CN112813044A - 一种用于制备nmn的烟酰胺磷酸核糖转移酶 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶，其特征在于，包括：酶，所述酶为氨基酸序列构成的蛋白质中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸并具有催化烟酰胺得到β‑烟酰胺单核苷酸活性的蛋白质衍生物；进一步的，还包括一种重组表达载体，重组表达载体含有用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因；进一步的，还包括一种遗传工程化的宿主细胞，宿主细胞包含重组表达载体；本发明得到的明制备β‑烟酰胺单核苷酸NMN的工艺简单，耗时短，并且制备NMN所用到的烟酰胺磷酸核糖转移酶活性比较高，可以在室温内用百分之六十以上的转化率将底物烟酰胺转化为NMN，而且反应条件比较简单、易达到，酶活性高了之后，NMN的生产效率就会相对变高。
Description
技术领域
本发明涉及生物科技技术领域，具体为一种用于制备NMN的烟酰胺磷酸 核糖转移酶。
背景技术
NMN是人体内固有的物质，也富含在一些水果和蔬菜中。在人体中NMN是 NAD+的前体，其功能是通过NAD+体现。NAD+又叫辅酶，全称烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸，存在每一个细胞中参与上千项反应，NMN对人体细胞有重要的生理功 能，能在细胞中天然合成，也可以来源于多种食物，包括西兰花、卷心菜、 黄瓜、毛豆、鳄梨等。在人体中NMN是合成NAD+的前体，其生理功能主要通 过提高NAD+水平来体现。NAD+又叫辅酶Ⅰ，全称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。NAD+ 在细胞中，不仅作为辅酶也作为多种信号反应的底物，参与几百项反应。华 盛顿大学医学院的科学家在2016年发表的一篇论文中指出，小鼠摄取溶解NMN 的饮用水后，10分钟内NMN在血液中的浓度逐渐上升，并且在30分钟内，NMN 随血液循环进入多个组织中，并在组织中合成NAD+，提升NAD+水平。
β-烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide mononuclotide，NMN)，是哺乳 动物体内烟酰；胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide， NAD+)合成途径的重要中间体；近年研究证明，NMN具有显著的抗衰老功能
传统的NMN的生产是采用化学合成，以烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷 进行磷酸化得到然而化学合成磷酸化特异性不高，导致产品中杂质过多，分 离纯化极其困难，总体收率很低；同时有机溶剂使用量大，环境污染严重,比 如，2002年，Tanimori等人用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在TMSOTf的催化 下发生缩合反应；又比如2004年Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进 行硅烷化，因而，目前NMN需要采用生物酶法来制备，其中烟酰胺磷酸核糖 转移酶是整个反应的限速酶，但是现有的烟酰胺磷酸核糖转移酶其活性太低， 使得NMN的生产效率不理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶，以 解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于制备NMN的烟酰 胺磷酸核糖转移酶，其特征在于，包括：酶，所述酶为氨基酸序列构成的蛋 白质中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸并具有催化烟酰胺得到β- 烟酰胺单核苷酸活性的蛋白质衍生物。
进一步的，还包括一种重组表达载体，重组表达载体含有用于制备NMN 的烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因。
进一步的，还包括一种遗传工程化的宿主细胞，宿主细胞包含重组表达 载体。
进一步的，宿主细胞为大肠杆菌菌BL21(DE3)、BLR(DE3)、BL21(DE3)pLysS 或M15、TB1。
进一步的，用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶的方法；
方法为异源重组表达，包括如下步骤：
构件表达载体；把表达载体转化为宿主细胞，获得遗传工程化的宿主细 胞；培养遗传工程化的宿主细胞，添加乳糖或异丙基硫代半乳糖IPTG诱导重 组烟酰胺磷酸核糖转移酶的表达。
进一步的，还包括一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法：包括如下步骤
在异源重组表达中加入底物烟酰胺；采用大肠杆菌培养基培养菌液，利 用摇瓶法培养或发酵罐培养；同时每小时检测菌液OD600值，计算大肠杆菌 密度；在OD600＝3.0以下培养，所述的大肠杆菌培养基为LB或PYA，培养 温度为35℃-38℃。
进一步的，还包括一种酶的摇瓶发酵制备酶冻干粉方法：菌株在加有终 浓度为30μg/ml硫酸卡那霉素的5ml LB液体培养基中于37℃、200rpm振荡 培养过夜后，按1％(V/V)比例接种于含有终浓度为30μg/ml硫酸卡那霉素 的500ml LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养。待OD600在0.8-1.0 之间时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷， IPTG)，并在30℃诱导过夜，菌体在4℃、8000rpm条件下离心收集，然后悬 浮于50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，超声破碎(200W，3s/5s，20min)，4℃、 12000rpm离心20min，取上清进行冷冻干燥，即得粗酶粉。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明得到的明制备β-烟酰胺单核苷酸NMN的工艺简单，耗时短，并且 制备NMN所用到的烟酰胺磷酸核糖转移酶活性比较高，可以在室温内用百分 之六十以上的转化率将底物烟酰胺转化为NMN，而且反应条件比较简单、易达 到，酶活性高了之后，NMN的生产效率就会相对变高，使用起来更方便。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所 描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶，其特征在于，包括：酶， 所述酶为氨基酸序列构成的蛋白质中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨 基酸并具有催化烟酰胺得到β-烟酰胺单核苷酸活性的蛋白质衍生物。
