的合成中，产物的摩尔产率为86.0％。专利文献CN111850065A报导一种辅助全细胞转化合成L-天冬酰胺的方法，利用III类多聚磷酸激酶2构建了单酶转化AMP再生ATP的系统，并将其应用于L-天冬酰胺的生物合成，得率达到90.15％。但是多聚磷酸激酶的催化效率较低，且酶活受到底物抑制，因此难以进行工业化应用。专利文献CN111254129A报道了一种源于谷氨酸棒杆菌的多聚磷酸激酶及其突变体，可作为ATP再生剂可促进谷胱甘肽合成酶催化法生产谷胱甘肽，但该突变体的酶活力仍达不到进行工业化大规模生产谷胱甘肽的要求。因此需要进一步开发具有更高酶活力的多聚磷酸激酶，以便促进ATP再生系统相关产品的商业化应用。

发明内容

发明人对于多种微生物来源的多聚磷酸激酶进行了广泛的筛选，发现Luteovulumsphaeroides(球形卢帖菌)来源的多聚磷酸激酶lsPPK(NCBI登录号WP_011338472；SEQ IDNO:1)的酶活力较高，能够有效地作为ATP再生剂催化ADP转化为ATP，促进L-谷胱甘肽的生物合成。为了寻找更高性能的多聚磷酸激酶，发明人进一步利用基因工程技术来对该多聚磷酸激酶lsPPK进行改造和筛选，得到了几株多聚磷酸激酶突变体，能够以六聚偏磷酸钠作为底物，高效地催化高能磷酸键转移至ADP上，产生ATP，实现以多聚偏磷酸为底物的ATP再生系统的工业化应用、尤其是在生产谷胱甘肽中的应用。以此为基础，本发明包括如下技术方案。

一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7，其中，

SEQ ID NO:5为野生型多聚磷酸激酶(lsPPK)的氨基酸序列SEQ ID NO:1第13位的A替换为E、第77位的E替换为D、第260位的T替换为I、第328位的P替换为Q的突变体：

MAEDRAMPVMPPEADAAEAVPAAPTALPEEGPAGPEAPLQTLHGPRHFPAVDANAIRQAFEGGHYPYPRRLGRVVYDAEKARLQAELLKVQIWAQETGQKFVILMEGRDAAGKGGTIKRFMEHLNPRYARVVALTKPGERERGQWFFQRYIEHLPTAGEIVFFDRSWYNRAGVERVMGFCTPSEYLEFMRQAPELERMLVRSGIRLYKYWFSVTRDEQRARFLARETDPLKRWKLSPIDKASLDKWDDYTEAKEAMFFYIDTADAPWTIVKSNDKKRARLNCMRHFLSSLDYPGKDPEVVGVPDPLIVGRAAQVIGTAADILDSATPQALRKPRQG(SEQ ID NO:5)。

SEQ ID NO:7为多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:5第107位的G替换为V、第245位的K替换为T的突变体，即为野生型多聚磷酸激酶(lsPPK)的氨基酸序列SEQ ID NO:1第13位的A替换为E、第77位的E替换为D、第260位的T替换为I、第328位的P替换为Q、第107位的G替换为V、第245位的K替换为T的突变体：

MAEDRAMPVMPPEADAAEAVPAAPTALPEEGPAGPEAPLQTLHGPRHFPAVDANAIRQAFEGGHYPYPRRLGRVVYDAEKARLQAELLKVQIWAQETGQKFVILMEVRDAAGKGGTIKRFMEHLNPRYARVVALTKPGERERGQWFFQRYIEHLPTAGEIVFFDRSWYNRAGVERVMGFCTPSEYLEFMRQAPELERMLVRSGIRLYKYWFSVTRDEQRARFLARETDPLKRWKLSPIDKASLDTWDDYTEAKEAMFFYIDTADAPWTIVKSNDKKRARLNCMRHFLSSLDYPGKDPEVVGVPDPLIVGRAAQVIGTAADILDSATPQALRKPRQG(SEQ ID NO:7)。

根据本发明的第二个方面，提供了编码上述多聚磷酸激酶突变体的基因。

优选地，当大肠杆菌作为宿主表达上述多聚磷酸激酶突变体时，编码多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:5的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:6，编码多聚磷酸激酶突变体SEQID NO:7的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:8。

根据本发明的第三个方面，提供了包含上述基因的质粒。该质粒包含用于表达上述基因的载体，优选载体是PET系列，比如载体是pET22b、pET24a、pET28a等，但并不受限于此。

根据本发明的第四个方面，提供了转化了上述质粒、用于表达上述多聚磷酸激酶突变体的微生物，该微生物可作为宿主用于表达上述多聚磷酸激酶突变体。

优选地，上述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

为了使得表达上述多聚磷酸激酶突变体的基因工程菌还能够同时表达谷胱甘肽双功能酶基因gshF，将ATP再生系统与谷胱甘肽生物合成催化系统整合在一起，从而形成一个复合型催化体系，优选所述微生物细胞中导入了谷胱甘肽双功能酶基因gshF。

上述的谷胱甘肽双功能酶例如可以是无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)来源的谷胱甘肽双功能酶(NCBI登录号WP_000582678.1)，氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

优选地，当大肠杆菌作为宿主时，所述谷胱甘肽双功能酶基因gshF的核苷酸序列可以为SEQ ID NO:4。

根据本发明的第五个方面，提供了上述微生物在生产L-谷胱甘肽中的用途。

在谷胱甘肽生产中，谷胱甘肽合成酶是生物催化剂，谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸是反应底物，上述多聚磷酸激酶突变体作为ATP再生剂催化ADP转化ATP，促进L-谷胱甘肽的生物合成。

在生产谷胱甘肽的合成反应体系中，同时表达谷胱甘肽合成酶和多聚磷酸激酶突变体的微生物可以呈菌体或者其细胞破碎物形式。

生产谷胱甘肽可采用常规的工艺条件，比如，反应温度选择20-40℃，例如25-35℃。

优选地，反应体系中添加有ATP、氯化镁和六聚偏磷酸钠，例如添加有3-20mM的ATP，优选5-15mM的ATP；10-50mM氯化镁，例如20-40mM氯化镁；20-70mM六聚偏磷酸钠，例如30-50mM六聚偏磷酸钠。其中ATP可为谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成谷胱甘肽的缩合反应提供能量，Mg²⁺是gshF酶的激活因子，六聚偏磷酸钠是多聚磷酸激酶突变体的底物。

反应体系可以为pH7.0-9.0，例如pH7.5-8.0。

当本发明构建的突变体SEQ ID NO:7应用于谷胱甘肽的酶法合成中时，可以辅助谷胱甘肽合成酶催化的缩合反应，在8个小时内产生超过111mM的L-谷胱甘肽，产物生成率超过92％，值得进一步开发利用。

