CN111235128B - 一种GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键寡糖的合成方法 - Google Patents

一种GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键寡糖的合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键寡糖的合成方法。本发明方法包括：将目标寡糖的非还原末端Gal进行α1,2‑岩藻糖基化修饰从而使底物可以被α1,3‑N‑乙酰氨基半乳糖糖基转移酶或α1,3‑半乳糖糖基转移酶识别合成GalNAc(Fucα1,2)α1,3Gal或Gal(Fucα1,2)α1,3Gal糖苷键，再脱除岩藻糖，从而合成含GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键的目标寡糖。本发明将酶法合成所具有的高区域选择性和高效性结合到一起，以较高的收率实现了目标分子的合成。且本发明中所利用的糖基转移酶、糖核苷生成酶以及糖激酶均为原核生物来源，具有蛋白表达量高、底物适应性宽、催化效率高等优点，可用于大量制备。

Description

一种GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键寡糖的合成方法
技术领域
本发明属于糖苷键合成技术领域，具体涉及一种GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键寡糖的合成方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
细胞表面有丰富的糖链，糖链在细胞识别、细胞免疫、病毒感染等方面具有重要生物意义。细胞表面糖链异常表达与癌细胞也有十分重要关系，研究表明含有末端GalNAcα1,3Gal糖苷键的寡糖是宫颈癌预后的指标，再如动物细胞表面的Galα1,3Gal抗原表位是引起人与动物异种移值排斥反应的主要原因。
鉴于上述情况，大量合成含GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键的寡糖，发掘其潜在的糖链化合物库，发展以其为先导化合物的肿瘤诊断探针、抗肿瘤新型药物及用于人体异种移植研究具有重大意义。
由于生物体内环境十分复杂，就目前的研究水平而言，以提取的方式从生物体内获得大量结构单一的目标寡糖用于生物学、药学研究的可能性微乎其微。对于化学合成而言，由于糖链本身固有的活性相似的多羟基结构，在合成过程中需要反复的保护以及脱保护操作来保证区域、立体选择性，导致其反应步骤多、总体收率低。
以酶法模块化组装策略合成复杂寡糖可以克服化学合成法的不足，但就目前酶的来源和实际应用的角度来说，合成寡糖链所应用的酶主要分为两类：一种是糖苷酶，该类酶来源丰富、性能稳定、反应简单、底物适应性强，目前在工业上已被采用，但此类酶催化的寡糖合成收率欠佳。此外，由于糖苷酶催化的转糖基反应的区域选择性不高，而且合成反应中还存在水解反应的竞争，导致产物不均一，难于分离纯化，限制了其广泛应用。第二种是糖基转移酶，该类酶具有很高的催化效率及严格的底物选择性。但是天然糖基转移酶的使用也存在着很多限制因素：酶的来源有限；酶的不稳定性、复杂性导致分离纯化困难；酶催化的糖苷化反应需要价格昂贵的核苷活化糖作糖基给体；酶具有严格的底物特异性，对非天然或异常的底物耐受能力较差。以上缺点极大地限制了糖苷酶和糖基转移酶在酶法模块化合成复杂寡糖中的应用。
目前来说，并没有发现直接催化合成GalNAcα1,3Gal糖苷键的糖苷酶或糖基转移酶，合成Galα1,3Gal糖苷键的糖基转移酶也有有限的底物适应性。
发明内容
基于上述研究背景，发明人认为寻求一种可行、高效合成GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键的方法是目前亟待解决的问题。针对该技术问题，本发明利用α1,3-N-乙酰氨基半乳糖糖基转移酶(BgtA)或α1,3-半乳糖糖基转移酶(GTB)将N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)或半乳糖(Gal)分别以α1,3糖苷键引入到非还原末端的Fucα1,2Gal糖苷键单元中Gal的3位OH上，再以一定方法脱除α1,2-Fuc基团，即可实现GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键的构建。
本发明第一方面，提供一种酶法组装模块A，此模块包含的酶有岩藻糖激酶(FKP)、糖核苷生成酶(BLUSP)、α1,2-岩藻糖糖基转移酶(Hmα1,2FucT)，用于合成Fucα1,2Gal糖苷键。
本发明第二方面，提供一种酶法组装模块B，此模块包含的酶有N-乙酰氨基己糖激酶(NahK)与糖核苷生成酶(GlmU)的融合酶(NahK/GlmU)、α1,3-N-乙酰氨基半乳糖糖基转移酶(BgtA)，用于合成GalNAcα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键。
本发明第三方面，提供一种酶法组装模块C，此模块包含的酶有半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)、α1,3-半乳糖糖基转移酶(GTB)，用于合成Galα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键。
本发明第四方面，提供一种酸解岩藻糖模块D，此模块所用的酸是0.04～0.06M的盐酸水溶液，所用设备是微波反应器，温度是105～115℃，反应时间是14～16min；此模块所用的酸还可以是12％～48％的氢氟酸溶液，温度是10～30℃，反应时间是1～8h，用于水解GalNAcα1,3(Fucα1,2)Gal或Galα1,3(Fucα1,2)Gal中的α1,2-Fuc糖苷键。
本发明第五方面，提供第一、第二、第三、第四方面所述酶法组装模块及酸解岩藻糖模块的具体应用，用于合成GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键。
本领域目前糖链的合成主要通过化学法合成和酶法合成来实现，化学法产率较低且面临频繁的保护基操作而酶法合成通常面临酶的来源有限及底物适应性有限等问题。为了克服化学法合成和酶法合成的不足，发明人研究团队采用细菌来源的糖基转移酶，构建了针对不同糖砌块的多酶合成模块，合成岩藻糖基化的糖链，再通过包括但不限于化学法将岩藻糖脱除得到目标糖链产物。原理如附图1-4所示，上述酶法模块化组装能够实现岩藻糖、N-乙酰氨基半乳糖、半乳糖等的定点偶联效果，酸解法可以实现岩藻糖的脱除效果。
本发明第六方面，提供一种糖链核心骨架末端Gal进行α1,2-岩藻糖基化合成方法，所述合成方法包括将岩藻糖以α1,2糖苷键平行偶联到式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)所示的多糖非还原末端二糖，平行合成式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VII)所示的多糖非还原末端三糖的步骤；
Figure BDA0002372418960000031
优选的，第六方面所述α1,2-岩藻糖基化合成方法通过第一方面所述酶法组装模块A进行合成。
在本发明的一个具体实施方案中，式(I)所示的β-构型的糖苷Galβl,3GlcNAcOR1的合成采用以下方法：将GlcNAcβProN3(图5所示)与半乳糖(1.2-5.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.2-5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.2-5.0当量)、MgCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol、pH5.0-10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶(GalK)、β1,3-半乳糖糖基转移酶(BiGalHexNAcP)，反应时间为3-72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(I)所示的二糖。其可作为下步酶反应受体，反应方程式如图8所示。
