CN103555796A - 双唾液酸化四糖的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化学可控的酶法合成双唾液酸化的四糖的合成方法。本发明还提供了两种用于合成制备双唾液酸化四糖的中间体，分别为通式Ⅳ、Ⅴ所示的化合物。本发明将化学合成法的灵活性和酶合成法的高区域选择性和高效性结合到一起，首次实现了用化学干预的方法合成双唾液酸化四糖的合成，解决了目前化学合成双唾液酸化四糖的所面临的底物反应活性低、合成步骤繁多、收率低等不足，以及酶法中唾液酸转移酶获得困难和只对糖肽识别的问题，具有底物反应活性高、收率高的优点，因而，本发明为在分子水平上研究唾液酸糖苷的生物功能和发展以此为基础的糖药物具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及糖类物质的化学酶法合成方法，尤其涉及一类肿瘤相关糖抗原和对神经修复具有促进作用的双唾液酸化四糖的化学酶法合成方法，属于糖类药物领域。
背景技术
双唾液酸化四糖Neu5Acα(2-3)Galβ(1-3)[Neu5Acα(2-6)]GalNAc(图1)广泛存在于各种类型细胞表面，并在众多生理和病理过程中发挥着至关重要的作用。例如，该四糖是人类红细胞表面高度糖基化的血型糖蛋白(glycophorin)上最主要的糖链，这一糖链除了可以避免红细胞的聚集外，还参与了红细胞所介导的众多生理过程(J.Parkkinen,G.N.Rogers,T.Korhonen,W.Dahr,J.Finne.Infectionandimmolunity,1986,54,37-42)；这一四糖也是肿瘤细胞过度表达的黏蛋白MUCII上的特异性肿瘤相关糖抗原，因而是合成以糖链为基础的肿瘤疫苗的重要组成部分；此外，这一四糖也是神经节苷酯GQ1bα的组成部分，是髓磷脂相关糖蛋白(myelin-associatedglycoprotein,MAG)所能识别的最小结构单元，且为其结合活性最高的天然受体(B.E.Collins,H.Ito,N.Sawada,H.Ishida,M.Kiso,R.L.Schnaar,J.Biol.Chem.1999,274,37637)；这一四糖还是促红细胞生成素（EPO）上的唯一O-聚糖链。
图1是双唾液酸化四糖的结构。
鉴于上述情况，大量合成这种富含唾液酸的寡糖用于在分子水平上研究其功能是非常有价值的，同时一个高效、便捷的合成方法将极大地促进以其为先导化合物的药物发现进程。然而由于这类天然唾液酸糖苷结构的复杂性及其不稳定性，给分离纯化带来了极大困难。虽然近年来化学合成寡糖获得了快速的发展，但依然没有一个统一、有效的普适性方法。化学法合成这类四糖需要进行反复的保护与脱保护操作，反应收率低，立体选择性不高(J.B.Schwarz,S.D.Kuduk,X.Chen,D.Sames,P.W.Glunz,andS.J.Danishefsky,J.Am.Chem.Soc.,1999,121,2662-2673)。同时，九碳糖唾液酸由于其自身独特结构，不仅容易形成分子内氢键，且在C1位的羧基、C3位的脱氧、C5位的氮杂原子取代等使得唾液酸糖苷键的化学合成一直以来都是糖合成领域的难点(X.Chen.,A.Varki,ACSChem.Biol.,2010,5,2,163-176)。酶法合成这类双唾液酸化的四糖需要使用α2,3唾液酸转移酶和α2,6唾液酸转移酶来分别将两个唾液酸引入不同位置。目前，仅有的一例酶法合成报道(O.Blixt,K.Allin,L.Pereira,A.Datta,andJ.C.Paulson,J.Am.Chem.Soc.,2002,124,5739-5746)，采用的是哺乳动物来源的两个唾液酸转移酶来分别引入四糖表位中的两个唾液酸。利用哺乳动物来源的唾液酸转移酶面临以下几方面的困难：（1）哺乳动物来源的唾液酸转移酶均为跨膜蛋白，现有技术手段很难实现可溶性蛋白的大量表达；（2）该系列酶往往具有很强的底物专一性，底物适用性窄，例如报道中的唾液酸转移酶只对糖肽有较高的反应活性(O.Blixt,K.Allin,L.Pereira,A.Datta,andJ.C.Paulson.J.Am.Chem.Soc.2002,124,5739-5746)。近年来发现细菌来源的唾液酸转移酶具有表达量高，底物适应性宽等优点(J.Yan,X.Chen,F.Wang,H.Cao.Org.Biomol.Chem.2013,11,842-848)，但是，其中的α2,6唾液酸转移酶却不能区分核心二糖Galβ(1-3)GalNAc的半乳糖(Gal)或乙酰氨基半乳糖(GalNAc)。为解决这些问题，本发明首次成功运用含有内酯的寡糖进行化学酶法的合成，实现了双唾液酸化四糖及其类似物的快速、高效合成，解决了目前化学或酶法合成中的不足。
