CN111254129A

CN111254129A - 一种多聚磷酸激酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN111254129A
Application number: CN202010213070.0A
Authority: CN
Inventors: 范文超; 王金刚; 梁岩; 高书良
Original assignee: Zhejiang Huarui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Huarui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2020-03-24
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2040-03-24
Also published as: CN111254129B

Abstract

本发明公开了一种多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:1，该突变体较野生型序列SEQ ID NO:3对ATP再生能力有明显的提升，采用该多聚磷酸激酶突变体作为ATP再生剂，可促进谷胱甘肽合成酶催化法生产谷胱甘肽。

Description

一种多聚磷酸激酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶催化技术领域，具体地说，涉及一种多聚磷酸激酶突变体，及其以多聚偏磷酸为底物将ADP转化ATP的用途。

背景技术

ATP(Adenosine triphosphate，简称三磷酸腺苷)是一种高能磷酸化合物，参与细胞内众多酶催化、蛋白代谢、生物合成过程，并提供能量。工业上ATP也参与了许多重要的生物活性物质及化学药物的生物合成，但因ATP原料成本价格高的因素，限制了ATP参与的酶促反应的工业化应用，因此ATP合成以及ATP的循环再生利用成为该方向主要需要解决的问题。

目前ATP再生技术的文献报道主要有三种：以高能磷酸化合物和ADP为底物，经磷酸转移酶催化使ADP磷酸化生成ATP；以酵母细胞为宿主，加入葡萄糖使其糖酵解生成ATP；ADP和无机磷在光照条件下转化成ATP，其中前两种方式的应用报道较多。采用酵母全细胞催化再生循环合成ATP是较早进入工业化的方式，但该方向需要加入大量的ATP再生旺盛的酵母活细胞在反应体系中，酶促反应体系复杂，副产物较多，且工业化成本相对较高。

采用高能磷酸化合物作为底物催化ADP生产ATP是现在这个方向中研究的重点，其中乙酸激酶和多聚磷酸激酶是常用的ATP再生用酶。乙酸激酶以乙酰磷酸作为高能磷酸化合物底物参与ATP合成，其中最常用的是乙酰磷酸盐为乙酰磷酸锂盐，乙酸激酶的催化效率较高，但其使用的底物乙酰磷酸盐热稳定性差，非常易于分解，底物实际利用率低，且酶催化反应体系中的副产物较多，控制工艺复杂，产品成本较高，因此很难放大生产。多聚磷酸激酶采用多聚偏磷酸作为底物参与ATP再生合成反应，该酶所用的底物廉价且稳定，操作过程简便，易于放大。1988年，Murata Kousaku等研究了D-丙氨酰-D-氨基酸连接酶与蓝细菌中的聚磷酸激酶联用，合成D-丙氨酸二肽，成功地进行了两个反应的偶联，D-丙氨酸二肽的产率高达80％。2016年北京化工大学刘珞老师课题组，采用多聚磷酸激酶(PPK)介导的ATP再生系统与谷胱甘肽双功能合成酶(GS)偶联，共同作用催化，初始仅加入体系需求量20％的ATP情况下，浓度约20mM，产物转化率83.8％，产量高达13g/L。但该酶的催化效率普遍偏低，酶活容易受多聚磷酸盐的抑制，体系中ATP加量较大，产品的生产成本依然很高，因此工业化推广没有优势。因此开发一种高性能的多聚磷酸激酶突变体，用于ATP再生系统，将极大的促进ATP再生相关产品的技术革新。

发明内容

为了克服目前多聚磷酸激酶酶活低，底物耐受性差即底物抑制性高的缺陷，本发明利用基因工程技术来对谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032来源的多聚磷酸激酶(PPK2)进行改造和筛选，构建以六聚偏磷酸钠为底物的高性能多聚磷酸激酶突变体，从而有利于实现以多聚偏磷酸为底物的ATP再生系统的工业化应用。

为此，本发明通过随机突变、组合突变等技术对Corynebacterium glutamicumATCC 13032来源的多聚磷酸激酶(SEQ ID NO:3)进行改造，获得以六聚偏磷酸钠作为底物的高酶活的多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:1，以便高效地催化六聚偏磷酸钠上的高能磷酸键转移至ADP上，产生ATP。具体而言，本发明包括如下技术方案。

