CN110373397B - 一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种烟酰胺核糖转移酶突变体及其应用，该突变体的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO.2相比，在氨基酸序列SEQ ID NO：2中第R189位、第S232位、第R302位进行单突变、两两联合突变、三个联合突变中的一种突变；该新型烟酰胺核糖转移酶突变体酶用于β‑烟酰胺单核苷酸的合成制备。本发明构建的烟酰胺核糖激转移酶突变体酶具有酶成本低，转化时间短、工艺操作简单等特点，具有大规模工业应用的广泛前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的烟酰胺磷酸核糖转移酶及其突变体，具体涉及用于生物酶法合成β-烟酰胺单核苷酸的工业酶及其突变体，属于生物酶工程技术领域。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide mononuclotide，NMN)，是哺乳动物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)合成途径的重要中间体。近年研究证明，NMN具有显著的抗衰老功能，因而以NMN为活性成分的功能性保健食品有着很大的开发潜力和市场前景。目前NMN在欧、美、日等发达国家已批准作为保健食品原料，并以NMN为主要成份开发出多种保健品，如美国HERBALmax、基因港GeneHarbor NMN9000、日本MIRAI LAB NMN3000胶囊、澳大利亚synext等。
传统的NMN的生产是采用化学合成，以烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到。然而化学合成磷酸化特异性不高，导致产品中杂质过多，分离纯化极其困难，总体收率很低；同时有机溶剂使用量大，环境污染严重，因而，目前NMN主要采用生物酶法来制备。
NMN的生物酶法制备是以D-核糖和烟酰胺为起始原料，在核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶等的作用下，经过三步催化反应得到NMN。其中烟酰胺磷酸核糖转移酶是整个反应的限速酶，其酶活高低直接决定了NMN的生产率和生产成本。目前所报道出来的烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活普遍较低，无法满足工业化生产。
发明内容
发明目的：为了解决上述问题，本发明的第一个目的在于提供一种新的烟酰胺核糖转移酶及其突变体。
本发明的第二个目的在于提供烟酰胺核糖转移酶突变体酶的应用。
本发明的第三个目的在于提供烟酰胺核糖激酶突变体酶催化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法。技术方案：本发明公开了一种来源于藤黄色杆菌Luteibacter sp.的烟酰胺磷酸核糖转移酶Nampt及其突变体基因，并提供该酶体外异源表达体系的构建方法和酶突变体的构建方法，以及该酶及其突变体作为生物催化剂用于制备烟酰胺单核苷酸的方法。
Nampt的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该基因编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
Nampt的基因序列通过常州基宇生物技术有限公司全基因合成所得，在编码区两端分别添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点。目的基因片段通过限制性内切酶NdeI和HindIII酶切后，与经过同样双酶切的pET29a(+)载体(Novagen公司)进行连接、转化和筛选，筛选得到的阳性质粒Nampt-pET29a(+)转入BL21(DE3)宿主菌中，从而构建Nampt的体外异源表达体系。
Nampt的突变体的构建，是通过定向进化的技术手段得到的。具体的为，利用易错PCR、DNA重排、半理性设计及三维结构模拟等定向进行技术来获得突变体。更为具体的是，本发明通过三维结构模拟技术来进行酶的定向进化。采用同源建模的方法来模拟Nampt的三维结构，利用能量最低原理和分子对接技术预测出可能的与催化相关的一个或多个位点，然后对这些位点进行定点(NNK)饱和定点突变，从中筛选出活性有显著提高的突变体。
本发明通过三维结构模拟技术预测出的可能与催化和底物结合相关的位点为R189、S232、R302。
然后以Nampt-pET29a(+)重组质粒为模板，对R189、S232、R302这三个位点进行定点饱和突变；其中第R189位突变正向引物：CTGCATGATTTTGGCGCGNNKGGCGTGAGCAGCGCGGAA，反向引物：TTCCGCGCTGCTCACGCCMNNCGCGCCAAAATCATGCAG；第S232位点突变正向引物：CGAACCGATGGCGGGCTTTNNKATTCCGGCGGCGGAACAT，反向引物：TGTTCCGCCGCCGGAATMNNAAAGCCCGCCATCGGTTCG；第R302位点突变正向引物：GGCGCGACCGTGGTGGTGNNKCCGGATAGCGGCGATCCG，反向引物：CGGATCGCCGCTATCCGGMNNCACCACCACGGTCGCGCC。