发明内容
针对上述现状，本发明首先要面临的技术问题是解决酶法合成中使用到的细菌来源的α2,6唾液酸转移酶不能区分核心二糖Galβ(1-3)GalNAc的半乳糖(Gal)或乙酰氨基半乳糖(GalNAc)的问题，从而将第二个唾液酸引入到正确的位置。
本发明所要解决的另一个技术问题提供一种快速、高效的化学操纵的酶法合成双唾液酸化四糖及其类似物的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一类双唾液酸化四糖的合成方法，具体步骤如下：
（1）利用化学法合成β-构型的N-乙酰氨基半乳糖苷GalNAcβΟR1（如图2的通式Ⅰ所示）；其中：R1为氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或α-或β-构型取代烷基；
（2）利用“一锅双酶法”将通式Ⅰ的化合物和半乳糖立体选择性偶联合成二糖Galβ(l-3)GalNAcOR1（如图3的通式Ⅱ所示），所述”一锅双酶法”中先后用到的酶分别为半乳糖激酶(GalK)和己糖磷酸化酶(BiGalHexNAcP)；其中：R1为氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或α-或β-构型取代烷基；
（3）利用“一锅双酶法”合成通式Ⅲ的三糖（如图4所示），所述“一锅双酶法”唾液酸化中用到的酶指CMP-唾液酸合成酶(NmCSS)和α2,3唾液酸转移酶(PmST1)(J.Yan,X.Chen,F.Wang,H.Cao.Org.Biomol.Chem.2013,11,842-848)；其中：R1为氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或α-或β-构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；
（4）利用乙酰化和选择性脱乙酰基的方法，合成含唾液酸的内酯三糖（如图5的通式Ⅳ所示）；其中：R1为氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或α-或β-构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；
（5）利用酶法合成双唾液酸化的内酯四糖（如图6的通式Ⅴ所示），所述酶法唾液酸化中用到的酶指α2,6唾液酸转移酶；其中：R1为氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或α-或β-构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R3为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；
（6）碱性水溶液中水解上述双唾液酸化四糖的内酯，得到双唾液酸化四糖（如图7的通式Ⅵ所示）；其中：R1为氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或α-或β-构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R3为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮。
本发明中，通过步骤（2）和步骤（3），我们利用α2,3唾液酸转移酶(PmST1)和己糖磷酸化酶(BiGalHexNAcP)，高效、快速的实现了对单唾液三糖的底物积累，对于这两种酶的底物适应性的考察(含R1和R2所列基团)可见相关报道（K.Lau,H.Yu,V.Thon,Z.Khedri,M.E.Leon,B.K.TranandX.Chen,Org.Biomol.Chem.,2011,9,2784；H.Yu,H.Yu,R.KarpelandX.Chen.Bioorg.Med.Chem.12,2004,6427）。但是，基于之前对α2,6唾液酸转移酶在上述三糖上引入第二个唾液酸的实验，发现α2,6唾液酸转移酶不能区分核心二糖Galβ(1-3)GalNAc的半乳糖(Gal)或乙酰氨基半乳糖(GalNAc)，为解决此关键性问题，我们运用化学手段合成了内酯三糖[具体见步骤(4)]，实现了对非还原末端二糖构象的锁定，使构象改变的半乳糖不再是α2,6唾液酸转移酶(PdST)的最适底物；通过步骤（5），发现α2,6唾液酸转移酶(PdST)还能以内酯三糖作为底物，高效的对还原端的乙酰氨基半乳糖进行唾液酸化；通过步骤（6），实现了目的双唾液酸四糖的高效合成。而且，通过步骤（4）和步骤（5），扩充了α2,6唾液酸转移酶的底物适应范围，利用内酯进行酶法合成也未见相关报道。
