WO2021253362A1 - 一种以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法 - Google Patents

一种以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法 Download PDF

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mononucleotide
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张贵平
徐浩杰
王秦
张章
张琦
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邦泰生物工程(深圳)有限公司
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    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of preparation of nicotinamide mononucleotide, in particular to a method for preparing nicotinamide mononucleotide using nicotinamide as a raw material by means of a combination of chemical synthesis and biological enzyme catalysis.
  • Nicotinamide mononucleotide is a biochemical substance inherent in biological cells. After being adenylated by nicotinamide nucleotide adenosyl transferase, it is transformed into biological cells that depend on survival.
  • the important substance nicotinamide adenine dinucleotide (abbreviated as NAD, also known as coenzyme I, exists in every cell and participates in thousands of reactions).
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • NMN is the direct precursor of NAD and is currently the most ideal way to supplement NAD. Its level in biological cells directly affects the concentration of NAD, plays an important role in biological cell energy production, and is not harmful to the human body.
  • nicotinamide mononucleotide has many pharmacological activities such as regulating immunity, regulating insulin secretion, and affecting the expression of mRNA. It has been developed for medical care such as delaying aging, improving symptoms of Parkinson’s and other senile diseases. , Other uses are also under study. With the increase in people's awareness of the medicinal and health effects of nicotinamide mononucleotide, and the wide application of nicotinamide mononucleotide as a reaction substrate in the chemical industry, the demand for nicotinamide mononucleotide in the market is increasing day by day.
  • Nicotinamide also known as nicotinamide, is an amide compound of niacin, which belongs to the precursor substance of NMN.
  • nicotinamide as a raw material is a commonly used method for preparing nicotinamide mononucleotide. This method generally adopts the chemical synthesis route shown in the following figure, that is, first convert nicotinamide into the intermediate nicotinamide ribose ( Nicotinamide riboside, referred to as NR), and then convert nicotinamide ribose into the final product nicotinamide mononucleotide.
  • NR nicotinamide riboside
  • the purpose of the present invention is to solve the technical problem that the refined nicotinamide ribose must be used to complete the conversion into nicotinamide mononucleotide, and at the same time, the more green and environmentally friendly biological enzyme catalytic means In combination with chemical synthesis, a simple and low-cost method for preparing nicotinamide mononucleotide using nicotinamide as a raw material is developed.
  • the inventor has carried out a large number of experiments for a long time, and finally developed a method for preparing nicotinamide mononucleotide using nicotinamide as a raw material.
  • the method includes the following steps:
  • the nicotinamide ribokinase is used to catalyze the reaction of the nicotinamide ribose solution obtained in step 5) at a temperature of 35-39°C, and the pH of the reaction process is controlled to be 7.5 ⁇ 8.0, Nicotinamide mononucleotide is obtained after the reaction is over.
  • the reaction in step 1) is carried out at a temperature of 25-35°C.
  • the solvent is preferably acetonitrile, because of its good solubility in the reaction, it helps to form a homogeneous system and facilitates the rapid progress of the reaction. , And the by-product ⁇ -isomer is very small ( ⁇ 0.1%).
  • the catalyst is preferably trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate because of its high reaction stereoselectivity in the reaction. Easy to handle, no metal residues.
  • step 1) of the method for preparing nicotinamide mononucleotide using nicotinamide as a raw material provided by the present invention trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate or tin tetrachloride, nicotinamide and tetraacetyl ribose
  • the molar ratio is 1.2 ⁇ 5:1.2 ⁇ 2:1.
  • the second reaction solution is concentrated to remove the solvent.
  • the reaction in step 3 is carried out at a temperature of -10 to -5°C .
  • step 3 of the method for preparing nicotinamide mononucleotide using nicotinamide as a raw material provided by the present invention the molar ratio of sodium methoxide to tetraacetylribose is 1 to 5:1.
  • the temperature of the reaction liquid is maintained at -10 ⁇ -5 in the process of step 4). °C.