在本发明的一个具体实施方案中，式(II)所示的β-构型的糖苷Galβl,4GlcNAcOR1的合成方法为：将GlcNAcβProN3(图5所示)与半乳糖(1.2-5.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.2-5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.2-5.0当量)、MgCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol、pH5.0-10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)以及β1,4-半乳糖糖基转移酶(NmLgtB)，反应时间为3-72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(II)所示的二糖。其可作为下步酶反应受体，反应方程式如图9所示。
在本发明的一个具体实施方案中，式(III)所示的α-构型的糖苷Galβl,3GalNAcOR1的合成方法为：将GalNAcαProN3(图6所示)与半乳糖(1.2-5.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.2-5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.2-5.0当量)、MgCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol、pH 5.0-10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶(GalK)、β1,3-半乳糖糖基转移酶(BiGalHexNAcP)，反应时间为3-72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(III)所示的二糖。其可作为下步酶反应受体，反应方程式如图10所示。
在本发明的一个具体实施方案中，式(III)所示的β-构型的糖苷Galβl,3GalNAcOR1合成方法为：将GalNAcβProN3(图7所示)与半乳糖(1.2-5.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.2-5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.2-5.0当量)、MgCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol、pH 5.0-10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶(GalK)、β1,3半乳糖糖基转移酶(BiGalHexNAcP)，反应时间为3-72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(III)所示的二糖。其可作为下步酶反应受体，反应方程式如图11所示。
在本发明的一个具体实施方案中，式(IV)所示的β-构型的糖苷Galβl,4GlcOR1的合成采用以下方法：将乳糖与醋酐进行反应后，将其全部裸露羟基用乙酰基保护；然后利用微波法将全乙酰化的乳糖进行β-构型糖苷化反应，最后依次叠氮化和脱保护，即可获得式(IV)所示的二糖。可作下步酶反应受体，具体反应方程式如图12所示。
在本发明的一个具体实施方案中，式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)所示的三糖的合成方法为：分别将式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)所示的二糖与岩藻糖糖(1.2-5.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.2-5.0当量)、鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)(1.2-5.0当量)、MnCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol、pH 5.0-10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加岩藻糖激酶(FKP)、糖核苷生成酶(FKP)、α1,2岩藻糖糖基转移酶(Hmα1,2FucT)，反应时间为3-72小时，待反应完成后，纯化即可分别获得式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)所示三糖。其可作为下步酶反应受体，反应方程式如图13所示。
本发明第七方面，提供一种糖链核心骨架末端GalNAcα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键的合成方法，所述合成方法包括将N-乙酰氨基半乳糖分别以以α1,3糖苷键平行偶联到式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)所示的多糖非还原末端三糖上，平行合成式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)所示的多糖非还原末端四糖的步骤。
Figure BDA0002372418960000051
优选的，所述糖链核心骨架末端GalNAcα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键的合成方法通过第二方面所述酶法组装模块B进行合成。
在本发明的一个具体实施方案中，式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)所示的四糖的合成方法为：分别将式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)所示的三糖与N-乙酰氨基半乳糖(1.2-5.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.2-5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.2-5.0当量)、MgCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol、pH 5.0-10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加N-乙酰氨基己糖激酶(NahK)与糖核苷生成酶(GlmU)的融合酶(NahK/GlmU)、α1,3N-乙酰氨基半乳糖糖基转移酶(BgtA)，反应时间为3-72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)所示的四糖。其可作为下步反应反应物，反应方程式如图14所示。
本发明第八方面，提供一种糖链核心骨架末端Galα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键的合成方法，所述合成方法包括将半乳糖分别以α1,3糖苷键平行偶联到式(VI)、式(VII)所示的多糖非还原末端三糖上，平行合成式(XIII)、式(XIV)所示的多糖非还原末端四糖的步骤。
Figure BDA0002372418960000061
优选的，所述糖链核心骨架末端Galα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键的合成方法通过第三方面所述酶法组装模块C进行合成。
在本发明的一个具体实施方案中，式(XIII)、式(XIV)所示的四糖的合成方法为：分别将式(VI)、式(VII)所示的三糖与半乳糖(1.2-5.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.2-5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.2-5.0当量)、MgCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol、pH 5.0-10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)、α1,3半乳糖糖基转移酶(GTB)，反应时间为3-72小时，待反应完成后，纯化即可获得式(XIV)、式(XV)所示的四糖。其可作为下步反应反应物，反应方程式如图15所示。
本发明第九方面，提供一种末端GalNAcα1,3Gal糖苷键寡糖的合成方法，所述合成方法包括第六方面及第七方面所述合成方法，还包括利用盐酸或氢氟酸溶液酸解岩藻糖的步骤。
本发明第十方面，提供一种末端Galα1,3Gal糖苷键寡糖的合成方法，所述合成方法包括第七方面及第八方面所述合成方法，还包括利用盐酸或氢氟酸溶液酸解岩藻糖的步骤。
优选的，所述第九和第十方面中，所述盐酸水溶液酸解岩藻糖的步骤包括利用微波反应器在盐酸水溶液中(如图4所示)将式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)、式(XIV)所示的多糖非还原末端四糖平行水解岩藻糖合成式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)、式(XX)所示多糖非还原末端三糖的步骤。
