CN116083394A - 多聚磷酸盐激酶及其偶联谷胱甘肽双功能酶生产谷胱甘肽的方法 - Google Patents

多聚磷酸盐激酶及其偶联谷胱甘肽双功能酶生产谷胱甘肽的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116083394A
CN116083394A CN202310223117.5A CN202310223117A CN116083394A CN 116083394 A CN116083394 A CN 116083394A CN 202310223117 A CN202310223117 A CN 202310223117A CN 116083394 A CN116083394 A CN 116083394A
Authority
CN
China
Prior art keywords
glutathione
polyphosphate kinase
atp
polyphosphate
production
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202310223117.5A
Other languages
English (en)
Inventor
徐美娟
饶志明
高惠
张�杰
张显
杨套伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202310223117.5A priority Critical patent/CN116083394A/zh
Publication of CN116083394A publication Critical patent/CN116083394A/zh
Priority to CN202310738715.6A priority patent/CN116769749A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1229—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种多聚磷酸盐激酶及其偶联谷胱甘肽双功能酶生产谷胱甘肽的方法。本发明通过分子对接和定点突变，理性设计来扩大多聚磷酸盐激酶的双底物polyP6和ADP通道腔，并提高多聚磷酸盐激酶的比酶活，将筛选获得的聚磷酸盐激酶突变体用于生产谷胱甘肽，通过发酵菌体生产并积累GshAB和多聚磷酸盐激酶，收集菌体后破细胞得到裂解液，该裂解液具有内源性的ATP可启动再生系统的优点，避免谷胱甘肽胞内生产过程中细胞屏障和复杂的通路修饰等问题，快速在体外重构谷胱甘肽的生产通路。偶联ATP再生体系后，可以减少ATP的使用，对生产体系优化后可以实现高效生产谷胱甘肽。

Description

多聚磷酸盐激酶及其偶联谷胱甘肽双功能酶生产谷胱甘肽的方法
技术领域
本发明涉及一种多聚磷酸盐激酶及其偶联谷胱甘肽双功能酶生产谷胱甘肽的方法，属于酶工程技术领域。
背景技术
谷胱甘肽(GSH)是所有生物中含量最多的非蛋白质硫醇化合物，具有抗氧化剂、解毒剂和免疫助推器的能力，广泛应用于医疗、食品和化妆品行业。发酵法生产谷胱甘肽的出发菌株主要是酿酒酵母，最近，在无乳链球菌中发现了一种谷胱甘肽双功能酶(GshAB)，它可以直接催化前体谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成GSH，伴随两分子ATP的消耗。发酵法生产谷胱甘肽可能存在细胞膜屏障、底物限制和产物运输等问题，而全细胞催化需要添加大量ATP，导致成本高。
三磷酸腺苷(ATP)是生物体内必需的高能磷酸化合物，它为活细胞内的合成、运输、信息传递等过程提供能量。在酶催化中，ATP通常作为基团转移的辅助因子，参与生产高价值的产品。生物催化中需能反应大多是发生在ATP、ADP和AMP之间的磷酸转移，例如，ATP驱动形成酰胺键、二肽、谷氨酰胺、谷胱甘肽、S-腺苷甲硫氨酸等。考虑到生物反应的时间和反应成本，添加大量的ATP似乎并不可行，这就要求我们寻求ATP供应方法的可持续性和高效性。无机聚磷酸盐(polyP)是具有几种磷酸盐的一种线性聚合物，已在包含古细菌、细菌和真核生物的所有活细胞中发现，可作为压力和生存、能量、细胞运动、生物膜形成和金属离子螯合剂。近年来，多聚磷酸盐激酶(PPK)催化的无机聚磷酸盐与ATP的可逆反应备受关注。PPK可以分为两个家族，PPK1和PPK2，PPK1倾向于以ATP末端的磷酸基团为底物合成polyP，例如，大肠杆菌来源的BlPPK就属于典型的PPK1类。PPK2则表现出相反的特性，可以催化polyP作为腺苷磷酸化的供体。目前，双功能的多聚磷酸盐激酶PPK引起人们的广泛关注，该酶利用廉价易得的磷酸盐(polyP)作为底物，属于PPK2-Ⅲ类，既可以催化腺苷生成二磷酸腺苷，也可催化二磷酸腺苷生成三磷酸腺苷。如何将多聚磷酸盐激酶应用于谷胱甘肽生产中，并提高谷胱甘肽的产量及转化率，成为亟待解决的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种多聚磷酸盐激酶突变体，并提供通过偶联谷胱甘肽双功能酶GshAB和多聚磷酸盐激酶的方法，利用发酵菌体生产并积累GshAB和多聚磷酸盐激酶，收集发酵液菌体后破细胞得到的裂解液来生产谷胱甘肽，提高多聚磷酸盐激酶再生ATP的能力并优化生产体系，实现高效生产谷胱甘肽，提高谷胱甘肽的产量及转化率。
