CN110358750B

CN110358750B - 新型蔗糖磷酸化酶突变体及其在合成甘油葡糖苷中的应用

Info

Publication number: CN110358750B
Application number: CN201910722610.5A
Authority: CN
Inventors: 祝俊; 李斌; 徐飞; 余允东; 刘双喜; 李二军; 张超; 邢飞; 马晶晶; 张晨晨; 许昇
Original assignee: Jiangsu Chengxin Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Jiangsu Chengxin Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-08-06
Filing date: 2019-08-06
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2039-08-06
Also published as: CN110358750A

Abstract

本发明提供一种新型蔗糖磷酸化酶突变体及其在合成甘油葡糖苷中的应用，该突变体的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO.2相比，在氨基酸序列SEQ ID NO：2中第L195位、第L235位、第H294位进行单突变、两两联合突变、三个联合突变中的一种突变；该新型蔗糖磷酸化酶突变体酶用于催化合成甘油葡糖苷。本发明构建的新型蔗糖磷酸化酶突变体酶具有成本低，转化时间短、工艺操作简单等特点，具有大规模工业应用的广泛前景。

Description

新型蔗糖磷酸化酶突变体及其在合成甘油葡糖苷中的应用

技术领域

本发明涉及一种新的蔗糖磷酸化酶突变体，具体涉及用于酶法合成2-甘油葡糖苷的工业酶及其突变体，属于生物酶工程技术领域。

背景技术

甘油葡萄糖苷(又称为2-甘油葡糖苷)，普遍存在于自然界中，特别是在耐盐的蓝藻细菌中，比如蓝绿藻和南非密罗木(也叫不死草、复活草)。它是密罗木能在极端环境中生存和重新激活复生的最主要的活性物质，能牢牢锁住体内珍贵的最后一滴水，因而甘油葡萄糖苷具有极强的“滋润、锁水、保湿”的生理效果，可作为化妆品的功能性原料，具有较大的市场需求。

目前关于甘油葡萄糖苷的制备主要采用生物酶法来合成。植物提取受限于场地、来源等，不能大规模生产；化学合成存在着杂质较多的问题(合成中会引入1-甘油葡萄苷，而2-甘油葡糖苷的锁水保湿功能最好)，因而目前主要采用专一性高的生物酶法来合成。以蔗糖和甘油为原料，在蔗糖磷酸化酶的作用下生产2-甘油葡萄糖苷。然而，目前国内报道的蔗糖磷酸化酶及其突变体的酶活不高，甘油葡萄糖苷的生产量在55g/l(CN109423485A)，远达不到工业生产的要求。

蛋白质三维结构模拟和蛋白定向进化技术，是近年来发展起来的对原始基因序列进行人工改造、以满足工业化应用需求的高科技技术，其中蛋白定向进化技术更是获得了2018年诺贝尔化学奖。本发明采用蛋白质三维结构模拟和蛋白定向进化技术，对来源于罗伊乳杆菌Lactobacillus reuteri的蔗糖磷酸化酶进行了人工改造，改造后的突变体单位酶活相对于原始蛋白来说提高了约9倍，甘油葡萄糖苷的生产量超过100g/l，具有良好的工业化应用前景。

发明内容

发明目的：为了解决上述问题，本发明的第一个目的在于提供一种新的蔗糖磷酸化酶及其突变体。

本发明的第二个目的在于提供新的蔗糖磷酸化酶催化合成2-甘油葡糖苷的方法及应用。

技术方案：本发明公开了一种来源于罗伊乳杆菌Lactobacillus reuteri的蔗糖磷酸化酶及其突变体基因，并提供该酶体外异源表达体系的构建方法和酶突变体的构建方法，以及该酶及其突变体作为生物催化剂用于制备甘油葡萄糖苷的方法。

蔗糖磷酸化酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该基因编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