附图说明

图1为用于敲除gshA基因的着陆质粒pBDC-gshAd的结构示意图。

图2为用于敲除gshB基因的着陆质粒pBDC-gshBd的结构示意图。

图3为用于表达野生型多聚磷酸激酶的重组质粒pET22b-lsPPK的结构示意图。

图4为用于表达谷胱甘肽双功能酶gshF的重组质粒pACT-gshF的结构示意图。

具体实施方式

本发明构建的多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7是Luteovulumsphaeroides来源的野生型多聚磷酸激酶lsPPK的氨基酸序列SEQ ID NO:1序列中个别氨基酸发生替换后的新蛋白质，其中野生型多聚磷酸激酶SEQ ID NO:1的NCBI登录号为WP_011338472：

MAEDRAMPVMPPAADAAEAVPAAPTALPEEGPAGPEAPLQTLHGPRHFPAVDANAIRQAFEGGHYPYPRRLGRVVYEAEKARLQAELLKVQIWAQETGQKFVILMEGRDAAGKGGTIKRFMEHLNPRYARVVALTKPGERERGQWFFQRYIEHLPTAGEIVFFDRSWYNRAGVERVMGFCTPSEYLEFMRQAPELERMLVRSGIRLYKYWFSVTRDEQRARFLARETDPLKRWKLSPIDKASLDKWDDYTEAKEAMFFYTDTADAPWTIVKSNDKKRARLNCMRHFLSSLDYPGKDPEVVGVPDPLIVGRAAQVIGTAADILDSATPPALRKPRQG(SEQ ID NO:1)。

两个突变体SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7的共同特征是A13E、E77D、T260I、P328Q突变，而突变体SEQ ID NO:7又是SEQ ID NO:5的G107V、K245T突变体。

现有技术CN111254129A报道的多聚磷酸激酶与谷胱甘肽合成酶联合催化生产谷胱甘肽的方法中，将谷胱甘肽合成酶表达微生物和多聚磷酸激酶表达微生物分别进行发酵培养，然后将这两种微生物的菌体细胞共同加入到反应体系中。该方法的缺陷包括：1.两种菌体细胞或者两种酶的投料量难以精确控制，容易造成其中一种菌体细胞或酶的浪费；2.两种微生物需要分别进行发酵培养后后处理，生产成本较高。

为了克服上述缺陷，本发明将多聚磷酸激酶(或其突变体)基因构建到pET系统质粒中，而谷胱甘肽双功能酶(谷胱甘肽合成酶)基因构建到含有p15A复制子的表达系统中，两种质粒可以在微生物中共表达，实现两种酶的共表达，从而实现ATP再生系统与谷胱甘肽生物合成催化系统的整合，构建成一个“混合反应器”，只需要一种微生物的发酵，就可将菌体细胞作为生物催化剂投入到反应体系中来合成谷胱甘肽。

本发明为了便于多聚磷酸激酶突变酶的高通量筛选，采用偶联反应的方式，将多聚磷酸激酶和谷胱甘肽合成酶组合在一起，以谷胱甘肽产量间接作为多聚磷酸激酶活力对比的依据，在构建该筛选体系中的双酶共表达微生物时，本发明将宿主菌比如大肠杆菌基因组中的两种基因gshA(γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因)和gshB(谷胱甘肽合成酶基因)进行了敲除。gshA和gshB是宿主中天然的合成谷胱甘肽的基因，敲除它们能够消除筛选过程中的背景干扰。

在基因gshA的敲除中，使用了着陆质粒(又称着陆垫质粒，landing pad plasmid，是基因敲除中搭载重组片段的质粒)pBDC-gshAd和配合使用的质粒pCNA及pSNK来敲除gshA基因。在基因gshB的敲除中，使用了着陆质粒pBDC-gshBd和配合使用的质粒pCNA及pSNK来敲除gshB基因。

众所周知，同样一种核苷酸序列，在不同的微生物宿主中的表达结果往往有很大差异。为了在基因工程中最常用的大肠杆菌中最佳地表达多聚磷酸激酶或其突变体、谷胱甘肽双功能酶，本发明对这些酶的表达基因进行了密码子优化。

密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。

为了在大肠杆菌中表达野生型多聚磷酸激酶SEQ ID NO:1及其突变体SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7、以及谷胱甘肽双功能酶SEQ ID NO:3，本发明对它们的编码基因进行了密码子优化，其中野生型多聚磷酸激酶SEQ ID NO:1的编码基因是SEQ ID NO:2；多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:5的编码基因是SEQ ID NO:6；多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:7的编码基因是SEQ ID NO:8；谷胱甘肽双功能酶SEQ ID NO:3的编码基因是SEQ ID NO:4。

在本发明中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多聚磷酸激酶lsPPK。为了表述方便起见，在本发明中可以将野生型多聚磷酸激酶与其突变体统称为“多聚磷酸激酶”。

为了评估多聚磷酸激酶突变体的酶活力，可以按照专利文献CN111254129A报道的DTNB显色法来测定酶活。

本发明的多聚磷酸激酶突变体的氨基酸数量只有336个，且结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。

上述转化体宿主可以使任何适合表达多聚磷酸激酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者枯草芽孢杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

在生产谷胱甘肽的反应体系中，本发明构建的微生物比如大肠杆菌BL21(DE3)工程菌可以呈现菌体的形式来作为催化剂，菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。

上述菌体形式本身就是一种天然的固定化酶体系，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以用于催化反应。由于反应底物和反应产物都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

实施例

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

质粒pCNA、pSNK和pBDC-1d由华东理工大学国家生化工程技术研究中心(上海)赠送。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K₂HPO₄.3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

谷胱甘肽含量HPLC检测方法(参照专利文献CN111254129A)：

仪器	安捷伦1260
		色谱柱	C18(4.6mm250mm5u)
流动相A	6.8g/L磷酸二氢钾+2.2g/L 1-庚烷磺酸钠
		流动相B	甲醇
A:B	90：10
		流速	1mL/min
柱温	30℃
		波长	210nm

实施例1大肠杆筛选宿主的构建

参照文献(Yanlong Wei,et al.,An electroporation-free method based onRed recombineering for markerless deletion and genomic replacement in theEscherichia coli DH1genome.PloS One,2017,12(10):e0186891.)报道的Red重组方法，分别敲除大肠杆菌BL21(DE3)基因组上的gshA基因和gshB基因。