本发明的第一个目的是提供一种多聚磷酸盐激酶突变体，所述多聚磷酸盐激酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的多聚磷酸盐激酶的第81位赖氨酸和/或第103位赖氨酸进行突变。
进一步地，所述多聚磷酸盐激酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的多聚磷酸盐激酶的第81位赖氨酸突变为苏氨酸或组氨酸。
进一步地，所述多聚磷酸盐激酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的多聚磷酸盐激酶的第103位赖氨酸突变为天冬氨酸、甘氨酸或缬氨酸。
进一步地，所述多聚磷酸盐激酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的多聚磷酸盐激酶的第81位赖氨酸突变为苏氨酸或组氨酸，并将第103位赖氨酸突变为天冬氨酸、甘氨酸或缬氨酸。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述多聚磷酸盐激酶突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的表达载体。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述多聚磷酸盐激酶突变体的重组菌。
进一步地，所述重组菌中还表达了谷胱甘肽双功能酶。
进一步地，所述谷胱甘肽双功能酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述重组菌以大肠杆菌为宿主。
进一步地，所述重组菌以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET28a(+)为表达载体。
本发明的第五个目的是提供所述多聚磷酸盐激酶突变体或表达所述多聚磷酸盐激酶突变体的重组菌在生产谷胱甘肽中的应用。
进一步地，所述应用是采用多聚磷酸盐激酶突变体与谷胱甘肽双功能酶偶联为催化剂，以包含40～60mM谷氨酸，40～60mM甘氨酸，40～60mM半胱氨酸，4～6mM ATP和40～60mM polyP6的缓冲液为反应体系，催化生产谷胱甘肽。
进一步地，所述应用是采用所述重组菌的菌体裂解液为催化剂，以包含40～60mM谷氨酸，40～60mM甘氨酸，40～60mM半胱氨酸，4～6mM ATP和40～60mM polyP6的缓冲液为反应体系，催化生产谷胱甘肽。
进一步地，谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和polyP6分批添加到反应体系中。
进一步地，分批添加是分为2～4次添加，分别在初始培养基中添加一份，后间隔1～3小时添加一份。
进一步地，所述菌体裂解液中，菌体量OD600为10～20。
进一步地，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
进一步地，所述菌体裂解液是将所述重组菌在LB培养基中，在35～38℃培养，并采用IPTG诱导培养后得到发酵液，将所述发酵液进行破碎，得到所述菌体裂解液。
本发明在谷胱甘肽生产中，通过发酵菌体生产并积累酶，收集菌体后破细胞得到裂解液，该裂解液可为ATP再生系统生产谷胱甘肽提供内源性的ATP，同时避免谷胱甘肽胞内生产过程中细胞屏障和复杂的通路修饰等问题；偶联ATP再生体系后，可以减少ATP的使用，对生产体系优化后可以实现高效生产谷胱甘肽。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过分子对接和定点突变，理性设计来扩大多聚磷酸盐激酶的双底物polyP6和ADP通道腔，突变前ChPPK的比酶活为605±2.1U/mg，突变后，双突变酶ChPPKK81H-K103V展现最高的催化活性，比酶活为1972±2.5U/mg。
2、本发明将筛选获得的聚磷酸盐激酶突变体用于生产谷胱甘肽，通过发酵菌体生产并积累GshAB和多聚磷酸盐激酶，收集菌体后破细胞得到裂解液，该裂解液具有内源性的ATP可启动再生系统的优点，避免谷胱甘肽胞内生产过程中细胞屏障和复杂的通路修饰等问题，快速在体外重构谷胱甘肽的生产通路。EC01体系中，添加足量的ATP，生产30.7±1.9mM的谷胱甘肽，而在EC03的体系中，运用ChPPKK81H-K103V酶再生ATP的能力，增强ATP的可持续供给，添加5mM ATP，最终6h也可以生产25.4±1.9mM的谷胱甘肽，同时比突变前的EC02体系，谷胱甘肽产量提高了41.9％。对体系的缓冲液、发酵液的菌体量、补料时间优化后，EC01体系可产生47.9±1.3mM谷胱甘肽，EC03体系可产生45.2±1.8mM谷胱甘肽，底物L-半胱氨酸的转化率达到90.4％。
3、ChPPKK81H-K103V的再生体系实现了酶催化生产谷胱甘肽的高产量、高转化率和高经济价值的统一。在获得该高效的PPK突变酶后，生物催化反应中添加ChPPKK81H-K103V可以显著提高ATP再生的效率和可持续性，对体系优化后可提高催化的效率和底物转化率，节省需能反应的成本。
