CN112940058B - 一种氟标签及其制备方法、辅助的酶法合成寡糖链的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种氟标签及其制备方法、辅助的酶法合成寡糖链的方法。氟标签，结构式如式Ⅰ所示，G‑R(Ⅰ)。其中，G代表单糖或低聚糖；R为下列式Ⅱ、式Ⅲ中的一种：
Figure DDA0002919112580000011
其中R1为C6H13、C8H17中的一种。G表示乳糖时，R代表C8F17双氟链时如式Ⅱ所示。氟标签，具有脱除容易，易回收的优点。利用这种糖基受体去合成各种不同的寡糖链，实现快速高效的合成结构确定的寡糖链。

Description

一种氟标签及其制备方法、辅助的酶法合成寡糖链的方法
技术领域
本发明属于糖类物质的分离方法技术领域，具体涉及一种氟标签及其制备方法、辅助的酶法合成寡糖链的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
碳水化合物是三大天然生物大分子之一，在生命过程中起着重要作用，且与许多疾病的发展密切相关。由于从天然来源中分离得到高纯度且结构单一的寡糖是非常费力费时的，因此快速高效的合成结构确定的寡糖是至关重要。为了提高寡糖合成的效率，已经发展了多种简化寡糖纯化过程的策略。其中，通过氟标签协助的氟液-液萃取(FLLE)或氟固相萃取(FSPE)技术在最近二十年中已被广泛关注。但是，由于重氟标签在普通有机溶剂中的溶解性差(F含量大于60％)以及在FLLE过程中使用氟化溶剂的成本较高，因此FLLE在碳水化合物合成中的应用范围受到限制。作为FLLE的替代品，FSPE近年来以酯甲硅烷基醚，苄基醚的轻质氟标签(F含量小于40％)的使用迅速发展。最近，一些轻氟标签已用于寡糖的自动液相合成中。然而，这些轻氟标签具有一些缺点，例如对酸或碱不稳定，较低的负载能力，并且难以切除和再生。
氟固相萃取(FSPE)是一种具有应用前景的低聚糖自动合成方法。含有CnF2n+1部分的化合物可以通过氟硅胶柱进行纯化，用甲醇洗脱时释放含氟化合物。在过去的几十年里，这一方法已经被广泛地研究了各种化合物，Seeberger在20世纪90年代末发展起来的基于液相的微反应器应用于碳水化合物化学。固相合成因能快速实现化合物的分离而先后用于寡肽、寡核苷酸及寡糖的合成。但由于反应监测困难、非均相体系反应导致糖基化效率低等问题，使得糖的固相合成在具体应用时存在着诸多问题。而氟液相萃取及氟固相萃取技术能快速实现氟载体支载的化合物与非氟化合物的分离，而被广泛应用于多肽、寡糖以及其它有机化合物的合成中。由于氟载体支载的寡糖合成是在均相体系中进行的，其糖基化效率一般不会受影响。同时，反应可通过常规手段来监测，因此在较为复杂的寡糖合成中具有优势。但是，在氟液相萃取中需要使用昂贵的高氟代溶剂作为萃取剂；而F-SPE分离技术中繁杂的步骤既造成了化合物的损失，同时也限制了反应的规模。此外，重氟载体由于成本高，很难大规模使用，而目前报道的轻氟载体具有难脱除、难回收使用、负载量有限等问题。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种氟标签及其制备方法、辅助的酶法合成寡糖链的方法。合成一类新型、成本较低、易回收使用的氟载体(氟标签、糖受体)，并在此基础上寻找一种能集固相、液相合成和酶法合成优点于一身的寡糖合成策略，对寡糖的合成有着极为重要的意义。
为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
第一方面，一种氟标签，结构式如式Ⅰ所示，
G-R (Ⅰ)。
其中，G代表单糖或低聚糖；
R为下列式Ⅱ、式Ⅲ中的一种：
Figure BDA0002919112560000021
其中R1为C6H13、C8H17、中的一种。
在本发明的一些实施方式中，G为下列结构式中的一种：
Figure BDA0002919112560000031
在本发明的一些实施方式中，G表示乳糖时，R代表C8F17双氟链时如式Ⅱ所示
Figure BDA0002919112560000032
所述式Ⅳ所示氟标签也称为氟载体、乳糖受体、二糖化合物。
所述氟标签，具有脱除容易，易回收的优点。利用这种糖基受体去合成各种不同的寡糖链，实现快速高效的合成结构确定的寡糖链。
第二方面，上述氟标签的制备方法，具体步骤为：
1)乳糖与醋酐、醋酸钠回流反应，反应产物浓缩后萃取得到化合物12；
2)化合物12与醋酸铵、甲醇/四氢呋喃反应、浓缩、纯化后，溶解在二氯甲烷中，加入三氯乙腈和DBU，反应后浓缩、纯化得到前步化合物，前步化合物与双氟链受体、活化的
Figure BDA0002919112560000041
分子筛溶于二氯甲烷中反应，然后加入三氟甲磺酸三甲基硅酯继续反应，加入三乙胺终止反应，得到的产物经过过滤、浓缩、纯化得到化合物13；
3)化合物13与甲醇、甲醇钠反应，将产物过滤、浓缩得到式Ⅰ所示化合物。
可选的，步骤1)中反应的温度为150-170℃，反应的时间为5-7h；可选的，乳糖与醋酐、醋酸钠的比例为1g:5-6mL:0.9-1g。
可选的，步骤2)中生成前步化合物先在温度为室温，反应的时间为7-9h，然后加入三氯乙腈和DBU后在室温下，反应的时间为0.6-1.2h；前步化合物与双氟链受体、
