CN105886571B - 人血型抗原p1五糖的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人血型抗原P1五糖的合成方法，包括：利用“一锅多酶”体系将半乳糖以β1‑4糖苷键偶联到式(III)所示的三糖上，合成式(IV)所示的四糖的步骤；以及利用“一锅多酶”体系将半乳糖以α1‑4糖苷键偶联到式(IV)所示的四糖上，合成式(I)所示的五糖的步骤；式(I)、式(III)和式(IV)中，R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α‑或β‑构型取代烷基、α‑或β‑构型丝氨酸残基、α‑或β‑构型苏氨酸残基。本发明将酶法合成所具有的高区域选择性和高效性结合到一起，并首次合成了P1抗原五糖，本发明所利用的糖基转移酶、糖核苷生成酶以及糖激酶均为原核生物来源，具有蛋白表达量高、底物适应性广泛、催化效率高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及糖类物质的合成方法，尤其涉及一种人血型抗原P1五糖的合成方法。
背景技术
目前已经发现并被国际输血协会承认的血型系统有30种，常见的血型系统有ABO型血型系统和Rh型血型系统。1927年，Landsteiner和Levine发现了P血型系统(P BloodGroup System)，随后Morgan和Watkins等的研究揭示其抗原决定簇为三糖结构Galα(l-4)Galβ(l-4)GlcNAc(如图1所示)。1974年，Naiki和Marcus等科学家研究发现P，PK(如图2所示)和P1抗原以糖脂形式存在于人血红细胞以及其他细胞，并解析出P1抗原的完整结构为五糖Galα(l-4)Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)Glc(如图3所示)。P1抗原除了与其他人血型糖抗原一样会导致血管内溶血性输血反应外，其还与习惯性流产有关。此外，最近的研究表明P1抗原过度表达与卵巢癌细胞表面并与肿瘤的转移相关。大量研究表明P、PK和P1抗原可以作为微生物和生物毒素的受体，进而与细菌和病毒等的感染密切相关。
肠致病性大肠杆菌E.coli O157：H7是最常见的产志贺毒素大肠杆菌。志贺毒素通过与细胞表面的寡糖受体结合，从而黏附于细胞表面，引起腹泻、出血性结肠炎甚至是危及生命的溶血性尿毒综合征。目前针对产志贺毒素大肠杆菌感染没有有效的疗法，常规的抗生素治疗已经表明会增强志贺毒素的产生，增加病人患溶血性尿毒综合征的风险。因而以志贺毒素的受体糖链作为抗菌剂来中和毒素成为目前研究的热点，同时高活性的受体糖链也有望作为先导分子用以发展高灵敏性的诊断试剂用以志贺毒素产生菌感染的早期发现。在志贺毒素与不同寡糖受体的结合实验中发现P1抗原五糖[Galα(l-4)Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)Glc]是包括Pk、Pk三糖类似物，以及P1抗原三糖表位(Galα(l-4)Galβ(l-4)GlcNAc)等一系列分子中结合能力最强的受体。
因此，P1抗原五糖可作为志贺毒素产生菌的理想毒素中和剂，阻止其与人体细胞表面受体的结合，发挥抗细菌感染的作用，同时其也有望用以发展更为灵敏的志贺毒素产生菌感染的早期诊断试剂。
鉴于上述情况，大量合成P1抗原五糖，发展以其为先导化合物抗产志贺毒素大肠杆菌侵袭人体的新型药物及发展新型早期诊断试剂具有重大意义。目前，已有文献报道用化学法和酶法对P1抗原三糖的合成进行研究。但是，对拮抗作用更强的P1抗原五糖的合成至今并未见报道。
由于生物体内环境十分复杂，就目前的研究水平而言，以提取的方式从生物体内获得大量结构单一的P1抗原五糖的难度非常大。对于化学合成而言，由于P1抗原五糖本身固有的活性相似的多羟基结构，在合成过程中需要繁琐的保护以及脱保护步骤来保证区域、立体选择性，导致其反应步骤多、总体收率低。
以一锅多酶体系为经典方法合成复杂寡糖可以克服化学合成法的不足，但就目前酶的来源和实际应用的角度来说，合成寡糖链所应用的酶主要分为两类：一种是糖苷酶，其催化合成的效率较低，底物适应性较宽；第二种是糖基转移酶，该类酶具有很高的催化效率及严格的底物选择性。糖苷酶因其来源丰富、性能稳定、反应简单、底物适应性强等优点目前在工业上己被采用，但此类酶催化的寡糖合成收率欠佳。此外，由于糖苷酶催化的转糖基反应的区域选择性不高，而且合成反应中还存在水解反应的竞争，导致产物不均－，难于分离纯化，限制了其广泛应用。天然糖基转移酶的使用也存在着很多的限制因素：酶的来源有限；酶的不稳定性、复杂性导致分离纯化困难；酶催化的糖苷化反应需要价格昂贵的核苷活化糖作糖基给体；酶具有严格的底物特异性，对非天然或异常的底物耐受能力较差。以上缺点极大地限制了糖苷酶和糖基转移酶在一锅多酶体系中合成复杂寡糖中的应用。