  • the pore size of the microfiltration membrane used in the microfiltration process is 0.2-1 ⁇ m to remove microorganisms in the reaction solution.
  • the nanofiltration process uses hollow fiber membranes with a molecular weight cut-off of 150-250 to remove nicotinamide, residual solvents and most of the inorganic salt impurities in the reaction solution.
  • step 6 the amount of each substance added in the entire enzyme-catalyzed reaction system is: Mg ion 10-50mM, ATP 10- 30mM, buffer 20-100mM, nicotinamide ribose 9-27mM, nicotinamide ribokinase 0.2-1g/L.
  • the Mg ion is MgCl 2 .
  • the buffer is K 2 HPO 4 buffer.
  • the preparation method of nicotinamide mononucleotide uses nicotinamide and tetraacetylribose as starting materials, and nicotinamide ribose as the reaction intermediate.
  • the whole process avoids the prior art. It is necessary to refine the nicotinamide ribose by crystallization and other methods to participate in the technical requirements of the subsequent conversion into nicotinamide mononucleotide, so the purification steps for nicotinamide ribose are reduced, the process is more streamlined, and the operation is simpler. Lower cost and shorter time-consuming.
  • the light yellow liquid obtained above is dissolved in water, and then sent to the membrane concentration equipment for microfiltration and nanofiltration treatments in sequence.
  • the microfiltration membrane used in the microfiltration process has a pore size of 0.2 ⁇ m, and the nanofiltration process uses a hollow with a molecular weight cut-off of 150.
  • the fibrous membrane is used to obtain a nicotinamide ribose solution (the organic solvent is less than 0.5%), and the obtained solution is ready for use.
  • the light yellow liquid obtained above is dissolved in water, and then sent to the membrane concentration equipment for microfiltration and nanofiltration treatments in sequence.
  • the microfiltration membrane used in the microfiltration process has a pore size of 0.5 ⁇ m, and the nanofiltration process uses a hollow with a molecular weight cut-off of 200.
  • the fibrous membrane is used to obtain a nicotinamide ribose solution (the organic solvent is less than 0.5%), and the obtained solution is ready for use.
  • the light yellow liquid obtained above is dissolved in water, and then sent to the membrane concentration equipment for microfiltration and nanofiltration treatments in sequence.
  • the microfiltration membrane used in the microfiltration process has a pore size of 0.7 ⁇ m, and the nanofiltration process uses a hollow with a molecular weight cut-off of 200.
  • the fibrous membrane is used to obtain a nicotinamide ribose solution (the organic solvent is less than 0.5%), and the obtained solution is ready for use.
  • the light yellow liquid obtained above is dissolved in water, and then sent to the membrane concentration equipment for microfiltration and nanofiltration in sequence.
  • the microfiltration membrane used in the microfiltration process has a pore size of 1 ⁇ m, and the nanofiltration process uses hollow fibers with a molecular weight cut-off of 250. Film, obtain nicotinamide ribose solution (organic solvent soluble residue is less than 0.5%), and the obtained solution is ready for use.
  • the NR solution prepared in the embodiment of the present invention has a faster initial speed in the reaction and requires a lower amount of enzyme.
  • the NR solution prepared in the examples of the present invention has a faster initial speed in the reaction, and can avoid the occurrence of the factors shown in the commercially available NR solids-batch 2. A situation where certain impurities are present and the reaction is inhibited.