突变体培养：将上述突变得到的质粒转化BL21(DE3)宿主菌后，涂布于含30μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，随后从平板上挑取单克隆置于96孔板中进行培养；过夜培养的菌液再转接于含有新鲜LB培养基的96孔板中，37℃、220rpm振荡培养4h后加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，30℃培养过夜；4℃、4000rpm离心10min收集菌体，用50mM pH7.0磷酸钠缓冲液悬浮，作为全细胞进行筛选反应。
突变体的筛选：底物浓度10g/l,ATP 5mM,50mM pH7.0磷酸钠缓冲液，50mM六偏磷酸钠，50mM氯化镁，2g/l PPK2，按10％比例加入上述制备的全细胞悬浮液，放于25℃、220rpm振荡反应；分别于2h和20h取样进行HPLC检测；测序结果显示，突变体酶活得到显著提高的克隆中含有的突变位点如下，第R189位点的精氨酸(R)突变为组氨酸(H)，第S232位点的丝氨酸(S)突变为苏氨酸(T)，第R302位点的精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)。
分别对这三个位点进行NNK饱和突变，利用高压液相色谱法(HPLC)来进行突变体的筛选。更为具体的为，当位点189的精氨酸(R)突变为组氨酸(H)时，突变体的催化活性相对于野生型酶来说得到了提高。当位点232的丝氨酸(S)突变为苏氨酸(T)时，突变体酶活得到了提高。当位点302的精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)时，突变体酶活相对野生型酶来说得到了提高。当将上述3个位点的突变两两联合突变或三个联合突变时，突变体的催化活性相对于单个突变体来说得到了更大的提高。
根据现有公共知识，任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体，转化至合适宿主细胞，经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。因此，Nampt酶及其突变体表达的载体可以为pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k等，表达宿主可以为大肠杆菌，毕赤酵母，链霉菌，枯草芽孢杆菌等。
本发明还提供了Nampt酶及其突变体作为生物催化剂在转化底物烟酰胺生成烟酰胺单核苷酸(NMN)中的应用。反应体系为：Nampt酶突变体，D-核糖激酶，5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)合成酶，磷酸钠缓冲液，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)或二磷酸腺苷(ADP)中的一种，烟酰胺，D-核糖，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)再生底物六偏磷酸钠，氯化镁。具体的为酶的用量在1-10g/l，缓冲液浓度在50-200mM，缓冲液pH值在6.0-8.0之间，ATP浓度为1-5mM，底物浓度在1％-5％，氯化镁浓度为10-50mM，ATP再生底物浓度根据底物浓度进行调整。反应后产物经HPLC验证，反应转化率>60％。D-核糖激酶和PRPP合成酶可从市场上购买。
可进行上述生物催化反应的酶包括纯酶、相应的重组菌休止细胞、粗酶液或者粗酶粉等其他存在形态。
有益的效果：本发明所涉及的酶突变体和辅酶再生体系，可在室温、24h之内将5％的底物烟酰胺转化为NMN，转化率>60％。反应条件温和，几乎无副产物，能量循环体系稳定，具有广阔的工业化应用前景。
具体实施方式
以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。
实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。
实施例1原核表达体系的构建
Nampt基因片段由常州基宇生物技术有限公司合成，并重组到PUC57载体上。经限制性内切酶NdeI和HindIII(购自New England Biolabs公司，NEB)在37℃双酶切4h后，1％琼脂糖凝胶电泳分离并进行切胶回收(胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司)。随后与经过同样双酶切的表达载体pET29a(+)(Novagen公司)，在T4 DNA连接酶(购自Takara公司)作用下于16℃连接过夜。连接液转化Top10感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司)，并进行菌落PCR筛选和测序验证，从而得到阳性重组质粒NrK-pET29a(+)。
将阳性重组质粒Nampt-pET29a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)(购自天根生化科技(北京)有限公司)，得到原核表达菌株Nampt-pET29a(+)/BL21(DE3)，作为后续定向进化和发酵的原代菌株。
用于ATP再生的多聚磷酸激酶(PPK2，来源于E.coli)由常州基宇生物技术有限公司合成，后续重组表达质粒的构建同Nampt-pET29a(+)质粒的构建，转入BL21(DE3)中后得到表达菌株。
