CN105949250A - 一种α-2,3唾液酸化乳果糖制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种α‑2，3唾液酸化乳果糖制备方法，其特征在于：一定组份的乳果糖、三磷酸胞苷钠、唾液酸、溶于超纯水中，用3摩尔/升的NaOH调pH8.5，加入1摩尔/升的pH8.5的Tris‑HCl。然后将混合物放入37℃气浴振荡器中，反应18～30小时。采用硅胶薄层层析(TLC)检测反应程度，TLC展开溶剂采用正丙醇∶甲醇∶水＝5∶2∶1。待乳果糖反应完全后，往反应液中加等体积95％乙醇，混合均匀，放入4℃冰箱中静置30min，然后在7000转/分下离心30min，上清液采用旋转蒸发浓缩。浓缩液采用硅胶色谱柱纯化，再经冷冻干燥即为纯品。

Description

一种α-2，3唾液酸化乳果糖制备方法
技术领域
本发明属于功能性寡糖制备技术领域，具体涉及一种α-2，3唾液酸化乳果糖制备方法。
背景技术
在医疗领域，唾液酸寡糖作为抗菌剂的潜力是非常大的。另外，唾液酸在细胞膜上的表达还与肿瘤的产生和转移有密切的关联。唾液酸的类似物Zanamivir和Tamiflu已被美国FDA批准治疗流感的新药。
现有的研究结果表明唾液酸在生物体许多生命现象中发挥着极为重要的作用，特别是在与唾液酸有关的功能性寡糖剂方面的研究正方兴未艾。因此，对唾液酸化寡糖的合成及以天然产物为母体进行唾液酸化修饰，以及相关的生物活性研究在化学和生物学界形成了一个热点，每年都有大量相关的研究工作报道。利用病毒对唾液酸寡糖有识别能力的特性，以有免疫活性的乳果糖为母体进行唾液酸糖苷化，得到的唾液酸修饰的乳果糖类新型低聚糖是很有潜力的免疫活性寡糖，对它们的功能性研究具有非常重要的科学和民生意义。正是根据市场的需求，经过不断实验和探索，我们发明了一种α-2，3唾液酸化乳果糖制备方法。
发明内容
本发明目的是克服了用化学方法对乳果糖进行唾液酸糖基化非常困难的问题。这是因为唾液酸糖苷化反应条件较一般糖苷化反应苛刻，立体选择性通常较差，端基碳的立体构型较难控制，唾液酸糖苷化反应产率差，很难制备。利用最近发展的酶法对乳果糖进行唾液酸糖基化修饰，利用高效的酶法合成制备技术，能够成功的制备出一种α-2，3唾液酸化乳果糖。
本发明的技术方案是：一种α-2，3唾液酸化乳果糖制备方法，其特征在于：乳果糖40重量份，三磷酸胞苷钠(CTP)90～110重量份，唾液酸，即Neu5Ac，50～60重量份，溶于3000重量份超纯水中，用3摩尔/升的NaOH调pH8.5，加入1摩尔/升的pH8.5的Tris-HCl，使其在反应体系中的浓度为100毫摩尔/升；2摩尔/升的MgCl2，使其在反应体系中的浓度为20毫摩尔/升；1～1.5重量份的CMP-唾液酸转移酶(NmCSS)；2～2.5重量份的α-2，3唾液酸苷转移酶，即PmST1。然后将混合物放入37℃气浴振荡器中，反应18～30小时。采用硅胶薄层层析(TLC)检测反应程度，TLC展开溶剂采用正丙醇∶甲醇∶水＝5∶2∶1。待乳果糖反应完全后，往反应液中加等体积95％乙醇，混合均匀，放入4℃冰箱中静置30min，然后在7000转/分下离心30min，上清液采用旋转蒸发浓缩。浓缩液采用硅胶色谱柱纯化。纯化溶剂的比例为乙酸乙酯∶甲醇∶水＝6∶2∶1。