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Abstract

一种以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法，包括：在乙腈、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷或者液态二氧化硫溶剂中，用三氟甲磺酸三甲基硅酯或四氯化锡催化烟酰胺和四乙酰核糖进行反应，调节pH值为3～5，加入甲醇钠溶液，于-15～5℃进行反应，调节pH值为3～5，用膜浓缩设备进行微滤和纳滤处理，得烟酰胺核糖溶液；在Mg离子、ATP和缓冲液存在的环境中，用烟酰胺核糖激酶催化烟酰胺核糖溶液进行反应，即得烟酰胺单核苷酸。该方法减少了对烟酰胺核糖的精制步骤，工艺更精简、成本更低廉、耗时更短，并且相较于直接采用烟酰胺核糖精制固体的酶催化过程具有更快的反应速度、更低的酶用量等优点。

Description

一种以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法 技术领域
本发明涉及烟酰胺单核苷酸的制备技术领域，特别涉及一种通过化学合成以及生物酶催化相结合的手段以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，简称NMN)是生物细胞内固有的一种生化物质，它在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后即转化成生物细胞所赖以生存的重要物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(简称NAD，又称辅酶I，存在每一个细胞中参与上千项反应)。NMN是NAD的直接前体，是补充NAD目前最理想的方式，其在生物细胞内的水平直接影响到NAD的浓度，在生物细胞能量生成中扮演着重要角色，并且对人体无危害。
截至目前，人们已经发现烟酰胺单核苷酸具有诸如调节免疫能力、调控胰岛素分泌、影响mRNA的表达等诸多药理活性，目前已开发用于医疗保健如延缓衰老、改善帕金森等老年病症状、，其他用途亦在研究中。随着人们对烟酰胺单核苷酸药用及保健效果认知的增加，以及作为一种反应底物在化工方面的广泛应用，市场上对烟酰胺单核苷酸的需求量与日俱增。
烟酰胺(Nicotinamide)又称尼克酰胺，是烟酸的酰胺化合物，属于NMN的前体物质。以烟酰胺为原料是目前已知的比较常用的制备烟酰胺单核苷酸的方法，该方法一般采用如下图所示的化学合成路线，即，先将烟酰胺转化成中间产物烟酰胺核糖(Nicotinamide riboside，简称NR)，然后再将烟酰胺核糖转化成终产物烟酰胺单核苷酸。由于该方法在将烟酰胺核糖转化成烟酰胺单核苷酸的反应过程中需要严格控制反应体系中水的含量，所以必须将前一步骤合成得到的中间产物烟酰胺核糖进行精制除水后才能投料参与到下一步的反应，这就导致该方法存在工艺复杂、生产成本较高的缺点。
Figure PCTCN2020096908-appb-000001
除了化学合成方法之外，目前还存在一种以烟酰胺核糖为原料采用生物酶催化的手段制备烟酰胺单核苷酸的方法，该方法的整个反应体系是水相的，因此不要求控制水分。但是为了确保催化过程中所使用的生物酶保持稳定且能循环使用，往往还是需要使用烟酰胺核糖的精制品作为原料，这也就导致了该方法的生产成本较高。
发明内容
鉴于上述背景技术中提到的不足，本发明的目的在于解决必须使用精制后的烟酰胺核糖才能完成转化成烟酰胺单核苷酸的反应的技术问题，同时将更绿色环保的生物酶催化手段与化学合成相结合，开发一种工艺简单、成本低廉的以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法。
为实现上述目的，发明人进行了长期大量的实验摸索，最终开发了一种以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法，该方法包括如下步骤：
1)在乙腈、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷或者液态二氧化硫溶剂中，用三氟甲磺酸三甲基硅酯或四氯化锡催化烟酰胺和四乙酰核糖于20～40℃的温度下进行反应，得第一反应液；