1.1根据公开的大肠杆菌BL21(DE3)基因组(GenBank:CP001509.3)序列，设计引物如下：

GSHAL-5：CCCAAGCTTTATTCCTCGTCCTGCTGGG，

GSHAL-3：CGAGCTCCGTAATCTGCTGCGTGAAGA，

GSHAR-5：

CGGGATCCAAATCCTCTTCGCGCAGAATTTCCAGCGGCTCTTCACGCAGCAGATTACGGCCATCAGCATTAACACGCA，

GSHAR-3：CCGCTCGAGTCCTCTTGTTGATGTGGTGAA，

GSHBL-5：CCCAAGCTTCCCCGCATTTATCATCCTGA，

GSHBL-3：GGAATTCGCCATTGATCAGATACAGATC，

GSHBR-5：

CATGCCATGGGTTACGAACTTCACTATATGGAGATGGGCGATCTGTATCTGATCAATGGCAGCCCAACCTGTATTCGTGA，

GSHBR-3：CCGCTCGAGTGCTTTTGGTGCCGAAGTCG。

1.2以BL21(DE3)基因组DNA为模板扩增gshA基因的左同源区。

PCR反应体系包括：引物GSHAL-5和GSHAL-3各50pmol，BL21(DE3)DNA模板100ng，1×KOD neo plus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，KOD neo plus 1U，补ddH₂O至总体系50μL。

PCR扩增条件为：95℃5min；98℃15s，57℃30s，68℃30s/kbp，30个循环；68℃10min。

PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，Axygen胶回收试剂盒回收大约1.0kb左右的特异条带。用HindIII和Sac I于37℃双酶切2小时，酶切体系包括：PCR产物42μL，10×FD buffer 5μL，Hind III 1.5μL，Sac I 1.5μL。Axygen胶回收试剂盒过柱纯化回收，获得DNA片段GSHAL-HS。

1.3以BL21(DE3)基因组DNA为模板扩增gshA基因的右同源区。

PCR反应体系包括：引物GSHAR-5和GSHAR-3各50pmol，BL21(DE3)DNA模板100ng，1×KOD neo plus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，KOD neo plus 1U，补ddH₂O至总体系50μL。

PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，Axygen胶回收试剂盒回收大约1.0kb左右的特异条带。用BamH I和Xho I于37℃双酶切2小时，酶切体系包括：PCR产物42μL，10×FD buffer 5μL，BamH I1.5μL，Xho I 1.5μL。Axygen胶回收试剂盒过柱纯化回收，获得DNA片段GSHAR-BX。

1.4以BL21(DE3)基因组DNA为模板扩增gshB基因的左同源区。

PCR反应体系包括：引物GSHBL-5和GSHBL-3各50pmol，BL21(DE3)DNA模板100ng，1×KOD neo plus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，KOD neo plus 1U，补ddH₂O至总体系50μL。

PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，Axygen胶回收试剂盒回收大约0.9kb左右的特异条带。用HindIII和EcoR I于37℃双酶切2小时，酶切体系包括：PCR产物42μL，10×FD buffer 5μL，Hind III 1.5μL，EcoR I 1.5μL。Axygen胶回收试剂盒过柱纯化回收，获得DNA片段GSHBL-HE。

1.5以BL21(DE3)基因组DNA为模板扩增gshB基因的右同源区。

PCR反应体系包括：引物GSHBR-5和GSHBR-3各50pmol，BL21(DE3)DNA模板100ng，1×KOD neo plus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，KOD neo plus 1U，补ddH₂O至总体系50μL。

PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，Axygen胶回收试剂盒回收大约0.9kb左右的特异条带。用NcoI和Xho I于37℃双酶切2小时，酶切体系包括：PCR产物42μL，10×FD buffer 5μL，NcoI1.5μL，Xho I 1.5μL。Axygen胶回收试剂盒过柱纯化回收，获得DNA片段GSHBR-NX。

1.6利用Sac I和BamH I于37℃双酶切质粒pBDC-1d约2小时，酶切体系包括：pBDC-1d 42μL，10×FD buffer 5μL，Sac I 1.5μL，BamH I 1.5μL。Axygen胶回收试剂盒过柱纯化回收约1.0kb的DNA片段，获得CAT-A。

利用EcoR I和Nco I于37℃双酶切质粒pBDC-1d约2小时，酶切体系包括：pBDC-1d42μL，10×FD buffer 5μL，EcoR I 1.5μL，Nco I 1.5μL。Axygen胶回收试剂盒过柱纯化回收约1.0kb的DNA片段，获得CAT-B。

利用HindIII I和Xho I于37℃双酶切质粒pBDC-1d约2小时，酶切体系包括：pBDC-1d 42μL，10×FD buffer 5μL，HindIII 1.5μL，Xho I 1.5μL。Axygen胶回收试剂盒过柱纯化回收约3.5kb的DNA骨架BDC。

1.7将片段GSHAL-HS、GSHAR-BX、CAT-A同时与骨架BDC混合，用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，转化E.coli DH5α感受态细胞，获得重组质粒pBDC-gshAd，质粒图谱见图1。

1.8将片段GSHBL-HE、GSHBR-NX、CAT-B同时与骨架BDC混合，用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，转化E.coli DH5α感受态细胞，获得重组质粒pBDC-gshBd，质粒图谱见图2。

1.9挑取含有质粒pCNA和着陆质粒pBDC-gshAd的BL21(DE3)单克隆，于5mL LB培养基(含50μg/mL Amp和25μg/mL Cm)在30℃培养至OD_600nm为0.3～0.4，加入0.2％L-阿拉伯糖诱导Red重组酶(Exo、Bet、Gam)和核酸内切酶(I-CreI)表达。核酸内切酶I-CreI切割着陆质粒pBDC-gshAd产生靶向DNA片段，在Red重组酶的辅助下，将装载着cat基因和I-SceI位点的靶向DNA片段整合到基因组上，获得BL21(DE3)ΔgshA::cat。挑取含有pSNK质粒的BL21(DE3)ΔgshA::cat单克隆，于5mL LB培养基(含25μg/mL Kan)在30℃培养至OD_600nm为0.3～0.4，加入0.2％L-阿拉伯糖诱导Red重组酶(Exo、Bet、Gam)和核酸内切酶(I-SceI)表达。核酸内切酶I-SceI切割基因组DNA上的I-SceI位点产生双链DNA断裂，在Red重组酶以及宿主的自身DNA修复机制作用下，断裂的基因组DNA修复，实现目的位点的无痕敲除，获得菌株BL21(DE3)ΔgshA。

1.10挑取含有pCNA和着陆质粒pBDC-gshBd质粒的BL21(DE3)ΔgshA单克隆，于5mLLB培养基(含50μg/mL Amp和25μg/mL Cm)在30℃培养至OD_600nm为0.3～0.4，加入0.2％L-阿拉伯糖诱导Red重组酶(Exo、Bet、Gam)和核酸内切酶(I-CreI)表达。核酸内切酶I-CreI切割着陆质粒pBDC-gshBd产生靶向DNA片段，在Red重组酶的辅助下，将装载着cat基因和I-SceI位点的靶向DNA片段整合到基因组上，获得BL21(DE3)ΔgshAΔgshB::cat。挑取含有pSNK质粒的BL21(DE3)ΔgshAΔgshB::cat单克隆，于5mL LB培养基(含25μg/mL Kan)在30℃培养至OD_600nm为0.3～0.4，加入0.2％L-阿拉伯糖诱导Red重组酶(Exo、Bet、Gam)和核酸内切酶(I-SceI)表达。核酸内切酶I-SceI切割基因组DNA上的I-SceI位点产生双链DNA断裂，在Red重组酶以及宿主的自身DNA修复机制作用下，断裂的基因组DNA修复，实现目的位点的无痕敲除，获得菌株BL21(DE3)ΔgshAΔgshB，该菌株将用作后续筛选的宿主。