一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1：

MVGKLPIMAETNENDLPVIDLAQIEGYVVDDSDEGDPVLLRPDGTPIETWREDFPYEERVTREDYEKVKRSLQIELLKWQNWTKETGQRHIILFEGRDAAGKGGTIKRFNEHLNPRGARTVALEKPSPRESTSWYFQRYIQHFTAAGEIVFFDRSWYNRSGVERVLGFCTESQHAEFLREVPMLENMILGSGISLTKFWFSVTRKEQRTRFAIRQVDPVRQWKLSPMDLASLDRWDDYTRAKEEQFRYTDTDESPWITIKSNDKKRARINAMRYVLSKFDYTDKDYELVGEPDPKVVLRGRDQIGD(SEQ ID NO:1)。

其为野生型多聚磷酸激酶(PPK2)的氨基酸序列SEQ ID NO:3第35位的D替换为G、第144位的P替换为T、第166位的M替换为L的突变体。

本发明的第二个方面提供了编码上述多聚磷酸激酶突变体基因。

优选地，编码上述多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:1的基因可以是下述核苷酸序列：

ATGGTTGGTAAACTGCCGATCATGGCTGAAACCAACGAAAACGACCTGCCGGTTATCGACCTGGCTCAGATCGAAGGTTACGTTGTTGACGACTCTGACGAAGGCGACCCGGTTCTGCTGCGTCCGGACGGTACCCCGATCGAAACCTGGCGTGAAGACTTCCCGTACGAAGAACGTGTTACCCGTGAAGACTACGAAAAAGTTAAACGTTCTCTGCAGATCGAACTGCTGAAATGGCAGAACTGGACCAAAGAAACCGGTCAGCGTCACATCATCCTGTTCGAAGGTCGTGACGCTGCTGGTAAAGGTGGTACCATCAAACGTTTCAACGAACACCTGAACCCGCGTGGTGCTCGTACCGTTGCTCTGGAAAAACCGTCTCCGCGTGAATCTACCTCTTGGTACTTCCAGCGTTACATCCAGCACTTCACGGCTGCTGGTGAAATCGTTTTCTTCGACCGTTCTTGGTACAACCGTTCTGGTGTTGAACGTGTTCTGGGTTTCTGCACCGAATCTCAGCACGCTGAATTCCTGCGTGAAGTTCCGATGCTGGAAAACATGATCCTGGGTTCTGGTATCTCTCTGACCAAATTCTGGTTCTCTGTTACCCGTAAAGAACAGCGTACCCGTTTCGCTATCCGTCAGGTTGACCCGGTTCGTCAGTGGAAACTGTCTCCGATGGACCTGGCTTCTCTGGACCGTTGGGACGACTACACCCGTGCTAAAGAAGAACAGTTCCGTTACACCGACACCGACGAATCTCCGTGGATCACCATCAAATCTAACGACAAAAAACGTGCTCGTATCAACGCTATGCGTTACGTTCTGTCTAAATTCGACTACACCGACAAAGACTACGAACTGGTTGGTGAACCGGACCCGAAAGTTGTTCTGCGTGGTCGTGACCAGATCGGTGACTAA(SEQ ID NO:2)。

本发明的第三个方面提供了包含上述基因的质粒。该质粒包含用于表达上述基因的载体，优选载体是PET系列，比如载体是pET24a，但并不受限于此。

本发明的第四个方面提供了转化了上述质粒的微生物，该微生物可作为宿主用于表达上述多聚磷酸激酶突变体。

优选地，上述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第五个方面提供了上述多聚磷酸激酶突变体或其表达微生物在生产谷胱甘肽中的用途。在谷胱甘肽生产中，谷胱甘肽合成酶或者谷胱甘肽合成酶表达菌株是生物催化剂，谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸是反应底物，本发明的多聚磷酸激酶突变体或其表达微生物作为ATP再生剂催化ADP转化ATP，促进L-谷胱甘肽的生物合成。