Figure BDA0002919112560000042
分子筛后先在室温下反应15-25min，然后在-25～-35℃下反应5-15min；加入三氟甲磺酸三甲基硅酯后，在-25～-35℃下反应0.8-1.2h。
可选的，化合物12、醋酸铵的质量比为5:2-2.5；前步化合物与双氟链受体、三氟甲磺酸三甲基硅酯的比为1g:2-2.5g:18-20μL。
可选的，步骤3)中反应的温度为室温，反应的时间为1.5-2.5h，pH 9-10。
第三方面，上述氟标签在寡糖合成方面的应用。
第四方面，上述的氟标签辅助的酶法合成寡糖链的方法，所述方法为：氟标签与酶法模块、糖基体进行组装反应，得到的产物经过氟固相萃取分离纯化、脱氟后得到寡糖链。
合成寡糖链的方法，实现快速的寡糖链与非氟化合物的分离。
在本发明的一些实施方式中，糖基体为N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰氨基半乳糖中的一种。
在本发明的一些实施方式中，酶法模块包括酶法模块A、酶法模块B、酶法模块C、酶法模块D、酶法模块E，酶法模块A包括N-乙酰氨基己糖激酶(NahK)与糖核苷生成酶(GlmU)的融合酶(NahK/GlmU)以及β1-3N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶(HpLgtA)；
酶法模块B包括半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)以及β1-4半乳糖基转移酶(NmLgtB)；
酶法模块C包括糖核苷生成酶(FKP)、α1-3岩藻糖基转移酶(Hpα1-3FucT)；
酶法模块D包括糖核苷生成酶(NmCSS)、α2-3唾液酸转移酶(PmST1M144D)；
酶法模块E包括N-乙酰氨基己糖激酶(NahK)与糖核苷生成酶(GlmU)的融合酶(NahK/GlmU)以及β1-3N-乙酰氨基半乳糖糖基转移酶(HiLgtD)；
酶法模块F包括半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)以及β1-3半乳糖基转移酶(CjCgtB)。
在本发明的一些实施方式中，利用酶法模块A、N-乙酰氨基葡萄糖、氟标签(式Ⅳ)组装得到三糖化合物，三糖化合物的结构式如式Ⅴ所示：
Figure BDA0002919112560000051
在本发明的一些实施方式中，利用式Ⅴ所示三糖化合物、半乳糖、酶法模块B组装得到四糖化合物，四糖化合物的结构式如式Ⅵ所示：
Figure BDA0002919112560000052
在本发明的一些实施方式中，利用式Ⅵ所示四糖化合物、酶法模块A、N-乙酰氨基葡萄糖组装合成五糖化合物，五糖化合物的结构式如式Ⅶ所示：
Figure BDA0002919112560000053
在本发明的一些实施方式中，利用式Ⅶ所示五糖化合物、半乳糖、酶法模块B组装得到六糖化合物，六糖化合物的结构式如式Ⅷ所示：
Figure BDA0002919112560000054
在本发明的一些实施方式中，利用式Ⅵ所示四糖化合物、岩藻糖、酶法模块C组装得到五糖化合物，五糖化合物的结构式如式Ⅸ所示：
Figure BDA0002919112560000061
在本发明的一些实施方式中，利用式Ⅸ所示五糖化合物、N-乙酰神经氨酸、酶法模块D组装得到六糖化合物，六糖化合物的结构式如式Ⅹ所示：
Figure BDA0002919112560000062
在本发明的一些实施方式中，利用氟标签(式Ⅳ)、半乳糖、酶法模块B组装得到三糖化合物，三糖化合物的结构式如式Ⅺ所示：
Figure BDA0002919112560000063
在本发明的一些实施方式中，利用式Ⅺ所示三糖化合物、N-乙酰氨基半乳糖、酶法模块E组装得到四糖化合物，四糖化合物的结构式如式Ⅻ所示：
Figure BDA0002919112560000071
在本发明的一些实施方式中，利用式Ⅻ所示四糖化合物、半乳糖、酶法模块组装得到五糖化合物，五糖化合物的结构式如式ⅩⅢ所示：
Figure BDA0002919112560000072
在本发明的一些实施方式中，氟标签辅助的酶法合成寡糖链的方法，所述方法具体为：将氟标签、糖基体、核苷三磷酸、MgCl2溶液、Tris-HCl缓冲液混合配制混合溶液，然后加入酶法模块孵育后，将产物浓缩、分离纯化，脱除非氟化合物后得到寡糖链。
可选的，核苷三磷酸为ATP、UTP、GTP、CTP中的一种或两种。
可选的，MgCl2溶液的浓度为5-100mM，Tris-HCl缓冲液的浓度为10-500mmol，pH为5.0-10.0。
可选的，混合溶液的pH为4.5-8.5。
可选的，加入酶法模块后孵育的时间为3-72h，温度为0-37℃，转速为0-240r/min。
可选的，利用甲醇/双蒸水混合溶剂脱除非氟化合物。
本发明一个或多个技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明将酶法合成快速高效的特点与氟固相萃取在寡糖分离纯化方面的优势相结合，可以快速大量的制备不同糖型的寡糖链。本发明所利用的糖基转移酶、糖核苷生成酶以及糖激酶均为原核生物来源，具有蛋白表达量高、底物适应性广泛、催化效率高等优点，因而以其为基础的酶法模块化组装效率高，且适于大量制备；利用糖核苷酸生成酶可以从价廉、易得的单糖出发高效的转化为昂贵的核苷活化的糖基供体，大大降低了生产成本；相对于步骤繁琐、产率较低的化学合成法，酶法合成在空间和立体化学特异性方面具有明显的优势，大大简化了反应步骤，提高反应的总体收率。
