CN110373398B

CN110373398B - 一种烟酰胺核糖激酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN110373398B
Application number: CN201910723177.7A
Authority: CN
Inventors: 祝俊; 李斌; 徐飞; 余允东; 刘双喜; 李二军; 张超; 邢飞; 马晶晶; 张晨晨; 许昇
Original assignee: Jiangsu Chengxin Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Jiangsu Chengxin Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-08-06
Filing date: 2019-08-06
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2039-08-06
Also published as: CN110373398A

Abstract

本发明提供一种烟酰胺核糖激酶突变体及其应用，该突变体的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO.2相比，在氨基酸序列SEQ ID NO：2中第D45位、第D58位、第R161位、第Y164位进行单突变、两两联合突变、三个联合突变或四个联合突变中的一种突变；该新型烟酰胺核糖激酶突变体工业酶用于β‑烟酰胺单核苷酸的合成制备。本发明构建的烟酰胺核糖激酶突变体酶具有酶成本低，转化时间短、工艺操作简单等特点，具有大规模工业应用的广泛前景。

Description

一种烟酰胺核糖激酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种新的烟酰胺核糖激酶及其突变体，具体涉及用于生物酶法合成β-烟酰胺单核苷酸的工业酶及其突变体，属于生物酶工程技术领域。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide mononuclotide，NMN)，是哺乳动物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)合成途径的重要中间体。近年研究证明，NMN具有显著的抗衰老功能，因而以NMN为活性成分的功能性保健食品有着很大的开发潜力和市场前景。目前NMN在欧、美、日等发达国家已批准作为保健食品原料，并以NMN为主要成份开发出多种保健品，如美国HERBALmax、基因港GeneHarbor NMN9000、日本MIRAI LAB NMN3000胶囊、澳大利亚synext等。

传统的NMN的生产是采用化学合成，以烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到。然而化学合成磷酸化特异性不高，导致产品中杂质过多，分离纯化极其困难，总体收率很低；同时有机溶剂使用量大，环境污染严重，因而，目前NMN主要采用生物酶法来制备。

NMN的生物酶法制备主要有两条途径：第一条是以D-核糖和烟酰胺为起始原料，在核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶等的作用下，经过三步催化反应得到NMN；该条路线底物转化率不高(以烟酰胺计算，最高不超过50％),且中间产物较多，后续分离纯化较困难，因而总体收率偏低，导致生产成本高。第二条路线是以烟酰胺核糖(NR)为起始原料，在烟酰胺核糖激酶(NR kinase，NrK)和ATP的作用下，一步反应得到NMN，收率高，产品纯度高，未来将成为NMN的主流生产方法。

然而用于NMN生产的酶——烟酰胺核糖激酶却研究开发较少，限制了其在NMN工业化生产中的应用。

发明内容

发明目的：为了解决以上问题，本发明的第一个目的在于提供一种新的烟酰胺核糖激酶及其突变体。

本发明的第二个目的在于提供一种烟酰胺核糖激酶突变体工业酶催化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法。

本发明的第三个目的在于提供烟酰胺核糖激酶突变体工业酶应用。

技术方案：本发明公开了一种来源于马克斯克鲁维酵母Kluyveromycesmarxianus的烟酰胺核糖激酶NrK及其突变体基因，并提供该酶体外异源表达体系的构建方法和酶突变体的构建方法，以及该酶及其突变体作为生物催化剂用于制备烟酰胺单核苷酸的方法。

NrK的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQID No.2所示。

NrK的基因序列通过常州基宇生物技术有限公司全基因合成所得，在编码区两端分别添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点。目的基因片段通过限制性内切酶NdeI和HindIII酶切后，与经过同样双酶切的pET29a(+)载体(Novagen公司)进行连接、转化和筛选，筛选得到的阳性质粒NrK-pET29a(+)转入BL21(DE3)宿主菌中，从而构建NrK的体外异源表达体系。