实施例2野生型多聚磷酸激酶基因重组大肠杆菌的构建

以Luteovulum sphaeroides来源的多聚磷酸激酶lsPPK(NCBI登录号WP_011338472)即SEQ ID NO:1为基础进行密码子优化，全基因合成基因序列SEQ ID NO:2，并在基因两端设计限制性内切酶位点Nde I和XhoI，亚克隆到载体pET22b(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET22b-lsPPK，质粒图谱见图3。将重组质粒pET22b-lsPPK转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)ΔgshAΔgshB，得到表达野生型多聚磷酸激酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)ΔgshAΔgshB/pET22b-lsPPK。

实施例3装载L-谷胱甘肽合成途经表达载体的构建

以无乳链球菌Streptococcus agalactiae来源的谷胱甘肽双功能酶gshF(NCBI登录号WP_000582678.1)即SEQ ID NO:3为基础进行密码子优化，全基因合成基因序列SEQ IDNO:4，并在基因两端设计限制性内切酶位点Nde I和XhoI，亚克隆到载体pET22b(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET22b-gshF。

以质粒pET22b-gshF为模板，以GSHF-5(5’-GAGGATCGAGATCTCGATC-3’)、GSHF-3(5’-TCCGGATATAGTTCCTCCTTT-3’)为引物，PCR扩增约2.6kb的DNA片段GSHF。以质粒pACYC184为模板，以CMORI-5(5’-GAGGAACTATATCCGGAGAGCCTTCAACCCAGTCAG-3’)、CMORI-3(5’-TCGAGATCTCGATCCTCATTCAGGCGTAGCACCAGG-3’)为引物，PCR扩增约2.1kb的DNA骨架CMORI。利用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的体外重组试剂盒对片段GSHF和骨架CMORI体外重组，获得质粒pACT-gshF，质粒图谱见图4。

实施例4多聚磷酸激酶随机突变库的构建及筛选方法

4.1第一轮随机突变库的构建

以SEQ ID NO:2为模板，以正向引物T7(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')、反向引物T7t(5'-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3')为引物对，利用安捷伦科技有限公司(AgilentTechnologies)的随机突变试剂盒PCR扩增，获得lsPPK突变体片段。反应体系：10×Buffer缓冲液5μL、dNTP Mixture 10mM、正向引物、反向引物和酶各1μL、模板100～600ng、加ddH₂O补至50μL。PCR扩增条件：95℃变性5min；(95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1.2min)共10循环；(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.2min)共12～15循环；72℃延伸7min。

将限制性内切酶DpnI加入到PCR反应后的溶液中消除甲基化模板，随后电泳、胶回收纯化PCR反应扩增出的DNA片段。利用限制性内切酶NdeI、BamHI消化DNA片段，利用T4DNA连接酶将DNA片段插入到载体pET22b骨架上。接着利用爱思进生物技术(杭州)有限公司的PCR清洁试剂盒除去连接反应体系中的缓冲液和酶，纯化DNA后，将回收液电转到BL21(DE3)ΔgshAΔgshB电转化感受态细胞中，加液体LB培养基孵育1h，涂布含有Amp的固体LB平板，获得包含3760个菌株的突变文库。

对突变文库中的菌株进行多聚磷酸激酶活力测定。

4.2第二轮随机突变库的构建

以从第一轮随机突变库中筛选到活力最高的多聚磷酸激酶突变体基因作为模板，以T7和T7t作为引物进行第二轮随机突变库的构建。PCR反应体系以及操作步骤同4.1，获得包含4700多株菌株的突变文库。

4.3随机突变库转化子的高通量筛选培养

挑取随机突变库中的转化子到400μL含有50μg/mL氨苄青霉素LB液体培养基的96孔深孔培养板中培养过夜。随后取80μl过夜培养物，转接至720μl含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃下培养3h后，加入终浓度0.5mM IPTG，降温至25℃，培养过夜诱导多聚磷酸激酶突变体的表达。次日，96孔深孔培养板在4000rpm下离心15min，弃上清，加入100μL无菌水重悬菌体用于酶活力测定。

4.4多聚磷酸激酶突变体的活力测定

向上述步骤4.3中的100μL菌悬液加入100μL底物反应液(0.2M Tris-HCl缓冲液、40mM MgCl₂、120mM谷氨酸钠、120mM甘氨酸、120mM半胱氨酸、10mM ATP、100mM六聚偏磷酸钠，溶解完全后，用氢氧化钠溶液校正pH8.0)，在30℃的条件下反应30min。加入200μL 0.5MNaOH溶液中终止，随后在4℃，5000rpm条件下离心10min。利用DTNB显色法测定多聚磷酸激酶酶活，取20μL离心后的上清液转移至新的96孔板中，加入3％甲醛溶液10μL和DTNB显色剂(0.1mM DTNB，0.2M Tris-HCl缓冲液(pH8.0))150μL，室温放置5min后，测定412nm波长处的吸光值。

第一轮随机突变对3,760个突变体进行筛选，获得一株酶活力更高的突变体lsPPK3341。委托苏州金唯智生物科技有限公司对菌株lsPPK3341的基因组进行测序，通过与野生型lsPPK进行序列对比，确认该突变体的突变位点为A13E、E77D、T260I、P328Q。该突变菌株lsPPK3341可表示为BL21(DE3)ΔgshAΔgshB/pET22b-lsPPK3341。

DTNB显色反应显示，突变株BL21(DE3)ΔgshAΔgshB/pET22b-lsPPK3341的活力约是野生型菌株BL21(DE3)ΔgshAΔgshB/pET22b-lsPPK的5.6倍。

第二轮随机突变是在突变体lsPPK3341基础上进行，对4,700个突变体进行筛选，获得一株酶活力更高的突变体lsPPK8097。委托苏州金唯智生物科技有限公司对菌株lsPPK3341的基因组进行测序，通过与突变体lsPPK3341菌株进行序列对比，确认该突变体的突变位点为G107V、K245T。该突变菌株lsPPK8097可表示为BL21(DE3)ΔgshAΔgshB/pET22b-lsPPK8097。

DTNB显色反应显示，突变株BL21(DE3)ΔgshAΔgshB/pET22b-lsPPK8097的活力约是BL21(DE3)ΔgshAΔgshB/pET22b-lsPPK3341的2.1倍，约是野生型菌株BL21(DE3)ΔgshAΔgshB/pET22b-lsPPK的11.8倍。