因此，寻求一种快速、高效合成P1抗原五糖的方法是目前亟待解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种人血型抗原P1五糖的合成方法，采用“一锅多酶”体系模块化组装合成天然P1抗原五糖，为系统研究P1抗原五糖作为抗产志贺毒素大肠杆菌在药物方面的应用奠定基础。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种人血型抗原P1五糖的合成方法，包括：利用“一锅多酶”体系将半乳糖以β1-4糖苷键偶联到式(III)所示的三糖上，合成式(IV)所示的四糖的步骤；以及利用“一锅多酶”体系将半乳糖以α1-4糖苷键偶联到式(IV)所示的四糖上，合成式(I)所示的五糖的步骤；
式(I)、式(III)和式(IV)中，R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基。
上述合成方法中，利用“一锅多酶”体系合成式(IV)所示的四糖的步骤中，先后用到的酶分别为：半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)以及β1-4半乳糖转移酶(NmLgtB)。
上述合成方法中，利用“一锅多酶”体系合成式(I)所示的五糖的步骤中，先后用到的酶分别为：半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)以及α1-4半乳糖转移酶(NmLgtC)。
上述合成方法中，式(III)所示的三糖是利用“一锅多酶”体系将N-乙酰氨基葡萄糖以β1-3糖苷键偶联到式(II)所示的乳糖苷上制备得到；所述“一锅多酶”体系先后用到的酶分别为：N-乙酰氨基葡萄糖激酶(NahK)、糖核苷生成酶(GlmU)以及β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(HpLgtA)。
式(II)中，R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基。
在本发明的一个具体实施方案中，式(II)所示的β-构型的乳糖苷Galβ(l-4)GlcOR1的合成采用以下方法：将乳糖与醋酐进行反应后，将其全部裸露羟基用乙酰基保护；然后利用微波反应仪将全乙酰化的乳糖进行β-构型糖苷化反应，然后依次叠氮化和脱保护后即得；可作为下步酶反应受体的乳糖苷，反应的方程式如图7所示。
在本发明的一个具体实施方案中，式(III)所示的三糖的合成方法为：将式(II)所示的乳糖苷、N-乙酰氨基葡萄糖(1.3-3.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.3-5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.3-5.0当量)、MgCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol、pH 5.0-10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加N-乙酰氨基葡萄糖激酶(NahK)、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖合成酶(GlmU)以及β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(HpLgtA)，反应时间为3-72小时，待反应完成后，纯化即可直接获得式(III)所示的三糖化合物；可作为下步酶反应受体，反应的方程式如图8所示。
在本发明的一个具体实施方案中，式(IV)所示的四糖的合成方法为：将式(III)所示的三糖、半乳糖(1.3-3.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.3-5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.3-5.0当量)、MgCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol、pH 5.0-10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)以及β1-4半乳糖转移酶(NmLgtB)，反应时间为3-72小时，待反应完成后，纯化即可直接获得式(IV)所示四糖化合物；可作为下步酶反应受体，反应的方程式如图9所示。
在本发明的一个具体实施方案中，式(I)所示的五糖的合成方法为：将式(IV)所示的四糖、半乳糖(1.3-3.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.3-5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.3-5.0当量)、MgCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol、pH 5.0-10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)以及α1-4半乳糖转移酶(NmLgtC)，反应时间为3-46小时，待反应完成后，纯化即可直接获得式(I)所示的五糖化合物，反应的方程式如图10所示。