所述步骤（1）中的β-构型的N-乙酰氨基半乳糖苷采用以下方法合成：将半乳糖氨盐酸盐与醋酐进行反应后，将其全部羟基用乙酰基保护；然后在微波条件下进行β-构型糖苷化反应，然后依次叠氮化和脱保护后即得可作为下步酶反应受体的N-乙酰氨基半乳糖苷（图8）。
所述步骤（2）中的二糖Galβ(l-3)GalNAcΟR1合成方法是：将化合物Ⅰ、半乳糖（1.5-3.0当量）、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.5-5.0当量)、MgCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol,pH5.0-10.0)配制水溶液，将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶(GalK)和己糖磷酸化酶(BiGalHexNAcP)，待反应完成后，纯化即可直接获得二糖化合物Ⅱ。
所述当量是指物质相互作用时的物质的量的比值，如：半乳糖(1.5-3.0当量)的含义即为：半乳糖与化合物Ⅰ的物质的量的比为1.5-3.0。下同。
所述步骤（3）中的α2,3唾液酸化二糖的合成方法：将化合物Ⅱ、唾液酸(Neu5Ac)(1.5-5.0当量)、胞苷三磷酸(CTP)(0.5-10.0当量)、MgCl2(5.0-100mmol)和Tris-HCl缓冲液(10-500mmol,pH5.0-10.5)配制水溶液，加入CMP-唾液酸合成酶和α2,3唾液酸转移酶，实现“一锅双酶法”唾液酸化，反应完成后，纯化即可直接获得化合物Ⅲ。
所述反应完成采用薄层色谱法(TLC)跟踪反应进程，展开剂为EA:CH3OH:H2O:HOAc=4:2:1:0.1来检测。
所述步骤（4）中α2,3唾液酸化内酯三糖合成方法是：在冰浴的条件下，加入化合物Ⅲ、吡啶、醋酐，反应5-24小时后旋蒸蒸干，拌入硅胶，柱分离纯化，得到全乙酰化的化合物IV。之后将全乙酰化的中间体溶于甲醇，加入甲醇钠粉末，使反应体系的pH值保持7-9大约5-10小时，然后柱分离纯化即得化合物Ⅳ。
所述反应完成采用薄层色谱法(TLC)跟踪反应进程，展开剂为EA:CH3OH:H2O:HOAc=4:2:1:0.1来检测。
所述步骤（5）中双唾液酸化四糖的合成方法是：将化合物Ⅳ、CMP-唾液酸(CMP-Neu5Ac)(1.5-5.0当量)、MgCl2(5.0-100mmol)和Tris-HCl缓冲液(10-500mmol，pH5.0-10.5)配制水溶液，加入α2,6唾液酸转移酶，实现酶法唾液酸化，反应完成后，纯化即可直接获得化合物Ⅴ。
所述步骤（6）中将化合物Ⅴ溶于氢氧化钠水溶液(0.1-1mol)中，反应2-12小时，纯化即可直接获得化合物Ⅵ。
当然，可以制备本发明化合物碱加成的盐，这些盐包括在发明之中。
所述步骤（2）中“一锅双酶法”中先后用到的酶分别是E.coliK-12galactokinase(GalK)和Bifidobacterium infantis D-galactosyl-β1-3-N-acetyl-D-hexosamine phosphorylase(BiGalHexNAcP)，反应时间为3-72小时。
所述步骤（3）中“一锅双酶法”唾液酸化中用到的酶是NeisseriameningitidisCMP-sialicacid synthetase(NmCSS)和Pasteurella multocida sialyltransferase1(PmST1)，反应时间为5分钟-30小时。
所述步骤（2）和步骤（3）中“一锅双酶法”合成中反应温度为0-37℃，转速为0-240r/min；所述酶反应的停止方法是向反应中加入与反应液等体积的4℃无水乙醇并在4℃下孵育0-30分钟。
本发明还提供了两种用于合成制备双唾液酸化四糖的中间体，分别为通式Ⅳ、Ⅴ所示的化合物。