进一步优选的，所述微波反应器酸解岩藻糖所用条件温度为105～115℃，盐酸水溶液浓度为0.04～0.06M，反应时间为14～16min。
优选的，所述第九和第十方面中，所述氢氟酸水溶液酸解岩藻糖的步骤包括在氢氟酸溶液中(如图4所示)将式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIII)、式(XIV)所示的多糖非还原末端四糖平行水解岩藻糖合成式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)、式(XX)所示多糖非还原末端三糖的步骤。
进一步优选的，所述氢氟酸溶液酸解岩藻糖所用条件温度为10～30℃，氢氟酸溶液浓度为12％～48％，反应时间为1～8h。
在本发明的一个具体实施方案中，式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)、式(XX)所示的三糖的合成方法为：分别将式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIV)、式(XV)所示的四糖用0.04～0.06M盐酸水溶液溶解在微波反应器中105～115℃反应14～16min，待反应完成后，纯化即可获得式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)、式(XX)所示的三糖。或分别将式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)、式(XIV)、式(XV)所示的四糖用浓度为12％～48％氢氟酸溶液溶解在反应管中10～30℃反应1～8h，待反应完成后，纯化即可获得式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)、式(XX)所示的三糖。其反应方程式如图16所示。
除非另外指出，上文中的“当量”是指物质相互作用时的物质的量的比值，如：岩藻糖(1.2-5.0当量)的含义即为：岩藻糖与式(I)所示的二糖的物质的量的比为1.2-5.0。
上述具体实施方案中，反应完成后采用薄层色谱法(TLC)跟踪反应进程，式(I)-(VIII)和式(XV)-(XX)展开剂为EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝8:3:1:0.2和式(IX)-(XIV)的合成展开剂为EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2。
上述多糖合成所采用的酶法模块化组装策略中，反应温度为0-37℃，转速为0-240r/min；所述酶反应的停止方法是向反应体系中加入与反应液等体积的4℃无水乙醇并在4℃下孵育0-50分钟。
本发明所采用的酶法模块均含有糖激酶、糖核苷生成酶和糖基转移酶三类酶，它们发挥着高效的催化作用，且相互协同，构成一个有机的酶反应体系。在试验过程中对上述所用的酶进行了多次的优化和筛选，结果发现：以NahK/GlmU，Bifidobacterium longum N-acetylhexosamine-1-kinase(NahK)和E.coli N-acetylglucosamine uridyltransferase(GlmU),以及Helicobacter mustelaeα1,3N-galactosyltransferase(BgtA)；E.coligalactokinase(GalK),Bifidobacterium longum UDP-sugar pyrophosphorylase(BLUSP)和Neisseria meningitidesβ1,4galactosyltransferase(NmLgtB),Bifidobacteriuminfantisβ1,3-galactosyltransferase(BiGalHexNAcp),Humanα1,3galactosyltransferase(GTB)；Bacteroides fragilis bifunctional L-fucokinase/GDP-fucose pyrophosphorylase(FKP)和Helicobacler muslelaeαl,2fucosyltransferase(Hmα1,2FucT)作为本发明所采用的酶，其催化效果最佳，合成效率高，纯化简便，而且上述酶可在常规的大肠杆菌表达系统中大量表达纯化。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明所利用的糖基转移酶、糖核苷生成酶以及糖激酶均为原核生物来源，具有蛋白表达量高、底物适应性广泛、催化效率高等优点，因而以其为基础的酶法模块化组装效率高，且适于大量制备；利用糖核苷酸生成酶可以从价廉、易得的单糖出发高效的转化为昂贵的核苷活化的糖基供体，大大降低了生产成本；相对于步骤繁琐、产率较低的化学合成法，酶法合成在空间和立体化学特异性方面具有明显的优势，大大简化了反应步骤，提高反应的总体收率。
(2)本发明不仅避免了目前化学合成策略存在的糖苷化反应选择性低、合成路线冗长、工作量大导致总体收率低，酶法合成缺乏相关糖苷键的酶等弊端，而且本发明所利用的糖基转移酶、糖核苷生成酶以及糖激酶均为原核生物来源，具有蛋白表达量高、底物适应性广泛、催化效率高等优点。为相关糖结构和生物学功能研究所需的糖链及其缀合物样品的获得提供了可行性极高的途径，还可在分子水平上深入研究这些糖链与受体的相互作用机制及构效关系，为相关疾病病理学机制的阐明和未来的诊断治疗奠定了基础。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本发明的不当限定。
图1：酶法组装模块A；
图2：酶法组装模块B；
图3：酶法组装模块C；
图4：酸解岩藻糖模块D；
图5：GlcNAcβProN3结构式；
图6：GalNAcαProN3结构式；
图7：GalNAcβProN3结构式；
图8：酶法合成β-构型的化合物1的反应方程式；
图9：酶法合成β-构型的化合物2的反应方程式；
图10：酶法合成α-构型的化合物3a的反应方程式；
图11：酶法合成β-构型的化合物3b的反应方程式；
图12：化学法法合成β-构型的化合物4的反应方程式；
图13：酶法模块化合成三糖化合物5-8的反应方程式；
图14：酶法模块化合成四糖化合物9-12的反应方程式。
图15：酶法模块化合成四糖化合物13-14的反应方程式。
图16：酸解岩藻糖模块合成三糖化合物15-20的反应方程式。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提出了一种GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键寡糖的合成方法。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1：含GalNAcα1,3Gal或Galα1,3Gal糖苷键寡糖的合成
步骤如下：
(1)酶法合成二糖化合物1[Galβl,3GlcNAcβProN3]
本发明的化合物1[Galβl,3GlcNAcβProN3]的合成方法如下：
向50mL离心管中加入受体GlcNAcβProN3(0.10g,0.33mmol)、半乳糖(0.09g,0.50mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,0.27g,0.50mmol)、Tris-HCl(100mmol,pH 7.5)和氯化镁(20mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH将pH调至7.0左右，之后加入酶GalK(2.00mg)，BiGalHexNAcP(1.50mg)，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应11h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min，将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过硅胶柱快速分离和Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得糖浆状固体化合物4(0.13g,收率85％)。化合物1的合成路线如图8所示。
(2)酶法合成二糖化合物2[Galβl,4GlcNAcβProN3]