附图说明：
图1为双酶偶联的发酵液生产谷胱甘肽的产量及体系的优化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
谷胱甘肽双功能酶GshAB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；多聚磷酸盐激酶ChPPK的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示；突变体ChPPKK81H-K103V的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
下述实施例中所涉及的培养基：
LB培养基(1L)：10g NaCl、10g胰蛋白胨、5g酵母提取物。
实施例1：重组大肠杆菌菌株BL21/pET-28a-GshAB、BL21/pET-28a-GshAB-ChPPK的构建
具体步骤如下：
(1)过表达质粒pET-28a-ChPPK、pET-28a-GshAB的构建
多聚磷酸盐激酶ChPPK(核苷酸序列见SEQ ID NO.2)和谷胱甘肽双功能酶GshAB(核苷酸序列见SEQ ID NO.1)由苏州金唯智生物科技有限公司合成，获得质粒pET-28a-ChPPK、pET-28a-GshAB。
(2)大肠杆菌BL21感受态的制备
将大肠杆菌E.coli BL21在无抗的LB平板上进行划线，于37℃培养箱放置培养后挑取菌落接种于10mL的LB小瓶中培养12h，1％接种量转接至50mL的LB培养基瓶中，当菌体浓度达至0.4-0.6时，准备大肠感受态的制备。提前进行相关试剂及仪器的预冷处理，准备好试剂盒中的solution A、solution B、1.5mL EP管以及50mL的离心管放置于冰上，离心机控温至4℃。将50mL的菌液在无菌操作台进行分装，离心(8000r·min-1，5min)，去掉上清。吸取5mL的solution A进行吹吸悬浮，离心(8000r·min-1，5min)，去掉上清。吸取5mL的solution B进行吹吸悬浮，分装至提前预冷装备好的EP管中，每管装100μL。
(3)重组菌BL21/pET-28a-GshAB、BL21/pET-28a-GshAB-ChPPK的构建
将步骤(1)所得到的pET-28a-ChPPK、pET-28a-GshAB质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到转化子，涂布于含有浓度为50μg/mL的卡纳霉素的LB固体培养基中，37℃培养12h，挑取阳性菌落，以P1/P2为引物通过Taq DNA聚合酶对单菌落进行菌落PCR验证；带有目的条带大小的阳性单菌落接种于含有LB液体培养基的小瓶中培养12h后，提质粒，送金唯智公司测序。测序正确，则E.coli BL21/pET-28a-ChPPK构建成功。以同样的方法构建得到E.coli BL21/pET-28a-GshAB，命名为EC01。
以质粒pET-28a-ChPPK为模板，以引物P3/P4扩增得到ChPPK片段，所得的基因片段经纯化后分别与线性化质粒pET-28a-GshAB(P5/P6扩增)通过同源重组酶连接，转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，得到转化子。同样，按上述方法构建得到BL21/pET-28a-GshAB-ChPPK命名为EC02。
P1：5’-cctgtggcgccggtgatgccggcc-3’；
P2：5’-atccggatatagttcctcctttca-3’；
P3：5’-cccgaaaggaagcggttctggcaaatattctgaaatgag-3’；
P4：5’-ccaagctgaattcgagctcgttagtggtggtggtggtggtgatcgg-3’；
P5：5’-accaccaccaccaccactaacgagctcgaattcagcttggctgt-3’；
P6：5’-agaatatttgccagaaccgcttcctttcgggctttgttagcag-3’。
实施例2：定点突变及酶活比较
(1)突变点的选择
采用Swiss-model预测ChPPK蛋白的三维结构，利用Schrodinger-glide对接底物与蛋白质，通过对接分析选择最佳的对接位置。对ChPPK蛋白的结构分析后发现双底物polyP6和ADP通道入口处的K81和K103残基可能会影响底物的进入，进一步影响该酶活性口袋的灵活性，并推测可以对双底物通道腔进行理性设计，扩大底物的通道，让更多的底物进入活性中心，从而提高酶的活性。选择K81和K103两个残基位点，运用Pymol软件对这两个位点进行突变，测定残基D77和K81之间的距离以及残基K81和K103之间的距离。突变前，残基D77的氧原子与残基K81的氮原子之间距离为
Figure BDA0004117525290000051
残基K81的氮原子与残基K103的氮原子之间的距离为
Figure BDA0004117525290000052
对残基K81与K103进行突变，通过Pymol软件进行可视化，残基D77与T81距离为
Figure BDA0004117525290000053
T81与D103、G103、V103距离分别为
