CN113373192B - 一种生物酶法合成核苷酸或其衍生物的方法 - Google Patents

一种生物酶法合成核苷酸或其衍生物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种生物酶法合成核苷酸或其衍生物的方法，以核苷或其衍生物，聚磷酸盐，ADP或ATP为原料，在核糖激酶和多聚磷酸激酶的催化作用下发生反应，制得核苷酸或其衍生物。本发明构建的方法实现了在体外生物催化以核苷和ADP等为原料合成核苷酸，仅需要少量起始ADP或ATP就可以完成反应，且能量循环再生，极大地降低了成本，并对耦联体系进行酶量比、反应温度、pH的优化，确立最佳反应条件，提高核苷酸的产量。本发明的体外生物催化可以缩短生产周期，避免分离纯化难度大，生产周期长，产品纯度不高等问题。

Description

一种生物酶法合成核苷酸或其衍生物的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种生物催化合成核苷酸或其衍生物的方法。
背景技术
核苷酸由一类由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物，作为生物生长发育过程中的重要中间体，发挥着不可替代的作用。
核苷酸的种类很多，都有着广泛的用途。例如肌苷酸在食品行业常用作增鲜剂，在医药行业用于治疗白细胞减少症、各种心脏疾病等(吕东坡等.肌苷酸的研究现状及展望.肉类研究,2007.11)。胞苷酸具有促进蛋白质合成、防皱、保湿、抗衰老等功能，也被用于化妆品行业。胞苷酸的衍生物常被用于医药行业。例如胞二磷胆碱能促进生物代谢,尤其是磷脂的生物合成反应，常被用来治疗神经疾病(宋丽芳等.东方伊萨酵母生物转化法制备胞二磷胆碱.食品与生物技术学报,2015.34(02))；此外，还有些核苷酸衍生物可用于急、慢性肝炎的治疗(Ibragimov EK，et al.Efficacy and safety of long-term therapy withnucleotides analogues in chronic hepatitis B.Terapevticheskii arkhiv，2019.91(2))。由于核苷酸及其衍生物用途广泛，因而对其合成研究越来越得到重视。
目前，核苷酸及其衍生物具有工业化前景的生产方法主要是RNA酶解法和酶催化法。张等采用超滤和盐析技术从麦芽根浸提液中获得1500u/mL的高活力5′-磷酸二酯酶液，在RNA浓度5.8％、酶用量8％、反应2h条件下，水解率可达95％(张一平等.高活力5′-磷酸二酯酶制备及水解RNA的研究.生物技术，2010.20(1))，再用离子交换法对水解液中四种核苷酸进行分离提取,可得到多种核苷酸(华洵璐等.核酸水解酶及酶解法生产核苷酸研究进展.辽宁大学学报，2012.39(2))，然而提取工艺烦琐，分离纯化得到4种高纯度产品的难度大，导致生产周期长，产品纯度不高。酶催化法是以多种核苷、ATP和磷酸二氢钠为原料，在核糖激酶的催化下反应得到母液，再调pH精制得到核苷酸，收率达90％(张剑等.一种5′-胞苷酸的酶催化合成工艺.2017)，但核糖激酶催化过程使用ATP等本身价格高昂的磷酸供体，导致生产成本很高。
因此，研发一种基于能量循环再生的低成本、高收率、高纯度且操作简便、环境友好的核苷酸及其衍生物合成法是非常必要的。
发明内容
本发明的第一个目的在于，提供一种基于能量循环再生的低成本、高收率、高纯度且操作简便、环境友好的生物酶法合成核苷酸或其衍生物的方法。
本发明的第二个目的在于，提供具有较高转化率和催化活性以及非常广的底物谱的核糖激酶(Ribokinase)在生物合成核苷酸或其衍生物中的应用。
本发明的第三个目的在于，提供具有较高转化率和催化活性以及极端嗜酸性的多聚磷酸激酶(Polyphosphatekinase)在生物合成核苷酸或其衍生物中的应用。
本发明的第四个目的在于，提供具有协同效果的双酶催化体系在生物合成核苷酸或其衍生物中的应用。
为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种生物酶法合成核苷酸或其衍生物的方法，以核苷或其衍生物，聚磷酸盐，ADP或ATP为原料，在核糖激酶和多聚磷酸激酶的催化作用下发生反应，制得核苷酸或其衍生物。
作为一个优选方案，所述反应在温度为30-60℃，pH为3.0-8.0的条件下进行。
作为一个优选方案，所述反应在MgCl2或MgSO4存在的条件下进行。
作为一个优选方案，所述核苷或其衍生物的浓度为50-200mM，所述聚磷酸盐的浓度为30-100mM，所述ADP或ATP的浓度为1-10mM。
作为一个优选方案，所述核糖激酶的基因序列为如下(1)—(3)任一所示：
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
(3)与(1)或(2)限定的核苷酸序列至少具有80％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
作为一个优选方案，所述多聚磷酸激酶的基因序列为如下(1)—(3)任一所示：