本发明的化合物2[Galβl,4GlcNAcβProN3]的合成方法如下：向50mL离心管中加入受体GlcNAcβProN3(0.10g,0.33mmol)、半乳糖(0.09g,1.5eq)、腺嘌核苷三磷酸(ATP,0.27g,0.50mmol)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP,0.24g,0.50mmol)、Tris-HCl(100mmol,pH 7.5)和氯化镁(20mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH将pH调至7.5左右，之后加入酶GalK(3.00mg)，BLUSP(1.50mg)，NmLgtB(2.00mg)，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应12h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过硅胶柱快速住分离和Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得糖浆状固体化合物5(0.13g,收率85％)。化合物2的合成路线如图9所示。
(3)酶法合成二糖化合物3a[Galβl,3GalNAcαProN3]
本发明的化合物3a[Galβl,3GalNAcαroN3]的合成方法如下：
向50mL离心管中加入受体GalNAcαProN3(0.10g,0.33mmol)、半乳糖(0.90g,0.50mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,0.27g,0.50mmol)、Tris-HCl(100mmol,pH 7.5)和氯化镁(20mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH将pH调至7.0左右，之后加入酶GalK(2.00mg),BiGalHexNAcP(1.50mg)，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应11h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过硅胶柱快速住分离和Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得糖浆状固体化合物6(0.13g,收率85％)。化合物3a的合成路线如图10所示。
(4)酶法合成二糖化合物3b[Galβl,3GalNAcβProN3]
本发明的化合物3b[Galβl,3GalNAcβroN3]的合成方法如下：
向50mL离心管中加入受体GalNAcβProN3(0.10g,0.33mmol)、半乳糖(0.09g,0.50mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,0.27g,0.50mmol)、Tris-HCl(100mmol,pH 7.5)和氯化镁(20mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH将pH调至7.0左右，之后加入酶GalK(2.00mg)，BiGalHexNAcP(1.50mg)，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应11h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过硅胶柱快速住分离和Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得糖浆状固体化合物7(0.13g,收率85％)。化合物3b的合成路线如图11所示。
(5)化学法合成二糖化合物4[Galβ1,4GlcβProN3]
向500mL圆底烧瓶中加入乳糖(10g,29.23mmol)、醋酐(55mL)和醋酸钠(9.6g)，在120℃反应条件下回流搅拌6小时。薄层色谱(PE:EA＝1:1)检测反应完全后，旋蒸浓缩。所得固体复溶于250mL二氯甲烷中，用半饱和食盐水萃取两次，饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，双蒸水溶液萃取三次，之后分离有机相，再用无水硫酸钠干燥有机相，旋蒸浓缩，获得全乙酰化乳糖(18.70g,94％)。
向容积为10mL的微波专用反应管中加入全乙酰化乳糖(1.0g,1.47mmol)、二氯甲烷(5.0mL)、三氟化硼乙醚(0.36mL)和3-氯-1-丙醇(0.25mL)，磁力搅拌，预搅拌2分钟，反应温度为50℃，反应时间为15分钟。按照相同的反应条件，平行开5组。收集反应液，用三乙胺淬灭反应后，旋蒸浓缩，快速硅胶柱分离纯化，获得PerAcLactoseβProCl(2.75g,53％)。
向250mL圆底烧瓶中加入化合物PerAcLactoseβProCl(2.40g,3.37mmol)、N,N-二甲基甲酰胺(40mL)、叠氮钠(1.2g)和四丁基碘化铵(0.12g)，110℃搅拌回流12小时。薄层色谱(PE:EA＝1:1)检测反应完全后，使用硅藻土过滤,再旋蒸浓缩，快速硅胶柱分离纯化，获得PerAcLactoseβProN3(1.93g,90％)。
向50mL圆底烧瓶中加入化合物PerAcLactoseβProN3(1.50g,2.36mmol)、甲醇(10mL)、甲醇钠，直至溶液体系pH值到9-10左右，室温搅拌4小时，薄层色谱检测(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2)反应完全后，用酸性阳离子交换树脂将反应液的pH值调节到中性，旋蒸浓缩，快速硅胶柱分离纯化，得到白色固体化合物4(0.90g,90％)。化合物4的合成路线如图12所示。
(6)酶法模块组装A合成三糖化合物5[Galβ1,3(Fucα1,2)GlcNAcβProN3]
向50mL离心管中加入化合物1(0.16g,0.34mmol)、岩藻糖(0.09g,0.52mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,0.28g,0.52mmol)、鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP,0.31g,0.52mmol)以及Tris-HCl(100mmol,pH 7.5)和氯化锰(10mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH将pH调至7.5，之后加入酶FKP(2.00mg)和Hmα1,2FucT(2.00mg)，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应4h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝8:3:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物5(0.17g,80％)。化合物5的合成路线如图12所示。
(7)酶法模块组装A合成三糖化合物6[Galβ1,4(Fucα1,2)GlcNAcβProN3]
向50mL离心管中加入化合物2(0.10g,0.22mmol)、岩藻糖(0.05g,0.32mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,0.18g,0.32mmol)、鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP,0.19g,0.32mmol)以及Tris-HCl(100mmol,pH 7.5)和氯化锰(10mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH将pH调至7.5，之后加入酶FKP(2.00mg)和Hmα1,2FucT(3.00mg)，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应36h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝8:3:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物6(0.10g,72％)。化合物6的合成路线如图13所示。
(8)酶法模块组装A合成三糖化合物7a[Galβ1,3(Fucα1,2)GalNAcαProN3]