实施例2酶的摇瓶发酵制备酶冻干粉
上述构建的表达菌株Nampt-pET29a(+)/BL21(DE3)、PPK2-pET29a(+)/BL21(DE3)、在加有终浓度为30μg/ml硫酸卡那霉素的5ml LB液体培养基【10g/l胰蛋白胨(OXIOD)，5g/l酵母粉(OXIOD)，10g/l氯化钠(国药试剂)】中于37℃、200rpm振荡培养过夜后，按1％(V/V)比例接种于含有终浓度为30μg/ml硫酸卡那霉素的500ml LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养。待OD600在0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG)，并在30℃诱导过夜。菌体在4℃、8000rpm条件下离心收集，然后悬浮于50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，超声破碎(200W，3s/5s，20min)，4℃、12000rpm离心20min，取上清进行冷冻干燥，即得粗酶粉。
实施例3突变体的构建和筛选
突变体的构建：采用同源建模的方法来进行Nampt的三维结构模拟，并利用分子对接和能量最低原理预测出可能与催化和底物结合有关的位点，初步确定为R189、S232、R302三个位点。随后以Nampt-pET29a(+)重组质粒为模板，对这三个位点分别进行了NNK饱和突变(具体突变操作参照stratagene公司的
Site-Directed Mutagenesis Kit操作说明)。其中189位突变正向引物：CTGCATGATTTTGGCGCGNNKGGCGTGAGCAGCGCGGAA，反向引物：TTCCGCGCTGCTCACGCCMNNCGCGCCAAAATCATGCAG；232位点突变正向引物：CGAACCGATGGCGGGCTTTNNKATTCCGGCGGCGGAACAT，反向引物：TGTTCCGCCGCCGGAATMNNAAAGCCCGCCATCGGTTCG；302位点突变正向引物：GGCGCGACCGTGGTGGTGNNKCCGGATAGCGGCGATCCG，反向引物：CGGATCGCCGCTATCCGGMNNCACCACCACGGTCGCGCC。
突变体培养：将上述突变得到的质粒转化BL21(DE3)宿主菌后，涂布于含30μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，随后从平板上挑取单克隆置于96孔板中进行培养。过夜培养的菌液再转接于含有新鲜LB培养基的96孔板中，37℃、220rpm振荡培养4h后加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，30℃培养过夜。4℃、4000rpm离心10min收集菌体，用50mM pH7.0磷酸钠缓冲液悬浮，作为全细胞进行筛选反应。
突变体的筛选：烟酰胺10g/l,D-核糖20g/l,腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)5mM,50mMpH7.0磷酸钠缓冲液，50mM六偏磷酸钠，50mM氯化镁，2g/l PPK2，2g/l D-核糖激酶和PRPP合成酶，按10％比例加入上述制备的全细胞悬浮液，放于25℃、220rpm振荡反应。分别于2h和20h取样进行HPLC检测。
将底物转化率在2h和20h均有显著提高的克隆进行扩大培养后测序验证突变情况。测序结果显示，突变体酶活得到显著提高的克隆中含有的突变位点如下：位点189的精氨酸(R)突变为组氨酸(H)，位点232的丝氨酸(S)突变为苏氨酸(T)，当位点302的精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)。
随后对这几个位点进行单突变、两两联合突变和三个联合突变，活性检测发现某些位点的联合突变后催化活性相较于单点突变来说又得到了显著提高，提高数值见下表。
| 突变体 | 相对酶活 |
| Wild type | 100 |
| R189H | 194 |
| S232T | 230 |
| R302K | 330 |
| R189H/S232T | 460 |
| R189H/R302K | 550 |
| S232T/R302K | 780 |
| R189H/S232T/R302K | 950 |
实施例4突变体的生物催化
将1g烟酰胺和2g D-核糖溶解于100ml 50mM pH6.0磷酸钠缓冲液中，待底物完全溶解后加入50mM六偏磷酸钠、5mM ATP、50mM氯化镁、0.2gNampt突变体(S232T/R302K)冻干粉、0.2g PPK2冻干粉、0.2g D-核糖激酶干粉、0.2g PRPP合成酶干粉。反应液置于25℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应20h后进行HP LC检测，底物烟酰胺转化率>60％。经离子交换树脂分离、冻干等后处理纯化后得到β-烟酰胺单核苷酸纯度大于98％。其中D-核糖激酶干粉和PRPP合成酶干粉从市场上购买得到。
实施例5突变体的生物催化