Figure BDA0004117525290000054
Figure BDA0004117525290000055
残基D77与H81距离为
Figure BDA0004117525290000056
H81与D103、G103、V103距离分别为
Figure BDA0004117525290000057
Figure BDA0004117525290000058
T81、H81与D103、G103、V103的突变使双底物polyP6和ADP的通道入口变大，因此，选择K81T、K81H、K103D、K103G和K103V用于后续的突变实验。
(2)定点突变
野生型ChPPK的K81位点定点突变为T、H，K103位点定点突变为V、G、D，基因位点的突变通过设计包含特定突变序列的引物来实现定点突变，按照P7-P15引物进行定点突变。PCR条件：以pET28a-ChPPK为DNA模板，扩增条件为：95℃预变性，5min：95℃变性，30s，58℃退火，30s，72℃延伸，2.5min，30个循环；72℃终延伸5min。获得的重组质粒送至金唯智(苏州)测序验证。测序正确的质粒按照实例1(3)的构建方法，构建得到重组菌株BL21/pET-28a-ChPPKmuts。
P7：5’-tgacttccttcgtggtgccatccaagatcgaactgtccca-3’；
P8：5’-tggcaccacgaaggaagtcaccttcacgccttgtg-3’；
P9：5’-tgacttccttcggcgtgccatccaagatcgaactgtccca-3’；
P10：5’-tggcacgccgaaggaagtcaccttcacgccttgtg’；
P11：5’-tgacttccttcgatgtgccatccaagatcgaactgtccca’；
P12：5’-tggcacatcgaaggaagtcaccttcacgccttgtg’；
P13：5’-atgcagccggccacgatggcaccgtgaagcacatc’；
P14：5’-caagcaatggatgcagccggccacgatggcaccgtgaa’；
P15：5’-atgcagccggcaccgatggcaccgtgaagcacatc’；
P16：5’-ccaagcaatggatgcagccggcaccgatggcacc’；
(3)蛋白的破碎与纯化
将BL21/pET-28a-ChPPK和BL21/pET-28a-ChPPKmuts重组菌株单菌落接种到10mL的LB液体培养基中，37℃培养12小时，1％接种量接种至50mL的LB液体培养基中，培养到OD600约为0.8，加入IPTG，16℃培养16h。PBS洗细胞洗三次，收集的菌体重新用PBS悬浮，超声破碎仪破碎细胞，大肠杆菌破1s停3s，共破15min。离心10000rpm，20min，取上清液跑蛋白胶。将粗酶液通过蛋白纯化镍柱进行纯化，纯酶跑蛋白胶验证。
(4)酶活比较
酶活测定的反应体系(2mL)包含(终浓度)100mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM葡萄糖、10mM NADP、10mM ADP、10mM polyP6、5U/mL HK、5U/mL G6PD和50μL PPK酶。反应在37℃下反应30min，沸水中反应5min以终止酶反应，12 000rpm离心5min，取上清液在340nm处测定吸光度。PPK的酶活(1U)定义为每分钟产生1μmol ATP所需的酶量。
分别将K81和K103两个残基位点进行定点突变，通过Ni2+-NTA柱亲和层析纯化，随后将野生型WT和突变酶分别在37℃反应30min，测定其酶活。野生型比酶活为605±2.1U/mg，81位点突变中，突变酶K81H的比酶活提高最多，为938±1.2U/mg，103位定点突变中，与野生型相比，K103V的比酶活提高最多，为1065±2.9U/mg，这也证明了通过理性改造，扩大双底物ADP与polyP6的通道腔，可以有效地提高ChPPK的催化活性。
于是针对以上比酶活提高的单突变酶，我们构建了6个双突变酶，并测定了双突变酶的比酶活，期望获得酶活提高更显著的突变酶。双突变酶K81H-K103V展现最高的催化活性，比酶活为1972±2.5U/mg。所有突变酶的比酶活见表1。
表1
突变酶 比酶活(×10，U/mg)
WT 60.5±0.21
K81T 76.8±0.34
K81H 93.8±0.12
K103D 80.5±0.24
K103G 84.7±0.09
K103V 106.5±0.29
K81T-K103D 101.0±0.17
K81T-K103G 115.6±0.30
K81T-K103V 175.5±0.23
K81H-K103D 113.1±0.15
K81H-K103G 155.5±0.22
K81H-K103V 197.2±0.25
实施例3：双酶偶联的发酵液生产谷胱甘肽
(1)菌株BL21/pET-28a-GshAB-ChPPKK81H-K103V的构建
以质粒pET-28a-ChPPKK81H-K103V为模板，以引物P3/P4扩增得到ChPPKK81H-K103V片段，所得的基因片段经纯化后分别与线性化质粒pET-28a-GshAB(P5/P6扩增)通过同源重组酶连接，转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到转化子。同样，按实例1的方法构建得到E.coli BL21/pET-28a-GshAB-ChPPKK81H-K103V，命名为EC03。