(2)本发明避免了酶法合成中普遍遇到的问题，需要对酶反应液进行多次的分离纯化，缩短了糖链合成的时间提高了寡糖合成的效率。为相关糖结构和生物学功能研究所需的糖链及其缀合物样品的获得提供了可行性极高的途径，还可在分子水平上深入研究这些糖链与受体的相互作用机制及构效关系，为相关疾病病理学机制的阐明和未来的诊断治疗奠定了基础。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：酶法模块化组装1；
图2：酶法模块化组装2；
图3：酶法模块化组装3；
图4：酶法模块化组装4；
图5：酶法模块化组装5；
图6：酶法模块化组装6；
图7：酶法模块化组装7；
图8：化学法合成β-构型的乳糖化合物1的反应方程式；；
图9：酶法模块化合成三糖化合物2的反应方程式；
图10：酶法模块化合成四糖化合物3的反应方程式；
图11：酶法模块化合成五糖化合物4的反应方程式；
图12：酶法模块化合成六糖化合物5的反应方程式；
图13：酶法模块化合成五糖化合物6的反应方程式；
图14：酶法模块化合成六糖化合物7的反应方程式；
图15：酶法模块化合成三糖化合物8的反应方程式；
图16：酶法模块化合成四糖化合物9的反应方程式；
图17：酶法模块化合成五糖化合物10的反应方程式。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下面结合实施例对本发明进一步说明
实施例1：一种氟标签辅助的寡糖快速分离方法
步骤如下：
(1)化学法合成β-构型的乳糖苷1(式Ⅳ)；
向500mL圆底烧瓶中加入乳糖11(10g,29.23mmol)、醋酐(55mL)和醋酸钠(9.6g)，在160℃反应条件下回流搅拌6小时。薄层色谱(PE:EA＝1:2)检测反应完全后，旋蒸浓缩。所得固体复溶于250mL二氯甲烷中，用半饱和食盐水萃取两次，饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，双蒸水溶液萃取三次，之后分离有机相，再用无水硫酸钠干燥有机相，旋蒸浓缩，获得淡黄色固体化合物12(18.70g,94％)。
向250mL圆底烧瓶中加化合物12(15.0g,22.12mmol)醋酸铵(6.8g,88.21mmol)甲醇/四氢呋喃(v/v,1/1)，室温反应8小时，浓缩，通过快速硅胶层析柱纯化(石油醚/乙酸乙酯1:2，v/v)得到白色浆状化合物。将此化合物溶解在无水的二氯甲烷中，三氯乙腈和DBU加入到反应液中，室温反应1小时，浓缩，通过快速硅胶层析柱纯化(石油醚/乙酸乙酯1:2，v/v)得到淡黄色浆状化合物。将前步的化合物(2.0g,2.90mmol)，受体双氟链受体(4.4g,0.31mmol)，活化的
Figure BDA0002919112560000101
分子筛溶于无水的二氯甲烷中，室温搅拌20分钟后一直-30℃的低温搅拌器中搅拌10分钟，加入三氟甲磺酸三甲基硅酯TMSOTf(38μL)，继续在-30℃的条件下反应1小时。加入三乙胺终止反应，过滤，浓缩，通过快速硅胶层析柱纯化(石油醚/乙酸乙酯1:2，v/v)得到白色糖浆状化合物13(5.9g,89％)。
向50mL圆底烧瓶中加入化合物13(5.9g)、甲醇(20mL)、甲醇钠，直至溶液体系pH值到9-10左右，室温搅拌2小时，薄层色谱检测(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2)反应完全后，用酸性离子交换树脂将反应液的pH值调节到中性，过滤，旋蒸浓缩，得到白色固体化合物1(式Ⅳ所示)(4.90g,98％)。
化合物1的合成路线如图8所示。
(2)酶法模块组装1合成三糖化合物2[GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβOR]
将乳糖受体化合物1(200mg)、N-乙酰氨基葡萄糖(34.3mg)、ATP(85.4mg)、UTP(75.0mg)、Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)和MgCl2(20mM)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入NahK/GlmU(2.0mg)和HpLgtA(2.0mg)，加双蒸水至总体积20mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育16小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝8:3:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过氟固相萃取分离纯化反应液，用甲醇/双蒸水混合溶剂洗脱非氟化合物，最后用甲醇洗脱释放目标化合物获得白色化合物2(式Ⅴ所示)(215.2mg,96％)。