在生产谷胱甘肽的合成反应体系中，谷胱甘肽合成酶表达微生物、多聚磷酸激酶突变体表达微生物可以呈菌体或者其细胞破碎物形式，分别作为缩合反应的催化剂和ATP再生剂。

生产谷胱甘肽可采用常规的工艺条件，比如，反应温度选择20-40℃，例如25-35℃。

优选地，反应体系中添加有ATP、氯化镁和六聚偏磷酸钠，例如添加有3-20mM的ATP，优选5-15mM的ATP；10-50mM氯化镁，例如20-40mM氯化镁；20-50mM六聚偏磷酸钠，例如30-40mM六聚偏磷酸钠。其中ATP可为谷胱甘肽的合成反应提供能量，Mg²⁺是gshF酶的激活因子，六聚偏磷酸钠是多聚磷酸激酶突变体的底物。

反应体系可以为pH7.0-8.0，例如pH7.2-7.5。

当本发明构建的突变体SEQ ID NO:1应用于谷胱甘肽的酶法合成中时，可以辅助谷胱甘肽合成酶催化合成在8个小时内产生超过72.6mM的谷胱甘肽，产物生成率超过90％，具有较好的工业化开发和应用前景。

附图说明

图1为用于表达野生型多聚磷酸激酶的重组质粒pET24a-cgPPK2的结构示意图。

图2为用于表达大肠杆菌来源的谷氨酸-半胱氨酸连接酶gshA的重组质粒pET28a-gshA的结构示意图。

具体实施方式

本发明构建的多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:1是的突变体，是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032来源的野生型多聚磷酸激酶(PPK2)的氨基酸序列SEQ ID NO:3序列中个别氨基酸发生替换后的新蛋白质，其中野生型多聚磷酸激酶SEQ ID NO:3的GenBank序列号为NP_601909：

MVGKLPIMAETNENDLPVIDLAQIEGYVVDDSDEDDPVLLRPDGTPIETWREDFPYEERVTREDYEKVKRSLQIELLKWQNWTKETGQRHIILFEGRDAAGKGGTIKRFNEHLNPRGARTVALEKPSPRESTSWYFQRYIQHFPAAGEIVFFDRSWYNRSGVERVMGFCTESQHAEFLREVPMLENMILGSGISLTKFWFSVTRKEQRTRFAIRQVDPVRQWKLSPMDLASLDRWDDYTRAKEEQFRYTDTDESPWITIKSNDKKRARINAMRYVLSKFDYTDKDYELVGEPDPKVVLRGRDQIGD(SEQ ID NO:3)。

为表述方便起见，蛋白质的氨基酸缩写既可以使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员熟知的，这些缩写列于下表中：

表1氨基酸中英文对照及缩写

作为构建多聚磷酸激酶突变体的基础模板，野生型多聚磷酸激酶SEQ ID NO:3的编码基因是核苷酸序列SEQ ID NO:4：

ATGGTTGGTAAACTGCCGATCATGGCTGAAACCAACGAAAACGACCTGCCGGTTATCGACCTGGCTCAGATCGAAGGTTACGTTGTTGACGACTCTGACGAAGACGACCCGGTTCTGCTGCGTCCGGACGGTACCCCGATCGAAACCTGGCGTGAAGACTTCCCGTACGAAGAACGTGTTACCCGTGAAGACTACGAAAAAGTTAAACGTTCTCTGCAGATCGAACTGCTGAAATGGCAGAACTGGACCAAAGAAACCGGTCAGCGTCACATCATCCTGTTCGAAGGTCGTGACGCTGCTGGTAAAGGTGGTACCATCAAACGTTTCAACGAACACCTGAACCCGCGTGGTGCTCGTACCGTTGCTCTGGAAAAACCGTCTCCGCGTGAATCTACCTCTTGGTACTTCCAGCGTTACATCCAGCACTTCCCGGCTGCTGGTGAAATCGTTTTCTTCGACCGTTCTTGGTACAACCGTTCTGGTGTTGAACGTGTTATGGGTTTCTGCACCGAATCTCAGCACGCTGAATTCCTGCGTGAAGTTCCGATGCTGGAAAACATGATCCTGGGTTCTGGTATCTCTCTGACCAAATTCTGGTTCTCTGTTACCCGTAAAGAACAGCGTACCCGTTTCGCTATCCGTCAGGTTGACCCGGTTCGTCAGTGGAAACTGTCTCCGATGGACCTGGCTTCTCTGGACCGTTGGGACGACTACACCCGTGCTAAAGAAGAACAGTTCCGTTACACCGACACCGACGAATCTCCGTGGATCACCATCAAATCTAACGACAAAAAACGTGCTCGTATCAACGCTATGCGTTACGTTCTGTCTAAATTCGACTACACCGACAAAGACTACGAACTGGTTGGTGAACCGGACCCGAAAGTTGTTCTGCGTGGTCGTGACCAGATCGGTGACTAA(SEQ ID NO:4)。

