JP4910091B2

JP4910091B2 - ４位ハロゲン化ガラクトース含有糖鎖及びその応用

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Publication number: JP4910091B2
Application number: JP2007503658A
Authority: JP
Inventors: 紳一郎西村; 紀子長堀; 智樹浜本; 潔奥山; 利忠野口
Original assignee: Hokkaido University NUC; Yamasa Corp
Current assignee: Hokkaido University NUC; Yamasa Corp
Priority date: 2005-02-16
Filing date: 2006-02-14
Publication date: 2012-04-04
Anticipated expiration: 2026-02-14
Also published as: US8148112B2; WO2006088017A1; US20090018327A1; JPWO2006088017A1

Description

本発明は医薬品等での応用が期待される４位ハロゲン化ガラクトース含有糖鎖（オリゴ糖）及び当該化合物の応用に関するものである。

生体内においては、糖供与体である糖ヌクレオチドと糖転移酵素によって、立体及び位置選択的に糖残基が逐次的に結合することにより多種多様な構造を有する糖鎖（オリゴ糖）が合成されている。例えば、ある細胞が癌化する際、新たな糖転移酵素の発現あるいは糖転移酵素群の量比に変化が生じ、糖鎖構造の一部が異変し、腫瘍マーカーへと糖鎖が伸長もしくは変化していくと考えられている。

従って、細胞表面に存在する糖鎖を人為的に改変することにより、細胞の持つ本来の性質や機能を変え得ることが期待され、その実証のために非天然型の新規な糖鎖を合成する試みが盛んに行われている。

非天然型の糖鎖の合成手段の１つとして、糖ヌクレオチドの糖部分の構造を変化させた非天然型糖ヌクレオチドを糖供与体とし、糖転移酵素反応により非天然型の糖鎖を合成する方法がある。

非天然型の糖ヌクレオチドとしては、糖の水酸基部分に類似の性質を有し、かつ不活性であるハロゲン原子を導入したものが考えられる。例えば、本発明者らは、生理活性糖鎖の不可欠な基本組成単位としてよく知られているＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミンの水酸基部分にフッ素原子を導入したフッ素化アミノ糖ヌクレオチドを調製し、その性質を検討した（特許文献１）。

また、Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミンと同様に、生理活性糖鎖における不可欠な基本組成であるガラクトースに関しても、４位フッ素化ガラクトース糖ヌクレオチド（非特許文献１、２）、４位以外の部位にフッ素を導入したガラクトース糖ヌクレオチドが調製されている（非特許文献３〜５）。
特開２００４−１６８７５１号公報Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９，６９９４−６９９８（１９９４）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ＰｅｒｋｉｎＴｒａｎｓ．１，２３７５−２３８２（１９９７）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５，４９７−５００（１９９７）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３２８，４７３−４８０（２０００）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ．３４．（４０），６４１９−６４２２．（１９９３）

しかし、４位フッ素化ガラクトース糖ヌクレオチドは、単に当該糖ヌクレオチドを化学的に調製しただけにとどまり、この糖ヌクレオチドを利用して非天然型の糖鎖は合成されていない。また、ガラクトース残基の２位、３位又は６位をフッ素化したガラクトース糖ヌクレオチドは、非天然型の糖鎖合成に利用されるか否かの試験が行われているが、糖供与体として利用できる可能性は示唆されているものの、非天然型の糖鎖は現実には調製されていない。

このように、糖鎖伸長のストッパーとして本命視されている４位にフッ素を導入したガラクトース糖ヌクレオチドが、非天然型の糖鎖合成のための糖供与体として利用できるかどうか、仮に利用できるとした場合、調製した非天然型の糖鎖は転移酵素の阻害剤となりうるか否かは、当業者であっても全く予想できることではなかった。

本発明者らは、立体異性体であるグルコースと唯一異なる箇所であり、生体分子における糖鎖認識機構において重要な位置と考えられる４位の水酸基部分をターゲットとして、この４位の位置にハロゲン原子を導入したガラクトース糖ヌクレオチドを調製し、当該非天然型の糖ヌクレオチドを糖供与体とした場合の糖転移反応に関して詳細に検討を行った。