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ7.48-7.43(m,2H),7.24-7.14(m,2H),4.70(d,J＝8.4Hz,1H),4.69(d,J＝4.6Hz,2H),4.50(d,J＝7.8Hz,1H),4.45(d,J＝7.8Hz,1H),4.16(d,J＝3.0Hz,1H),4.03–3.46(m,54H),2.05(s,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.95,140.42,131.24,127.68,120.54,102.92,102.84,102.10,81.96,78.34,75.64,74.88,74.76,74.35,73.55,72.79,72.58,72.49,71.16,70.69,70.36,70.00,69.68,68.33,64.29,62.61,61.60,60.96,60.47,60.06,55.65,35.44,22.19；19F NMR(282MHz,D2O)δ-83.70,-116.33,-124.46,-124.69,-125.48,-126.56,-129.01。
化合物2的合成路线如图9所示。
(3)酶法模块组装2合成四糖化合物3[Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβOR]
将三糖化合物2(150mg)、半乳糖(18.7mg)、ATP(57.1mg)、UTP(50.2mg)、Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 7.5)和MgCl2(20mM)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入GalK(2.0mg)、BLUSP(2.0mg)和NmLgtB(2.0mg)，加双蒸水至总体积15mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育12小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过氟固相萃取分离纯化反应液，用甲醇/双蒸水混合溶剂洗脱非氟化合物，最后用甲醇洗脱释放目标化合物获得白色化合物3(式Ⅵ所示)(154.8mg,95％)；整个洗脱纯化过程用时短在0.5-1小时，洗脱效率95％以上。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ7.48-7.43(m,2H),7.24-7.14(m,2H),4.73(d,J＝8.4Hz,1H),4.69(d,J＝4.6Hz,2H),4.50(d,J＝7.8Hz,1H),4.49(d,J＝7.8Hz,1H),4.46(d,J＝8.4Hz,1H),4.17(d,J＝3.6Hz,1H),4.03–3.41(m,60H),2.05(s,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.89,140.42,131.24,127.68,120.54,102.92,102.84,102.73,102.09,82.05,78.35,78.14,75.33,74.87,74.75,74.53,74.34,72.79,72.58,72.49,72.16,71.16,70.96,70.69,69.95,68.55,68.31,64.29,62.61,61.16,61.04,60.96,60.06,59.85,55.18,35.44,22.22；19F NMR(282MHz,D2O)δ-83.70,-116.32,-124.46,-124.69,-125.49,-126.56,-129.02。
化合物3的合成路线如图10所示。
(4)酶法模块化1合成五糖化合物
4[GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβOR]
将四糖化合物3(100mg)、N-乙酰氨基葡萄糖(14.1mg)、ATP(35.1mg)、UTP(30.8mg)、Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)和MgCl2(20mM)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入NahK/GlmU(2.0mg)和HpLgtA(2.0mg)，加双蒸水至总体积10mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育16小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过氟固相萃取分离纯化反应液，用甲醇/双蒸水混合溶剂洗脱非氟化合物，最后用甲醇洗脱释放目标化合物获得白色化合物4(式Ⅶ所示)(105.5mg,96％)。