向50mL离心管中加入化合物3a(0.20g,0.43mmol)、岩藻糖(0.10g,0.64mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,0.36g,0.64mmol)、鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP,0.39g,0.64mmol)，Tris-HCl(100mmol,pH 7.5)和氯化锰(10mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/LHCl或1mol/L NaOH将pH调至7.5，之后加入酶FKP(2.00mg)和Hmα1,2FucT(2.00mg)，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应4h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝8:3:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物3a(0.28g,95％)。化合物7a的合成路线如图13所示。
(9)酶法模块组装A合成三糖化合物7b[Galβ1,3(Fucα1,2)GalNAcβProN3]
向50mL离心管中加入化合物3b(0.20g,0.43mmol)、岩藻糖(0.11g,0.64mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,0.36g,0.64mmol)、鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP,0.39g,0.64mmol)，Tris-HCl(100mmol,pH 7.5)和氯化锰(10mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/LHCl或1mol/L NaOH将pH调至7.5，之后加入酶FKP(2.00mg)和Hmα1,2FucT(2.00mg)，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应4h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝8:3:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物7b(0.23g,89％)。化合物7b的合成路线如图13所示。
(10)酶法模块组装A合成三糖化合物8[Galβ1,4(Fucα1,2)GlcβProN3]
向50mL离心管中加入化合物4(0.10g,0.24mmol)、岩藻糖(0.05g,0.32mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,0.18g,0.32mmol)、鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP,0.19g,0.32mmol)，Tris-HCl(100mmol,pH 7.5)和氯化锰(10mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/LHCl或1mol/L NaOH将pH调至7.5，之后加入酶FKP(2.00mg)和Hmα1,2FucT(3.00mg)，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应36h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝8:3:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物8(0.07g,49％)。化合物8的合成路线如图13所示。
(11)酶法模块组装B合成四糖化合物9
[GalNAcα1,3Galβ1,3(Fucα1,2)GlcNAcβProN3]
向50mL离心管中加入化合物5(0.07g,0.12mmol)、N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc,0.03g,0.14mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,0.08g,0.14mmol)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP,0.07g,0.14mmol)，Tris-HCl(100mmol,pH 8.0)和氯化镁(20mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH将pH调至8.0，之后加入酶NahK/GlmU(1.50mg)和BgtA(1.00mg),，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应12h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物9(0.09g,95％)。化合物9的合成路线如图14所示。
(12)酶法模块组装B合成四糖化合物10
[GalNAcα1,4Galβ1,4(Fucα1,2)GlcNAcβProN3]
向50mL离心管中加入化合物6(0.03g,0.04mmol)、N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc,0.014g,0.06mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,0.034g,0.06mmol)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP,0.03g,0.06mmol)，Tris-HCl(100mmol,pH 8.0)和氯化镁(20mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH将pH调至8.0，之后加入酶NahK/GlmU(1.50mg)和BgtA(1.00mg)，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应12h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物10(0.04g,95％)。化合物10的合成路线如图14所示。
(13)酶法模块组装B合成四糖化合物11a
[GalNAcα1,3Galβ1,3(Fucα1,2)GalNAcαProN3]
向50mL离心管中加入化合物7a(0.10g,0.16mmol)、N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc,0.05g,0.24mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,0.13g,0.24mmol)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP,0.12g,0.24mmol)，Tris-HCl(100mmol,pH 8.0)和氯化镁(20mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH将pH调至8.0，之后加入酶NahK/GlmU(1.50mg)和BgtA(1.00mg),，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应12h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物11a(0.12g,90％)。化合物11a的合成路线如图14所示。
(14)酶法模块组装B合成四糖化合物
11b[GalNAcα1,3Galβ1,3(Fucα1,2)GalNAcαProN3]
向50mL离心管中加入化合物7b(0.08g,0.12mmol)、N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc,0.04g,0.18mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,0.10g,0.18mmol)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP,0.09g,0.18mmol)，Tris-HCl(100mmol,pH 8.0)和氯化镁(20mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH将pH调至8.0，之后加入酶NahK/GlmU(1.50mg)和BgtA(1.00mg)，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应12h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物11b(0.09g,94％)。化合物11b的合成路线如图14所示。
(15)酶法模块组装B合成四糖化合物12
[GalNAcα1,3Galβ1,4(Fucα1,2)GlcβProN3]