除非另外指出，上文中的“当量”是指物质相互作用时的物质的量的比值，如：N-乙酰氨基葡萄糖(1.3-3.0当量)的含义即为：N-乙酰氨基葡萄糖与式(II)所示的乳糖苷的物质的量的比为1.3-3.0。
上述具体实施方案中，反应完成后采用薄层色谱法(TLC)跟踪反应进程，展开剂为EA:CH3OH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2来检测。
式(I)中的叠氮基团，可以进一步通过“点击化学”反应来链接疏水性功能基团。
合成式(I)、式(III)和式(IV)所示的多糖所采用的“一锅多酶”体系中，反应温度为0-37℃，转速为0-240r/min；所述酶反应的停止方法是向反应中加入与反应液等体积的4℃无水乙醇并在4℃下孵育0-50分钟。
本发明所采用的不同的“一锅多酶”体系中，均含有糖激酶、糖核苷生成酶和糖转移酶三类酶，并且均发挥各自重要的催化作用，而且三类酶协同作用，构成一个有机的酶反应体系，前一种酶的催化效果会直接影响后一种酶的作用效果。本发明在试验过程中对上述三类酶进行了多次的优化和筛选，结果发现：以NahK/GlmU，Bifidobacterium longum N-acetylhexosamine-1-kinase(NahK)和E.coli N-acetylglucosamine uridyltransferase(GlmU)，以及Helicobacter pyloriβ1–3-N-acetylglucosaminyltransferase(HpLgtA)；E.coli galactokinase(EcGalK),Bifidobacterium longum UDP-sugarpyrophosphorylase(BLUSP)和Neisseria meningitidesβ1–4-galactosyltransferase(NmLgtB)和Neisseria meningitidesα1–4-galactosyltransferase(NmLgtC)作为本发明的“一锅多酶”体系所采用的酶，其催化效果最为优异，特别适用于P1抗原五糖的酶催化合成，合成效率高，基本无副产物的生成，方便进行纯化。而且上述酶均为细菌来源，均可在常规的大肠杆菌表达系统中方便的表达纯化。
需要说明的是，虽然哺乳动物中常见的单糖只有9种，但由于糖链的微观不均一性和结构复杂性，且不能从DNA模板预测其生物合成并难以测序，导致糖类合成的研究困难重重，且相对落后。“一锅多酶”体系虽然是一种具有较好应有效果的复杂寡糖的合成方法，但是，针对不同的合成目标，需要有针对性的制定合成策略，并非是简单的在不同酶的催化作用下，将不同单糖的连接在一起。
本发明针对P1抗原五糖的合成设计了“一锅多酶”法的合成策略，首先，对P1抗原五糖中单糖的组成、顺序以及糖苷键构型进行分析，确定合成P1抗原五糖所需要的关键酶；然后对关键酶进行优化筛选，根据酶的催化活性、酶对底物的区域选择性、空间选择性等角度进行考察，分别建立了针对三糖、四糖和五糖合成的不同“一锅多酶”体系，实现了P1抗原五糖的高效、快速合成。
另外，酶的化学本质是蛋白质，其催化活性收到很多因素的影响，如金属离子、底物浓度、反应体系的温度、时间、pH等，本发明针对P1抗原五糖合成过程中所使用的不同的酶设计了最适的反应条件体系，保证了本发明“一锅多酶”体系中酶的高效能发挥。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了一种模块化酶法组装合成P1抗原五糖的合成方法。本发明将酶法合成所具有的高区域选择性和高效性结合到一起，可以实现从简单、价廉的单糖原料从发一步构建相应的糖苷键；通过将酶法模块进行串联使用就可以从简单、价廉的单糖从发高效的实现复杂糖链的合成，避免使用价格昂贵且没有大量商业来源的核苷活化的糖基供体。而且合成所用的酶均来自细菌，可以在大肠杆菌中得以大量重组表达，因而以其为基础的酶法组装策略合成步骤少，效率高，成本低，适于大量制备。并成功的首次合成了P1抗原五糖。现有报道的多糖化合物的化学合成中需要对单糖砌块进行反复的保护基操作，而且化学合成α1-4半乳糖苷键时立体选择性差会同时生成α-和β-混合物，合成步骤繁多，反应效率低，分离纯化困难。之前报道的P1三糖表位的酶法合成是采用重组大肠杆菌进行全细胞催化实现的，该合成后处理过程中除了需要降解反应体系中未反应的蔗糖，还需要将P1三糖从其与乳糖胺二糖和过度半乳糖化的四糖副产物等混合中分离纯化出来，过程繁琐，收率低。
(2)本发明不仅避免了目前化学合成策略存在的糖苷化反应选择性低、合成路线冗长、工作量大导致总体收率低等弊端，而且本发明所利用的糖基转移酶、糖核苷生成酶以及糖激酶均为原核生物来源，具有蛋白表达量高、底物适应性广泛、催化效率高等优点。因而，本发明为在分子水平上研究P1抗原五糖与大肠杆菌志贺毒素特异性结合相互作用以及作为抗大肠杆菌志贺毒素药物方面具有重要意义。
附图说明
图1：P1抗原表位三糖；