(2)发酵液的处理
分别将EC01、EC02、EC03的单菌落接种到10mL LB液体小瓶中，37℃培养18h，按1％(V/V)接种量接种到100mL LB培养基中，37℃培养4h，OD600约为0.8时，加入0.2mM IPTG，16℃培养18h，发酵菌体生产并积累相关酶。收集发酵液的菌体后加入800mLPBS缓冲液(pH8.0，100mM)重悬细胞(OD600为10)，高压匀浆机破碎细胞15min，破碎后得到的裂解液备用。
(3)双酶偶联的发酵液生产谷胱甘肽
EC01生产谷胱甘肽体系：PBS缓冲液包含谷氨酸50mM，甘氨酸50mM，半胱氨酸50mM，ATP 100mM。EC02/EC03生产谷胱甘肽体系：PBS缓冲液包含谷氨酸50mM，甘氨酸50mM，半胱氨酸50mM，5mM ATP，polyP6 50mM。将上述的发酵液的裂解液加入到该体系中。用NaOH调pH为8.0，37℃反应。
生产体系中添加底物谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和充足的ATP(100mM)时，37℃反应后，取样测定谷胱甘肽产量。如图1A所示，EC01的生产体系6h内可将50mM的底物转化为30.7±1.9mM的谷胱甘肽，但由于ATP的价格昂贵，在实际生产中添加大量的ATP是不太可能的，因此，我们将ChPPK与GshAB偶联，除了额外添加的5mM ATP，裂解液中内源性的ATP也可进一步启动催化反应，EC02生产体系6h可生产17.9±1.7mM的谷胱甘肽。而在突变酶ChPPKK81H-K103V与GshAB偶联的EC03生产体系中，6h内可将50mM底物转化产生25.4±1.9mM的谷胱甘肽，可以达到EC01生产体系的82.7％的效果，比未突变的ChPPK与GshAB偶联的产量提高了41.9％。突变酶ChPPKK81H-K103V可以有效地减少底物ATP的添加，在该突变酶的驱动下，为谷胱甘肽的生产提供了高效的ATP供应，大大节省了反应成本。
实施例4：双酶偶联的发酵液生产谷胱甘肽体系的优化
(1)缓冲液的优化
按照实例3中生产谷胱甘肽的体系，改变体系的缓冲液，分别放置于PBS、Tris-HCl、甘氨酸-NaOH缓冲液中，37℃反应，取样测定谷胱甘肽的产量。如图1B所示，6h时EC01在PBS、Tris-HCl、甘氨酸-NaOH缓冲液中谷胱甘肽的产量分别为31.5±1.4mM、34.1±2.7mM、27.6±1.1mM，EC03在PBS、Tris-HCl、甘氨酸-NaOH缓冲液中谷胱甘肽的产量分别为24.3±2.1mM、26.8±2.9mM、20.2±2.5mM。由此可见，在Tris-HCl缓冲液下EC01、EC03体系中谷胱甘肽的产量最高，选择Tris-HCl缓冲液用于后续实验。
(2)菌体量的优化
按照实例3中生产谷胱甘肽的体系，改变发酵液的菌体量，分别将OD600为5、10、15、20的发酵液通过高压匀浆机破碎细胞15min，破碎后得到的裂解液加入体系中，37℃反应，取样测定谷胱甘肽的产量。如图1C所示，OD600为5、10、15时，EC01与EC03体系中谷胱甘肽产量逐渐增加，而OD600为20时，谷胱甘肽产量不再增加，当OD600为15时，EC01与EC03中谷胱甘肽产量最高，分别为39.9±1.5mM、30.4±1.4mM，选择OD600为15用于后续实验。
(3)补料时间的优化
按照实例3中生产谷胱甘肽的体系，选择缓冲液Tris-HCl、菌体量OD600为15的反应条件，改变底物补料的时间，将底物分别于不同时间加入到体系中，37℃反应，取样测定谷胱甘肽的产量。如图1D所示，初始培养基中底物谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的量分别为16.6mM，并在2h、4h分别加入底物谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸(每次每种底物添加量为16.6mM，合计总量为每种底物约50mM)，6h时EC01体系中谷胱甘肽产量最高，为47.9±1.3mM；而EC03生产谷胱甘肽的体系在缓冲液和菌体量最优的情况下，初始培养基中底物谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的量分别为16.6mM，polyP6的量为33.3mM，并在2h和4h分别加入底物谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸(每次每种底物添加量为16.6mM，合计总量为每种底物约50mM)和polyP6(每次加入33.3mM)，6h时EC03体系中谷胱甘肽产量为45.2±1.8mM，底物L-半胱氨酸的转化率为90.4％，与未优化的EC03体系生产谷胱甘肽产量(25.4±1.9mM)提高了1.78倍；在2h、4h、6h加入底物后谷胱甘肽产量并未继续增加，可能是由于随着时间的增加，体系中酶的活性逐渐降低，生产效率因此下降。本文中谷胱甘肽产量的对比见表2。
表2