向50mL离心管中加入化合物8(0.02g,0.03mmol)、N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc,0.01g,0.05mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,0.03g,0.05mmol)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP,0.024g,0.049mmol)，Tris-HCl(100mmol,pH 8.0)和氯化镁(20mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH将pH调至8.0，之后加入酶NahK/GlmU(1.50mg)和BgtA(1.00mg),，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应12h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物12(0.09g,94％)。化合物12的合成路线如图14所示。
(16)酶法模块组装模块C合成四糖化合物13
[Galα1,3Galβ1,4(Fucα1,2)GlcNAcβProN3]
向50mL离心管中加入化合物6(0.04g,0.06mmol)、半乳糖(Gal,12.0mg,0.07mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,38.0mg,0.07mmol)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP,33.0mg,0.07mmol)，Tris-HCl(100mmol,pH 7.5)和氯化镁(20mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH将pH调至7.5，之后加入酶EcGalK(2.00mg),BLUSP(1.50mg)和GTB(2.00mg)，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应36h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝8:3:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物13(48.0mg,95％)。化合物13的合成路线如图15所示。
(17)酶法模块组装模块C合成四糖化合物14a
[Galα1,3Galβ1,3(Fucα1,2)GalNAcαProN3]
向50mL离心管中加入化合物7a(48.0mg,0.08mmol)、半乳糖(Gal,12.0mg,0.09mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,48.0mg,0.09mmol)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP,42.0mg,0.09mmol)，Tris-HCl(100mmol,pH 7.5)和氯化镁(20mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH将pH调至7.5，之后加入酶GalK(2.00mg),BLUSP(1.50mg)和GTB(2.00mg)，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应36h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝8:3:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物14a(30.0mg,60％)。化合物14a的合成路线如图15所示。
(18)酶法模块组装模块C合成四糖化合物14b
[Galα1,3Galβ1,3(Fucα1,2)GalNAcβProN3]
向50mL离心管中加入化合物7b(20.0mg,0.03mmol)、半乳糖(Gal,6.50mg,0.035mmol)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP,20.0mg,0.035mmol)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP,17.0mg,0.035mmol)，Tris-HCl(100mmol,pH 7.5)和氯化镁(20mmol)，溶于少许三蒸水，震荡至完全溶解，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH将pH调至7.5，之后加入酶GalK(2.00mg),BLUSP(1.50mg)和GTB(2.00mg)，最后用三蒸水将反应液总体积补至10mL，在37℃，100r/min条件下反应36h，反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝8:3:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入等体积冰乙醇终止反应，4℃条件下沉降蛋白30min。将反应液于4℃，12000r/min条件下离心30min，收集上清液浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物14b(25.0mg,98％)。化合物14b的合成路线如图15所示。
(19)酸解岩藻糖模块D合成三糖化合物15
[GalNAcα1,3Galβ1,3GlcNAcβProN3]
向10mL微波反应瓶中加入化合物9(80mg,0.098mmol)加入5mL 0.05M的盐酸水溶液溶解，110℃反应15min；或向10mL聚四氟乙烯反应瓶中加入化合物9(80mg,0.098mmol)加入5mL 48％氟化氢水溶液溶解，室温下反应2h,反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入NaOH调pH为7.0终止反应后浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物15(45mg,68％)。1H NMR(600MHz,D2O)δ5.06(d,J＝4.8Hz,1H),4.55(d,J＝8.5Hz,1H),4.48(d,J＝7.8Hz,1H),4.22–4.16(m,2H),4.08(t,J＝4.2Hz,1H),4.02–3.94(m,3H),3.92(dd,J＝12.4,1.9Hz,1H),3.85–3.81(m,1H),3.79–3.70(m,5H),3.69–3.58(m,4H),3.56–3.51(m,2H),3.50–3.46(m,1H),3.39–3.34(m,2H),2.04–2.00(d,J＝4.8Hz,6H),1.86–1.80(m,2H).13C NMR(150MHz,D2O)δ174.52,103.34,100.77,93.83,83.10,76.70,75.20,75.10,70.80,69.25,68.73,68.31,67.46,67.09,64.52,60.96,60.90,60.61,59.23,54.29,49.55,28.01,22.16,21.91.化合物15的合成路线如图16所示。
(20)酸解岩藻糖模块D合成三糖化合物16
[GalNAcα1,3Galβ1,4GlcNAcβProN3]
向10mL微波反应瓶中加入化合物10(80mg,0.098mmol)加入5mL 0.05M的盐酸水溶液溶解，110℃反应15min；或向10mL聚四氟乙烯反应瓶中加入化合物10(80mg,0.098mmol)加入5mL 48％氟化氢水溶液溶解，室温下反应2h,反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入NaOH调pH为7.0终止反应后浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物16(48mg,73％)。1H NMR(600MHz,D2O)δ5.07(d,J＝3.7Hz,1H),4.52(d,J＝7.8Hz,2H),4.24–4.15(m,2H),4.10(d,J＝3.1Hz,1H),4.03–3.93(m,4H),3.83–3.56(m,13H),3.39–3.34(m,2H),2.03(d,J＝4.0Hz,6H),1.86–1.80(m,2H).13C NMR(150MHz,D2O)δ174.51,101.00,93.87,78.53,76.59,75.14,74.61,72.33,70.78,69.54,68.24,67.47,67.03,60.83,54.99,49.53,47.66,27.99,22.05,21.87.化合物16的合成路线如图16所示。