收集纯化后的溶液，旋转蒸发浓缩，并冷冻干燥即为纯品。采用质谱和核磁共振鉴定纯品的分子量以及结构，通过质谱鉴定分子量(见附图1)，附图1中横坐标(m/z)是质荷比，纵坐标(relative abundance)是相对丰度，能够鉴定出本发明制备出的纯品分子量为632(由于质谱测定采用负离子模式，所以质谱图上显示分子量的数据为631)，与一种α-2，3唾液酸化乳果糖分子量632相同，说明本发明制备出的纯品是一种α-2，3唾液酸化乳果糖；通过核磁共振鉴定分子结构(见附图2)，附图2中横坐标f1(ppm)是化学位移，纵坐标是吸收峰的强度，能够鉴定出本发明制备出的纯品分子结构为一种α-2，3唾液酸化乳果糖，说明本发明的一种α-2，3唾液酸化乳果糖制备成功。一种α-2，3唾液酸化乳果糖的结构如下：
附图说明
图1为本发明的一种α-2，3唾液酸化乳果糖质谱图。
图2为本发明的一种一种α-2，3唾液酸化乳果糖核磁共振1H谱图。
图3为本发明的一种一种α-2，3唾液酸化乳果糖核磁共振13C谱图。
图4一种α-2，3唾液酸化乳果糖的结构图。
具体实施方式
实施例1
原料配方 乳果糖40mg，三磷酸胞苷钠(CTP)95mg，唾液酸(Neu5Ac)53mg，溶于3000mg超纯水中，用3摩尔/升的NaOH调pH8.5，加入1摩尔/升的pH8.5的Tris-HCl，使其在反应体系中的浓度为100毫摩尔/升；2摩尔/升的MgCl2，使其在反应体系中的浓度为20毫摩尔/升；1mg的CMP-唾液酸转移酶(NmCSS)；2mg的唾液酸苷转移酶，即PmST1。然后将混合物放入37℃气浴振荡器中，反应20小时。采用硅胶薄层层析(TLC)检测反应程度，TLC展开溶剂采用正丙醇∶甲醇∶水＝5∶2∶1。待乳果糖反应完全后，往反应液中加等体积95％乙醇，混合均匀，放入4℃冰箱中静置30min，然后在7000转/分下离心30min，上清液采用旋转蒸发浓缩。浓缩液采用硅胶色谱柱纯化。纯化溶剂的比例为乙酸乙酯∶甲醇∶水＝6∶2∶1。收集纯化后的溶液，旋转蒸发浓缩，并冷冻干燥即为成品。最后得到的一种α-2，3唾液酸化乳果糖纯品采用质谱和核磁鉴定结构。
实施例2
乳果糖40mg，三磷酸胞苷钠(CTP)110mg，唾液酸(Neu5Ac)60mg，溶于3000mg超纯水中，用3摩尔/升的NaOH调pH8.5，加入1摩尔/升的pH8.5的Tris-HCl，使其在反应体系中的浓度为100mM；2摩尔/升的MgCl2，使其在反应体系中的浓度为20毫摩尔/升；1.5mg的CMP-唾液酸转移酶(NmCSS)；2.5mg的唾液酸苷转移酶(PmST1)。然后将混合物放入37℃气浴振荡器中，反应24小时。采用硅胶薄层层析(TLC)检测反应程度，TLC展开溶剂采用正丙醇∶甲醇∶水＝5∶2∶1。待乳果糖反应完全后，往反应液中加等体积95％乙醇，混合均匀，放入4℃冰箱中静置30min，然后在7000转/分下离心30min，上清液采用旋转蒸发浓缩。浓缩液采用硅胶色谱柱纯化。纯化溶剂的比例为乙酸乙酯∶甲醇∶水＝6∶2∶1。收集纯化后的溶液，旋转蒸发浓缩，并冷冻干燥即为成品。最后得到的一种α-2，3唾液酸化乳果糖纯品采用质谱和核磁鉴定结构。
实施例3