2)向所述第一反应液中加入碳酸氢钠、碳酸钠或氢氧化钠，调节pH值为3～5，得第二反应液；
3)向所述第二反应液中加入甲醇钠溶液，于-15～5℃的温度下进行反应，得第三反应液；
4)向所述第三反应液中加入盐酸，调节pH值为3～5，得第四反应液；
5)用膜浓缩设备对所述第四反应液依次进行微滤和纳滤处理，得烟酰胺核糖溶液；
6)在Mg离子、ATP和缓冲液存在的环境中，于35～39℃的温度下，用烟酰胺核糖激酶催化步骤5)得到的烟酰胺核糖溶液进行反应，控制反应过程的pH值为7.5～8.0，反应结束后即得烟酰胺单核苷酸。
综合考虑能耗及反应速度，优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法中，步骤1)的反应在25～35℃的温度下进行。
本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法的步骤1)中，溶剂优选为乙腈，因其在反应中溶解性好，有助形成均相体系，利于反应快速进行，且副产物α-异构体极少(<0.1％)。
本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法的步骤1)中，催化剂优选为三氟甲磺酸三甲基硅酯，因其在反应中反应立体性选择高，易处理，无金属残渣。
优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法的步骤1)中，三氟甲磺酸三甲基硅酯或四氯化锡、烟酰胺与四乙酰核糖的摩尔比为1.2～5:1.2～2:1。
优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法中，在步骤3)之前，先将第二反应液进行浓缩处理以除去溶剂。
综合考虑能耗及产品的稳定性，优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法中，步骤3)的反应在-10～-5℃的温度下进行。
优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法的步骤3)中，甲醇钠与四乙酰核糖的摩尔比为1～5:1。
综合考虑能耗及产品的稳定性，优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法中，步骤4)的过程保持反应液的温度为-10～-5℃。
优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法的步骤5)中，微滤过程采用的微滤膜孔径为0.2-1μm，以去除掉反应液中的微生物和大颗粒分子；纳滤过程采用截留分子量为150～250的中空纤维膜，以去除掉反应液中的烟酰胺、残留溶剂和大部分的无机盐杂质。
优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法的步骤6)中，整个酶催化反应体系中各物质的加入量为：Mg离子10～50mM，ATP 10～30mM，缓冲液20～100mM，烟酰胺核糖9～27mM，烟酰胺核糖激酶0.2～1g/L。
优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法的步骤6)中，Mg离子为MgCl 2。
优选地，本发明提供的上述以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法的步骤6)中，缓冲液为K 2HPO 4缓冲液。
有益效果：
与现有技术相比，本发明提供的烟酰胺单核苷酸的制备方法以烟酰胺和四乙酰核糖为起始原料，以烟酰胺核糖为反应中间体，整个工艺过程避开了现有技术中需要通过结晶等方法对烟酰胺核糖进行精制后才能参与后续的转化成烟酰胺单核苷酸的反应的技术要求，所以减少了对烟酰胺核糖的精制步骤，工艺更精简、操作更简单、成本更低廉、耗时更短。与此同时，将该方法合成得到的未经精制的烟酰胺核糖溶液应用于后续酶催化制备烟酰胺单核苷酸的反应中时却取得了相较于直接采用烟酰胺核糖精制固体时更快的反应速度、更低的酶用量等意料之外的优点，同时也进一步缩短了时间、降低了成本。另外，该方法在化学合成的基础上引入生物酶催化的手段，相较于纯化学合成方法更为绿色环保。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。