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ7.48-7.43(m,2H),7.24-7.14(m,2H),4.69(d,J＝4.6Hz,2H),4.67(dd,J＝11.6,8.4Hz,2H),4.46(dd,J＝12.0,7.9Hz,2H),4.42(d,J＝7.9Hz,1H),4.13(d,J＝3.0Hz,2H),4.00–3.42(m,65H),2.02(d,J＝3.0Hz,6H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.87,174.82,140.42,131.24,127.68,120.54,102.89,102.84,102.81,102.69,102.07,81.98,81.94,78.31,78.13,75.61,74.84,74.82,74.72,74.50,74.31,73.51,72.75,72.58,72.49,72.12,71.16,69.95,69.91,69.64,68.28,64.29,62.61,61.61,60.92,60.45,60.02,59.82,55.62,55.10,35.44,22.18,22.06；19F NMR(282MHz,D2O)δ-83.70,-116.33,-124.46,-124.69,-125.48,-126.56,-129.01。
化合物4的合成路线如图11所示。
(5)酶法模块组装2合成六糖化合物5
[Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβOR]
将五糖化合物4(50mg)、半乳糖(5.2mg)、ATP(15.9mg)、UTP(14.0mg)、Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 7.5)和MgCl2(20mM)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入GalK(2.0mg)、BLUSP(2.0mg)和NmLgtB(2.0mg)，加双蒸水至总体积10mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育12小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过氟固相萃取分离纯化反应液，用甲醇/双蒸水混合溶剂洗脱非氟化合物，最后用甲醇洗脱释放目标化合物获得白色化合物5(式Ⅷ所示)(50.9mg,95％)。整个洗脱纯化过程用时短在0.5-1小时，洗脱效率95％以上。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ7.48-7.43(m,2H),7.24-7.14(m,2H),4.69(d,J＝4.6Hz,2H),4.65(d,J＝7.8Hz,2H),4.45(d,J＝7.2Hz,1H),4.43(d,J＝6.6Hz,1H),4.42(d,J＝7.8Hz,1H),4.39(d,J＝7.8Hz,1H),4.11(d,J＝3.0Hz,2H),3.98–3.42(m,71H),1.99(s,6H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.82,174.77,140.42,131.24,127.68,120.54,102.81,102.75,102.72,102.65,102.63,101.98,81.94,81.90,78.17,77.97,75.22,74.74,74.64,74.41,74.22,72.65,72.57,72.48,72.36,72.04,71.16,70.83,70.68,70.37,69.82,68.41,68.20,64.29,62.63,61.62,60.91,60.83,59.90,59.70,55.05,55.01,35.46,22.17,22.04；19F NMR(282MHz,D2O)δ-83.71,-116.33,-124.46,-124.69,-125.47,-126.56,-129.00。
化合物5的合成路线如图12所示。
(6)酶法模块组装3合成五糖化合物6
[Galβ(l-4)(Fucα1-3)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβOR]
将四糖化合物III(100mg)、岩藻糖(10.4mg)、ATP(35.1mg)、GTP(38.4mg)、Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 7.5)和MgCl2(20mM)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入酶FKP(2.00mg)和Hpα1,3FucT(2.00mg)，加双蒸水至总体积10mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育4小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝8:3:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过氟固相萃取分离纯化反应液，用甲醇/双蒸水混合溶剂洗脱非氟化合物，最后用甲醇洗脱释放目标化合物获得白色化合物6(式Ⅸ所示)(102.9mg,96％)。整个洗脱纯化过程用时短在0.5-1小时，洗脱效率95％以上。