蔗糖磷酸化酶的基因序列通过常州基宇生物技术有限公司全基因合成所得，在编码区两端分别添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点。目的基因片段通过限制性内切酶NdeI和HindIII酶切后，与经过同样双酶切的pET29a(+)载体(Novagen公司)进行连接、转化和筛选，筛选得到的阳性质粒转入BL21(DE3)宿主菌中，从而构建蔗糖磷酸化酶的体外异源表达体系。

蔗糖磷酸化酶的突变体的构建，是通过定向进化的技术手段得到的。具体的为，利用易错PCR、DNA重排、半理性设计及三维结构模拟等定向进行技术来获得突变体。更为具体的是，本发明通过三维结构模拟技术来进行酶的定向进化。采用同源建模的方法来模拟蔗糖磷酸化酶的三维结构，利用能量最低原理和分子对接技术预测出可能的与催化相关的一个或多个位点，然后对这些位点进行定点(NNK)饱和定点突变，从中筛选出活性有显著提高的突变体。

本发明通过三维结构模拟技术预测出的对酶活可能有影响的位点为L195、L235、H294。分别对这三个位点进行NNK饱和突变，利用高压液相色谱法(HPLC)来进行突变体的筛选。

随后以LrSP-pET29a(+)重组质粒为模板，对这三个位点分别进行了NNK饱和突变(具体突变操作参照stratagene公司的

Site-Directed Mutagenesis Kit操作说明)。其中第L195位突变正向引物：CATGGCGCGGATATGATTCGCNNKGATGCGTTTGCGTATGCGATT，反向引物：AATCGCATACGCAAACGCATCMNNGCGAATCATATCCGCGCCATG；第L235位点突变正向引物：GCGCCGTATAAAGCGATTATTNNKCCGGAAATTCATGAACATTAT，反向引物：ATAATGTTCATGAATTTCCGGMNNAATAATCGCTTTATACGGCGC；第H294位点突变正向引物：CAGTTTACCACCCTGGATACCNNKGATGGCATTGGCGTGGTGGAT，反向引物：ATCCACCACGCCAATGCCATCMNNGGTATCCAGGGTGGTAAACTG。

突变体培养：将上述突变得到的质粒转化BL21(DE3)宿主菌后，涂布于含30μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，随后从平板上挑取单克隆置于96孔板中进行培养。过夜培养的菌液再转接于含有新鲜LB培养基的96孔板中，37℃、220rpm振荡培养4h后加入终浓度为0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，30℃培养过夜。4℃、4000rpm离心10min收集菌体，用50mM pH7.0磷酸钠缓冲液悬浮，作为全细胞进行筛选反应。

突变体的筛选：蔗糖浓度200g/l,甘油200g/l,50mM pH7.0磷酸钠缓冲液，按10％比例加入上述制备的全细胞悬浮液，放于30℃、220rpm振荡反应。分别于2h和24h取样进行HPLC检测。

将底物转化率在2h和24h均有显著提高的克隆进行扩大培养后测序验证突变情况。测序结果显示，蔗糖磷酸化酶突变体酶活得到显著提高的克隆中含有的突变位点如下：位点195的亮氨酸(L)突变为精氨酸(R)，位点235的亮氨酸(L)突变为天冬氨酸(D)，位点294的组氨酸(H)突变为精氨酸(R)。

更为具体的为，当位点195的亮氨酸(L)突变为精氨酸(R)时，突变体的催化活性相对于野生型酶来说得到了提高。当位点235的亮氨酸(L)突变为天冬氨酸(D)时，突变体酶活得到了提高。当位点294的组氨酸(H)突变为精氨酸(R)时，突变体酶活相对野生型酶来说得到了提高。当将上述3个位点的突变、两两联合突变或三个联合突变时，突变体的催化活性相对于单个突变体来说得到了更大的提高。

根据现有公共知识，任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体，转化至合适宿主细胞，经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。因此，蔗糖磷酸化酶及其突变体表达的载体可以为pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k等，表达宿主可以为大肠杆菌，毕赤酵母，链霉菌，枯草芽孢杆菌等。