本发明提供了一种高效简捷的化学可控的酶法合成双唾液酸化的四糖的合成方法。本发明将化学合成法的灵活性和酶合成法的高区域选择性和高效性结合到一起，首次实现了用化学干预的方法合成双唾液酸化四糖的合成，解决了目前化学合成双唾液酸化四糖的所面临的底物反应活性低、合成步骤繁多、收率低等不足，以及酶法中唾液酸转移酶获得困难和只对糖肽识别的问题，具有底物反应活性高、收率高的优点，因而，本发明为在分子水平上研究唾液酸糖苷的生物功能和发展以此为基础的糖药物具有重要意义。
附图说明
图1：双唾液酸化四糖的结构。
图2：通式Ⅰ所示化合物。
图3：通式Ⅱ所示化合物。
图4：通式Ⅲ所示化合物。
图5：通式Ⅳ所示化合物。
图6：通式Ⅴ所示化合物。
图7：通式Ⅵ所示化合物。
图8：化学法合成β-构型的单糖化合物1的反应方程式。
图9：“一锅双酶法”合成二糖化合物通式II的反应方程式（现有技术）。
图:10：“一锅双酶法”合成二糖化合物2的反应方程式。
图11：“一锅双酶法”合成三糖化合物通式Ⅲ的反应方程式（现有技术）。
图12：“一锅双酶法”合成三糖化合物3的反应方程式。
图13：化学法合成内酯三糖4的反应方程式。
图14：酶法法合成内酯四糖5的反应方程式。
图15：化学法合成双唾液酸四糖6的反应方程式。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的阐述。应该说明的是，实施例仅是示范性的，并不对本发明构成任何限制。
本发明中所提及的化合物1、2、3、4、5、6分别对应于R1为叠氮取代烷基、R2为氮乙酰氨基、R3为氮乙酰氨基的通式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的化合物。
下述实施例中所涉及的反应原料、溶剂等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规产品，所涉及的合成方法、工艺，若无特别说明，均为所属领域的常规技术手段。
实施例1化学酶法合成双唾液酸化四糖[Neu5Acα(2-3)Galβ(1-3)[Neu5Acα(2-6)]GalNAc]
步骤如下：
（1）化学法合成β-构型的单糖衍生物1：
化合物1(GalNAcβProN3)的合成
反应方程式如图8所示；
向500mL圆底烧瓶中，加入半乳糖氨盐酸盐(8.0g,37.1mmol)、醋酐(38mL)、吡啶(160mL)、二甲氨基吡啶(DMAP,0.3g,2.46mmol)，室温搅拌12小时。薄层色谱检测(EA:MeOH=10:1)反应完全后，旋蒸浓缩，之后向反应液中加入甲苯20mL，旋蒸浓缩，反复进行3次。所得固体复溶于300mL甲醇，在4℃条件下静置12小时重结晶。过滤，弃除滤液，收集所得固体，干燥，获得白色固体化合物7(11.7g,84%)。
向容积为10mL的微波专用反应管中，加入化合物7(1.00g,2.57mmol)、1,2-二氯乙烷(5mL)、1-氯-3-丙醇(0.34mL,5.14mmol),、硫酸-硅胶(17mg)，磁子搅拌，微波条件下110℃反应15分钟。按照相同的反应条件，平行开5组相同的反应。之后收集反应液，过滤，二氯甲烷冲洗，滤液用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次，半饱和食盐水萃取一次，之后分离有机相，再用无水硫酸钠干燥有机相，过滤，蒸干，获得白色固体化合物8(5.45g,92%)。
向250mL圆底烧瓶中加入化合物8(4.82g,11.4mmol)、N,N-二甲基甲酰胺(70mL)、叠氮钠(3.7g,56.9mmol),110℃搅拌回流12小时。薄层色谱检测(PE:EtOAc=1:8)反应完全后，使用硅藻土过滤，二氯甲烷冲洗，半饱和食盐水40mL萃取，反复三次，再用无水硫酸钠干燥有机相，旋蒸浓缩，获得棕色糖浆状化合物9(4.4g,90%)。
向250mL圆底烧瓶中加入化合物9、甲醇(60mL)、甲醇钠，直至溶液体系pH值到9.5左右，室温搅拌4小时，薄层色谱检测(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc=4:2:1:0.2)反应完全后，旋蒸浓缩，快速柱分离纯化，得到白色固体化合物1(3.96g,91%)。参数如下：1HNMR(600MHz,D2O)δ4.40(d,J=8.4Hz,1H),3.94(dt,J=10.8,5.6Hz,1H),3.89(d,J=3.1Hz,1H),3.83(dd,J=19.6,10.9Hz,1H),3.80–3.70(m,2H),3.68(dd,J=10.8,3.2Hz,1H),3.65–3.60(m,2H),3.43–3.27(m,2H),2.04(s,3H),1.80(m,2H).