以下实施例中所使用的原料和试剂，如无特别说明，均为从市场购入。
实施例1
中间体产物烟酰胺核糖溶液的制备
氮气保护下，向2L三口烧瓶中依次加入100g四乙酰核糖(314.5mmol，1.0eq)，115.1g烟酰胺(943.4mmol，3eq)和700ml乙腈，20℃温度下搅拌，溶液呈悬浊液，缓慢滴加170.3ml(943.4mmol，3eq)三氟甲磺酸三 甲基硅酯，滴加过程中悬浊液变澄清再变浑浊，20℃温度下继续搅拌45分钟，点板显示原料完全转化。向反应液中加入碳酸氢钠调节pH值至3～5，浓缩蒸除溶剂，得浅黄色油状液体(产率100％)。
将上述所得浅黄色油状液体溶于500ml甲醇，搅拌下降温至-10℃，缓慢滴加314.5ml(1572.5mmol，5eq)的甲醇钠溶液，滴加过程中保持反应液的内温低于-5℃，滴加完后，在-5～-10℃反应40分钟，高效液相色谱(HPLC)检测显示原料完全转化。向反应液中缓慢滴加250mL(1500mmol)的6M盐酸调节pH值在3～4，将反应液浓缩得到浅黄色液体(产率100％)。
将上述所得浅黄色液体溶于水中，然后送入膜浓缩设备依次进行微滤和纳滤处理，其中，微滤过程采用的微滤膜孔径为0.2μm，纳滤过程采用截留分子量为150的中空纤维膜，得烟酰胺核糖溶液(有机溶剂溶残小于0.5％)，所得溶液待用。
实施例2
中间体产物烟酰胺核糖溶液的制备
氮气保护下，向2L三口烧瓶中依次加入100g四乙酰核糖(314.5mmol，1.0eq)，76.7g烟酰胺(628.7mmol，2eq)和700ml二氯甲烷，25℃温度下搅拌，溶液呈悬浊液，缓慢滴加113.5ml(628.7mmol，2eq)三氟甲磺酸三甲基硅酯，25℃温度下继续搅拌50分钟，原料完全转化。向反应液中加入碳酸氢钠调节pH值至3～5，浓缩蒸除溶剂，得浅黄色油状液体(产率100％)。
将上述所得浅黄色油状液体溶于500ml甲醇，搅拌下降温至-10℃，缓慢滴加188.7ml(943.5mmol，3eq)的甲醇钠溶液，滴加过程中保持反应液的内温低于-5℃，滴加完后，在-5～-10℃反应60分钟，原料完全转化，向反应液中缓慢滴加150mL(900mmol)的6M盐酸，调节pH值至3～4，将反应液浓缩得到浅黄色液体(产率100％)。
将上述所得浅黄色液体溶于水中，然后送入膜浓缩设备依次进行微滤和纳滤处理，其中，微滤过程采用的微滤膜孔径为0.5μm，纳滤过程采用截留分子量为200的中空纤维膜，得烟酰胺核糖溶液(有机溶剂溶残小于 0.5％)，所得溶液待用。
实施例3
中间体产物烟酰胺核糖溶液的制备
氮气保护下，向2L三口烧瓶中依次加入100g四乙酰核糖(314.5mmol，1.0eq)，57.5g烟酰胺(471.3mmol，1.5eq)和700ml1,2-二氯乙烷，35℃温度下搅拌，溶液呈悬浊液，缓慢滴加85.1ml(471.3mmol，1.5eq)四氯化锡，35℃温度下继续搅拌45分钟，＝原料完全转化。向反应液中加入碳酸钠调节pH值至3～5，浓缩蒸除溶剂，得浅黄色油状液体(产率100％)。
将上述所得浅黄色油状液体溶于500ml甲醇，搅拌下降温至-10℃，缓慢滴加125.8ml(629mmol，2eq)的甲醇钠溶液，滴加过程中保持反应液的内温低于-5℃，滴加完后，在-5～-10℃反应90分钟，原料完全转化，向反应液中缓慢滴加100mL(600mmol)的6M盐酸，调节pH值至3～5，将反应液浓缩得到浅黄色液体(产率100％)。
将上述所得浅黄色液体溶于水中，然后送入膜浓缩设备依次进行微滤和纳滤处理，其中，微滤过程采用的微滤膜孔径为0.7μm，纳滤过程采用截留分子量为200的中空纤维膜，得烟酰胺核糖溶液(有机溶剂溶残小于0.5％)，所得溶液待用。
实施例4
中间体产物烟酰胺核糖溶液的制备
氮气保护下，向2L三口烧瓶中依次加入100g四乙酰核糖(314.5mmol，1.0eq)，46g烟酰胺(377mmol，1.2eq)和700ml液态二氧化硫，40℃温度下搅拌，溶液呈悬浊液，缓慢滴加68.0ml(377mmol，1.2eq)三氟甲磺酸三甲基硅酯，40℃温度下继续搅拌45分钟，原料完全转化。向反应液中加入氢氧化钠调节pH值至3～5，浓缩蒸除溶剂，得浅黄色油状液体(产率100％)。