本发明还提供了蔗糖磷酸化酶及其突变体作为生物催化剂在转化底物甘油和蔗糖生成甘油葡萄糖苷中的应用。反应式为：

反应体系为：蔗糖磷酸化酶突变体酶，三乙醇胺-盐酸缓冲液，底物为甘油和蔗糖。具体的为酶的用量在1-10g/l，缓冲液浓度在50-200mM，缓冲液pH值在6.0-8.0之间，底物浓度在40-200g/l；反应后产物经HPLC验证，产物含量>100g/l。

可进行上述生物催化反应的酶包括纯酶、相应的重组菌休止细胞、粗酶液或者粗酶粉等其他存在形态。

有益的效果：本发明所涉及的酶突变体，可在室温、24h之内将40-200g/l的底物完全转化为不低于100g/l的产物。反应条件温和，几乎无副产物，具有广阔的工业化应用前景。

具体实施方式

以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。

实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

实施例1原核表达体系的构建

蔗糖磷酸化酶基因片段(LrSP)由常州基宇生物技术有限公司合成，并重组到PUC57载体上。经限制性内切酶NdeI和HindIII(购自New England Biolabs公司，NEB)在37℃双酶切4h后，1％琼脂糖凝胶电泳分离并进行切胶回收(胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司)。随后与经过同样双酶切的表达载体pET29a(+)(Novagen公司)，在T4 DNA连接酶(购自Takara公司)作用下于16℃连接过夜。连接液转化Top10感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司)，并进行菌落PCR筛选和测序验证，从而得到阳性重组质粒LrSP-pET29a(+)。

将阳性重组质粒LrSP-pET29a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)(购自天根生化科技(北京)有限公司)，得到原核表达菌株LrSP-pET29a(+)/BL21(DE3)，作为后续定向进化和发酵的原代菌株。

实施例2酶的摇瓶发酵制备

上述构建的表达菌株LrSP-pET29a(+)/BL21(DE3)在加有终浓度为30μg/ml硫酸卡那霉素的5ml LB液体培养基【10g/l胰蛋白胨(OXIOD)，5g/l酵母粉(OXIOD)，10g/l氯化钠(国药试剂)】中于37℃、200rpm振荡培养过夜后，按1％(V/V)比例接种于含有终浓度为30μg/ml硫酸卡那霉素的500ml LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养。待OD600在0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG)，并在30℃诱导过夜。菌体在4℃、8000rpm条件下离心收集，然后悬浮于50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，超声破碎(200W，3s/5s，20min)，4℃、12000rpm离心20min，取上清进行冷冻干燥，即得粗酶粉。

实施例3突变体的构建和筛选

突变体的构建：采用同源建模的方法来进行蔗糖磷酸化酶LrSP的三维结构模拟，并利用分子对接和能量最低原理预测出可能的与催化反应相关的位点，初步确定为L195、L235、H294三个位点。随后以LrSP-pET29a(+)重组质粒为模板，对这三个位点分别进行了NNK饱和突变(具体突变操作参照stratagene公司的

Site-DirectedMutagenesisKit操作说明)。其中195位突变正向引物：CATGGCGCGGATATGATTCGCNNKGATGCGTTTGCGTATGCGATT，反向引物：AATCGCATACGCAAACGCATCMNNGCGAATCATATCCGCGCCATG；235位点突变正向引物：GCGCCGTATAAAGCGATTATTNNKCCGGAAATTCATGAACATTAT，反向引物：ATAATGTTCATGAATTTCCGGMNNAATAATCGCTTTATACGGCGC；294位点突变正向引物：CAGTTTACCACCCTGGATACCNNKGATGGCATTGGCGTGGTGGAT，反向引物：ATCCACCACGCCAATGCCATCMNNGGTATCCAGGGTGGTAAACTG。