すなわち、もし、４位ハロゲン化ガラクトース糖ヌクレオチドが糖供与体として糖転移酵素による糖転移反応が可能であるならば、（１）このハロゲン化糖含有糖鎖が以降の糖鎖伸長のストッパーになることで、ガラクトースの４位結合を有する糖鎖で生体内における機能、役割についてほとんど不明であるグロボ系列のＧｂ３、Ｇｂ４、あるいはガングリオシド系列のＧＭ２（以降に生合成される糖脂質を含む）の機能、役割を解明することができ、（２）糖の水酸基と類似の性質を示し、不活性であるハロゲン化糖を含有した糖鎖を種々合成できるようになることから、ハロゲン化含有糖鎖とその天然型糖鎖を比較することで、糖鎖の生体内における機能、役割がより明確に解明することができるからである。

本発明者らの検討の結果、以下のことが明らかとなった。
（ａ）従来、４位以外の部位にフッ素を導入したガラクトース糖ヌクレオチドは酵母由来の２種類の酵素（ガラクトカイネースとガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ）を用いて調製されていたが、この方法を４位フッ素化ガラクトース糖ヌクレオチドの調製に応用した場合、収率がかなり低いことから、酵母由来以外の酵素を用いて検討した結果、細菌、特に大腸菌由来の酵素を用いることで、収率よく目的とする４位フッ素化ガラクトース糖ヌクレオチドを調製できること。

（ｂ）本発明者らが先に調製したフッ素化アミノ糖ヌクレオチド（たとえば、ウリジン５’−（２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−４−フルオロ−α−Ｄ−グルコピラノシル）ジホスフェート又はウリジン５’−（２−アセタミド−２，４−ジデオキシ−４−フルオロ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）ジホスフェート）は、転移酵素を用いた糖転移反応における糖供与体となり得なかったが、４位フッ素化ガラクトース糖ヌクレオチドは、意外にもガラクトース転移酵素が糖供与体として認識し、４位フッ素化ガラクトース含有糖鎖を容易に種々合成できること。

（ｃ）４位フッ素化ガラクトース含有糖鎖に対して、シアル酸転移酵素によるシアル酸転移反応が阻害されること。

本発明者らは、上記知見をさらに発展させて本発明を完成した。
すなわち、本発明は、４位ハロゲン化ガラクトース残基を末端に有するオリゴ糖を提供するものである。

また、本発明は、糖供与体として下記式（ＩＩ）のハロゲン化ガラクトース糖ヌクレオチドを用い、糖転移酵素により受容体糖化合物に４位ハロゲン化ガラクトース残基を転移することを特徴とする、４位ハロゲン化ガラクトース残基を末端に有するオリゴ糖の製造法を提供するものである。

（上記式中、Ｒ_１〜Ｒ_３は水酸基、アセチル基、ハロゲン原子又は水素原子を示し、Ｘはハロゲン原子を示し、Ｍ^＋は水素イオン又は金属イオンを示す）

また、本発明は、４位ハロゲン化ガラクトース残基を末端に有するオリゴ糖を含有する転移酵素阻害剤を提供するものである。
さらに本発明は、４位ハロゲン化ガラクトース残基を末端に有するオリゴ糖を阻害剤として用いる、糖転移酵素による糖鎖伸長反応を阻害する方法を提供するものである。

さらにまた、本発明は式（ＩＩＩ）の化合物を細菌由来のガラクトカイネースを用いてリン酸化して式（ＩＶ）の化合物を得、得られた式（ＩＶ）の化合物と糖ヌクレオチドから細菌由来のヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼを用いて式（ＩＩ）の化合物を合成することを特徴とする４位ハロゲン化ガラクトース糖ヌクレオチドの製造法を提供するものである。

（上記式中、Ｒ_１〜Ｒ_３は水酸基、アセチル基、ハロゲン原子又は水素原子を示し、Ｒ^４はリン酸残基又はその塩を示し、Ｘはハロゲン原子を示し、Ｍ^＋は水素イオン又は金属イオンを示す）