进一步的，还包括一种重组表达载体，重组表达载体含有用于制备NMN 的烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因。
进一步的，还包括一种遗传工程化的宿主细胞，宿主细胞包含重组表达 载体。
进一步的，宿主细胞为大肠杆菌菌BL21(DE3)、BLR(DE3)、BL21(DE3)pLysS 或M15、TB1。
进一步的，用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶的方法；
方法为异源重组表达，包括如下步骤：
构件表达载体；把表达载体转化为宿主细胞，获得遗传工程化的宿主细 胞；培养遗传工程化的宿主细胞，添加乳糖或异丙基硫代半乳糖IPTG诱导重 组烟酰胺磷酸核糖转移酶的表达。
进一步的，还包括一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法：包括如下步骤
在异源重组表达中加入底物烟酰胺；采用大肠杆菌培养基培养菌液，利 用摇瓶法培养或发酵罐培养；同时每小时检测菌液OD600值，计算大肠杆菌 密度；在OD600＝3.0以下培养，所述的大肠杆菌培养基为LB或PYA，培养 温度为35℃-38℃。
进一步的，还包括一种酶的摇瓶发酵制备酶冻干粉方法：菌株在加有终 浓度为30μg/ml硫酸卡那霉素的5ml LB液体培养基中于37℃、200rpm振荡 培养过夜后，按1％(V/V)比例接种于含有终浓度为30μg/ml硫酸卡那霉素 的500ml LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养。待OD600在0.8-1.0 之间时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷， IPTG)，并在30℃诱导过夜，菌体在4℃、8000rpm条件下离心收集，然后悬 浮于50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，超声破碎(200W，3s/5s，20min)，4℃、 12000rpm离心20min，取上清进行冷冻干燥，即得粗酶粉。
本发明还提供了Nampt酶及其突变体作为生物催化剂在转化底物烟酰胺 生成烟酰胺单核苷酸(NMN)中的应用。反应体系为：Nampt酶突变体，D-核 糖激酶，5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)合成酶，磷酸钠缓冲液，腺嘌呤核苷 三磷酸(ATP)或二磷酸腺苷(ADP)中的一种，烟酰胺，D-核糖，腺嘌呤核 苷三磷酸(ATP)再生底物六偏磷酸钠，氯化镁。具体的为酶的用量在1-10g/l， 缓冲液浓度在50-200mM，缓冲液pH值在6.0-8.0之间，ATP浓度为1-5mM，底物浓度在1％-5％，氯化镁浓度为10-50mM，ATP再生底物浓度根据底物浓度 进行调整。反应后产物经HPLC验证，反应转化率>60％。D-核糖激酶和PRPP 合成酶可从市场上购买。
SEQ ID No.1核苷酸序列
ATGCTGTGGGTGATGACCACCCATAGCGTGAGCTATCTGGATAACCCGATTCTGGATACCGA TAGCTATAAAGCGAGCCATTGGCTGCAGTATCCGCCGAACACCGATGCGACCTTTTTTTATGTGGA AAGCCGCGGCGGCACCTATGATCGCACCCTGTTTTTTGGCCTGCAGGCGGTGCTGAAAGCGCGCCT GGAACGCCCGGTGACCCATGCGGATGTGGATGAAGCGCGCGATTTTTTTGCGGCGCATGGCGAACC GTTTAACGATGAAGGCTGGCGCTATATTGTGGATACCCATGGCGGCCGCCTGCCGGTGCGCGTGCG CGCGGTGCCGGAAGGCAGCGTGGTGCCGACCCATCAGGCGCTGGTGACCATTGAAAGCACCGATCC GCGCACCTATTGGCTGCCGAGCTATCTGGAAACCCGCCTGCTGCGCCTGTGGTATCCGGTGACCGT GGCGACCACCAGCTGGCATGCGCGCCAGACCATTGCGCATTATCTGGATACCACCAGCGATGATCC GGCGGCGCAGATTCCGTTTAAACTGCATGATTTTGGCGCGCGCGGCGTGAGCAGCGCGGAAAGCGC GGGCCTGGGCGGCATGGCGCATCTGGTGAACTTTCTGGGCACCGATACCGTGAGCGGCGTGCTGGC GGCGCGCGCGTATTATGGCGAACCGATGGCGGGCTTTAGCATTCCGGCGGCGGAACATAGCACCAT TACCAGCTGGGGCCGCGATCATGAAGTGGATGCGTATCGCAACATGCTGCGCCATTTTGCGAAACC GGGCAGCCTGGTGGCGGTGGTGAGCGATAGCTATGATATTTATCATGCGATTAAAGAACATTGGGG CAAAACCCTGCGCGATGAAGTGATTGCGAGCGGCGCGACCGTGGTGGTGCGCCCGGATAGCGGCGA TCCGGTGGAAGTGGTGCATCGCTGCGTGAGCCTGCTGGATGAAGCGTTTGGCAGCACCGTGAACGG CAAAGGCTATCGCGTGCTGAACCATGTGCGCGTGATTCAGGGCGATGGCGTGAACCCGGATAGCAT TCGCGCGATTCTGGAACGCATTACCACCGCGGGCTATAGCGCGGATAACCTGGCGTTTGGCATGGG CGGCGCGCTGCTGCAGAAACTGACCCGCGATACCCAGAAATTTGCGCTGAAATGCAGCGCGGCGCG CGTGGATGGCGCGTGGCGCGATGTGTGGAAAGATCCGGTGACCGATCAGGGCAAACTGAGCAAACG CGGCCGCATGACCCTGCTGCATCATCGCGAAAGCGGCACCTATCGCACCGTGCCGCTGCCGGGCGA TGCGATTGCGATGCCGCCGGAAGCGATTGAACCGGGCTGGGAAGAAGCGATGGTGACCGTGTGGGA AAACGGCGAACCGGTGCGCGAATGGAGCTTTGCGGATGTGCGCGAACGCGCGGCGGCGGGCGGCTA A