将上述所得浅黄色油状液体溶于500ml甲醇，搅拌下降温至-10℃，缓慢滴加94.3ml(471.7mmol，1.5eq)的甲醇钠溶液，滴加过程中保持反应液的内温低于-5℃，滴加完后，在-5～-10℃反应120分钟，原料完全转化，向 反应液中缓慢滴加75mL(450mmol)的6M盐酸，调节pH值至3～5，将反应液浓缩得到浅黄色液体(产率100％)。
将上述所得浅黄色液体溶于水中，然后送入膜浓缩设备依次进行微滤和纳滤处理，其中，微滤过程采用的微滤膜孔径为1μm，纳滤过程采用截留分子量为250的中空纤维膜，得烟酰胺核糖溶液(有机溶剂溶残小于0.5％)，所得溶液待用。
实施例5
对中间体产物烟酰胺核糖溶液的制备过程中各参数的考察，结果如表1至表5所示。
表1烟酰胺/三氟甲磺酸三甲基硅酯用量对反应转化率的影响
Figure PCTCN2020096908-appb-000002
表2碳酸氢钠调节pH值后对烟酰胺核糖溶液长期稳定性的影响
实验 pH值 温度 放置时间 稳定性
1 3 2～4℃ 45天 基本不降解
2 4 2～4℃ 45天 降解2.4％
3 5 2～4℃ 45天 降解3.7％
表3步骤3)中温度对反应的影响
温度 甲醇钠用量 反应时间 反应结果
0～5℃ 2.0eq 0.5h 反应完全，产品降解9.2％
-5～0℃ 2.0eq 1.0h 反应完全，产品降解19.6％
-10～-5℃ 2.0eq 1.5h 反应完全，产品基本不降解
-15～-10℃ 2.0eq 5.0h 反应完全，产品基本不降解
表4步骤3)中甲醇钠用量对反应的影响
甲醇钠用量 反应温度 反应时间 反应结果
1.2eq -10～-5℃ 24.0h 反应完全，产品基本不降解
1.5eq -10～-5℃ 2.0h 反应完全，产品基本不降解
2.0eq -10～-5℃ 1.5h 反应完全，产品基本不降解
3.0eq -10～-5℃ 1.0h 反应完全，产品基本不降解
5.0eq -10～-5℃ 40min 反应完全，产品基本不降解
表5盐酸调节pH值后对烟酰胺核糖溶液长期稳定性的影响
实验 储存温度 pH值 储存时间 稳定性
1 0～4℃ 3 45天 基本不降解
2 0～4℃ 4 45天 降解1.3％
3 0～4℃ 5 45天 降解2.1％
实施例6
烟酰胺单核苷酸的制备
表6
Figure PCTCN2020096908-appb-000003
称取1g烟酰胺核糖激酶加入10mL纯水配成酶工作液，4℃保存。
按表6称取前三种物料分别加入纯水约70mL溶解，然后分别加入市售NR固体(含量80％)或本发明实施例制备的NR溶液(含量300mM)，用3M NaOH调节pH值为7.5～8.0,定容到100mL，37℃预热后加入酶工作液330-500uL，220rpm恒温振荡反应，反应结束后即得烟酰胺单核苷酸。
反应过程中每半小时取样，HPLC分析产物生成，并监控调节pH值，结果如表7所示：
表7
Figure PCTCN2020096908-appb-000004
从表7中可以看出，相较于市售NR固体，本发明实施例制备的NR溶液在反应中的初速度更快，所需酶量更低。
实施例7
烟酰胺单核苷酸的制备
表8
Figure PCTCN2020096908-appb-000005
称取1g烟酰胺核糖激酶加入10mL纯水配成酶工作液，4℃保存。
按表8称取前三种物料分别加入纯水约70mL溶解，然后分别加入市售NR固体(含量50％)或本发明实施例制备的NR溶液(含量570mM)，用3M NaOH调节pH值为7.5～8.0,定容到100mL，37℃预热后，加入酶工作液650uL，220rpm恒温振荡反应，反应结束后即得烟酰胺单核苷酸。
反应过程中每半小时取样，HPLC分析产物生成，并监控调节pH值，结果如表9所示：
表9
Figure PCTCN2020096908-appb-000006
从表9中可以看出，相较于市售NR固体，本发明实施例制备的NR溶液在反应中的初速度更快，并且可以避免出现如市售NR固体-批次2所呈现的因某些杂质存在而使反应受到抑制的情况。
实施例8
烟酰胺单核苷酸的制备
表10
Figure PCTCN2020096908-appb-000007