为了获得酶性能更高的多聚磷酸激酶，本发明对SEQ ID NO:3的基因序列SEQ IDNO:4进行点突变。通过多轮易错PCR随机突变技术获得一个氨基酸35位天冬氨酸位点、144位脯氨酸位点、166位甲硫氨酸位点的突变体氨基酸序列，即本发明中具有氨基酸序列SEQID NO:1的突变体。

在本发明中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指多聚磷酸激酶的野生序列SEQ ID NO:3。为了与突变体相区别和表述方便起见，在本发明中可以将野生型多聚磷酸激酶称为“野生(型)多聚磷酸激酶”或者“野生(型)酶”。

本发明的多聚磷酸激酶突变体的氨基酸数量只有306个，且结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。

为了在不同微生物中进行蛋白质SEQ ID NO:1的最佳表达，可以针对特定的微生物比如大肠杆菌进行密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。在本文中所提供的基因序列SEQ ID NO:2是经过密码子优化的核苷酸序列，但本发明的多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:1表达基因不限于此。

这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

上述转化体宿主可以使任何适合表达多聚磷酸激酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者枯草芽孢杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明采用多聚磷酸激酶和谷氨酸-半胱氨酸连接酶偶联反应的方式对多聚磷酸激酶进行高通量筛选，通过对最终产物γ-谷氨酰半胱氨酸的标定，间接标定多聚磷酸激酶的活力，标定γ-谷氨酰半胱氨酸的方法可以是液相法、四氧嘧啶法，DTNB法，优选DTNB法。

当作为ATP再生系统的再生剂，促进生物催化剂谷胱甘肽合成酶用于生产谷胱甘肽时，本发明的多聚磷酸激酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。

在该反应体系中，主催化剂谷胱甘肽合成酶也可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。

上述菌体形式本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

实施例

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K₂HPO₄.3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

谷胱甘肽含量HPLC检测方法：

实施例1野生型多聚磷酸激酶基因重组大肠杆菌的构建

对于谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032来源的野生型多聚磷酸激酶(GenBank序列号为NP_601909)即SEQ ID NO:3，以此为基础进行密码子优化，全基因合成基因序列SEQ ID NO:4，并在基因两端设计限制性内切酶位点Nde I和XhoI，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET24a-cgPPK2，质粒图谱见图1。将重组质粒pET24a-cgPPK2转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达野生型多聚磷酸激酶的重组大肠杆菌PET24a-cgPPK2/BL21(DE3)。

实施例2大肠杆菌高通量筛选宿主的构建

采用Red同源重组方式采用插入敲除的方式，对BL21(DE3)中的gshB进行敲除，同时将谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因gshA和氯霉素基因组合片段插入谷胱甘肽合成酶基因gshB位点。

根据已报道大肠杆菌BL21(DE3)来源谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因gshA的基因序列(NCBI登录号：AM946981.2)，设计引物如下：

正向GshA-NcoI-F：5’-CATGCCATGGGAATCCCGGACGTATCACAGGC-3’，

反向GshA-Xho I-R：5’-CGCTCGAGTCAGGCGTGTTTTTCCAGCC-3’。

以BL21(DE3)基因组DNA为模板扩增gshA片段。

PCR反应体系包括：引物各50pmol，BL21(DE3)DNA模板100ng，1×KOD neo plusbuffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，KOD neo plus 1U，补ddH₂O至总体系50μL。PCR扩增条件为：95℃5min；98℃15s，57℃30s，68℃30s/kbp，30个循环；68℃10min。PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，Axygen胶回收试剂盒回收大约1.5kb左右的特异条带。用Nde I和Xho I于37℃双酶切2小时，酶切体系包括：PCR产物42μL，10×FD buffer 5μL，Nde I 1.5μL，Xho I 1.5μL。Axygen胶回收试剂盒过柱纯化回收。回收产物与同样酶切处理的表达载体pET28a(Novagen)用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，转化E.coli DH5α感受态细胞，获得重组质粒pET28a-gshA，质粒图谱见图2。