Figure BDA0004117525290000091
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种多聚磷酸盐激酶突变体，其特征在于，所述多聚磷酸盐激酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的多聚磷酸盐激酶的第81位赖氨酸和/或第103位赖氨酸进行突变。
2.根据权利要求1所述的多聚磷酸盐激酶突变体，其特征在于，所述多聚磷酸盐激酶突变体为如下突变体中的一种：
将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的多聚磷酸盐激酶的第81位赖氨酸突变为苏氨酸或组氨酸；
将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的多聚磷酸盐激酶的第103位赖氨酸突变为天冬氨酸、甘氨酸或缬氨酸；
将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的多聚磷酸盐激酶的第81位赖氨酸突变为苏氨酸或组氨酸，并将第103位赖氨酸突变为天冬氨酸、甘氨酸或缬氨酸。
3.一种编码权利要求1～2任一项所述多聚磷酸盐激酶突变体的基因。
4.一种携带权利要求3所述基因的表达载体。
5.一种表达权利要求1～2任一项所述多聚磷酸盐激酶突变体的重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌中还表达了谷胱甘肽双功能酶。
7.权利要求1～2任一项所述的多聚磷酸盐激酶突变体或权利要求7～8任一项所述的重组菌在生产谷胱甘肽中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是采用多聚磷酸盐激酶突变体与谷胱甘肽双功能酶偶联为催化剂，以包含40～60mM谷氨酸，40～60mM甘氨酸，40～60mM半胱氨酸，4～6mM ATP和40～60mM polyP6的缓冲液为反应体系，催化生产谷胱甘肽；或，
所述应用是采用所述重组菌的菌体裂解液为催化剂，以包含40～60mM谷氨酸，40～60mM甘氨酸，40～60mM半胱氨酸，4～6mM ATP和40～60mM polyP6的缓冲液为反应体系，催化生产谷胱甘肽。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和polyP6分批添加到反应体系中，分批添加是分为2～4次添加，分别在初始培养基中添加一份，后间隔1～3小时添加一份。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述菌体裂解液中，菌体量OD600为10～20；所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
CN202310223117.5A 2023-03-09 2023-03-09 多聚磷酸盐激酶及其偶联谷胱甘肽双功能酶生产谷胱甘肽的方法 Withdrawn CN116083394A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310223117.5A CN116083394A (zh) 2023-03-09 2023-03-09 多聚磷酸盐激酶及其偶联谷胱甘肽双功能酶生产谷胱甘肽的方法
CN202310738715.6A CN116769749A (zh) 2023-03-09 2023-06-21 多聚磷酸盐激酶及其偶联谷胱甘肽双功能酶生产谷胱甘肽的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310223117.5A CN116083394A (zh) 2023-03-09 2023-03-09 多聚磷酸盐激酶及其偶联谷胱甘肽双功能酶生产谷胱甘肽的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116083394A true CN116083394A (zh) 2023-05-09

Family

ID=86200984

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310223117.5A Withdrawn CN116083394A (zh) 2023-03-09 2023-03-09 多聚磷酸盐激酶及其偶联谷胱甘肽双功能酶生产谷胱甘肽的方法
CN202310738715.6A Pending CN116769749A (zh) 2023-03-09 2023-06-21 多聚磷酸盐激酶及其偶联谷胱甘肽双功能酶生产谷胱甘肽的方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310738715.6A Pending CN116769749A (zh) 2023-03-09 2023-06-21 多聚磷酸盐激酶及其偶联谷胱甘肽双功能酶生产谷胱甘肽的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN116083394A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117721165A (zh) * 2024-02-08 2024-03-19 天津凯莱英生物科技有限公司 Atp再生体系和多肽的合成方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111254129A (zh) * 2020-03-24 2020-06-09 浙江华睿生物技术有限公司 一种多聚磷酸激酶突变体及其应用