图2：P和PK抗原寡糖结构；
图3：P1抗原五糖，通式Ⅰ所示化合物；
图4：通式Ⅱ所示化合物；
图5：通式Ⅲ所示化合物；
图6：通式Ⅳ所示化合物；
图7：化学法合成β-构型的乳糖化合物1的反应方程式；
图8：“一锅多酶”体系合成三糖化合物2的反应方程式；
图9：“一锅多酶”体系合成四糖化合物3的反应方程式；
图10：“一锅多酶”体系合成五糖化合物4的反应方程式。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
下述实施例中所涉及的反应原料、溶剂等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规产品，所涉及的合成方法、工艺，若无特别说明，均为所属领域的常规技术手段。
下述实施例中所提及的化合物1、2、3、4分别对应于R1为叠氮取代烷基的通式Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅰ的化合物。
实施例1：P1抗原五糖的合成
步骤如下：
(1)化学法合成β-构型的乳糖化合物1(Galβ1,4GlcβProN3)
向500mL圆底烧瓶中加入乳糖(10g,29.23mmol)、醋酐(55mL)和醋酸钠(9.6g)，在160℃反应条件下回流搅拌6小时。薄层色谱检测(PE:EA＝1:1)反应完全后，旋蒸浓缩。所得固体复溶于300mL二氯甲烷中，用半饱和食盐水萃取一次，饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，双蒸水溶液萃取三次，之后分离有机相，再用无水硫酸钠干燥有机相，旋蒸浓缩，获得淡黄色固体化合物5(18.6g,94％)。
向容积为10mL的微波专用反应管中加入化合物5(1.0g,1.47mmol)、二氯甲烷(5.0mL)、三氟化硼乙醚(0.36mL)和3-氯-1-丙醇(0.25mL)，磁力搅拌，预搅拌2分钟，反应温度为50℃，反应时间为15分钟。按照相同的反应条件，平行开5组相同的反应。之后收集反应液，旋蒸浓缩，快速硅胶柱分离纯化，获得淡黄色固体化合物6(2.78g,53％)。
向250mL圆底烧瓶中加入化合物6(2.40g,3.37mmol)、N,N-二甲基甲酰胺(40mL)、叠氮钠(1.1g)和四丁基碘化铵(0.12g)，110℃搅拌回流12小时。薄层色谱检测(PE:EA＝1:1)反应完全后，使用硅藻土过滤，二氯甲烷冲洗，半饱和食盐水萃取，反复三次，再用无水硫酸钠干燥有机相，旋蒸浓缩，快速硅胶柱分离纯化，获得淡黄色固体化合物7(1.93g,90％)。
向50mL圆底烧瓶中加入化合物7(1.50g,2.36mmol)、甲醇(10mL)、甲醇钠，直至溶液体系pH值到9.5左右，室温搅拌4小时，薄层色谱检测(EtOAc:MeOH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2)反应完全后，用酸性离子交换树脂将反应液的PH值调节到中性，旋蒸浓缩，快速硅胶柱分离纯化，得到白色固体化合物1(0.90g,90％)。
化合物1的合成路线如图7所示。
(2)“一锅多酶”体系合成三糖化合物2[GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]
本发明的化合物2[GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcβProN3]的合成步骤如下：
将乳糖受体化合物1(80mg)、N-乙酰氨基葡萄糖(54mg)、ATP(124mg)、UTP(118mg)、Tris-HCl缓冲液(100mmol,pH 8.0)和氯化镁(20mmol)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入NahK/GlmU(1.0-3.0mg)和HpLgtA(0.5-2.0mg)，加双蒸水至总体积10mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、140r/min孵育16小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过硅胶柱快速柱分离，获得白色化合物2(105mg,89％)。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.70(d,J＝8.4Hz,1H),4.50(d,J＝7.8Hz,1H),4.45(d,J＝7.8Hz,1H),4.16(d,J＝3.0Hz,1H),4.03–3.46(m,20H),3.32(t,J＝8.4Hz,1H),2.05(s,3H),1.93(p,J＝6.6Hz,2H)；13C NMR(151MHz,D2O)δ174.95,102.92,102.84,102.10,81.96,78.34,75.64,74.88,74.76,74.35,73.55,72.79,70.00,69.68,68.33,67.36,60.96,60.47,60.06,55.65,47.87,28.23,22.19。