实施例5多聚磷酸激酶突变体用于生产L-谷胱甘肽

将质粒pET22b-lsPPK、pET22b-lsPPK3341和pET22b-lsPPK8097分别与质粒pACT-gshF共转化到BL21(DE3)感受态细胞中，涂布含有25μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL氨苄青霉素的LB平板，获得合成谷胱甘肽的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pACT-gshF/pET22b-lsPPK、BL21(DE3)/pACT-gshF/pET22b-lsPPK3341和BL21(DE3)/pACT-gshF/pET22b-lsPPK8097。挑取单菌落接种至5mL含25μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，在37℃，220rpm下培养过夜。取2mL过夜培养物转接至200mL液体TB培养基中，于37℃，220rpm培养2-3h，至OD_600nm约为0.6-0.8时，加入0.1mM IPTG诱导谷胱甘肽双功能酶和多聚磷酸激酶表达，于28℃，200rpm培养过夜。如需保存菌体，在4℃，10,000rpm条件下离心10min，收集菌体，-80℃冷冻保存。

合成L-谷胱甘肽的酶反应体系：0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、20mM MgCl₂、120mM谷氨酸钠、120mM甘氨酸、120mM半胱氨酸、5mM ATP、50mM六聚偏磷酸钠，溶解完全后，定容到50mL，用氢氧化钠校正pH值为8.0。随后加入终浓度5％w/v表达谷胱甘肽双功能酶和多聚磷酸激酶的BL21(DE3)/pACT-gshF/pET22b-lsPPK、BL21(DE3)/pACT-gshF/pET22b-lsPPK3341或BL21(DE3)/pACT-gshF/pET22b-lsPPK8097冻融菌体，加纯水补充反应体积至100mL，在30℃的条件下，搅拌反应8个小时(反应开始3小时后补加20mM半胱氨酸)，利用HPLC检测L-谷胱甘肽含量。

结果表明，多聚磷酸激酶突变体lsPPK3341(SEQ ID NO:5)和lsPPK8097(SEQ IDNO:7)能够有效地提升ATP的再生率，用于谷胱甘肽的合成。多聚磷酸激酶突变体lsPPK3341和lsPPK8097参与的反应体系中L-谷胱甘肽的产量浓度分别达到101.3mM和111.3mM，即产物生成率分别达到84.4％和92.8％。而含有野生型多聚磷酸激酶基因的菌株BL21(DE3)/pACT-gshF/pET22b-lsPPK参与的反应体系中L-谷胱甘肽的产量浓度约为78.4mM。

综上所述，相比野生型多聚磷酸激酶lsPPK，本发明构建的多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7、尤其是SEQ ID NO:7对于ATP再生的能力提升明显，将其应用于谷胱甘肽的酶催化合成中，可以在8个小时内，辅助催化合成可以产生111.3mM的产物，产物生成率92.8％，值得进一步开发利用。

序列表

<110> 上海邦林生物科技有限公司

<120> 一种高性能多聚磷酸激酶突变体及其应用

<130> SHPI2110094

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 336

<212> PRT

<213> Luteovulum sphaeroides

<400> 1

Met Ala Glu Asp Arg Ala Met Pro Val Met Pro Pro Ala Ala Asp Ala

1 5 10 15

Ala Glu Ala Val Pro Ala Ala Pro Thr Ala Leu Pro Glu Glu Gly Pro

20 25 30

Ala Gly Pro Glu Ala Pro Leu Gln Thr Leu His Gly Pro Arg His Phe

35 40 45

Pro Ala Val Asp Ala Asn Ala Ile Arg Gln Ala Phe Glu Gly Gly His

50 55 60

Tyr Pro Tyr Pro Arg Arg Leu Gly Arg Val Val Tyr Glu Ala Glu Lys

65 70 75 80

Ala Arg Leu Gln Ala Glu Leu Leu Lys Val Gln Ile Trp Ala Gln Glu

85 90 95

Thr Gly Gln Lys Phe Val Ile Leu Met Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly

100 105 110

Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg Phe Met Glu His Leu Asn Pro Arg Tyr

115 120 125

Ala Arg Val Val Ala Leu Thr Lys Pro Gly Glu Arg Glu Arg Gly Gln

130 135 140

Trp Phe Phe Gln Arg Tyr Ile Glu His Leu Pro Thr Ala Gly Glu Ile

145 150 155 160

Val Phe Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val Glu Arg Val

165 170 175

Met Gly Phe Cys Thr Pro Ser Glu Tyr Leu Glu Phe Met Arg Gln Ala

180 185 190

Pro Glu Leu Glu Arg Met Leu Val Arg Ser Gly Ile Arg Leu Tyr Lys

195 200 205

Tyr Trp Phe Ser Val Thr Arg Asp Glu Gln Arg Ala Arg Phe Leu Ala

210 215 220

Arg Glu Thr Asp Pro Leu Lys Arg Trp Lys Leu Ser Pro Ile Asp Lys

225 230 235 240

Ala Ser Leu Asp Lys Trp Asp Asp Tyr Thr Glu Ala Lys Glu Ala Met

245 250 255

Phe Phe Tyr Thr Asp Thr Ala Asp Ala Pro Trp Thr Ile Val Lys Ser

260 265 270

Asn Asp Lys Lys Arg Ala Arg Leu Asn Cys Met Arg His Phe Leu Ser

275 280 285

Ser Leu Asp Tyr Pro Gly Lys Asp Pro Glu Val Val Gly Val Pro Asp

290 295 300

Pro Leu Ile Val Gly Arg Ala Ala Gln Val Ile Gly Thr Ala Ala Asp

305 310 315 320

Ile Leu Asp Ser Ala Thr Pro Pro Ala Leu Arg Lys Pro Arg Gln Gly

325 330 335

<210> 2

<211> 1008

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atggccgaag accgcgccat gccggttatg ccgccggcgg ccgatgcggc cgaggcggtg 60