CN111662358A (zh) * 2019-03-07 2020-09-15 华东理工大学 一种无细胞自组装体系高效合成谷胱甘肽的方法
CN114606213A (zh) * 2022-01-28 2022-06-10 浙江工业大学 一种多聚磷酸激酶突变体、工程菌及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111662358A (zh) * 2019-03-07 2020-09-15 华东理工大学 一种无细胞自组装体系高效合成谷胱甘肽的方法
CN111254129A (zh) * 2020-03-24 2020-06-09 浙江华睿生物技术有限公司 一种多聚磷酸激酶突变体及其应用
CN114606213A (zh) * 2022-01-28 2022-06-10 浙江工业大学 一种多聚磷酸激酶突变体、工程菌及其应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117721165A (zh) * 2024-02-08 2024-03-19 天津凯莱英生物科技有限公司 Atp再生体系和多肽的合成方法
CN117721165B (zh) * 2024-02-08 2024-05-03 天津凯莱英生物科技有限公司 Atp再生体系和多肽的合成方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN116769749A (zh) 2023-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113151198B (zh) 一种γ-谷酰胺甲胺合成酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用
CN116769749A (zh) 多聚磷酸盐激酶及其偶联谷胱甘肽双功能酶生产谷胱甘肽的方法
CN113186142A (zh) 一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
CN110373370A (zh) 一种耦合atp再生系统的催化体系及其在生产谷胱甘肽过程中的应用
KR100922085B1 (ko) Ｃｍｐ-ｎ-아세틸뉴라민산의 제조 방법
CN111808829A (zh) 一种γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体及其应用
CN114921392B (zh) 一种高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法
US11760988B2 (en) L-aspartate alpha-decarboxylase mutant and application thereof
CN114736884A (zh) 一种胞苷单磷酸激酶突变体及其基因和应用
CN104372050A (zh) 一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法
JP3833584B2 (ja) Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法
CN116925993B (zh) 用于酶催化生产胞苷酸的基因工程改造菌株和方法
CN115786296B (zh) 一种内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体及生产方法
JP2003093091A5 (zh)
CN111607548B (zh) 一种产甘露聚糖的重组大肠杆菌及其应用
CN113817761B (zh) 一种无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌及其构建方法与应用
CN113373192B (zh) 一种生物酶法合成核苷酸或其衍生物的方法
CN116218796A (zh) 一种gmas突变体及其在合成茶氨酸中的应用
CN116004599A (zh) 一种不可逆合成燕窝酸的微生物细胞转化方法
CN116042566A (zh) 烟酰胺核糖激酶突变体及其应用
CN117757760A (zh) 一种谷氨酰半胱氨酸合成酶及其应用
CN116179459A (zh) 一种多酶协同表达重组基因工程菌及其应用
CN117511831A (zh) 产麦角硫因的大肠杆菌的构建方法
CN118185886A (zh) 一种用于活化co2的甲酸脱氢酶突变体
CN118028202A (zh) 一种高效合成乳酰-n-二糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20230509