根据已报道的Escherichia coli BL21(DE3)来源谷胱甘肽合成酶基因gshB的基因序列(NCBI登录号：AM946981.2)、pACYC184质粒(NCBI登录号：X06403.1)序列、以及上述构建的pET24a-gshA质粒序列，设计重组片段扩增引物如下：

GshB-up200F：5’-CAATACGTTGCCGTTACCGGTTGAAC-3’，

GshB-CM-R：

5’-GATGCTGCCAACTTACTGATTTAGTGTATGATGCACGATGCCGAGCTTGAT CAT-3’。

GshB-CM-F：

5’-ATGATCAAGCTCGGCATCGTGCATCATACACTAAATCAGTAAGTTGGCAGC ATC-3’，

CM-GshA-R：

5’-GAGTCGTATTAATTTCGCGGGATCGAGATCTTTACGCCCCGCCCTGCCACT CATCGCAG-3’。

CM-GshA-F：

5’-CTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAAAGATCTCGATCCCGCGAAATTA ATACGACTC-3’，

GshA-GshB-R：

5’-TTACTGCTGCTGTAAACGTGCTTCGATGCTCGAGTCAGGCGTGTTTTTCCA GCCACAC-3’。

GshA-GshB-F：

5’-GTGTGGCTGGAAAAACACGCCTGACTCGAGCATCGAAGCACGTTTACAG CAGCAGTAA-3’，

GshB-dn200R：5’-GATCCCCATTGCACCATTGGTATTATGTTC-3’。

以GshB-up200F/GshB-CM-R、GshA-GshB-F/GshB-dn200F为引物对，以BL21(DE3)基因组DNA为模板，扩增片段GshB-up和GshB-dn，片段大小都为200bp左右；以GshB-CM-F/CM-GshA-R为引物对，以PACYC184质粒为模板扩增CM片段，扩增片段大小约为1kbp；以CM-GshA-F/GshA-GshB-R为引物对，以PET28a-gshA质粒为模板扩增T7-gshA片段，扩增片段大小约为1.6kbp。

PCR反应体系包括：引物各50pmol，模板(DNA模板100ng；质粒模板10ng)，1×KODneo plus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，KOD neo plus 1U，补ddH₂O至总体系50μL。PCR扩增条件为：95℃5min；98℃15s，57℃30s，68℃30s/kbp，30个循环；68℃10min。PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，Axygen胶回收试剂盒回收各自特异条带。

然后，以GshB-up、CM、T7-gshA、GshB-dn四个胶回收片段为模板，GshB-up200F/GshB-dn200R为引物，扩增表达盒GshB-up-CM-T7-gshA-GshB-dn。PCR反应体系包括：引物各50pmol，模板(四个片段各0.3μM)，1×KOD FX buffer，0.4mM dNTP，KOD FX 1U，补ddH₂O至总体系50μL。PCR扩增条件为：95℃2min；98℃15s，55℃30s，68℃30s/kbp，25个循环；68℃10min。PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，Axygen胶回收试剂盒回收约3kbp条带。

将转化有pKD46的BL21(DE3)菌种接种，30℃培养过夜。次日以1:50体积比接种于50mL LB培养基(含100μg/mL Amp)，同时加入20mM L-阿拉伯糖，30℃培养至OD₆₀₀＝0.6，使pKD46上Exo、Bet和Gam三个蛋白充分表达。冰上预冷10min，菌液于4℃、4000rpm离心10min，弃上清，用预冷的10％甘油离心洗涤3次，浓缩成100-200μL的感受态细胞。取2-3μL整合盒片段，加入感受态细胞，混匀，转入0.2cm电击杯中，用Bio-rad电击仪做电转化，电压2.5kV，电击时间4-5s。电击后迅速加入1mL LB，37℃、200rpm复苏1h，涂布Cm平板，37℃培养过夜。

采用GshB-up200F/GshB-dn200R为引物鉴定基因导入情况，阳性克隆扩增片段约3kbp，阴性克隆约为1.5kbp，阳性克隆菌经高温培养消除PKD46质粒后，则为构建成功的菌株，编号BL21(DE3)-gshBΔ：：CM-T7-gshA，该菌株将用作后续高通量筛选的宿主。