ccggcggcgc caacggcgtt accggaagaa ggcccggccg gcccggaagc gccgctgcag 120

accctgcatg gcccgcgcca ttttccggcg gtggatgcga acgcgattcg ccaagcgttt 180

gaaggcggcc attatccgta tccgcgccgc ctgggccgcg tggtgtatga agcggaaaaa 240

gcgcgcctgc aagcggaact gctgaaagtg cagatttggg cgcaagaaac cggtcagaaa 300

tttgtgattc tgatggaagg ccgcgatgcg gcgggcaaag gcggcaccat taaacgcttt 360

atggaacatc tgaacccgcg ctatgcgcgc gtggtggcgc tgaccaaacc gggcgaacgc 420

gaacgcggtc agtggttttt tcagcgctat attgaacatc tgccgaccgc gggcgaaatt 480

gtgttttttg atcgcagctg gtataaccgc gcgggcgtgg agcgcgtgat gggcttttgc 540

accccgagcg aatatctgga atttatgcgc caagcgccgg aactggaacg tatgctggtg 600

cgcagcggca ttcgcctgta taaatattgg tttagcgtga cccgcgatga acagcgcgcg 660

cgctttctgg cgcgcgaaac cgatccgctg aaacgctgga aactgagccc gattgataaa 720

gcgagcctgg ataaatggga tgactatacc gaagcgaaag aagcgatgtt cttttatacc 780

gataccgcgg atgcgccgtg gaccattgtg aaaagcaacg ataaaaaacg cgcgcgcctg 840

aactgtatgc gccattttct gagcagcctg gattatccgg gcaaagatcc ggaagtggtg 900

ggcgtgccgg acccgctgat tgtgggccgc gcggcgcaag tgattggcac cgcggcggat 960

attctggata gcgcgacccc gccggcgctg cgcaaaccgc gccaaggc 1008

<210> 3

<211> 750

<212> PRT

<213> Streptococcus agalactiae

<400> 3

Met Ile Ile Asp Arg Leu Leu Gln Arg Ser His Ser His Leu Pro Ile

1 5 10 15

Leu Gln Ala Thr Phe Gly Leu Glu Arg Glu Ser Leu Arg Ile His Gln

20 25 30

Pro Thr Gln Arg Val Ala Gln Thr Pro His Pro Lys Thr Leu Gly Ser

35 40 45

Arg Asn Tyr His Pro Tyr Ile Gln Thr Asp Tyr Ser Glu Pro Gln Leu

50 55 60

Glu Leu Ile Thr Pro Ile Ala Lys Asp Ser Gln Glu Ala Ile Arg Phe

65 70 75 80

Leu Lys Ala Ile Ser Asp Val Ala Gly Arg Ser Ile Asn His Asp Glu

85 90 95

Tyr Leu Trp Pro Leu Ser Met Pro Pro Lys Val Arg Glu Glu Asp Ile

100 105 110

Gln Ile Ala Gln Leu Glu Asp Ala Phe Glu Tyr Asp Tyr Arg Lys Tyr

115 120 125

Leu Glu Lys Thr Tyr Gly Lys Leu Ile Gln Ser Ile Ser Gly Ile His

130 135 140

Tyr Asn Leu Gly Leu Gly Gln Glu Leu Leu Thr Ser Leu Phe Glu Leu

145 150 155 160

Ser Gln Ala Asp Asn Ala Ile Asp Phe Gln Asn Gln Leu Tyr Met Lys

165 170 175

Leu Ser Gln Asn Phe Leu Arg Tyr Arg Trp Leu Leu Thr Tyr Leu Tyr

180 185 190

Gly Ala Ser Pro Val Ala Glu Glu Asp Phe Leu Asp Gln Lys Leu Asn

195 200 205

Asn Pro Val Arg Ser Leu Arg Asn Ser His Leu Gly Tyr Val Asn His

210 215 220

Lys Asp Ile Arg Ile Ser Tyr Thr Ser Leu Lys Asp Tyr Val Asn Asp

225 230 235 240

Leu Glu Asn Ala Val Lys Ser Gly Gln Leu Ile Ala Glu Lys Glu Phe

245 250 255

Tyr Ser Pro Val Arg Leu Arg Gly Ser Lys Ala Cys Arg Asn Tyr Leu

260 265 270

Glu Lys Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Phe Arg Thr Phe Asp Leu Asn Pro

275 280 285

Phe Ser Pro Ile Gly Ile Thr Gln Glu Thr Val Asp Thr Val His Leu

290 295 300

Phe Leu Leu Ala Leu Leu Trp Ile Asp Ser Ser Ser His Ile Asp Gln

305 310 315 320

Asp Ile Lys Glu Ala Asn Arg Leu Asn Asp Leu Ile Ala Leu Ser His

325 330 335

Pro Leu Glu Lys Leu Pro Asn Gln Ala Pro Val Ser Asp Leu Val Asp

340 345 350

Ala Met Gln Ser Val Ile Gln His Phe Asn Leu Ser Pro Tyr Tyr Gln

355 360 365

Asp Leu Leu Glu Ser Val Lys Arg Gln Ile Gln Ser Pro Glu Leu Thr

370 375 380

Val Ala Gly Gln Leu Leu Glu Met Ile Glu Gly Leu Ser Leu Glu Thr

385 390 395 400

Phe Gly Gln Arg Gln Gly Gln Ile Tyr His Asp Tyr Ala Trp Glu Ala

405 410 415

Pro Tyr Ala Leu Lys Gly Tyr Glu Thr Met Glu Leu Ser Thr Gln Leu

420 425 430

Leu Leu Phe Asp Val Ile Gln Lys Gly Val Asn Phe Glu Val Leu Asp

435 440 445

Glu Gln Asp Gln Phe Leu Lys Leu Trp His Asn Ser His Ile Glu Tyr

450 455 460

Val Lys Asn Gly Asn Met Thr Ser Lys Asp Asn Tyr Ile Val Pro Leu

465 470 475 480

Ala Met Ala Asn Lys Val Val Thr Lys Lys Ile Leu Asp Glu Lys His

485 490 495

Phe Pro Thr Pro Phe Gly Asp Glu Phe Thr Asp Arg Lys Glu Ala Leu

500 505 510

Asn Tyr Phe Ser Gln Ile Gln Asp Lys Pro Ile Val Val Lys Pro Lys

515 520 525

Ser Thr Asn Phe Gly Leu Gly Ile Ser Ile Phe Lys Thr Ser Ala Asn

530 535 540

Leu Ala Ser Tyr Glu Lys Ala Ile Asp Ile Ala Phe Thr Glu Asp Ser

545 550 555 560

Ala Ile Leu Val Glu Glu Tyr Ile Glu Gly Thr Glu Tyr Arg Phe Phe

565 570 575

Val Leu Glu Gly Asp Cys Ile Ala Val Leu Leu Arg Val Ala Ala Asn

580 585 590

Val Val Gly Asp Gly Ile His Thr Ile Ser Gln Leu Val Lys Leu Lys

595 600 605

Asn Gln Asn Pro Leu Arg Gly Tyr Asp His Arg Ser Pro Leu Glu Val

610 615 620

Ile Glu Leu Gly Glu Val Glu Gln Leu Met Leu Glu Gln Gln Gly Tyr

625 630 635 640

Thr Val Asn Ser Ile Pro Pro Glu Gly Thr Lys Ile Glu Leu Arg Arg

645 650 655

Asn Ser Asn Ile Ser Thr Gly Gly Asp Ser Ile Asp Val Thr Asn Thr

660 665 670

Met Asp Pro Thr Tyr Lys Gln Leu Ala Ala Glu Met Ala Glu Ala Met

675 680 685

Gly Ala Trp Val Cys Gly Val Asp Leu Ile Ile Pro Asn Ala Thr Gln

690 695 700

Ala Tyr Ser Lys Asp Lys Lys Asn Ala Thr Cys Ile Glu Leu Asn Phe

705 710 715 720

Asn Pro Leu Met Tyr Met His Thr Tyr Cys Gln Glu Gly Pro Gly Gln

725 730 735

Ser Ile Thr Pro Arg Ile Leu Ala Lys Leu Phe Pro Glu Leu

740 745 750

<210> 4

<211> 2250

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atgattattg atcgcctgct gcagcgcagc catagccatc tgccgattct gcaagcgacc 60