(1)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
(3)与(1)或(2)限定的核苷酸序列至少具有80％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：核糖激酶在生物合成核苷酸或其衍生物中的应用，所述核糖激酶的基因序列为如下(1)—(3)任一所示：
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
(3)与(1)或(2)限定的核苷酸序列至少具有80％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：多聚磷酸激酶在生物合成核苷酸或其衍生物中的应用，所述多聚磷酸激酶的基因序列为如下(1)—(3)任一所示：
(1)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
(3)与(1)或(2)限定的核苷酸序列至少具有80％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
为实现本发明第四个目的，本发明公开以下技术方案：双酶催化体系在生物合成核苷酸或其衍生物中的应用，所述双酶催化体系包括核糖激酶和多聚磷酸激酶。
作为一个优选方案，所述核糖激酶的基因序列为如下(1)—(3)任一所示：
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
(3)与(1)或(2)限定的核苷酸序列至少具有80％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
所述多聚磷酸激酶的基因序列为如下(4)—(6)任一所示：
(4)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
(5)SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
(6)与(4)或(5)限定的核苷酸序列至少具有80％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
本发明中所使用的各种酶的具体存在形式包括酶液、酶冻干粉、含酶细胞以及各种固定化酶和固定化酶细胞，可以是未经纯化的粗酶形式、也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。
本发明核苷或其衍生物是指嘌呤核苷或嘧啶核苷，包含胞苷，尿苷，鸟苷，肌苷，以及以它们为中间产物的化学品，如胞苷的衍生物阿糖胞苷。
聚磷酸盐是指磷酸的聚合物，包括二聚、三聚等不同链长的缩聚磷酸盐，常用聚磷酸盐是六偏磷酸钠和三聚磷酸钠。
本发明核糖激酶和多聚磷酸激酶同源序列还包括与本发明所公开的核糖激酶和多聚磷酸激酶的基因序列有至少80％、85％、90％、94％、95％、98％、或99％序列相似性。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法、Needleman-Wunsch全局比对法、Smith-Waterman局部比对法、Pearson和Lipman相似性搜索法、Karlin和Altschul的算法，这对于本领域技术人员来说是公知的。虽然并不是所有来源的核糖激酶都具有本发明所主张的效果，但是来自Thermovibrio guaymasensis和Phorcysia thermohydrogeniphila的两个不同来源核糖激酶都被证实具有效果，本领域技术人员可以知晓，本发明公开的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列以及与(1)或(2)限定的核苷酸序列至少具有80％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子编码的蛋白质与多聚磷酸激酶联合使用具有良好的催化效率。
本发明首次筛选到了具有较高转化率和催化活性以及非常广的底物谱的两种极端嗜热来源核糖激酶，分别来自Thermovibrio guaymasensis和Phorcysiathermohydrogeniphila。通过发明人多年的研究、分析、对比，首次分离出来自极端嗜酸菌Acidibacillus sulfuroxidans的多聚磷酸激酶编码基因。发明人经过比较多种微生物来源的多聚磷酸激酶的活性和与核糖激酶的协同性，证实与Acidibacillus sulfuroxidans来源多聚磷酸激酶具有70％以上氨基酸序列相似性的多种多聚磷酸激酶均可以与核糖激酶级联反应，只是转化率上有高低不同。
基于来自极端嗜酸菌Acidibacillus sulfuroxidans的多聚磷酸激酶，本发明首次建立了在酸性条件下高效运行的ATP再生系统，并且实现酶法高产多种核苷酸。本发明实施例中证实，与Acidibacillus sulfuroxidans来源多聚磷酸激酶具有70％以上氨基酸序列相似性的多种多聚磷酸激酶，比如来自于Halothiobacillus neapolitanus，Methylomonas koyamae，Acidihalobacter ferrooxidans的多聚磷酸激酶，均可以在酸性条件下，与核糖激酶级联反应生产核苷酸。