实施例3易错PCR法构建随机突变库及筛选方法

3.1第一轮易错PCR法构建随机突变库

以野生酶的基因SEQ ID NO:4为模板，应用易错PCR技术构建随机突变体库。正向引物cgPPK2-F为5’-ATGGTTGGTAAACTGCCGATC-3’，反向引物cgPPK2-R为5’-TTAGTCACCGATCTGGTCACG-3’。

50μL易错PCR反应体系包括：10ng质粒模板pET24a-cgPPK2，50pmol一对引物cgPPK2-F和cgPPK2-R，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mMMgCl₂，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl₂，2.5个单位的Taq酶(Fermentas公司)。PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp，30个循环；72℃10min。胶回收1kbp随机突变片段作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。DpnI消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-gshBΔ：：CM-T7-gshA的随机突变库。

对随机突变库中的菌株进行多聚磷酸激酶活力测定。

3.2后续易错PCR法构建随机突变库

以前一轮随机突变库筛选出的多聚磷酸激酶活力最高的菌株的质粒作为模板，以cgPPK2-F和cgPPK2-R为引物，再次进行易错PCR突变库的构建，易错PCR反应体系同上述步骤3.1。

3.3突变体库的高通量筛选培养

选取突变体库中的转化子接种到500μL含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基的96孔深孔培养板中，培养过夜，然后取80μl过夜培养物，转接至800μl含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3h后，加入终浓度0.5mM IPTG，降温至25℃，培养过夜。4000rpm离心15min，弃上清，加入100μL含无菌水重悬菌体用于活力测定。

3.4高通量筛选活力测定

将上述步骤3.3中100μL菌悬液加入100μL底物反应液(0.2M Tris-HCl缓冲液，100mM谷氨酸钠，100mM半胱氨酸，40mM MgCl₂，10mM ATP，90mM六聚偏磷酸钠，溶解完全后，用氢氧化钠校正pH8.0)，在30℃的条件下反应30min，加入200μL 0.45M NaOH溶液中终止，然后4℃，5000rpm离心10min。取离心上清，取20μL上清加入10μL3％甲醛溶液和150μL DTNB显色剂(0.1mM DTNB，0.2M Tris-HCl缓冲液(pH8.0))，室温放置5min后，测定412nm波长处的吸光值。

通过两轮随机突变，大约对约6000个突变体克隆筛选，获得一株酶活力突出的突变株cgPPK2-Mut41，该菌株的多聚磷酸激酶突变位点为D35G、P144T、M166L。DTNB显色反应显示，突变株PET24a-cgPPK2-Mut41/BL21(DE3)-gshBΔ：：CM-T7-gshA的活力高于野生型菌株PET24a-cgPPK2/BL21(DE3)-gshBΔ：：CM-T7-gshA约11.3倍。

实施例4多聚磷酸激酶突变体和谷胱甘肽合成酶菌株的培养

突变株PET24a-cgPPK2-Mut41/BL21(DE3)-gshBΔ：：CM-T7-gshA抽提质粒，然后化学转化至BL21(DE3)菌株中，得到多聚磷酸激酶突变体表达菌株PET24a-cgPPK2-Mut41/BL21(DE3)。

将野生型多聚磷酸激酶表达菌株PET24a-cgPPK2/BL21(DE3)、多聚磷酸激酶突变体表达菌株PET24a-cgPPK2-Mut41/BL21(DE3)和谷胱甘肽合成酶表达菌株pET24a-SAG/BL21(DE3)(中国科学院上海生命科学研究院赠送，参见专利ZL201310538982.5。)三个菌株分别在其LB培养平板上挑取单菌落，各自接种至5mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。取2mL过夜培养物接种至200mL TB培养基中，于37℃，250rpm培养2-3h，至OD₆₀₀约为0.6-0.8时，加入0.1mM IPTG，于28℃，200rpm培养过夜。然后于4℃，10000rpm，离心10min，分别收集菌体，-20℃冷冻过夜。