tttggcctgg aacgcgaaag cctgcgcatt catcagccga cgcagcgcgt ggcgcagacc 120

ccgcatccga aaaccctggg cagccgcaac tatcatccgt atattcagac cgactatagc 180

gaaccgcagc tggaactgat taccccgatt gcgaaagata gccaagaagc gattcgcttt 240

ctgaaagcga ttagcgatgt ggcgggccgc agcattaacc atgatgaata tctgtggccg 300

ctgagtatgc cgccgaaagt gcgcgaagaa gatattcaga ttgcgcagct ggaagatgcg 360

tttgaatatg attatcgcaa atatctggaa aaaacctacg gcaaactgat tcagagcatt 420

agcggcattc actataacct gggcctgggc caagaactgc tgacgagcct gtttgaactg 480

agccaagcgg ataacgcgat tgattttcag aatcagctgt atatgaaact gagtcagaac 540

tttctgcgct atcgctggct gctgacctat ctgtatggcg cgagcccggt ggcggaagaa 600

gattttctgg atcagaaact gaacaacccg gtgcgcagcc tgcgcaacag ccatctgggc 660

tatgtgaacc ataaagatat tcgcattagc tatacgagcc tgaaagatta tgtgaacgat 720

ctggaaaacg cggtgaaaag cggtcagctg attgcggaaa aagaatttta tagcccggtg 780

cgcctgcgcg gcagcaaagc gtgccgtaat tatctggaga aaggcatcac ctatctggaa 840

tttcgcacct ttgatctgaa cccgtttagc ccgattggca ttacccaaga aaccgtggat 900

accgtgcatc tgtttctgct ggcgctgctg tggattgata gcagtagcca tattgatcaa 960

gatattaaag aagcgaaccg cctgaacgat ctgattgcgc tgagccatcc gctggaaaaa 1020

ctgccgaacc aagcgccggt gagcgatctg gtggatgcga tgcagagcgt gattcagcat 1080

tttaacctga gcccgtatta tcaagacctg ctggaaagcg tgaaacgtca gattcagagc 1140

ccggaactga ccgtggcggg tcagctgctg gaaatgattg aaggcctgag cctggaaacc 1200

tttggtcagc gccaaggtca gatttatcat gattatgcgt gggaagcgcc gtatgcgctg 1260

aaaggctatg aaacgatgga actgagcacg cagctgttac tgtttgatgt gattcagaaa 1320

ggcgtgaact ttgaagtgct ggatgaacaa gatcagtttc tgaaactgtg gcataacagc 1380

cacatcgaat acgtgaaaaa cggcaacatg acgagcaaag ataactatat tgtgccgctg 1440

gcgatggcga acaaagtggt gaccaagaaa attctggatg aaaaacattt tccgaccccg 1500

tttggcgatg aatttaccga tcgcaaagaa gcgctgaact attttagtca gattcaagat 1560

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acgagcgcga acctggcgag ctatgaaaaa gcgattgata ttgcgtttac cgaagatagc 1680

gcgattctgg tggaagaata tattgaaggc accgaatatc gcttttttgt gctggaaggc 1740

gattgcattg cggtgctgct gcgcgtggcg gcgaacgtgg tgggcgatgg cattcatacc 1800

attagtcagc tggtgaaact gaaaaatcag aacccgctgc gcggctatga tcatcgcagc 1860

ccgctggaag tgattgaact gggcgaagtg gaacagctga tgctggaaca gcaaggctat 1920

accgtgaaca gcattccgcc ggaaggcacc aaaattgaac tgcgccgcaa cagcaacatt 1980

agcaccggcg gcgatagcat tgatgtgacc aacacgatgg acccgaccta taaacagctg 2040

gcggcggaaa tggcggaagc gatgggcgcg tgggtgtgcg gcgtggatct gattattccg 2100

aacgcgaccc aagcgtatag caaagataag aaaaacgcga cctgcattga actgaacttt 2160

aacccgctga tgtatatgca tacctattgc caagaaggcc cgggtcagag cattaccccg 2220

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<210> 5

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 5

Met Ala Glu Asp Arg Ala Met Pro Val Met Pro Pro Glu Ala Asp Ala

1 5 10 15

Ala Glu Ala Val Pro Ala Ala Pro Thr Ala Leu Pro Glu Glu Gly Pro

20 25 30

Ala Gly Pro Glu Ala Pro Leu Gln Thr Leu His Gly Pro Arg His Phe

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Tyr Pro Tyr Pro Arg Arg Leu Gly Arg Val Val Tyr Asp Ala Glu Lys

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Ala Arg Leu Gln Ala Glu Leu Leu Lys Val Gln Ile Trp Ala Gln Glu

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Trp Phe Phe Gln Arg Tyr Ile Glu His Leu Pro Thr Ala Gly Glu Ile

145 150 155 160

Val Phe Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val Glu Arg Val

165 170 175

Met Gly Phe Cys Thr Pro Ser Glu Tyr Leu Glu Phe Met Arg Gln Ala

180 185 190

Pro Glu Leu Glu Arg Met Leu Val Arg Ser Gly Ile Arg Leu Tyr Lys

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Tyr Trp Phe Ser Val Thr Arg Asp Glu Gln Arg Ala Arg Phe Leu Ala

210 215 220

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Ala Ser Leu Asp Lys Trp Asp Asp Tyr Thr Glu Ala Lys Glu Ala Met

245 250 255

Phe Phe Tyr Ile Asp Thr Ala Asp Ala Pro Trp Thr Ile Val Lys Ser

260 265 270

Asn Asp Lys Lys Arg Ala Arg Leu Asn Cys Met Arg His Phe Leu Ser

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Ser Leu Asp Tyr Pro Gly Lys Asp Pro Glu Val Val Gly Val Pro Asp

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Pro Leu Ile Val Gly Arg Ala Ala Gln Val Ile Gly Thr Ala Ala Asp

305 310 315 320

Ile Leu Asp Ser Ala Thr Pro Gln Ala Leu Arg Lys Pro Arg Gln Gly

325 330 335

<210> 6

<211> 1008

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

atggccgaag accgcgccat gccggttatg ccgccggagg ccgatgcggc cgaggcggtg 60

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accctgcatg gcccgcgcca ttttccggcg gtggatgcga acgcgattcg ccaagcgttt 180