本発明の新規な４位ハロゲン化ガラクトース残基を末端に有するオリゴ糖（以下、「４位ハロゲン化糖含有オリゴ糖」と言うこともある）は、糖転移酵素による糖鎖伸長（生合成経路）を阻害するため、例えば、癌細胞やウイルスの増殖を阻止する阻害剤としての開発が期待できるものである。

具体的には、ガラクトースの４位結合糖鎖、Ｇｂ３、Ｇｂ４などのグロボ系列、あるいはガングリオシド系列のＧＭ２以降の糖脂質伸長反応（生合成経路）を阻害することで、その機能、役割の解明、さらには糖鎖自身の機能性素材や医薬品等への応用が期待される。また、細胞が癌化した場合、糖鎖の高シアル酸化が起こることが報告されていることから、このシアル酸転移阻害活性機構を利用した抗腫瘍剤等への応用の可能性も期待できる。

また、２種類の細菌由来の酵素を使用することで、化学合成では大量取得が困難であった４位ハロゲン化ガラクトース糖ヌクレオチドを収率良く大量に取得できるようになった。

以下、本発明を、（１）４位ハロゲン化ガラクトース糖ヌクレオチドの酵素合成、（２）４位ハロゲン化ガラクトース基を有するオリゴ糖、及び（３）糖転移酵素による糖鎖伸長反応の阻害の順で説明する。

（１）４位ハロゲン化ガラクトース糖ヌクレオチドの酵素合成
上述したように、本発明の４位ハロゲン化ガラクトース糖ヌクレオチドの酵素合成は、前記式（ＩＩＩ）の化合物をガラクトカイネースを用いてリン酸化して前記式（ＩＶ）の化合物を得、得られた式（ＩＶ）の化合物と糖ヌクレオチドからヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼを用いて前記式（ＩＩ）の化合物を合成することを特徴とする。

（式中、Ｒ_１〜Ｒ_４、Ｘ及びＭは前記と同じ）

Ｒ_１〜Ｒ_３及びＸで示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、フッ素原子が好ましい。Ｍの金属原子としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属が挙げられる。上記式（ＩＩ）の化合物としては、Ｒ_１〜Ｒ_３が水酸基で、Ｘがフッ素原子であるものが特に好ましい。

原料として使用する４位ハロゲン化ガラクトースである前記式（ＩＩＩ）の化合物は、市販品として購入が可能であり、また、Ｍａｒａｄｕｆｕ＆Ｐｅｒｌｉｎ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３２，２６１−２７７（１９７４）、Ｉｔｔａｈ＆Ｇｌａｕｄｅｍａｎｓ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，９５，１８９−１９４（１９８１）、Ｋａｍｅｒｌｉｎｇら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２９１，６３−８３（１９９６）などの公知の方法に準じて合成することも可能である。

このような原料を用い、ガラクトカイネースによりリン酸化して前記式（ＩＶ）の化合物を得る。

使用するガラクトカイネースとしては、細菌由来の酵素、特に大腸菌由来のものが好ましい。また、ガラクトカイネース遺伝子がクローン化されている場合には、そのクローン化されたガラクトカイネース遺伝子を用いて常法により大腸菌などを宿主として大量生産させ、当該微生物の菌体より当該酵素を調製してもよい。

細菌の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、大腸菌類に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）又は２ｘＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、約３０〜５０℃で約１０〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより目的とする活性を有する微生物菌体を調製することができる。

得られた細菌の菌体は、機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理し、菌体の破壊物又は菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物とする。

酵素の調製は、上記菌体処理物から目的とする活性を有する画分を通常の酵素の精製手段、例えば塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理などを施して得られる粗酵素又は精製酵素を使用することができるが、リン酸供与体、すなわち基質として用いるヌクレオチド５’−トリリン酸（ＮＴＰ）、あるいは生成中間体である糖−１リン酸の分解を抑え、収率を向上させるために、脱リン酸活性（ホスファターゼ活性）を残存していない酵素標品を用いることが望ましい。