实施例5多聚磷酸激酶突变体用于生产谷胱甘肽

采用50ml反应体系：0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，80mM谷氨酸钠，80mM甘氨酸，110mM半胱氨酸，20mM MgCl₂，5mM ATP，35mM六聚偏磷酸钠，溶解完全后，用氢氧化钠校正pH8.0。然后加入终浓度2.5％w/v表达谷胱甘肽合成酶的pET24a-SAG/BL21(DE3)冻融菌体，并且加入2.5％w/v表达多聚磷酸激酶(野生型或突变体)的大肠杆菌PET24a-cgPPK2/BL21(DE3)或PET24a-cgPPK2-Mut41/BL21(DE3)冻融菌体，纯水补足体积至100ml，在30℃的条件下，搅拌反应8个小时，通过HPLC检测反应样品。

结果显示，多聚磷酸激酶突变体菌株PET24a-cgPPK2-Mut41/BL21(DE3)参与的反应体系中谷胱甘肽的产量浓度达到72.6mM，生成率超过90％；而野生型多聚磷酸激酶菌株PET24a-cgPPK2/BL21(DE3)参与的反应体系中谷胱甘肽的产量浓度约为58.1mM。可见多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:1能有效地提升ATP的再生率，用于谷胱甘肽的合成。

综上所述，相比野生型多聚磷酸激酶，本发明构建的多聚磷酸激酶突变体SEQ IDNO:1对于ATP再生的能力有明显的提升，将其应用于谷胱甘肽的酶法合成中，可以在8个小时内，辅助催化合成可以产生超过72.6mM的产物，产物生成率超过90％，具有较好的工业化开发和应用前景。

序列表

<110> 浙江华睿生物技术有限公司

<120> 一种多聚磷酸激酶突变体及其应用

<130> SHPI2010106

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 306

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

<400> 1

Met Val Gly Lys Leu Pro Ile Met Ala Glu Thr Asn Glu Asn Asp Leu

1 5 10 15

Pro Val Ile Asp Leu Ala Gln Ile Glu Gly Tyr Val Val Asp Asp Ser

20 25 30

Asp Glu Gly Asp Pro Val Leu Leu Arg Pro Asp Gly Thr Pro Ile Glu

35 40 45

Thr Trp Arg Glu Asp Phe Pro Tyr Glu Glu Arg Val Thr Arg Glu Asp

50 55 60

Tyr Glu Lys Val Lys Arg Ser Leu Gln Ile Glu Leu Leu Lys Trp Gln

65 70 75 80

Asn Trp Thr Lys Glu Thr Gly Gln Arg His Ile Ile Leu Phe Glu Gly

85 90 95

Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg Phe Asn Glu His

100 105 110

Leu Asn Pro Arg Gly Ala Arg Thr Val Ala Leu Glu Lys Pro Ser Pro

115 120 125

Arg Glu Ser Thr Ser Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Ile Gln His Phe Thr

130 135 140

Ala Ala Gly Glu Ile Val Phe Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ser

145 150 155 160

Gly Val Glu Arg Val Leu Gly Phe Cys Thr Glu Ser Gln His Ala Glu

165 170 175

Phe Leu Arg Glu Val Pro Met Leu Glu Asn Met Ile Leu Gly Ser Gly

180 185 190

Ile Ser Leu Thr Lys Phe Trp Phe Ser Val Thr Arg Lys Glu Gln Arg

195 200 205

Thr Arg Phe Ala Ile Arg Gln Val Asp Pro Val Arg Gln Trp Lys Leu

210 215 220

Ser Pro Met Asp Leu Ala Ser Leu Asp Arg Trp Asp Asp Tyr Thr Arg

225 230 235 240

Ala Lys Glu Glu Gln Phe Arg Tyr Thr Asp Thr Asp Glu Ser Pro Trp

245 250 255

Ile Thr Ile Lys Ser Asn Asp Lys Lys Arg Ala Arg Ile Asn Ala Met

260 265 270

Arg Tyr Val Leu Ser Lys Phe Asp Tyr Thr Asp Lys Asp Tyr Glu Leu

275 280 285

Val Gly Glu Pro Asp Pro Lys Val Val Leu Arg Gly Arg Asp Gln Ile

290 295 300

Gly Asp

305

<210> 2

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atggttggta aactgccgat catggctgaa accaacgaaa acgacctgcc ggttatcgac 60