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tttgtgattc tgatggaagg ccgcgatgcg gcgggcaaag gcggcaccat taaacgcttt 360

atggaacatc tgaacccgcg ctatgcgcgc gtggtggcgc tgaccaaacc gggcgaacgc 420

gaacgcggtc agtggttttt tcagcgctat attgaacatc tgccgaccgc gggcgaaatt 480

gtgttttttg atcgcagctg gtataaccgc gcgggcgtgg agcgcgtgat gggcttttgc 540

accccgagcg aatatctgga atttatgcgc caagcgccgg aactggaacg tatgctggtg 600

cgcagcggca ttcgcctgta taaatattgg tttagcgtga cccgcgatga acagcgcgcg 660

cgctttctgg cgcgcgaaac cgatccgctg aaacgctgga aactgagccc gattgataaa 720

gcgagcctgg ataaatggga tgactatacc gaagcgaaag aagcgatgtt cttttatatc 780

gataccgcgg atgcgccgtg gaccattgtg aaaagcaacg ataaaaaacg cgcgcgcctg 840

aactgtatgc gccattttct gagcagcctg gattatccgg gcaaagatcc ggaagtggtg 900

ggcgtgccgg acccgctgat tgtgggccgc gcggcgcaag tgattggcac cgcggcggat 960

attctggata gcgcgacccc gcaggcgctg cgcaaaccgc gccaaggc 1008

<210> 7

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 7

Met Ala Glu Asp Arg Ala Met Pro Val Met Pro Pro Glu Ala Asp Ala

1 5 10 15

Ala Glu Ala Val Pro Ala Ala Pro Thr Ala Leu Pro Glu Glu Gly Pro

20 25 30

Ala Gly Pro Glu Ala Pro Leu Gln Thr Leu His Gly Pro Arg His Phe

35 40 45

Pro Ala Val Asp Ala Asn Ala Ile Arg Gln Ala Phe Glu Gly Gly His

50 55 60

Tyr Pro Tyr Pro Arg Arg Leu Gly Arg Val Val Tyr Asp Ala Glu Lys

65 70 75 80

Ala Arg Leu Gln Ala Glu Leu Leu Lys Val Gln Ile Trp Ala Gln Glu

85 90 95

Thr Gly Gln Lys Phe Val Ile Leu Met Glu Val Arg Asp Ala Ala Gly

100 105 110

Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg Phe Met Glu His Leu Asn Pro Arg Tyr

115 120 125

Ala Arg Val Val Ala Leu Thr Lys Pro Gly Glu Arg Glu Arg Gly Gln

130 135 140

Trp Phe Phe Gln Arg Tyr Ile Glu His Leu Pro Thr Ala Gly Glu Ile

145 150 155 160

Val Phe Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val Glu Arg Val

165 170 175

Met Gly Phe Cys Thr Pro Ser Glu Tyr Leu Glu Phe Met Arg Gln Ala

180 185 190

Pro Glu Leu Glu Arg Met Leu Val Arg Ser Gly Ile Arg Leu Tyr Lys

195 200 205

Tyr Trp Phe Ser Val Thr Arg Asp Glu Gln Arg Ala Arg Phe Leu Ala

210 215 220

Arg Glu Thr Asp Pro Leu Lys Arg Trp Lys Leu Ser Pro Ile Asp Lys

225 230 235 240

Ala Ser Leu Asp Thr Trp Asp Asp Tyr Thr Glu Ala Lys Glu Ala Met

245 250 255

Phe Phe Tyr Ile Asp Thr Ala Asp Ala Pro Trp Thr Ile Val Lys Ser

260 265 270

Asn Asp Lys Lys Arg Ala Arg Leu Asn Cys Met Arg His Phe Leu Ser

275 280 285

Ser Leu Asp Tyr Pro Gly Lys Asp Pro Glu Val Val Gly Val Pro Asp

290 295 300

Pro Leu Ile Val Gly Arg Ala Ala Gln Val Ile Gly Thr Ala Ala Asp

305 310 315 320

Ile Leu Asp Ser Ala Thr Pro Gln Ala Leu Arg Lys Pro Arg Gln Gly

325 330 335

<210> 8

<211> 1008

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

atggccgaag accgcgccat gccggttatg ccgccggagg ccgatgcggc cgaggcggtg 60

ccggcggcgc caacggcgtt accggaagaa ggcccggccg gcccggaagc gccgctgcag 120

accctgcatg gcccgcgcca ttttccggcg gtggatgcga acgcgattcg ccaagcgttt 180

gaaggcggcc attatccgta tccgcgccgc ctgggccgcg tggtgtatga tgcggaaaaa 240

gcgcgcctgc aagcggaact gctgaaagtg cagatttggg cgcaagaaac cggtcagaaa 300

tttgtgattc tgatggaagt ccgcgatgcg gcgggcaaag gcggcaccat taaacgcttt 360

atggaacatc tgaacccgcg ctatgcgcgc gtggtggcgc tgaccaaacc gggcgaacgc 420

gaacgcggtc agtggttttt tcagcgctat attgaacatc tgccgaccgc gggcgaaatt 480

gtgttttttg atcgcagctg gtataaccgc gcgggcgtgg agcgcgtgat gggcttttgc 540

accccgagcg aatatctgga atttatgcgc caagcgccgg aactggaacg tatgctggtg 600

cgcagcggca ttcgcctgta taaatattgg tttagcgtga cccgcgatga acagcgcgcg 660

cgctttctgg cgcgcgaaac cgatccgctg aaacgctgga aactgagccc gattgataaa 720

gcgagcctgg atacatggga tgactatacc gaagcgaaag aagcgatgtt cttttatatc 780

gataccgcgg atgcgccgtg gaccattgtg aaaagcaacg ataaaaaacg cgcgcgcctg 840

aactgtatgc gccattttct gagcagcctg gattatccgg gcaaagatcc ggaagtggtg 900

ggcgtgccgg acccgctgat tgtgggccgc gcggcgcaag tgattggcac cgcggcggat 960

attctggata gcgcgacccc gcaggcgctg cgcaaaccgc gccaaggc 1008

Claims

1.一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7。

2.编码如权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:5的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:6，编码多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:7的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:7。

4.表达如权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体的微生物。

5.如权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌。

6.如权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。

7.如权利要求4-6中任一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物中导入了谷胱甘肽双功能酶基因gshF。

8.如权利要求7所述的微生物，其特征在于，所述谷胱甘肽双功能酶基因gshF的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

9.如权利要求7或8所述微生物在生产L-谷胱甘肽中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，以谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸为底物，使用如权利要求7或8所述微生物作为生物催化剂，催化合成L-谷胱甘肽。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，反应体系中添加有ATP、六聚偏磷酸钠和氯化镁。