突变体培养：将上述突变得到的质粒转化BL21(DE3)宿主菌后，涂布于含30μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，随后从平板上挑取单克隆置于96孔板中进行培养。过夜培养的菌液再转接于含有新鲜LB培养基的96孔板中，37℃、220rpm振荡培养4h后加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，30℃培养过夜。4℃、4000rpm离心10min收集菌体，用50mM pH7.0磷酸钠缓冲液悬浮，作为全细胞进行筛选反应。

突变体的筛选：蔗糖浓度200g/l，甘油200g/l，50mM pH7.0磷酸钠缓冲液，按10％比例加入上述制备的全细胞悬浮液，放于30℃、220rpm振荡反应。分别于2h和24h取样进行HPLC检测。

将底物转化率在2h和24h均有显著提高的克隆进行扩大培养后测序验证突变情况。测序结果显示，突变体酶活得到显著提高的克隆中含有的突变位点如下：位点195的亮氨酸(L)突变为精氨酸(R)，位点235的亮氨酸(L)突变为天冬氨酸(D)，位点294的组氨酸(H)突变为精氨酸(R)。

随后对这几个位点进行单点突变、两两联合突变和三个联合突变，活性检测发现某些位点的联合突变后催化活性相较于单点突变来说又得到了显著提高，具体酶活数值见下表：

突变体	单位酶活	提高倍数
			Wild type LrSP	2.1U/mg	-
L195R	3.2U/mg	1.5
			L235D	4.3U/mg	2.0
H294R	2.5U/mg	1.2
			L195R/L235D	7.4U/mg	3.5
L195R/H294R	12U/mg	5.7
			L235D/H294R	12.4U/mg	5.9
L195R/L235D/H294R	19.2U/mg	9.1

1U定义为单位时间内(1min)生产1μmol产物所需的酶量。

实施例4突变体的生物催化

将200g蔗糖和200g甘油溶解于1L 50mM pH6.0磷酸钠缓冲液中，待底物完全溶解后加入2g蔗糖磷酸化酶突变体酶L195R/H294R冻干粉。反应液置于30℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC检测，2-甘油葡萄糖的生产量为100g/l，未检测到1-甘油葡萄糖苷。

实施例5突变体的生物催化

将200g蔗糖和200g甘油溶解于1L 50mM pH6.0磷酸钠缓冲液中，待底物完全溶解后加入2g酶突变体L195R/L235D/H294R冻干粉。反应液置于30℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC检测，2-甘油葡萄糖的生产量为140g/l，未检测到1-甘油葡萄糖苷。

实施例6HPLC分析方法

HPLC系统：Agilent 1260；

色谱柱：Waters Amide柱(34.6×150mm,3.5μm)；

流动相:乙腈:1‰氨水＝4:1(V/V)；

进样量10μL；

柱温30℃；

流速1mL/min；

RID检测器检测。

在上述色谱条件下，2-甘油葡萄糖苷标准品的出峰位置为8.141min，1-甘油葡萄糖苷标准品的出峰位置为9.108min。

序列表

<110> 江苏诚信药业有限公司

<120> 新型蔗糖磷酸化酶突变体及其在合成甘油葡糖苷中的应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgccgatta aaaacgaagc gatgctgatt acctatagcg atagcatggg caaaaacatt 60