本发明一实施例中也证实，非嗜酸多聚磷酸激酶，比如Jhaorihella thermophile来源多聚磷酸激酶，与核糖激酶在碱性条件下也可以产生协同效应高效催化合成核苷酸。
本发明所需核糖激酶的一个实施例中制备方法如下：
(1)将SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列分别连接质粒中，得到重组质粒，然后转化至BL21(DE3)，得到重组菌；
(2)培养重组菌，诱导表达重组蛋白，离心收集菌体，在70℃热裂解30分钟收集菌体直接用于反应。
本发明所需多聚磷酸激酶的一个实施例中制备方法如下：
(1)将SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列连接质粒中，得到重组质粒，然后转化至BL21(DE3)，得到重组菌；
(2)培养重组菌，诱导表达重组蛋白，利用高压匀浆机破碎收集菌体，通过镍离子亲和层析柱纯化蛋白。
本发明的一种实施方式中，重组菌以pET-28a(+)为表达载体。
本发明的一种实施方式中，重组菌以BL21或Rosetta为宿主菌。
本发明的优点在于，本发明核糖激酶催化多种核苷和ATP形成相应的核苷酸和ADP；多聚磷酸激酶催化ADP和聚磷酸盐生成ATP，实现ATP循环利用和多种核苷酸生产。本发明构建的方法实现了在体外生物催化以核苷和ADP等为原料合成核苷酸，仅需要少量起始ADP或ATP就可以完成反应，且能量循环再生，极大地降低了成本，并对耦联体系进行酶量比、反应温度、pH的优化，确立最佳反应条件，提高核苷酸的产量。本发明的体外生物催化可以缩短生产周期，仅需要3-10h即可获得产物，并且可以避免分离纯化难度大，生产周期长，产品纯度不高等问题。
附图说明
图1为酶催化体外合成胞苷酸反应流程图。
图2为胞苷酸标准品液相图谱。
图3为胞苷酸标准品和胞苷标准品混合液相图谱。
图4为生物催化产物液相图谱。
图5为酶的表达纯化。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。下述实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
以下实施例中所用的两种核糖激酶分别来自Thermovibrio guaymasensis和Phorcysia thermohydrogeniphila，(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)多聚磷酸激酶分别来自Jhaorihella thermophile和Acidibacillus sulfuroxidans(SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4)。将各自的基因分别连接至pET28a表达载体上，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到的阳性克隆培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.2mM的IPTG，18℃，220rpm诱导培养16h。
实施例1.
体外合成相关酶的纯化，具体步骤如下：
分别接四种重组菌至50ml含有50mg/L卡那霉素的LB中，37℃，220rpm培养6-8h，随后按2％接种量接入100ml的LB中于37℃培养，待OD600达0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，18℃，220rpm诱导16-18h。离心收集菌体，弃去上清，加入适量的含有10mM咪唑，500mMNaCl的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)重悬菌体。对于核糖激酶的纯化，使用热裂解法。将重悬后的菌体在70℃孵育30分钟，离心收集上清液，直接用于反应。对于多聚磷酸激酶的纯化，将重悬后的菌体加入压力破碎机进行破碎，压力为600-700bar，直至菌液变澄清。收集破碎后的菌体，离心得到上清，将上清倒入镍柱中，使用含有不同浓度咪唑的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集150mM咪唑浓度下的洗脱液。将洗脱液超滤浓缩，直至剩余体积达0.5ml左右，按体积比1:1加入50％的分子级甘油，混匀后分装，置于-80℃保存备用。对纯化得到的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示。其中1号泳道为protein maker；2号泳道为Phorcysiathermohydrogeniphila来源核糖激酶；3号泳道为Jhaorihella thermophile来源多聚磷酸激酶；4号泳道为Thermovibrio guaymasensis来源核糖激酶；5号泳道为Acidibacillussulfuroxidans来源多聚磷酸激酶。
实施例2.