(21)酸解岩藻糖模块D合成三糖化合物17a
[GalNAcα1,3Galβ1,3GalNAcαProN3]
向10mL微波反应瓶中加入化合物11a(80mg,0.098mmol)加入5mL 0.05M的盐酸水溶液溶解，110℃反应15min；或向10mL聚四氟乙烯反应瓶中加入化合物11a(80mg,0.098mmol)加入5mL 48％氟化氢水溶液溶解，室温下反应2h,反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入NaOH调pH为7.0终止反应后浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物17a(50mg,76％)。1H NMR(600MHz,D2O)δ5.07(d,J＝3.7Hz,1H),4.90(d,J＝3.7Hz,1H),4.51(d,J＝7.8Hz,1H),4.34(dd,J＝11.1,3.7Hz,1H),4.27(d,J＝2.6Hz,1H),4.25–4.17(m,2H),4.09(d,J＝3.1Hz,1H),4.01(ddd,J＝16.8,10.0,4.3Hz,4H),3.84–3.78(m,2H),3.78–3.69(m,6H),3.62(dd,J＝10.9,6.5Hz,2H),3.58–3.52(m,1H),3.52–3.42(m,2H),2.05–2.01(m,6H),1.94–1.88(m,2H).13C NMR(150MHz,D2O)δ174.50,104.59,97.12,93.78,77.77,76.67,74.75,70.69,70.47,69.09,68.61,68.25,67.45,64.80,64.63,61.08,60.90,60.84,49.54,48.43,48.07,27.86,21.89,21.87.化合物17a的合成路线如图16所示。
(22)酸解岩藻糖模块D合成三糖化合物17b
[GalNAcα1,3Galβ1,3GalNAcβProN3]
向10mL微波反应瓶中加入化合物11b(80mg,0.098mmol)加入5mL 0.05M的盐酸水溶液溶解，110℃反应15min；或向10mL聚四氟乙烯反应瓶中加入化合物11b(80mg,0.098mmol)加入5mL 48％氟化氢水溶液溶解,反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入NaOH调pH为7.0终止反应后浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物17b(45mg,68％)。1HNMR(600MHz,D2O)δ5.14(d,J＝3.7Hz,1H),4.65(t,J＝7.2Hz,1H),4.30(d,J＝7.6Hz,1H),4.29(t,J＝8.3Hz,1H),4.25(dd,J＝11.5,5.2Hz,2H),4.22–4.17(m,2H),3.97–3.93(m,2H),3.92–3.88(m,3H),3.87–3.83(m,1H),3.80–3.67(m,9H),3.37–3.27(m,2H),2.02(d,J＝12.8Hz,6H),1.84–1.75(m,2H).13C NMR(150MHz,D2O)δ174.31,104.25,97.12,93.48,78.87,76.67,74.25,70.39,70.47,69.49,68.61,68.25,67.45,64.80,64.45,61.08,60.40,60.84,49.54,48.42,48.07,27.66,21.64,21.27.化合物17b的合成路线如图16所示。
(23)酸解岩藻糖模块D合成三糖化合物18[GalNAcα1,3Galβ1,3GlcβProN3]
向10mL微波反应瓶中加入化合物12(80mg,0.098mmol)加入5mL 0.05M的盐酸水溶液溶解，110℃反应15min；或向10mL聚四氟乙烯反应瓶中加入化合物12(80mg,0.098mmol)加入5mL 48％氟化氢水溶液溶解,反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入NaOH调pH为7.0终止反应后浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物18(37mg,57％)。1H NMR(600MHz,D2O)δ5.07(d,J＝3.7Hz,1H),4.51(t,J＝10.4Hz,2H),4.25–4.15(m,2H),4.10(d,J＝3.1Hz,1H),4.03–3.94(m,4H),3.75(qdd,J＝10.3,9.5,4.1Hz,8H),3.69–3.56(m,4H),3.40–3.33(m,2H),2.03(s,3H),1.88–1.75(m,2H).13C NMR(150MHz,D2O)δ102.24,100.04,98.65,92.90,75.85,75.26,74.79,74.26,72.40,71.58,71.02,69.88,69.38,67.95,67.56,63.36,61.16,61.02,60.06,47.75,28.12.化合物18的合成路线如图16所示。
(24)酸解岩藻糖模块D合成三糖化合物19[Galα1,3Galβ1,4GlcNAcβProN3]
向10mL微波反应瓶中加入化合物13(80mg,0.098mmol)加入5mL 0.05M的盐酸水溶液溶解，110℃反应15min；或向10mL聚四氟乙烯反应瓶中加入化合物13(80mg,0.098mmol)加入5mL 48％氟化氢水溶液溶解,反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入NaOH调pH为7.0终止反应后浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物19(47mg,72％)。1H NMR(600MHz,D2O)δ5.13(d,J＝3.9Hz,1H),4.56–4.49(m,2H),4.18(dd,J＝9.6,4.3Hz,2H),4.02–3.99(m,1H),3.95(ddd,J＝13.5,9.6,3.0Hz,2H),3.83(ddd,J＝15.2,10.1,3.3Hz,2H),3.80–3.69(m,8H),3.69–3.63(m,2H),3.36(tq,J＝11.3,5.8Hz,2H),2.07(s,3H),1.88–1.77(m,2H).13C NMR(150MHz,D2O)δ174.41,102.70,101.03,95.33,78.60,77.08,74.95,74.62,72.35,70.74,69.51,69.19,69.03,68.10,67.07,64.71,54.98,47.69,28.02,22.08.化合物19的合成路线如图16所示。
(25)酸解岩藻糖模块D合成三糖化合物20a[Galα1,3Galβ1,3GalNAcαProN3]
向10mL微波反应瓶中加入化合物14a(80mg,0.098mmol)加入5mL 0.05M的盐酸水溶液溶解，110℃反应15min；或向10mL聚四氟乙烯反应瓶中加入化合物14a(80mg,0.098mmol)加入5mL 48％氟化氢水溶液溶解,反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入NaOH调pH为7.0终止反应后浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物20a(38mg,59％)。1HNMR(600MHz,D2O)δ5.22(d,J＝3.7Hz,1H),4.83(d,J＝5.8Hz,1H),4.68(d,J＝7.6Hz,1H),4.25(td,J＝12.9,6.3Hz,2H),4.19(s,1H),4.12(d,J＝9.7Hz,2H),4.00(t,J＝6.1Hz,1H),3.97–3.91(m,2H),3.91–3.82(m,3H),3.80–3.69(m,5H),3.63(dt,J＝10.1,5.9Hz,2H),3.54(dd,J＝10.1,3.2Hz,1H),3.44(m,3H),2.04(s,3H),1.89–1.79(m,2H).13C NMR(150MHz,D2O)δ174.32,102.64,100.23,94.73,78.65,77.08,74.95,74.72,72.75,70.74,68.91,69.39,69.03,68.18,67.47,64.71,54.98,47.89,28.02,21.78.化合物20a的合成路线如图16所示。
(26)酸解岩藻糖模块D合成三糖化合物20b[Galα1,3Galβ1,3GalNAcβProN3]