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ7.48-7.43(m,2H),7.24-7.14(m,2H),5.12(d,J＝3.6Hz,1H),4.70(d,J＝8.4Hz,1H),4.69(d,J＝4.6Hz,2H),4.48(d,J＝7.8Hz,1H),4.45(d,J＝7.8Hz,1H),4.42(d,J＝8.4Hz,1H),4.15(d,J＝3.0Hz,1H),4.05-3.43(m,64H),2.02(s,3H),1.17(d,J＝6.6Hz,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.58,140.42,131.24,127.68,120.54,102.84,102.43,102.01,101.67,98.51,81.97,78.24,75.01,74.80,74.76,74.66,74.26,72.96,72.69,72.59,72.50,72.38,71.81,71.16,70.95,70.69,70.36,69.85,69.10,68.25,68.20,67.61,66.59,64.31,61.59,61.40,60.87,59.97,59.54,55.86,35.46,22.18,15.25；19F NMR(282MHz,D2O)δ-83.70,-116.33,-124.46,-124.69,-125.48,-126.58,-129.01。
化合物6的合成路线如图13所示。
(7)酶法模块组装4合成六糖化合物7
[Neu5Acα(2-3)Galβ(l-4)(Fucα1-3)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβOR]
将五糖化合物6(50mg)、Neu5Ac(9.2mg)、CTP(14.3mg)、Tris-HCl缓冲液(100mM,pH8.0)和MgCl2(20mM)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入NmCSS(2.0mg)、PmST1M144D(2.0mg)，加双蒸水至总体积20mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育1小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过氟固相萃取分离纯化反应液，用甲醇/双蒸水混合溶剂洗脱非氟化合物，最后用甲醇洗脱释放目标化合物获得白色化合物7(式Ⅹ所示)(54.4mg,96％)。整个洗脱纯化过程用时短在0.5-1小时，洗脱效率95％以上。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ7.48-7.43(m,2H),7.24-7.14(m,2H),5.08(d,J＝4.2Hz,1H),4.69(d,J＝4.6Hz,2H),4.67(d,J＝7.8Hz,1H),4.49(d,J＝7.8Hz,1H),4.45(d,J＝8.4Hz,1H),4.40(d,J＝7.8Hz,1H),4.13(d,J＝3.0Hz,1H),4.05(dd,J＝2.6,9.8Hz,1H),4.04(d,J＝2.4Hz,1H),4.00–3.42(m,69H),2.73(dd,J＝4.2,12.6Hz,1H),2.00(s,3H),1.99(s,3H),1.76(t,J＝12.0Hz,1H),1.13(d,J＝6.6Hz,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.88,174.55,173.74,140.42,131.24,127.68,120.54,102.84,102.81,102.47,101.97,101.42,99.51,98.46,81.97,78.19,75.52,74.89,74.79,74.76,74.64,74.51,74.23,72.88,72.78,72.65,72.58,72.49,71.77,71.73,71.16,70.69,70.36,69.82,69.13,69.04,68.17,67.96,67.57,67.18,66.53,64.30,62.61,62.46,61.60,61.37,60.85,59.92,59.37,59.18,55.83,51.56,39.65,35.44,22.12,21.90,15.16；19F NMR(282MHz,D2O)δ-83.70,-116.33,-124.44,-124.69,-125.48,-126.56,-129.03。
化合物7的合成路线如图14所示。
(8)酶法模块组装5合成三糖化合物8[Galα(1–4)Galβ(1–4)GlcβOR]