胞苷酸体外合成，具体如下：
反应体系及反应条件：反应体系包括2mM ADP,40mM MgCl2,30mM polyP,50mM胞苷,50mM PB缓冲液，Thermovibrio guaymasensis来源核糖激酶浓度为0.8-1.0g/L，Acidibacillus sulfuroxidans来源多聚磷酸激酶浓度为0.1-0.3g/L，总体积1mL，45-60℃，pH 4.0-4.5反应时间为10h，得到产物胞苷酸。
按实施例2的体外合成体系，用高效液相色谱检测胞苷酸的含量(图2、图3、图4)，最终产量为40mM，以加入的胞苷计算产率为80％。
实施例3.
胞苷酸体外合成，具体如下：
反应体系及反应条件：反应体系包括2mM ADP,40mM MgCl2,30mM polyP,50mM胞苷,50mM PB缓冲液，Phorcysia thermohydrogeniphila来源核糖激酶浓度为0.2-0.5g/L，Jhaorihella thermophile来源多聚磷酸激酶浓度为0.1-0.3g/L，总体积1mL，30-45℃，pH7.0-8.0反应时间为10h，得到产物胞苷酸。
按实施例3的体外合成体系，用高效液相色谱检测胞苷酸的含量，最终产量为45mM，以加入的胞苷计算产率为90％。
实施例4.
胞苷酸体外合成，具体如下：
反应体系及反应条件：反应体系包括2mM ADP,40mM MgCl2,30mM polyP,150mM胞苷,50mM PB缓冲液，Phorcysia thermohydrogeniphila来源核糖激酶浓度为0.8-1.0g/L，Acidibacillus sulfuroxidans来源多聚磷酸激酶浓度为0.2-0.4g/L，总体积1mL，45-60℃，pH 4.5-5.5反应时间为2h；之后向体系中补加30mM polyP，保持酶浓度不变，继续反应2h；之后向体系中补加20mM polyP，保持酶浓度不变，继续反应2h，得到产物胞苷酸。
按实施例4的体外合成体系，用高效液相色谱检测胞苷酸的含量，最终产量为125mM，以加入的胞苷计算产率为96％。
实施例5.
胞苷酸体外合成，具体如下：
通过补料分批培养得到50mM的胞苷，取50mL发酵液，向中加入40mM MgCl2，30mMpolyP，Phorcysia thermohydrogeniphila来源核糖激酶浓度为0.8-1.0g/L，Acidibacillus sulfuroxidans来源多聚磷酸激酶浓度为0.3-0.5g/L，45-60℃，pH 4.5-5.5，反应时间为5h，得到产物胞苷酸。
按实施例5的体外合成体系，用高效液相色谱检测胞苷酸的含量，最终产量为42mM，以加入的胞苷计算产率为84％。
实施例6.
胞苷酸体外合成，具体如下：
反应体系及反应条件：反应体系包括2mM ADP,40mM MgCl2,30mM polyP,50mM胞苷,50mM PB缓冲液，Phorcysia thermohydrogeniphila来源核糖激酶浓度为0.8-1.0g/L，与Acidibacillus sulfuroxidans来源多聚磷酸激酶具有70％以上氨基酸序列相似性的多种多聚磷酸激酶，其序列参见SEQ ID NO.5——SEQ ID NO.7，总体积1mL。具体如下表：
Figure BDA0002392046920000081
Figure BDA0002392046920000091
实施例7.
多种核苷酸体外合成，使用Phorcysia thermohydrogeniphila来源核糖激酶，Acidibacillus sulfuroxidans来源多聚磷酸激酶。具体如下表：
Figure BDA0002392046920000092
实施例8.