化合物2的合成路线如图8所示。
(3)“一锅多酶”体系合成四糖化合物3[Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcOβProN3]
本发明的化合物3[Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcOβProN3]的合成方法如下：
将三糖化合物2(80mg)、半乳糖(30mg)、ATP(84mg)、UTP(80mg)、Tris-HCl缓冲液(100mmol,pH 7.5)和MgCl2(20mmol)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入EcGalK(2.0-4.0mg)、BLUSP(2.0-5.0mg)和NmLgtB(1.0-3.0mg)，加双蒸水至总体积10mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、140r/min孵育12小时。薄层色谱(EtOAc:MeOH:H2O:EtOH＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过硅胶柱快速柱分离，获得白色化合物3(94mg,93％)。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.73(d,J＝8.4Hz,1H),4.50(d,J＝7.8Hz,1H),4.49(d,J＝7.8Hz,1H),4.46(d,J＝8.4Hz,1H),4.17(d,J＝3.6Hz,1H),4.03–3.96(m,3H),3.94(d,J＝3.0Hz,1H),3.87(dd,J＝4.8,12.6Hz,1H),3.84–3.54(m,19H),3.48(t,J＝6.6Hz,2H),3.33(t,J＝8.4Hz,1H),2.05(s,3H),1.93(p,J＝6.6Hz,2H)；13C NMR(151MHz,D2O)δ174.89,102.92,102.84,102.73,102.09,82.05,78.35,78.14,75.33,74.87,74.75,74.53,74.34,72.79,72.49,72.16,70.96,69.95,68.55,68.31,67.36,61.04,60.96,60.06,59.85,55.18,47.87,28.24,22.22。
化合物3的合成路线如图9所示。
(4)“一锅多酶”体系合成五糖化合物4[Galα(l-4)Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcOβPr oN3]
本发明的化合物4[Galα(l-4)Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)GlcOβProN3]的合成方法如下：
将四糖化合物3(79mg)、半乳糖(23mg)、ATP(66mg)、UTP(63mg)、Tris-HCl缓冲液(100mmol,pH 7.5)和氯化镁(20mmol)(Tris和MgCl2的用量由最终反应液的体积来计算确定)溶于50mL离心管中，加入EcGalK(2.0-3.0mg)、BLUSP(2.0-4.0mg)和NmLgtC(1.0-3.0mg)，加双蒸水至总体积10mL后，将反应体系置于摇床中，37℃、140r/min孵育6小时后，补加半乳糖(11mg)、ATP(33mg)、UTP(32mg)、EcGalK(1.0-2.0mg)、BLUSP(1.0-3.0mg)和NmLgtC(1.0-2.0mg)继续孵育6小时。薄层色谱(E tOAc:MeOH:H2O:EtOH＝4:2:1:0.2)检测反应完成后，加入与反应体系等体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置30分钟使酶变性以终止反应。然后将反应体系4℃、12000r/min离心20分钟，收集上清液，旋蒸浓缩，通过硅胶柱快速柱分离，获得白色化合物4(52mg,55％)。参数如下：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.96(d,J＝4.2Hz,1H),4.72(d,J＝8.4Hz,1H),4.55(d,J＝7.8Hz,1H),4.50(d,J＝7.8Hz,1H),4.45(d,J＝7.8Hz,1H),4.37(t,J＝6.6Hz,1H),4.17(d,J＝3.0Hz,1H),4.05(dd,J＝3.0,6.6Hz,2H),4.03–3.57(m,27H),3.47(t,J＝6.9Hz,2H),3.32(t,J＝8.7Hz,1H),2.05(s,3H),1.92(p,J＝6.6Hz,2H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.91,103.21,102.92,102.70,102.10,100.27,82.03,78.43,78.34,77.30,75.41,74.87,74.76,74.57,74.34,72.78,72.19,72.13,70.89,70.79,69.96,69.12,68.92,68.53,68.32,67.36,60.94,60.49,60.36,60.04,59.81,59.33,47.86,28.22,22.18。