（2）“一锅双酶法”合成二糖化合物2[Galβ(1-3)GalNAcβProN3]
“一锅双酶法”的一般操作方法如图9所示（现有技术中的方法）；
本发明的化合物2[Galβ(1-3)GalNAcβProN3]的合成
反应方程式如图10所示；
将受体化合物1(200mg)、半乳糖(176mg)、ATP(540mg)、Tris-HCl缓冲液(100mmol,pH7.5)和氯化镁(20mmol)(Tris和氯化镁的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入GalK(7.2-8.0mg)和BiGalHexNAcP(8.5–11.0mg),加双蒸水至总体积30mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、140r/min孵育48小时。薄层色谱EtOAc:MeOH:H2O:EtOH=4:2:1:0.2跟踪检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇4℃、140r/min孵育30min以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心10分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过硅胶柱快速柱分离，获得白色化合物2(1.03g,83%)。参数如下：1HNMR(600MHz,D2O)δ4.45(d,J=8.4Hz,1H),4.40(d,J=7.8Hz,1H),4.14(s,1H),3.95(t,J=9.3Hz,2H),3.86(s,1H),3.82(d,J=10.8Hz,1H),3.79–3.68(m,4H),3.65(d,J=3.5Hz,2H),3.62(s,1H),3.57(d,J=10.0Hz,1H),3.48(t,J=8.4Hz,1H),3.34(s,2H),1.99(s,3H),1.80(s,2H).
（3）“一锅双酶法”合成三糖化合物3[Neu5Acα(2-3)Galβ(l-3)GalNAcβProN3]
“一锅双酶法”唾液酸化的一般操作方法如图11所示（现有技术中的方法）；
本发明的化合物3[Neu5Acα(2-3)Galβ(l-3)GalNAcβProN3]的合成
反应方程式如图12所示；
向50mL离心管中，加入由“一锅双酶法”合成得到的二糖受体2(0.22g,0.47mmol)、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac，0.22g)、胞苷三磷酸(CTP,0.44g)、Tris-HCl缓冲液(100mmol,pH8.5)和氯化镁(20mmol)(Tris和氯化镁的用量由最终反应液的体积来计算确定)，加双蒸水调节总体积为20mL，振动搅匀后加入酶NmCSS(3-6mg)和PmST1(0.2-0.6mg)，在37℃、140r/min条件下孵育0.5小时。薄层色谱（EA:CH3OH:H2O:HOAc=4:2:1:0.1）跟踪检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，4℃、140r/min孵育0.5h中止反应。之后将反应体系4℃、12000r/min离心10分钟，收集上清液。旋蒸浓缩，通过快速柱分离，获得白色化合物3(1.04g,97%)。参数如下：1HNMR(300MHz,D2O)δ4.54(d,J=8.4Hz,1H,),4.52(d,1H,J=7.8Hz),4.20(d,J=3.3Hz,1H),4.09(dd,J=9.9,3.1Hz,1H),4.06–4.01(m,1H),3.99(d,J=4.1Hz,1H),3.95(d,J=3.1Hz,1H),3.91(dd,J=5.8,2.8Hz,2H),3.86(dd,J=6.0,2.9Hz,2H),3.84–3.81(m,1H),3.81–3.77(m,2H),3.77–3.50(m,13H),3.41(t,J=6.6Hz,2H),2.77(dd,J=12.6,4.5Hz,1H),2.04(d,J=5.7Hz,6H),1.88(dd,J=12.8,6.4Hz,2H),1.80(t,J=11.7Hz,1H).