将二糖化合物1(200mg)、半乳糖(27.9mg)、ATP(85.4mg)、UTP(75.0mg)、Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 7.5)和MgCl2(20mM)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入GalK(2.0mg)、BLUSP(2.0mg)和NmLgtC(2.0mg)，加双蒸水至总体积20mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育12小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过氟固相萃取分离纯化反应液，用甲醇/双蒸水混合溶剂洗脱非氟化合物，最后用甲醇洗脱释放目标化合物获得白色化合物8(式Ⅺ所示)(208.3mg,95％)。整个洗脱纯化过程用时短在0.5-1小时，洗脱效率95％以上。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ7.48-7.43(m,2H),7.24-7.14(m,2H),5.11(d,J＝4.2Hz,1H),4.69(d,J＝4.6Hz,2H),4.50(d,J＝7.8Hz,1H),4.45(d,J＝7.8Hz,1H),4.16(d,J＝3.0Hz,1H),4.03–3.46(m,54H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ140.42,131.24,127.68,120.54,102.92,102.84,102.10,81.96,78.34,75.64,74.88,74.76,74.35,73.55,72.79,72.58,72.49,71.16,70.69,70.36,70.00,69.68,68.33,64.29,62.61,61.60,60.96,60.47,60.06,55.65,35.44；19F NMR(282MHz,D2O)δ-83.70,-116.36,-124.46,-124.69,-125.48,-126.56,-129.01。
化合物8的合成路线如图15所示。
(9)酶法模块组装6合成四糖化合物9[GalNAcβ(1–3)Galα(1–4)Galβ(1–4)GlcβOR]
将三糖化合物8(151mg)、N-乙酰氨基半乳糖(23.6mg)、ATP(58.8mg)、UTP(51.6mg)、Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)和MgCl2(20mM)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入NahK/GlmU(2.0mg)和HiLgtD(2.0mg)，加双蒸水至总体积15mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育16小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过氟固相萃取分离纯化反应液，用甲醇/双蒸水混合溶剂洗脱非氟化合物，最后用甲醇洗脱释放目标化合物获得白色化合物9(式Ⅻ所示)(161.0mg,95％)。整个洗脱纯化过程用时短在0.5-1小时，洗脱效率95％以上。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ7.48-7.43(m,2H),7.24-7.14(m,2H),5.13(d,J＝4.3Hz,1H),4.69(d,J＝4.6Hz,2H),4.50(d,J＝7.8Hz,1H),4.49(d,J＝7.8Hz,1H),4.45(d,J＝7.2Hz,1H),4.17(d,J＝3.6Hz,1H),4.03–3.41(m,59H),2.05(s,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.89,140.42,131.24,127.68,120.54,102.92,102.84,102.73,102.09,82.05,78.35,78.14,75.33,74.87,74.75,74.53,74.34,72.79,72.58,72.49,72.16,71.16,70.96,70.69,69.95,68.55,68.31,64.29,62.61,61.16,61.04,60.96,60.06,59.85,55.18,35.44,22.22；19FNMR(282MHz,D2O)δ-83.70,-116.33,-124.46,-124.69,-125.48,-126.56,-129.01。
化合物9的合成路线如图16所示。
(10)酶法模块组装7合成五糖化合物10
[Galβ(1–3)GalNAcβ(1–3)Galα(1–4)Galβ(1–4)GlcβOR]
将四糖化合物9(80mg)、半乳糖(9.2mg)、ATP(28.0mg)、UTP(24.6mg)、Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 7.5)和MgCl2(20mM)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入GalK(2.0mg)、BLUSP(2.0mg)和CjCgtB(2.0mg)，加双蒸水至总体积10mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、110r/min孵育12小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过氟固相萃取分离纯化反应液，用甲醇/双蒸水混合溶剂洗脱非氟化合物，最后用甲醇洗脱释放目标化合物获得白色化合物10(式ⅩⅢ所示)(82.0mg,95％)。整个洗脱纯化过程用时短在0.5-1小时，洗脱效率95％以上。