aaagaaaccc atgaagtgct gaaaaactat attggcgatg cgattggcgg cgtgcatctg 120

ctgccgtttt ttccgagcac cggcgatcgc ggctttgcgc cgtatcgcta tgatgtggtg 180

gatagcgcgt ttggcaactg ggatgatgtg gaagcgctgg gcgaagatta ttatctgatg 240

tttgatttta tgattaacca tattagcaaa aaaagcgaaa tgtatcagga ttttaaaaaa 300

aaacatgatg atagcaaata taacgatttt tttattcgct gggaaaaatt ttgggaaaaa 360

gcgggcaaaa accgcccgac ccaggaagat gtggatctga tttataaacg caaagataaa 420

gcgccgaaac aggaaattac ctttgatgat ggcaccaccg aaaacctgtg gaacaccttt 480

ggcgaagaac agattgatat taacgtgaaa agcaaagtgg cgaacgaatt ttttaaagaa 540

accctgattg atatggtgaa acatggcgcg gatatgattc gcctggatgc gtttgcgtat 600

gcgattaaaa aagtgggcac caacgatttt tttgtggaac cggaaatttg ggatctgctg 660

aacgaagtgc aggatattct ggcgccgtat aaagcgatta ttctgccgga aattcatgaa 720

cattatacca ttccgcagaa aattagccag catgattttt ttatttatga ttttaccctg 780

ccgatgacca ccctgtatac cctgtatagc ggcaaaacca accgcctggc gaaatggctg 840

aaaatgagcc cgatgaaaca gtttaccacc ctggataccc atgatggcat tggcgtggtg 900

gatgcgaaag atattctgac cgatgatgaa attgaatatg cgagcaacga actgtataaa 960

gtgggcgcga acgtgaaacg caaatatagc agcgcggaat ataacaacct ggatatttat 1020

cagattaaca gcacctatta tagcgcgctg ggcgatgatg ataaagcgta tctgctgagc 1080

cgcgtgtttc aggtgtttgc gccgggcatt ccgatggtgt attatgtggg cctgctggcg 1140

ggcagcaacg atctggaact gctggaaaaa accaaagaag gccgcaacat taaccgccat 1200

tattatacca aagaagaagt ggcgcaggaa gtgcagcgcc cggtggtgaa aaacctgctg 1260

gatctgctgg cgtggcgcaa caaatttgcg gcgtttgatc tggatggcag cattgaagtg 1320

gaaaccccga ccgaaaccac cattaaagtg acccgcaaag ataaagatgg caaaaacgtg 1380

gcggtgctgg atgcggatgc ggcgaacaaa acctttacca ttaccgcgaa cggcgaaaaa 1440

gtgatggaac agaaataa 1458

<210> 2

<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Pro Ile Lys Asn Glu Ala Met Leu Ile Thr Tyr Ser Asp Ser Met

1 5 10 15

Gly Lys Asn Ile Lys Glu Thr His Glu Val Leu Lys Asn Tyr Ile Gly

20 25 30

Asp Ala Ile Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly

35 40 45

Asp Arg Gly Phe Ala Pro Tyr Arg Tyr Asp Val Val Asp Ser Ala Phe

50 55 60

Gly Asn Trp Asp Asp Val Glu Ala Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Leu Met

65 70 75 80

Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Lys Lys Ser Glu Met Tyr Gln

85 90 95

Asp Phe Lys Lys Lys His Asp Asp Ser Lys Tyr Asn Asp Phe Phe Ile

100 105 110

Arg Trp Glu Lys Phe Trp Glu Lys Ala Gly Lys Asn Arg Pro Thr Gln

115 120 125

Glu Asp Val Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Lys Ala Pro Lys Gln

130 135 140

Glu Ile Thr Phe Asp Asp Gly Thr Thr Glu Asn Leu Trp Asn Thr Phe

145 150 155 160

Gly Glu Glu Gln Ile Asp Ile Asn Val Lys Ser Lys Val Ala Asn Glu

165 170 175

Phe Phe Lys Glu Thr Leu Ile Asp Met Val Lys His Gly Ala Asp Met

180 185 190

Ile Arg Leu Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Ile Lys Lys Val Gly Thr Asn