ctggctcaga tcgaaggtta cgttgttgac gactctgacg aaggcgaccc ggttctgctg 120

cgtccggacg gtaccccgat cgaaacctgg cgtgaagact tcccgtacga agaacgtgtt 180

acccgtgaag actacgaaaa agttaaacgt tctctgcaga tcgaactgct gaaatggcag 240

aactggacca aagaaaccgg tcagcgtcac atcatcctgt tcgaaggtcg tgacgctgct 300

ggtaaaggtg gtaccatcaa acgtttcaac gaacacctga acccgcgtgg tgctcgtacc 360

gttgctctgg aaaaaccgtc tccgcgtgaa tctacctctt ggtacttcca gcgttacatc 420

cagcacttca cggctgctgg tgaaatcgtt ttcttcgacc gttcttggta caaccgttct 480

ggtgttgaac gtgttctggg tttctgcacc gaatctcagc acgctgaatt cctgcgtgaa 540

gttccgatgc tggaaaacat gatcctgggt tctggtatct ctctgaccaa attctggttc 600

tctgttaccc gtaaagaaca gcgtacccgt ttcgctatcc gtcaggttga cccggttcgt 660

cagtggaaac tgtctccgat ggacctggct tctctggacc gttgggacga ctacacccgt 720

gctaaagaag aacagttccg ttacaccgac accgacgaat ctccgtggat caccatcaaa 780

tctaacgaca aaaaacgtgc tcgtatcaac gctatgcgtt acgttctgtc taaattcgac 840

tacaccgaca aagactacga actggttggt gaaccggacc cgaaagttgt tctgcgtggt 900

cgtgaccaga tcggtgacta a 921

<210> 3

<211> 306

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Val Gly Lys Leu Pro Ile Met Ala Glu Thr Asn Glu Asn Asp Leu

1 5 10 15

Pro Val Ile Asp Leu Ala Gln Ile Glu Gly Tyr Val Val Asp Asp Ser

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Thr Trp Arg Glu Asp Phe Pro Tyr Glu Glu Arg Val Thr Arg Glu Asp

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85 90 95

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Leu Asn Pro Arg Gly Ala Arg Thr Val Ala Leu Glu Lys Pro Ser Pro

115 120 125

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165 170 175

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180 185 190

Ile Ser Leu Thr Lys Phe Trp Phe Ser Val Thr Arg Lys Glu Gln Arg

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210 215 220

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225 230 235 240

Ala Lys Glu Glu Gln Phe Arg Tyr Thr Asp Thr Asp Glu Ser Pro Trp

245 250 255

Ile Thr Ile Lys Ser Asn Asp Lys Lys Arg Ala Arg Ile Asn Ala Met

260 265 270

Arg Tyr Val Leu Ser Lys Phe Asp Tyr Thr Asp Lys Asp Tyr Glu Leu

275 280 285

Val Gly Glu Pro Asp Pro Lys Val Val Leu Arg Gly Arg Asp Gln Ile

290 295 300

Gly Asp

305

<210> 4

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atggttggta aactgccgat catggctgaa accaacgaaa acgacctgcc ggttatcgac 60

ctggctcaga tcgaaggtta cgttgttgac gactctgacg aagacgaccc ggttctgctg 120

cgtccggacg gtaccccgat cgaaacctgg cgtgaagact tcccgtacga agaacgtgtt 180

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gttgctctgg aaaaaccgtc tccgcgtgaa tctacctctt ggtacttcca gcgttacatc 420

cagcacttcc cggctgctgg tgaaatcgtt ttcttcgacc gttcttggta caaccgttct 480

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gttccgatgc tggaaaacat gatcctgggt tctggtatct ctctgaccaa attctggttc 600

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cagtggaaac tgtctccgat ggacctggct tctctggacc gttgggacga ctacacccgt 720

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tacaccgaca aagactacga actggttggt gaaccggacc cgaaagttgt tctgcgtggt 900

cgtgaccaga tcggtgacta a 921

Claims

1.一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.编码如权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.包含如权利要求3所述基因的质粒。

5.转化了如权利要求4所述质粒的微生物。

6.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，是所述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌。

7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，是所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。

8.如权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体或者如权利要求6所述微生物在生产L-谷胱甘肽中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，以谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸为底物，使用谷胱甘肽合成酶或者谷胱甘肽合成酶表达菌株作为生物催化剂，并添加权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体或者如权利要求6所述微生物作为ATP再生剂，催化合成L-谷胱甘肽。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，反应体系中添加有ATP和氯化镁、六聚偏磷酸钠。