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ7.48-7.43(m,2H),7.24-7.14(m,2H),5.13(d,J＝4.2Hz,1H),4.69(d,J＝4.6Hz,2H),4.67(dd,J＝11.6,8.4Hz,2H),4.46(dd,J＝12.0,7.9Hz,2H),4.13(d,J＝3.0Hz,2H),4.00–3.42(m,65H),2.02(d,J＝3.0Hz,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.87,140.42,131.24,127.68,120.54,102.89,102.84,102.81,102.69,102.07,81.98,81.94,78.31,78.13,75.61,74.84,74.82,74.72,74.50,74.31,73.51,72.75,72.58,72.49,72.12,71.16,69.95,69.91,69.64,68.28,64.29,62.61,61.61,60.92,60.45,60.02,59.82,55.62,55.10,35.44,22.18,22.06；19F NMR(282MHz,D2O)δ-83.71,-116.31,-124.48,-124.69,-125.48,-126.58,-129.01。
化合物10的合成路线如图17所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种氟标签，其特征在于：结构式如式Ⅳ所示
Figure FDA0003846268420000011
2.权利要求1所述的氟标签辅助的酶法合成寡糖链的方法，其特征在于：氟标签与酶法模块、糖基体进行组装反应，得到的产物为寡糖链；
糖基体为N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰氨基半乳糖中的一种；
酶法模块为酶法模块A、酶法模块B、酶法模块C、酶法模块D、酶法模块E；
酶法模块A为N-乙酰氨基己糖激酶与糖核苷生成酶的融合酶以及β1-3N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶；
酶法模块B为半乳糖激酶、糖核苷生成酶以及β1-4半乳糖基转移酶；
酶法模块C为糖核苷生成酶、α1-3岩藻糖基转移酶；
酶法模块D为糖核苷生成酶、α2-3唾液酸转移酶；
酶法模块E为N-乙酰氨基己糖激酶与糖核苷生成酶的融合酶以及β1-3N-乙酰氨基半乳糖糖基转移酶。
3.如权利要求2所述的氟标签辅助的酶法合成寡糖链的方法，其特征在于：利用酶法模块A、N-乙酰氨基葡萄糖、氟标签式Ⅳ组装得到三糖化合物，三糖化合物的结构式如式Ⅴ所示：
Figure FDA0003846268420000012
或，利用式Ⅴ所示三糖化合物、半乳糖、酶法模块B组装得到四糖化合物，四糖化合物的结构式如式Ⅵ所示：
Figure FDA0003846268420000021
或，利用式Ⅵ所示四糖化合物、酶法模块A、N-乙酰氨基葡萄糖组装合成五糖化合物，五糖化合物的结构式如式Ⅶ所示：
Figure FDA0003846268420000022
4.如权利要求3所述的氟标签辅助的酶法合成寡糖链的方法，其特征在于：利用式Ⅶ所示五糖化合物、半乳糖、酶法模块B组装得到六糖化合物，六糖化合物的结构式如式Ⅷ所示：
Figure FDA0003846268420000023
或，利用式Ⅵ所示四糖化合物、岩藻糖、酶法模块C组装得到五糖化合物，五糖化合物的结构式如式Ⅸ所示：
Figure FDA0003846268420000024
或，利用式Ⅸ所示五糖化合物、N-乙酰神经氨酸、酶法模块D组装得到六糖化合物，六糖化合物的结构式如式Ⅹ所示：
Figure FDA0003846268420000025
5.如权利要求2所述的氟标签辅助的酶法合成寡糖链的方法，其特征在于：利用氟标签式Ⅳ、半乳糖、酶法模块B组装得到三糖化合物，三糖化合物的结构式如式Ⅺ所示：
Figure FDA0003846268420000031
或，利用式Ⅺ所示三糖化合物、N-乙酰氨基半乳糖、酶法模块E组装得到四糖化合物，四糖化合物的结构式如式Ⅻ所示：
Figure FDA0003846268420000032
或，利用式Ⅻ所示四糖化合物、半乳糖、酶法模块组装得到五糖化合物，五糖化合物的结构式如式ⅩⅢ所示：
Figure FDA0003846268420000033
6.如权利要求2所述的氟标签辅助的酶法合成寡糖链的方法，其特征在于：所述方法具体为：将氟标签、糖基体、核苷三磷酸、MgCl2溶液、Tris-HCl缓冲液混合配制混合溶液，然后加入酶法模块孵育后，将产物浓缩、分离纯化，脱除非氟化合物后得到寡糖链；
核苷三磷酸为ATP、UTP、GTP、CTP中的一种或两种；
MgCl2溶液的浓度为5-100mM，Tris-HCl缓冲液的浓度为10-500mmol，pH为5.0-10.0；
混合溶液的pH为4.5-8.5；
加入酶法模块后孵育的时间为3-72h，温度为0-37℃，转速为0-240r/min；
利用甲醇/双蒸水混合溶剂脱除非氟化合物。
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