乳果糖40mg，三磷酸胞苷钠(CTP)90mg，唾液酸(Neu5Ac)50mg，溶于3000mg超纯水中，用3摩尔/升的NaOH调pH8.5，加入1摩尔/升的pH8.5的Tris-HCl，使其在反应体系中的浓度为100毫摩尔/升；2摩尔/升的MgCl2，使其在反应体系中的浓度为20毫摩尔/升；1.2mg的CMP-唾液酸转移酶，即NmCSS；2.3mg的唾液酸苷转移酶，即PmST1。然后将混合物放入37℃气浴振荡器中，反应26小时。采用硅胶薄层层析(TLC)检测反应程度，TLC展开溶剂采用正丙醇∶甲醇∶水＝5∶2∶1。待乳果糖反应完全后，往反应液中加等体积95％乙醇，混合均匀，放入4℃冰箱中静置30min，然后在7000转份下离心30min，上清液采用旋转蒸发浓缩。浓缩液采用硅胶色谱柱纯化。纯化溶剂的比例为乙酸乙酯∶甲醇∶水＝6∶2∶1。收集纯化后的溶液，旋转蒸发浓缩，并冷冻干燥即为成品。最后得到的一种α-2，3唾液酸化乳果糖纯品采用质谱和核磁鉴定结构。
实施例4
乳果糖40mg，三磷酸胞苷钠(CTP)100mg，唾液酸(Neu5Ac)56mg，溶于3000mg超纯水中，用3摩尔/升的NaOH调pH8.5，加入1摩尔/升的pH8.5的Tris-HCl，使其在反应体系中的浓度为100毫摩尔/升；2摩尔/升的MgCl2，使其在反应体系中的浓度为20毫摩尔/升；1.4mg的CMP-唾液酸转移酶，即NmCSS；2.4mg的唾液酸苷转移酶，即PmST1。然后将混合物放入37℃气浴振荡器中，反应28小时。采用硅胶薄层层析(TLC)检测反应程度，TLC展开溶剂采用正丙醇∶甲醇∶水＝5∶2∶1。待乳果糖反应完全后，往反应液中加等体积95％乙醇，混合均匀，放入4℃冰箱中静置30min，然后在7000转/分下离心30min，上清液采用旋转蒸发浓缩。浓缩液采用硅胶色谱柱纯化。纯化溶剂的比例为乙酸乙酯∶甲醇∶水＝6∶2∶1。收集纯化后的溶液，旋转蒸发浓缩，并冷冻干燥即为成品。最后得到的一种α-2，3唾液酸化乳果糖纯品采用质谱和核磁鉴定结构。

Claims (2)

1.一种α-2，3唾液酸化乳果糖制备方法，其特征在于：乳果糖40重量份，三磷酸胞苷钠(CTP)90～110重量份，唾液酸(Neu5Ac)50～60重量份，溶于3000重量份超纯水中，用3摩尔/升的NaOH调pH8.5，加入1摩尔/升的pH8.5的Tris-HCl，使其在反应体系中的浓度为100毫摩尔/升；2摩尔/升的MgCl2，使其在反应体系中的浓度为20毫摩尔/升；1～1.5重量份的CMP-唾液酸转移酶(NmCSS)；2～2.5重量份的唾液酸苷转移酶，即PmST1。然后将混合物放入37℃气浴振荡器中，反应18～30小时。
2.一种权利要求1所述的α-2，3唾液酸化乳果糖制备方法，其特征还包括以下纯化步骤：采用硅胶薄层层析(TLC)检测反应程度，TLC展开溶剂采用正丙醇∶甲醇∶水＝5∶2∶1。待乳果糖反应完全后，往反应液中加等体积95％乙醇，混合均匀，放入4℃冰箱中静置30min，然后在7000转/分下离心30min，上清液采用旋转蒸发浓缩。浓缩液采用硅胶色谱柱纯化。纯化溶剂的比例为乙酸乙酯∶甲醇∶水＝6∶2∶1。收集纯化后的溶液，旋转蒸发浓缩，并冷冻干燥即为纯品。
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