NrK的突变体的构建，是通过定向进化的技术手段得到的。具体的为，利用易错PCR、DNA重排、半理性设计及三维结构模拟等定向进行技术来获得突变体。更为具体的是，本发明通过三维结构模拟技术来进行酶的定向进化。采用同源建模的方法来模拟NrK的三维结构，利用能量最低原理和分子对接技术预测出可能的与催化相关的一个或多个位点，然后对这些位点进行饱和定点突变(NNK)，从中筛选出活性有显著提高的突变体。

本发明通过三维结构模拟技术预测出的可能与催化和底物结合相关的位点为D45、D58、R161、Y164。分别对这四个位点进行NNK饱和突变。

其中，第D45位突变正向引物：

GATGATTTTTATAAACCGNNKAGCGAAATTCCGATTAACG，反向引物：CGTTAATCGGAATTTCGCTMNNCGGTTTATAAAAATCATC；第D58位点突变正向引物：CGAAAAATATGGCGTGGCGNNKTGGGATTGCCCGGAAGCG，反向引物：CGCTTCCGGGCAATCCCAMNNCGCCACGCCATATTTTTCG；第R161位点突变正向引物：

GCCGCCGCCGCCATGCGNNKGCGGGCTATAAAACCCTGGAAG，反向引物：CTTCCAGGGTTTTATAGCCCGCMNNCGCATGGCGGCGGCGGC；第Y164位点突变正向引物：

CGCCATGCGCGCGCGGGCNNKAAAACCCTGGAATCGTTTTG，反向引物：CAAAACGATTCCAGGGTTTTMNNGCCCGCGCGCGCATGGCG；

然后利用高压液相色谱法(HPLC)来进行突变体的筛选。更为具体的为，当位点45的天冬氨酸(D)突变为谷氨酸(E)时，突变体的催化活性相对于野生型酶来说得到了提高。当位点58的天冬氨酸(D)突变为谷氨酰胺(Q)时，突变体酶活得到了提高。当位点161的精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)时，突变体酶活相对野生型酶来说得到了提高。当位点164的酪氨酸(Y)突变为色氨酸(W)时，突变体酶活得到了显著提高。当将上述4个位点进行单突变、两两联合突变或三个联合突变或四个联合突变时，突变体的催化活性相对于单个突变体来说得到了更大的提高。

根据现有公共知识，任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体，转化至合适宿主细胞，经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。因此，NrK酶及其突变体表达的载体可以为pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k等，表达宿主可以为大肠杆菌株，毕赤酵母，链霉菌株，枯草芽孢杆菌株等。

本发明还提供了NrK酶及其突变体作为生物催化剂在转化底物烟酰胺核糖(NR)生成烟酰胺单核苷酸(NMN)中的应用。反应体系为：NrK酶突变体，磷酸钠缓冲液，ATP或ADP，底物(NR)，ATP再生底物六偏磷酸钠、氯化镁。具体的为酶的用量在1-10g/l，缓冲液浓度在50-200mM，缓冲液pH值在6.0-8.0之间，ATP浓度为1-5mM，底物浓度在1％-5％，氯化镁浓度为10-50mM，ATP再生底物浓度根据底物浓度进行调整。反应后产物经HPLC验证，反应转化率>80％。

可进行上述生物催化反应的酶包括纯酶、相应的重组菌休止细胞、粗酶液或者粗酶粉等其他存在形态。

有益的效果：本发明所涉及的酶突变体和辅酶再生体系，可在室温、24h之内将5％的底物转化为NMN，转化率>80％。反应条件温和，几乎无副产物，能量循环体系稳定，具有广阔的工业化应用前景。

具体实施方式

以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。

实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

本发明涉及的烟酰胺核苷激酶突变体是在重组微生物细胞中生产，该微生物细胞为大肠杆菌株、枯草芽孢杆菌株、酿酒酵母或毕赤酵母中的一种。

实施例1原核表达体系的构建：

NrK基因片段由常州基宇生物技术有限公司合成，并重组到PUC57载体上。经限制性内切酶NdeI和HindIII(购自New England Biolabs公司，NEB)在37℃双酶切4h后，1％琼脂糖凝胶电泳分离并进行切胶回收(胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司)。随后与经过同样双酶切的表达载体pET29a(+)(Novagen公司)，在T4 DNA连接酶(购自Takara公司)作用下于16℃连接过夜。连接液转化Top10感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司)，并进行菌落PCR筛选和测序验证，从而得到阳性重组质粒NrK-pET29a(+)。