将5g烟酰胺和10g D-核糖溶解于100ml 50mM pH6.0磷酸钠缓冲液中，待底物完全溶解后加入50mM六偏磷酸钠、5mM ATP、50mM氯化镁、0.2gNampt突变体(R189H/S232T/R302K)冻干粉、0.2g PPK2冻干粉、0.2g D-核糖激酶干粉、0.2g PRPP合成酶干粉。反应液置于25℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应20h后进行HP LC检测，烟酰胺转化率>70％。经离子交换树脂分离、冻干等后处理纯化后得到β-烟酰胺单核苷酸纯度大于98％。其中D-核糖激酶干粉和PRPP合成酶干粉从市场上购买得到。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏诚信药业有限公司
<120> 一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用
<130> 2021-0719
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1449
<212> DNA
<213> 烟酰胺磷酸核糖转移酶(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
atgctgtggg tgatgaccac ccatagcgtg agctatctgg ataacccgat tctggatacc 60
gatagctata aagcgagcca ttggctgcag tatccgccga acaccgatgc gacctttttt 120
tatgtggaaa gccgcggcgg cacctatgat cgcaccctgt tttttggcct gcaggcggtg 180
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<210> 2
<211> 482
<212> PRT
<213> 烟酰胺磷酸核糖转移酶(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 2
Met Leu Trp Val Met Thr Thr His Ser Val Ser Tyr Leu Asp Asn Pro
1 5 10 15
Ile Leu Asp Thr Asp Ser Tyr Lys Ala Ser His Trp Leu Gln Tyr Pro
20 25 30
Pro Asn Thr Asp Ala Thr Phe Phe Tyr Val Glu Ser Arg Gly Gly Thr
35 40 45
Tyr Asp Arg Thr Leu Phe Phe Gly Leu Gln Ala Val Leu Lys Ala Arg
50 55 60
Leu Glu Arg Pro Val Thr His Ala Asp Val Asp Glu Ala Arg Asp Phe
65 70 75 80
Phe Ala Ala His Gly Glu Pro Phe Asn Asp Glu Gly Trp Arg Tyr Ile
85 90 95
Val Asp Thr His Gly Gly Arg Leu Pro Val Arg Val Arg Ala Val Pro
100 105 110
Glu Gly Ser Val Val Pro Thr His Gln Ala Leu Val Thr Ile Glu Ser
115 120 125
Thr Asp Pro Arg Thr Tyr Trp Leu Pro Ser Tyr Leu Glu Thr Arg Leu
130 135 140
Leu Arg Leu Trp Tyr Pro Val Thr Val Ala Thr Thr Ser Trp His Ala
145 150 155 160
Arg Gln Thr Ile Ala His Tyr Leu Asp Thr Thr Ser Asp Asp Pro Ala
165 170 175
Ala Gln Ile Pro Phe Lys Leu His Asp Phe Gly Ala Arg Gly Val Ser
180 185 190
Ser Ala Glu Ser Ala Gly Leu Gly Gly Met Ala His Leu Val Asn Phe
195 200 205
Leu Gly Thr Asp Thr Val Ser Gly Val Leu Ala Ala Arg Ala Tyr Tyr
210 215 220
Gly Glu Pro Met Ala Gly Phe Ser Ile Pro Ala Ala Glu His Ser Thr
225 230 235 240
Ile Thr Ser Trp Gly Arg Asp His Glu Val Asp Ala Tyr Arg Asn Met
245 250 255
Leu Arg His Phe Ala Lys Pro Gly Ser Leu Val Ala Val Val Ser Asp
260 265 270
Ser Tyr Asp Ile Tyr His Ala Ile Lys Glu His Trp Gly Lys Thr Leu
275 280 285
Arg Asp Glu Val Ile Ala Ser Gly Ala Thr Val Val Val Arg Pro Asp
290 295 300
Ser Gly Asp Pro Val Glu Val Val His Arg Cys Val Ser Leu Leu Asp
305 310 315 320