（4）化学法合成内酯三糖4
化合物3-叠氮丙基-[5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-α-吡喃九碳酮糖酸-(1”→4’)-内酯]-(2→3)-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→3)-β-D-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖苷4的合成
反应方程式如图13所示；
向50mL圆底烧瓶中加入化合物3(130mg)、醋酐(1mL)、吡啶(2mL)，冰浴条件下搅拌12h。薄层色谱检测(EA:MeOH=10:1)反应完全后，旋蒸浓缩，之后向反应液中加入2mL甲苯，旋蒸浓缩，反复进行3次。之后，通过快速柱分离，获得白色化合物10(160mg,87%)。
向50mL圆底烧瓶中加入化合物10(110mg)、甲醇(5mL)，室温下搅拌溶解，再加入甲醇钠，薄层色谱(EA:CH3OH:H2O:HOAc=4:2:1:0.1)跟踪检测反应完成后，旋蒸浓缩，通过快速柱分离，获得白色化合物4(38mg,49.4%)。参数如下：1HNMR(600MHz,D2O)δ4.53(d,J=7.8Hz,1H),4.46(d,J=9.0Hz,1H),4.32–4.19(m,2H),4.08(s,1H),4.01–3.94(m,1H),3.93(t,J=5.9Hz,1H),3.85(dd,J=18.5,8.3Hz,2H),3.82–3.79(m,1H),3.78(d,J=5.5Hz,1H),3.76–3.68(m,3H),3.64(dd,J=10.8,6.1Hz,2H),3.62–3.56(m,3H),3.54–3.49(m,3H),3.33(dd,J=17.0,10.5Hz,3H),2.55(dd,J=13.3,5.2Hz,1H),2.12–1.95(m,5H),1.77(dt,J=35.8,14.7Hz,3H).
（5）酶法法合成内酯四糖5
化合物3-叠氮丙基-[5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-α-2-吡喃九碳酮糖酸-(1”→4’)-内酯]-(2→3)-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→3)-[(5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-β-D-吡喃九碳酮糖酸)-(2→6)-β-D-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖苷5的合成
反应方程式如图14所示；
向50mL离心管中，加入内酯三糖受体4(40mg,0.05mmol)、胞苷二磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Ac，0.17mmol）、双蒸水(4mL)，调节溶液pH值至中性，加入酶PdST(0.75mg)，加双蒸水调节总体积为8mL，在37℃、140r/min条件下孵育2小时。薄层色谱(EA:CH3OH:H2O:HOAc=4:2:1:0.1)跟踪检测反应完成后，旋蒸浓缩，通过快速柱分离，获得白色化合物5(48mg,86%)。参数如下：1HNMR(600MHz,D2O)δ4.50(d,J=7.8Hz,1H),4.43(d,J=8.4Hz,1H),4.26–4.21(m,1H),4.11(d,J=2.6Hz,1H),3.98–3.86(m,4H),3.86–3.79(m,4H),3.78–3.69(m,4H),3.68–3.55(m,9H),3.55–3.46(m,5H),3.36–3.27(m,2H),2.67(dd,J=12.4,4.4Hz,1H),2.54(dd,J=13.4,5.4Hz,1H),1.99(dd,J=16.9,13.5Hz,7H),1.86(s,9H),1.82–1.71(m,3H),1.64(t,J=12.6Hz,1H).
（6）化学法合成双唾液酸化四糖6
化合物3-叠氮丙基-[(5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-α-吡喃九碳酮糖酸)-(2→3)]-β-D-吡喃半乳糖基-(1→3)[(5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-α-吡喃九碳酮糖酸)-(2→6)]-β-D-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖苷6的合成
反应方程式如图15所示；
向50mL圆底烧瓶中加入化合物5(35mg,0.03mmol)，1molNaOH溶液(1mL)，搅拌4小时，薄层色谱（EA:CH3OH:H2O:HOAc=4:2:1:0.1）跟踪检测反应完成后，加入1mol盐酸中和反应液，之后溶液过0.22μm的微孔滤膜，通过Bio-gelP2凝胶分子排阻色谱进行组合纯化，获得纯品化合物6(34.8mg,98%)。参数如下：1HNMR(300MHz,D2O)δ4.51(dd,J=8.1,4.2Hz,2H),4.21(d,J=2.9Hz,1H),4.13–4.05(m,1H),4.05–4.00(m,1H),4.00–3.93(m,3H),3.91(d,J=2.5Hz,1H),3.91–3.87(m,3H),3.87–3.84(m,2H),3.81(t,J=3.9Hz,1H),3.77(d,J=3.7Hz,1H),3.75–3.70(m,4H),3.70–3.57(m,9H),3.54(dd,J=7.2,2.5Hz,1H),3.39(dd,J=11.8,5.1Hz,2H),2.85–2.67(m,2H),2.05(s,9H),1.87(dd,J=12.5,6.1Hz,2H),1.80(t,J=7.9Hz,1H),1.70(dd,J=14.6,9.5Hz,1H).