将阳性重组质粒NrK-pET29a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)(购自天根生化科技(北京)有限公司)，得到原核表达菌株NrK-pET29a(+)/BL21(DE3)，作为后续定向进化和发酵的原代菌株。

用于ATP再生的多聚磷酸激酶(PPK2，来源于E.coli)由常州基宇生物技术有限公司合成，后续重组表达质粒的构建同NrK-pET29a(+)质粒的构建，转入BL21(DE3)中后得到表达菌株。

实施例2酶的摇瓶发酵制备酶冻干粉：

上述构建的表达菌株NrK-pET29a(+)/BL21(DE3)、PPK2-pET29a(+)/BL21(DE3)、在加有终浓度为30μg/ml硫酸卡那霉素的5ml LB液体培养基【10g/l胰蛋白胨(OXIOD)，5g/l酵母粉(OXIOD)，10g/l氯化钠(国药试剂)】中于37℃、200rpm振荡培养过夜后，按1％(V/V)比例接种于含有终浓度为30μg/ml硫酸卡那霉素的500ml LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养。待OD600在0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG)，并在30℃诱导过夜。菌体在4℃、8000rpm条件下离心收集，然后悬浮于50mMpH7.0磷酸钠缓冲液中，超声破碎(200W，3s/5s，20min)，4℃、12000rpm离心20min，取上清进行冷冻干燥，即得粗酶粉。

实施例3突变体的构建和筛选：

突变体的构建：采用同源建模的方法来进行NrK的三维结构模拟，并利用分子对接和能量最低原理预测出可能与催化和底物结合有关的位点，初步确定为D45、D58、R161、Y164四个位点。随后以NrK-pET29a(+)重组质粒为模板，对这四个位点分别进行了NNK饱和突变(具体突变操作参照stratagene公司的

Site-Directed Mutagenesis Kit操作说明)。其中45位突变正向引物：GATGATTTTTATAAACCGNNKAGCGAAATTCCGATTAACG，反向引物：CGTTAATCGGAATTTCGCTMNNCGGTTTATAAAAATCATC；58位点突变正向引物：CGAAAAATATGGCGTGGCGNNKTGGGATTGCCCGGAAGCG，反向引物：CGCTTCCGGGCAATCCCAMNNCGCCACGCCATATTTTTCG；161位点突变正向引物：GCCGCCGCCGCCATGCGNNKGCGGGCTATAAAACCCTGGAAG，反向引物：CTTCCAGGGTTTTATAGCCCGCMNNCGCATGGCGGCGGCGGC；164位点突变正向引物：CGCCATGCGCGCGCGGGCNNKAAAACCCTGGAATCGTTTTG，反向引物：CAAAACGATTCCAGGGTTTTMNNGCCCGCGCGCGCATGGCG

突变体培养：将上述突变得到的质粒转化BL21(DE3)宿主菌后，涂布于含30μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，随后从平板上挑取单克隆置于96孔板中进行培养。过夜培养的菌液再转接于含有新鲜LB培养基的96孔板中，37℃、220rpm振荡培养4h后加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，30℃培养过夜。4℃、4000rpm离心10min收集菌体，用50mM pH7.0磷酸钠缓冲液悬浮，作为全细胞进行筛选反应。

突变体的筛选：底物浓度10g/l,ATP 5mM,50mM pH7.0磷酸钠缓冲液，50mM六偏磷酸钠，50mM氯化镁，2g/l PPK2，按10％比例加入上述制备的全细胞悬浮液，放于25℃、220rpm振荡反应。分别于2h和20h取样进行HPLC检测。