SEQ ID No.2氨基酸序列
MLWVMTTHSVSYLDNPILDTDSYKASHWLQYPPNTDATFFYVESRGGTYDRTLFFGLQAVLK ARLERPVTHADVDEARDFFAAHGEPFNDEGWRYIVDTHGGRLPVRVRAVPEGSVVPTHQALVTIES TDPRTYWLPSYLETRLLRLWYPVTVATTSWHARQTIAHYLDTTSDDPAAQIPFKLHDFGARGVSSA ESAGLGGMAHLVNFLGTDTVSGVLAARAYYGEPMAGFSIPAAEHSTITSWGRDHEVDAYRNMLRHF AKPGSLVAVVSDSYDIYHAIKEHWGKTLRDEVIASGATVVVRPDSGDPVEVVHRCVSLLDEAFGST VNGKGYRVLNHVRVIQGDGVNPDSIRAILERITTAGYSADNLAFGMGGALLQKLTRDTQKFALKCS AARVDGAWRDVWKDPVTDQGKLSKRGRMTLLHHRESGTYRTVPLPGDAIAMPPEAIEPGWEEAMVT VWENGEPVREWSFADVRERAAAGG
烟酰胺磷酸核糖转移酶序列1
烟酰胺磷酸核糖转移酶序列2
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来 将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示 这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、 “包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系 列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明 确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有 的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而 言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行 多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限 定。
Claims (7)
1.一种用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶，其特征在于，包括：酶，所述酶为氨基酸序列构成的蛋白质中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸并具有催化烟酰胺得到β-烟酰胺单核苷酸活性的蛋白质衍生物。
2.根据权利要求1所述的一种用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶，其特征在于，还包括一种重组表达载体，重组表达载体含有用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因。
3.根据权利要求1所述的一种用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶，其特征在于，还包括一种遗传工程化的宿主细胞，宿主细胞包含重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的一种用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌菌BL21(DE3)、BLR(DE3)、BL21(DE3)pLysS或M15、TB1。
5.根据权利要求1所述的一种用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶的方法；
方法为异源重组表达，包括如下步骤：
构件表达载体；把表达载体转化为宿主细胞，获得遗传工程化的宿主细胞；培养遗传工程化的宿主细胞，添加乳糖或异丙基硫代半乳糖IPTG诱导重组烟酰胺磷酸核糖转移酶的表达。
6.根据权利要求5所述的一种用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶，其特征在于，还包括一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法：包括如下步骤
在异源重组表达中加入底物烟酰胺；采用大肠杆菌培养基培养菌液，利用摇瓶法培养或发酵罐培养；同时每小时检测菌液OD600值，计算大肠杆菌密度；在OD600＝3.0以下培养，所述的大肠杆菌培养基为LB或PYA，培养温度为35℃-38℃。
7.根据权利要求1所述的一种用于制备NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶，其特征在于，还包括一种酶的摇瓶发酵制备酶冻干粉方法：菌株在加有终浓度为30μg/ml硫酸卡那霉素的5ml LB液体培养基中于37℃、200rpm振荡培养过夜后，按1％(V/V)比例接种于含有终浓度为30μg/ml硫酸卡那霉素的500ml LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养。待OD600在0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG)，并在30℃诱导过夜，菌体在4℃、8000rpm条件下离心收集，然后悬浮于50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，超声破碎(200W，3s/5s，20min)，4℃、12000rpm离心20min，取上清进行冷冻干燥，即得粗酶粉。
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