化合物4的合成路线如图10所示。
Claims (7)
1.一种人血型抗原P1五糖的合成方法，包括：利用“一锅多酶”体系将半乳糖以β1-4糖苷键偶联到式(III)所示的三糖上，合成式(IV)所示的四糖的步骤；以及利用“一锅多酶”体系将半乳糖以α1-4糖苷键偶联到式(IV)所示的四糖上，合成式(I)所示的五糖的步骤；
式(I)、式(III)和式(IV)中，R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基；
其中，利用“一锅多酶”体系合成式(IV)所示的四糖的步骤中，先后用到的酶分别为：半乳糖激酶、糖核苷生成酶以及β1-4半乳糖转移酶；
其中，利用“一锅多酶”体系合成式(I)所示的五糖的步骤中，先后用到的酶分别为：半乳糖激酶、糖核苷生成酶以及α1-4半乳糖转移酶；
其中，式(III)所示的三糖是利用“一锅多酶”体系将N-乙酰氨基葡萄糖以β1-3糖苷键偶联到式(II)所示的乳糖苷上制备得到；
式(II)中，R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基；
所述“一锅多酶”体系先后用到的酶分别为：N-乙酰氨基葡萄糖激酶、糖核苷生成酶以及β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。
2.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，式(II)所示的乳糖苷的合成采用以下方法：将乳糖与醋酐进行反应后，将其全部裸露羟基用乙酰基保护；然后利用微波反应仪将全乙酰化的乳糖进行β-构型糖苷化反应，然后依次叠氮化和脱保护后即得。
3.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，式(III)所示的三糖的合成方法为：将式(II)所示的乳糖苷、1.3-3.0当量N-乙酰氨基葡萄糖、1.3-5.0当量腺嘌呤核苷三磷酸、1.3-5.0当量尿嘧啶核苷三磷酸、5-100mmol MgCl2、10-500mmol、pH5.0-10.0的Tris-HCl缓冲液配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加N-乙酰氨基葡萄糖激酶、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖合成酶以及β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，反应时间为3-72小时，待反应完成后，纯化即可直接获得式(III)所示的三糖化合物。
4.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，式(IV)所示的四糖的合成方法为：将式(III)所示的三糖、1.3-3.0当量半乳糖、1.3-5.0当量腺嘌呤核苷三磷酸、1.3-5.0当量尿嘧啶核苷三磷酸、5-100mmol MgCl2、10-500mmol、pH5.0-10.0的Tris-HCl缓冲液配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶、糖核苷生成酶以及β1-4半乳糖转移酶，反应时间为3-72小时，待反应完成后，纯化即可直接获得式(IV)所示四糖化合物。
5.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，式(I)所示的五糖的合成方法为：将式(IV)所示的四糖、1.3-3.0当量半乳糖、1.3-5.0当量腺嘌呤核苷三磷酸、1.3-5.0当量尿嘧啶核苷三磷酸、5-100mmol MgCl2、10-500mmol、pH5.0-10.0的Tris-HCl缓冲液配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶、糖核苷生成酶以及α1-4半乳糖转移酶，反应时间为3-46小时，待反应完成后，纯化即可直接获得式(I)所示的五糖化合物。
6.如权利要求3-5任一项所述的合成方法，其特征在于，反应完成后采用薄层色谱法跟踪反应进程，展开剂为EA:CH3OH:H2O:HOAc＝4:2:1:0.2来检测。
7.如权利要求3-5任一项所述的合成方法，其特征在于，合成式(I)、式(III)和式(IV)所示的多糖所采用的“一锅多酶”体系中，反应温度为0-37℃，转速为0-240r/min；酶反应的停止方法是向反应中加入与反应液等体积的4℃无水乙醇并在4℃下孵育0-50分钟。
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