多种核苷酸体外合成，使用Thermovibrio guaymasensis来源核糖激酶，Acidibacillus sulfuroxidans来源多聚磷酸激酶。具体如下表：
Figure BDA0002392046920000093
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 一种生物酶法合成核苷酸或其衍生物的方法
<130> /
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213> Thermovibrio guaymasensis
<400> 1
atgcgtgata tcctggcgtt cggtagcatc gttattgata acgttctgct ggttaaacgt 60
ttcgcgtctg ttaacgaaac cgttcaggcg gaaaaatacc gttacaccta cggcggcgcg 120
ggcgcgaacg ttgcggttgc agcggctcgt ctgggcgcga aatctggcgt tttcgctgtt 180
tctggttatg atttcaaacg tttcaactac gaacgtaccc tgatcgaaca gggtgttgat 240
gttcgtggtg ttatcgaaaa ctctaactct ccgatgccgc gtagcttcat catctctatc 300
gaaggtagcg atgatcagat cctgtactac tacgaaaacc gtcgtgaaac cagcaaactg 360
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<210> 3
<211> 911
<212> DNA
<213> Jhaorihella thermophile
<400> 3
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agtaatgata aaaaacgtgc acgcattaat tgcatgaaac attttctggc aagtctggac 900
tacccggaca a 911
<210> 4
<211> 789
<212> DNA
<213> Acidibacillus sulfuroxidans
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gaacagtcta tcaaacactg ggaagaatac agcgttgcgc gtaacgaaat gttcgcgcgt 600
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ctgaacgtta tcaaacacat cctgacccag ttccagtacg ttgataaaga agaagcgatc 720
accctgccga acccggatgt tgttttcccg tacgatgaaa cctacctgcg tgataaaaag 780
atcgcgccg 789
<210> 5
<211> 795
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<213> Halothiobacillus neapolitanus
<400> 5
atggcgcacc acactccaag tgcagcgcac ccaaaaacgc cgacgaaaaa agcatatgaa 60
cacgagctgc acggcttaca agtggaattg gtcaaattac agaaacattt tattgcacag 120
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gcgctcattt gtcctaatcc ggatattgtt tttacgtatg cagaggccta tttggacaac 780
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<211> 780
<212> DNA
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<210> 7
<211> 795
<212> DNA
<213> Acidihalobacter ferrooxidans
<400> 7
atgccgcatc accctgcgcc tgccccgtac cctgaaacgc caagtaaaaa agactataaa 60
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atgctgatcc ggagcgggat ccatcttatt aaatattact tagatatctc taaagacgaa 480
caaaaaaaac gtttggcggc ccgtcgtaaa gatcctctca aacaatggaa aatgagccct 540
atcgatgcgg tggcacaaaa acattggcgc gattattcgg aagcccgcga cgccatgttt 600
gcacggaccc acagcgcact ggccccttgg accattgcgc gtgccgatga taaaaaactc 660
acgcgcctga gcattatcaa agatctgctc aaccggctgg actatgcaga taaagatcat 720
gaacttattc gcccaaatcc ggatgttgtc ttcccatatg cagaggcgaa cttcgcgaat 780
gggatgattg ccgcc 795

Claims (4)

1.一种生物酶法合成核苷酸或其衍生物的方法，其特征在于，以核苷或其衍生物，聚磷酸盐，ADP或ATP为原料，在核糖激酶和多聚磷酸激酶的催化作用下发生反应，制得核苷酸或其衍生物，所述反应在温度为30-60℃，pH为4.0-5.5的条件下进行；
所述核糖激酶的基因序列为如下（1）—（2）任一所示：
（1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
（2）SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述多聚磷酸激酶的基因序列为如下（3）所示：
（3）SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种生物酶法合成核苷酸或其衍生物的方法，其特征在于，所述反应在MgCl2或MgSO4存在的条件下进行。
3.根据权利要求1所述的一种生物酶法合成核苷酸或其衍生物的方法，其特征在于，所述核苷或其衍生物的浓度为50-200 mM，所述聚磷酸盐的浓度为30-100 mM，所述ADP 或ATP的浓度为1-10 mM。
4.双酶催化体系在生物合成核苷酸或其衍生物中的应用，其特征在于，所述双酶催化体系包括核糖激酶和多聚磷酸激酶，所述核糖激酶的基因序列为如下（1）—（2）任一所示：
（1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
（2）SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述多聚磷酸激酶的基因序列为如下（3）所示：
（3）SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
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