向10mL微波反应瓶中加入化合物14b(80mg,0.098mmol)加入5mL 0.05M的盐酸水溶液溶解，110℃反应15min；或向10mL聚四氟乙烯反应瓶中加入化合物14b(80mg,0.098mmol)加入5mL 48％氟化氢水溶液溶解,反应进程用薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2,v/v)检测，茴香醛染色液显色。反应完成后，加入NaOH调pH为7.0终止反应后浓缩蒸干。通过Bio-gel P2凝胶分子排阻色谱进行分离纯化，获得化合物20b(45mg,69％)。1HNMR(600MHz,D2O)δ5.17(d,J＝4.0Hz,1H),4.55(d,J＝7.7Hz,1H),4.26(d,J＝7.5Hz,1H),4.16(q,J＝6.5Hz,1H),4.04(d,J＝1.7Hz,1H),3.96–3.85(m,2H),3.82(d,J＝3.3Hz,1H),3.80–3.63(m,9H),3.62–3.52(m,6H),3.34–3.22(m,2H),2.05–1.89(s,3H),1.76(td,J＝12.1,6.0Hz,2H).13C NMR(150MHz,D2O)δ174.02,102.57,100.14,95.71,78.61,78.18,75.12,74.42,72.15,70.52,68.80,69.32,69.13,68.14,67.57,64.81,54.92,47.78,28.32,21.19.化合物20b的合成路线如图16所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种末端GalNAcα1,3Gal糖苷键的寡糖的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括糖链核心骨架末端Gal进行α1,2岩藻糖基化合成、糖链核心骨架末端GalNAcα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键的合成以及通过酸解岩藻糖的步骤；
所述糖链核心骨架末端Gal进行α1,2岩藻糖基化合成的方法，包括将岩藻糖以α1,2糖苷键平行偶联到式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)所示的多糖非还原末端二糖，合成式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)所示的多糖非还原末端三糖的步骤；
Figure FDA0003323184960000011
所述α1,2岩藻糖基化合成方法通过酶组合物A进行合成，所述酶组合物A包含的酶有岩藻糖激酶Bacteroides fragilis bifunctional L-fucokinase/GDP-fucosepyrophosphorylase、糖核苷生成酶Bifidobacterium longum UDP-sugarpyrophosphorylase、α1,2岩藻糖糖基转移酶Helicobacler muslelaeαl,2fucosyltransferase，用于合成Fucα1,2Gal糖苷键；
所述糖链核心骨架末端GalNAcα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键的合成，方法包括将N-乙酰氨基半乳糖分别以以α1,3糖苷键平行偶联到式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)所示的多糖非还原末端三糖上，平行合成式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)所示的多糖非还原末端四糖的步骤；
Figure FDA0003323184960000012
所述糖链核心骨架末端GalNAcα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键的合成，所述合成方法为：通过酶组合物B进行合成，所述酶组合物B包含的酶有N-乙酰氨基己糖激酶Bifidobacteriumlongum N-acetylhexosamine-1-kinase与糖核苷生成酶E.coli N-acetylglucosamineuridyltransferase的融合酶NahK/GlmU、α1,3N-乙酰氨基半乳糖糖基转移酶Helicobactermustelaeα1,3N-galactosyltransferase，用于合成GalNAcα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键。
2.根据权利要求1所述的末端GalNAcα1,3Gal糖苷键的寡糖的合成方法，其特征在于，所述酸解岩藻糖包括利用微波反应器在盐酸水溶液中将式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)所示的多糖非还原末端四糖的岩藻糖水解平行合成多糖非还原末端三糖的步骤，所述微波法酸解岩藻糖所用条件温度为105～115℃，盐酸水溶液浓度为0.04～0.06M，反应时间为1～2h。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述酸解岩藻糖包括在氢氟酸水溶液中将式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)所示的多糖非还原末端四糖的岩藻糖水解平行合成多糖非还原末端三糖的步骤；所述氢氟酸溶液酸解岩藻糖所用条件温度为10～30℃，氢氟酸水溶液浓度为12％～48％，反应时间为1～2h。
4.一种末端Galcα1,3Gal糖苷键的寡糖的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括糖链核心骨架末端Gal进行α1,2岩藻糖基化合成、糖链核心骨架末端Galα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键的合成以及通过酸解岩藻糖的步骤；
所述糖链核心骨架末端Gal进行α1,2岩藻糖基化合成的方法，包括将岩藻糖以α1,2糖苷键平行偶联到式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)所示的多糖非还原末端二糖，合成式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)所示的多糖非还原末端三糖的步骤；
Figure FDA0003323184960000021
所述α1,2岩藻糖基化合成方法通过酶组合物A进行合成，所述酶组合物A包含的酶有岩藻糖激酶Bacteroides fragilis bifunctional L-fucokinase/GDP-fucosepyrophosphorylase、糖核苷生成酶Bifidobacterium longum UDP-sugarpyrophosphorylase、α1,2岩藻糖糖基转移酶Helicobacler muslelaeαl,2fucosyltransferase，用于合成Fucα1,2Gal糖苷键；
所述合成方法包括将半乳糖分别以α1,3糖苷键平行偶联到式(VI)、式(VII)所示的多糖非还原末端三糖上，平行合成式(XIII)、式(XIV)所示的多糖非还原末端四糖的步骤；
Figure FDA0003323184960000031
所述糖链核心骨架末端Galα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键的合成方法通过酶组合物C进行合成，所述酶组合物C包含的酶有半乳糖激酶E.coli galactokinase、糖核苷生成酶Bifidobacterium longum UDP-sugar pyrophosphorylase、α1,3半乳糖糖基转移酶Humanα1,3galactosyltransferase，用于合成Galα1,3(Fucα1,2)Gal糖苷键。
5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述酸解岩藻糖包括利用微波反应器在盐酸水溶液中将式(XIII)、式(XIV)所示的多糖非还原末端四糖的岩藻糖水解平行合成多糖非还原末端三糖的步骤，所述微波法酸解岩藻糖所用条件温度为105～115℃，盐酸水溶液浓度为0.04～0.06M，反应时间为1～2h。
6.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述酸解岩藻糖包括在氢氟酸水溶液中将式(XIII)、式(XIV)所示的多糖非还原末端四糖的岩藻糖水解平行合成多糖非还原末端三糖的步骤；所述氢氟酸溶液酸解岩藻糖所用条件温度为10～30℃，氢氟酸水溶液浓度为12％～48％，反应时间为1～2h。
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