Glu Ala Phe Gly Ser Thr Val Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Val Leu Asn
325 330 335
His Val Arg Val Ile Gln Gly Asp Gly Val Asn Pro Asp Ser Ile Arg
340 345 350
Ala Ile Leu Glu Arg Ile Thr Thr Ala Gly Tyr Ser Ala Asp Asn Leu
355 360 365
Ala Phe Gly Met Gly Gly Ala Leu Leu Gln Lys Leu Thr Arg Asp Thr
370 375 380
Gln Lys Phe Ala Leu Lys Cys Ser Ala Ala Arg Val Asp Gly Ala Trp
385 390 395 400
Arg Asp Val Trp Lys Asp Pro Val Thr Asp Gln Gly Lys Leu Ser Lys
405 410 415
Arg Gly Arg Met Thr Leu Leu His His Arg Glu Ser Gly Thr Tyr Arg
420 425 430
Thr Val Pro Leu Pro Gly Asp Ala Ile Ala Met Pro Pro Glu Ala Ile
435 440 445
Glu Pro Gly Trp Glu Glu Ala Met Val Thr Val Trp Glu Asn Gly Glu
450 455 460
Pro Val Arg Glu Trp Ser Phe Ala Asp Val Arg Glu Arg Ala Ala Ala
465 470 475 480
Gly Gly
Claims (5)
1.一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，其特征在于：将氨基酸序列SEQ ID NO：2中第189位的精氨酸突变为组氨酸。
2.根据权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，其特征在于：所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体表达宿主为大肠杆菌、毕赤酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌中的一种。
3.一种制备如权利要求1所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的方法，包括如下步骤：(1)以Nampt-pET29a(+)重组质粒为模板，对R189进行定点饱和突变；其中第189位突变正向引物：CTGCATGATTTTGGCGCGNNKGGCGTGAGCAGCGCGGAA，第189位突变反向引物：TTCCGCGCTGCTCACGCCMNNCGCGCCAAAATCATGCAG；(2)突变体培养：将上述突变得到的质粒转化BL21(DE3)宿主菌后，涂布于含30μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，随后从平板上挑取单克隆置于96孔板中进行培养；过夜培养的菌液再转接于含有新鲜LB培养基的96孔板中，37℃、220rpm振荡培养4h后加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，30℃培养过夜；4℃、4000rpm离心10min收集菌体，用50mM pH7.0磷酸钠缓冲液悬浮，作为全细胞进行筛选反应；(3)突变体的筛选：底物浓度10g/l,ATP 5mM,50mM pH7.0磷酸钠缓冲液，50mM六偏磷酸钠，50mM氯化镁，2g/lPPK2，按10％比例加入上述制备的全细胞悬浮液，放于25℃、220rpm振荡反应；分别于2h和20h取样进行HPLC检测；测序结果显示，突变体酶活得到显著提高的克隆中含有的突变位点如下，第189位点的精氨酸突变为组氨酸。
4.一种如权利要求1所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体酶的应用，用于催化合成β-烟酰胺单核苷酸。
5.一种如权利要求4所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体酶催化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，包括如下步骤：1)反应体系为：烟酰胺核糖激酶突变体酶，D-核糖激酶，5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶，磷酸钠缓冲液，腺嘌呤核苷三磷酸或二磷酸腺苷中的一种，烟酰胺，D-核糖，腺嘌呤核苷三磷酸再生底物六偏磷酸钠，氯化镁；2)具体的为烟酰胺核糖激酶突变体酶的用量在1-10g/l，缓冲液浓度在50-200mM，缓冲液pH值在6.0-8.0之间，腺嘌呤核苷三磷酸浓度为1-5mM，底物浓度在1％-5％，氯化镁浓度为10-50mM，腺嘌呤核苷三磷酸再生底物浓度根据底物浓度进行调整；3)反应后产物经HPLC验证，反应转化率>60％。
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