将底物转化率在2h和20h均有显著提高的克隆进行扩大培养后测序验证突变情况。测序结果显示，突变体酶活得到显著提高的克隆中含有的突变位点如下：位点45的天冬氨酸(D)突变为谷氨酸(E)，位点58的天冬氨酸(D)突变为谷氨酰胺(Q)，位点161的精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)，位点164的酪氨酸(Y)突变为色氨酸(W)。

随后对这几个位点进行两两联合突变、三个联合突变和四个联合突变，活性检测发现某些位点的联合突变后催化活性相较于单点突变来说又得到了显著提高，具体酶活数值见下表：

1U定义为单位时间内(1min)生产1nmol产物所需的酶量。

实施例4突变体的生物催化；

将1g底物NR溶解于100ml 50mM pH6.0磷酸钠缓冲液中，待底物完全溶解后加入50mM六偏磷酸钠、5mM ATP、50mM氯化镁、0.2gNrK突变体(D45E/D58Q/R161K)冻干粉、0.2gPPK2冻干粉。反应液置于25℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应20h后进行HP LC检测，底物转化率>90％。经离子交换树脂分离、冻干等后处理纯化后得到β-烟酰胺单核苷酸纯度大于98％。

实施例5突变体的生物催化；

将5g底物NR溶解于100ml 50mM pH6.0磷酸钠缓冲液中，待底物完全溶解后加入50mM六偏磷酸钠、5mM ATP、50mM氯化镁、0.2gNrK突变体(D45E/D58Q/R161K/Y164W)冻干粉、0.2g PPK2冻干粉。反应液置于25℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应20h后进行HP LC检测，底物转化率>80％。经离子交换树脂分离、冻干等后处理纯化后得到β-烟酰胺单核苷酸纯度大于98％。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏诚信药业有限公司

<120> 一种烟酰胺核糖激酶突变体及其应用

<130> 2021-0719

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 717

<212> DNA

<213> 烟酰胺核糖激酶(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

atgaccacca ccaaagtgaa actgattgcg attagcggct gcagcagcag cggcaaaacc 60

accctggcga aatttctggc gaacgcgatt ccgggctgca ttctgattca tgaagatgat 120

ttttataaac cggatagcga aattccgatt aacgaaaaat atggcgtggc ggattgggat 180

tgcccggaag cgctggatct ggatgcgttt aaacgcgaac tggatctgat taaaaccacc 240

ggcagcatta aaaccaaact gattcataac gaaaacgtgg atgatattgg caaatttaac 300

attaaacagg aagattggga tgcgctgcgc gcgaaactga gcagcgtgat tgaaagcgat 360

ctgaaagtgg tgctggtgga tggctttatg atttttaacg atgaagaact gatgaaaaaa 420

tttgatattc gcatttttgt gcgcgcgccg tatgaagtgc tgagccgccg ccgccatgcg 480

cgcgcgggct ataaaaccct ggaatcgttt tgggtggatc cgccgtatta ttttgatgaa 540

tttgtgtatc gcgcgtatcg cgaagaacat aaacatctgt ttgtgaacga agatgtggaa 600

ggcagcctgc gcagcgatgc gggcctgttt gaactgatta acgatgatga aaccgaaatt 660

accaaagcgc tgaacaccat tgcggattat attgtgagcc atctggatgc gaactaa 717

<210> 2

<211> 238

<212> PRT

<213> 烟酰胺核糖激酶(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Met Thr Thr Thr Lys Val Lys Leu Ile Ala Ile Ser Gly Cys Ser Ser

1 5 10 15

Ser Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys Phe Leu Ala Asn Ala Ile Pro Gly