称取1g烟酰胺核糖激酶加入10mL纯水配成酶工作液，4℃保存。
按表10称取前三种物料分别加入纯水约70mL溶解，然后分别加入市售NR固体(含量98％)或本发明实施例制备的NR溶液(含量1020mM),用3M NaOH调节pH值为7.5～8.0,定容到100mL，37℃预热后加入酶工作液1mL，220rpm恒温振荡反应，反应结束后即得烟酰胺单核苷酸。
反应过程中每半小时取样，HPLC分析产物生成，并监控调节pH值，结果如表11所示：
表11
Figure PCTCN2020096908-appb-000008
从表11中可以看出，相较于市售NR固体，本发明实施例制备的NR溶液在反应中的初速度稍快，并且底物浓度提高，转化率会降低。

Claims (10)

  1. 一种以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
    1)在乙腈、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷或者液态二氧化硫溶剂中，用三氟甲磺酸三甲基硅酯或四氯化锡催化烟酰胺和四乙酰核糖于20～40℃的温度下进行反应，得第一反应液；
    2)向第一反应液中加入碳酸氢钠、碳酸钠或氢氧化钠，调节pH值为3～5，得第二反应液；
    3)向第二反应液中加入甲醇钠溶液，于-15～5℃的温度下进行反应，得第三反应液；
    4)向第三反应液中加入盐酸，调节pH值为3～5，得第四反应液；
    5)用膜浓缩设备对第四反应液依次进行微滤和纳滤处理，得烟酰胺核糖溶液；
    6)在Mg离子、ATP和缓冲液存在的环境中，于35～39℃的温度下，用烟酰胺核糖激酶催化步骤5)得到的烟酰胺核糖溶液进行反应，控制反应过程的pH值为7.5～8.0，反应结束后即得烟酰胺单核苷酸。
  2. 根据权利要求1所述的以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述步骤1)的反应在25～35℃的温度下进行。
  3. 根据权利要求1所述的以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述三氟甲磺酸三甲基硅酯、所述烟酰胺与所述四乙酰核糖的摩尔比为1.2～5:1.2～2:1。
  4. 根据权利要求1所述的以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述步骤3)的反应在-10～-5℃的温度下进行。
  5. 根据权利要求1所述的以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述甲醇钠与所述四乙酰核糖的摩尔比为1～5:1。
  6. 根据权利要求1所述的以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述步骤4)的过程保持反应液的温度为-10～-5℃。
  7. 根据权利要求1所述的以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方 法，其特征在于：所述步骤5)中，所述微滤过程采用的微滤膜孔径为0.2～1μm，所述纳滤过程采用截留分子量为150～250的中空纤维膜。
  8. 根据权利要求1所述的以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于所述步骤6)中，整个酶催化反应体系中各物质的加入量为：Mg离子10～50mM，ATP 10～30mM，缓冲液20～100mM，烟酰胺核糖9～27mM，烟酰胺核糖激酶0.2～1g/L。
  9. 根据权利要求1所述的以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述步骤6)中，所述Mg离子为MgCl 2。
  10. 根据权利要求1所述的以烟酰胺为原料制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述步骤6)中，所述缓冲液为K 2HPO 4缓冲液。
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