Claims (10)
1.双唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于：所述步骤如下：
（1）利用化学法合成β-构型的N-乙酰半乳糖胺，结构如通式Ⅰ所示，其中：R1为氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或α-或β-构型取代烷基；
（2）利用“一锅双酶法”将通式Ⅰ的化合物和半乳糖立体选择性偶联合成二糖Galβ(l-3)GalNAcOR1，结构如通式Ⅱ所示，所述“一锅双酶法”中先后用到的酶分别为半乳糖激酶和己糖磷酸化酶；其中：R1为氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或α-或β-构型取代烷基；
（3）利用“一锅双酶法”合成通式Ⅲ的三糖，所述“一锅双酶法”唾液酸化中用到的酶指CMP-唾液酸合成酶和α2,3唾液酸转移酶；其中：R1为氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或α-或β-构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；
（4）利用乙酰化和选择性脱乙酰基的方法，合成含唾液酸的内酯三糖，结构如通式Ⅳ所示，其中：R1为氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或α-或β-构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；
（5）利用酶法合成双唾液酸化内酯四糖，结构如通式Ⅴ所示，所述酶法唾液酸化中用到的酶指α2,6唾液酸转移酶；其中：R1为氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或α-或β-构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R3为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；
（6）碱性水溶液中水解上述双唾液酸化四糖的内酯，得到双唾液酸化四糖，结构如通式Ⅵ所示，其中：R1为氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或α-或β-构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R3为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮。
2.根据权利要求1所述的双唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于：所述步骤（1）中的β-构型的N-乙酰半乳糖胺采用以下方法合成：将半乳糖氨盐酸盐与醋酐进行反应后，将其全部羟基用乙酰基保护；然后在微波条件下进行β-构型糖苷化反应，然后依次叠氮化和脱保护后即得。
3.根据权利要求1所述的双唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于：所述步骤（2）中的二糖Galβ(l-3)GalNAcOR1合成方法是：将化合物Ⅰ、半乳糖(1.5-3.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.5-5.0当量)、MgCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol,pH5.0-10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶和己糖磷酸化酶，待反应完成后，纯化即可直接获得二糖化合物Ⅱ。
4.根据权利要求1所述的双唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于：所述步骤（3）中的α2,3唾液酸化二糖的合成方法：将化合物Ⅱ、唾液酸(1.5-5.0当量)、胞苷三磷酸(0.5-10.0当量)、MgCl2(5.0-100mmol)和Tris-HCl缓冲液(10-500mmol,pH5.0-10.5)配制水溶液，加入CMP-唾液酸合成酶和α2,3唾液酸转移酶，实现“一锅双酶法”唾液酸化，反应完成后，纯化即可直接获得化合物Ⅲ。
5.根据权利要求1所述的双唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于：所述步骤（4）中α2,3唾液酸化内酯三糖合成方法是：在冰浴的条件下，加入化合物Ⅲ、吡啶、醋酐，反应5-24小时后旋蒸蒸干，拌入硅胶，柱分离纯化，得到全乙酰化的化合物Ⅳ；之后将全乙酰化的中间体溶于甲醇，加入甲醇钠粉末，使反应体系的pH值保持在7-9，反应5-10小时，然后柱分离纯化即得化合物Ⅳ。
6.根据权利要求1所述的双唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于：所述步骤（5）中双唾液酸化四糖的合成方法是：将化合物Ⅳ、CMP-唾液酸(1.5-5.0当量)、MgCl2(5.0-100mmol)和Tris-HCl缓冲液(10-500mmol，pH5.0-10.5)配制水溶液，加入α2,6唾液酸转移酶，实现酶法唾液酸化，反应完成后，纯化即可直接获得化合物Ⅴ。
7.根据权利要求1所述的双唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于：所述步骤（6）中将化合物Ⅴ溶于氢氧化钠水溶液(0.1-1mol)中，反应2-12小时，纯化即可直接获得化合物Ⅵ。
8.根据权利要求1所述的双唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于：所述步骤（2）和步骤（3）中“一锅双酶法”合成中反应温度为0-37℃，转速为0-240rpm；所述酶反应的停止方法是向反应体系中中加入与反应液等体积的4℃无水乙醇并在4℃下孵育0-30分钟。
9.一种用于制备双唾液酸化四糖的中间体，其特征在于：结构如通式Ⅳ所示，其中，R1为氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或α-或β-构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮。
10.一种用于制备双唾液酸化四糖的中间体，其特征在于：结构如通式Ⅴ所示，其中，R1为氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基或α-或β-构型取代烷基；R2为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮；R3为氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基或叠氮。
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