20 25 30

Cys Ile Leu Ile His Glu Asp Asp Phe Tyr Lys Pro Asp Ser Glu Ile

35 40 45

Pro Ile Asn Glu Lys Tyr Gly Val Ala Asp Trp Asp Cys Pro Glu Ala

50 55 60

Leu Asp Leu Asp Ala Phe Lys Arg Glu Leu Asp Leu Ile Lys Thr Thr

65 70 75 80

Gly Ser Ile Lys Thr Lys Leu Ile His Asn Glu Asn Val Asp Asp Ile

85 90 95

Gly Lys Phe Asn Ile Lys Gln Glu Asp Trp Asp Ala Leu Arg Ala Lys

100 105 110

Leu Ser Ser Val Ile Glu Ser Asp Leu Lys Val Val Leu Val Asp Gly

115 120 125

Phe Met Ile Phe Asn Asp Glu Glu Leu Met Lys Lys Phe Asp Ile Arg

130 135 140

Ile Phe Val Arg Ala Pro Tyr Glu Val Leu Ser Arg Arg Arg His Ala

145 150 155 160

Arg Ala Gly Tyr Lys Thr Leu Glu Ser Phe Trp Val Asp Pro Pro Tyr

165 170 175

Tyr Phe Asp Glu Phe Val Tyr Arg Ala Tyr Arg Glu Glu His Lys His

180 185 190

Leu Phe Val Asn Glu Asp Val Glu Gly Ser Leu Arg Ser Asp Ala Gly

195 200 205

Leu Phe Glu Leu Ile Asn Asp Asp Glu Thr Glu Ile Thr Lys Ala Leu

210 215 220

Asn Thr Ile Ala Asp Tyr Ile Val Ser His Leu Asp Ala Asn

225 230 235

Claims

1.一种烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于：该突变体的氨基酸序列与氨基酸序列SEQID NO.2相比，将氨基酸序列SEQ ID NO：2中第45位的天冬氨酸突变为谷氨酸。

2.根据权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于：所述烟酰胺核糖激酶突变体是在重组微生物细胞中生产，该重组微生物细胞为大肠杆菌株、枯草芽孢杆菌株、酿酒酵母或毕赤酵母中的一种。

3.一种制备如权利要求1所述烟酰胺核糖激酶突变体的方法，包括如下步骤：(1)以NrK-pET29a(+)重组质粒为模板，对D45进行了定点饱和突变，其中第45位突变正向引物：GATGATTTTTATAAACCGNNKAGCGAAATTCCGATTAACG，第45位突变反向引物：CGTTAATCGGAATTTCGCTMNNCGGTTTATAAAAATCATC；(2)突变体培养：将上述突变得到的质粒转化BL21(DE3)宿主菌后，涂布于含30μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，随后从平板上挑取单克隆置于96孔板中进行培养；过夜培养的菌液再转接于含有新鲜LB培养基的96孔板中，37℃、220rpm振荡培养4h后加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，30℃培养过夜；4℃、4000rpm离心10min收集菌体，用50mM pH7.0磷酸钠缓冲液悬浮，作为全细胞进行筛选反应；(3)突变体的筛选：底物浓度10g/l,ATP 5mM,50mM pH7.0磷酸钠缓冲液，50mM六偏磷酸钠，50mM氯化镁，2g/l PPK2，按10％比例加入上述制备的全细胞悬浮液，放于25℃、220rpm振荡反应；分别于2h和20h取样进行HPLC检测；测序结果显示，突变体酶活得到显著提高的克隆中含有的突变位点如下，第45位点的天冬氨酸突变为谷氨酸。

4.一种如权利要求1所述烟酰胺核糖激酶突变体工业酶的应用，用于催化合成β-烟酰胺单核苷酸。

5.一种如权利要求4所述的烟酰胺核糖激酶突变体工业酶催化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，包括如下步骤：1)将1g底物烟酰胺核糖溶解于100ml 50mM pH6.0磷酸钠缓冲液中；2)待步骤1)所述的底物完全溶解后，加入50mM六偏磷酸钠、5mM ATP、50mM氯化镁、0.2g烟酰胺核糖激酶突变体工业酶冻干粉、0.2g PPK2冻干粉；3)将步骤2)制得的反应液置于25℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应；反应20h后进行HPLC检测，底物转化率>90％；经离子交换树脂分离、冻干处理纯化后得到β-烟酰胺单核苷酸，目标物纯度大于98％。