195 200 205

Asp Phe Phe Val Glu Pro Glu Ile Trp Asp Leu Leu Asn Glu Val Gln

210 215 220

Asp Ile Leu Ala Pro Tyr Lys Ala Ile Ile Leu Pro Glu Ile His Glu

225 230 235 240

His Tyr Thr Ile Pro Gln Lys Ile Ser Gln His Asp Phe Phe Ile Tyr

245 250 255

Asp Phe Thr Leu Pro Met Thr Thr Leu Tyr Thr Leu Tyr Ser Gly Lys

260 265 270

Thr Asn Arg Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe

275 280 285

Thr Thr Leu Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Ala Lys Asp

290 295 300

Ile Leu Thr Asp Asp Glu Ile Glu Tyr Ala Ser Asn Glu Leu Tyr Lys

305 310 315 320

Val Gly Ala Asn Val Lys Arg Lys Tyr Ser Ser Ala Glu Tyr Asn Asn

325 330 335

Leu Asp Ile Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asp

340 345 350

Asp Asp Lys Ala Tyr Leu Leu Ser Arg Val Phe Gln Val Phe Ala Pro

355 360 365

Gly Ile Pro Met Val Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Ser Asn Asp

370 375 380

Leu Glu Leu Leu Glu Lys Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His

385 390 395 400

Tyr Tyr Thr Lys Glu Glu Val Ala Gln Glu Val Gln Arg Pro Val Val

405 410 415

Lys Asn Leu Leu Asp Leu Leu Ala Trp Arg Asn Lys Phe Ala Ala Phe

420 425 430

Asp Leu Asp Gly Ser Ile Glu Val Glu Thr Pro Thr Glu Thr Thr Ile

435 440 445

Lys Val Thr Arg Lys Asp Lys Asp Gly Lys Asn Val Ala Val Leu Asp

450 455 460

Ala Asp Ala Ala Asn Lys Thr Phe Thr Ile Thr Ala Asn Gly Glu Lys

465 470 475 480

Val Met Glu Gln Lys

485

Claims

1.一种蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于：该突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.2的基础上发生L235D突变。

2.根据权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于：所述蔗糖磷酸化酶突变体的突变位点进一步发生L195R和/或H294R突变。

3.根据权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于：所述蔗糖磷酸化酶突变体的表达宿主为大肠杆菌，毕赤酵母，链霉菌，枯草芽孢杆菌中的一种。

4.一种制备如权利要求1所述蔗糖磷酸化酶突变体酶的方法，包括如下步骤：1）以LrSP-pET29a（+）重组质粒为模板，其中LrSP的基因序列如SEQ ID No.1所示，对第235位点进行定点饱和突变，其中第235位点突变正向引物：GCGCCGTATAAAGCGATTATTNNKCCGGAAATTCATGAACATTAT，第235位点突变反向引物：ATAATGTTCATGAATTTCCGGMNNAATAATCGCTTTATACGGCGC；2）突变体培养：将上述突变得到的质粒转化BL21（DE3）宿主菌后，涂布于含30μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，随后从平板上挑取单克隆置于96孔板中进行培养；过夜培养的菌液再转接于含有新鲜LB培养基的96孔板中，37℃、220rpm振荡培养4h后加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，30℃培养过夜；4℃、4000rpm离心10min收集菌体，用50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液悬浮，作为全细胞进行筛选反应；3）突变体的筛选：蔗糖浓度200g/L,甘油 200g/L, 50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液，按10%比例加入上述制备的全细胞悬浮液，放于30℃、220rpm振荡反应；分别于2h和24h取样进行HPLC检测；将底物转化率在2h和24h均有显著提高的克隆进行扩大培养后测序验证突变情况；测序结果显示，突变位点如下：位点235的亮氨酸突变为天冬氨酸。

5.一种如权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体的应用，用于催化合成甘油葡萄糖苷。

6.一种如权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突变体酶催化合成甘油葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：1）反应体系为：蔗糖磷酸化酶突变体酶，三乙醇胺-盐酸缓冲液，底物为甘油和蔗糖；2）蔗糖磷酸化酶突变体酶的用量在1-10g/L，缓冲液浓度在50-200mM，缓冲液pH值在6.0-8.0之间，底物浓度在40-200g/L；反应后产物经HPLC验证，产物含量>100g/L。