ガラクトカイネースによるリン酸化反応は、０．１〜１００ｍＭ、好ましくは１〜５０ｍＭの前記式（ＩＩＩ）の化合物とリン酸供与体としてのアデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）などのヌクレオシド５’−トリリン酸（ＮＴＰ）を１〜５００ｍＭ、好ましくは５〜１００ｍＭ使用し、さらに０．０１〜５０ユニット／ｍＬのガラクトカイネースを添加し、緩衝液（ｐＨ４．０〜１０）中、１０〜７０℃の温度条件下、１〜１００時間程度インキュベートすることで実施することができる。

なお、上記リン酸化反応に供するＮＴＰは、当該反応で生成するヌクレオチド５’−ジリン酸（ＮＤＰ）をポリリン酸カイネースを利用したＮＴＰ再生系（Ｔ．Ｎｏｇｕｃｈｉ＆Ｔ．Ｓｈｉｂａ、Ｂｉｏｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２，１５９４−１５９６（１９９８））、あるいは公知であるピルビン酸カイネースを利用したＮＴＰ再生系（Ｃ．Ｈ．Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５７，４３４３−４３４４（１９９２））により再生されたＮＴＰであってもかまわない。

このようにして得られた式（ＩＶ）の化合物と糖ヌクレオチドからヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼを用いて前記式（ＩＩ）の化合物を合成する。
反応に使用する糖ヌクレオチドとしては、ウリジン５’−ジリン酸グルコース、ウリジン５’−ジリン酸ガラクトースなどのヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの基質になるものであれば、特に制限されない。
また、反応に使用するヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼはガラクトカイネースと同様に細菌由来のもの、特に大腸菌由来のものが好ましく、上記と同様に調製したものを使用することができる。

ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼによる転移反応は、０．１〜１００ｍＭ、好ましくは０．５〜５０ｍＭの前記式（ＩＶ）の化合物と１〜２００ｍＭ、好ましくは５〜１００ｍＭの糖ヌクレオチドを使用し、さらに０．１〜５０ユニット／ｍＬのヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼを添加し、緩衝液（ｐＨ４．０〜１０．０）中、１０〜７０℃の温度条件下、１〜１００時間程度インキュベートすることで実施することができる。

なお、上記転移反応に供する糖ヌクレオチドは、グルコース１−リン酸をウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）存在下、糖ヌクレオチドピロホスホリラーゼの反応により生成あるいは再生させたものであってもかまわない。

また、ガラクトカイネースによるリン酸化反応とヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼによる転移反応は、逐次、あるいは同時で行ってもよく、また、ガラクトカイネースによるリン酸化反応後、得られたリン酸化糖を精製した後、あるいは精製せず転移反応に供してもかまわない。

このようにして得られた４位ハロゲン化ガラクトース糖ヌクレオチドは、通常の糖ヌクレオチドの単離精製手段（イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなど）により単離精製することができる。

（２）４位ハロゲン化ガラクトース残基を末端に有するオリゴ糖
４位ハロゲン化糖含有オリゴ糖は、上記４位ハロゲン化ガラクトース糖ヌクレオチドを糖供与体とし、糖転移酵素を用い、受容体化合物に４−デオキシ−４−ハロゲノガラクトシル基を転移することで調製することができる。

反応に用いる転移酵素としては、４−デオキシ−４−ハロゲノガラクトシル基を転移できるものであれば特に制限されるものではない。具体的には、β１，４−ガラクトース転移酵素、β１，３−ガラクトース転移酵素、α１，３−ガラクトース転移酵素などが例示される。また、転移酵素は特定の由来のものには限定されず、動物由来、植物由来、微生物由来など、すべての由来のものを使用することができる。また、使用する糖転移酵素遺伝子がクローン化されている場合には、そのクローン化された糖転移酵素遺伝子を用いて常法により大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などを宿主として生産させ、当該酵素を調製することも可能である。

このような転移酵素は、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。具体的には細胞の処理物又は当該処理物から得られる酵素調製物などが挙げられる。
細胞の処理物としては、各種培養法によって得られた細胞を機械的破砕（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる細胞の破壊物又は細胞の細胞壁もしくは細胞膜の変性物が挙げられる。

酵素調製物としては、上記菌体処理物から糖転移活性を有する画分を通常の酵素の精製手段、例えば塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理などを施して得られる粗酵素又は精製酵素を使用することができる。

反応液に添加する受容体化合物は、合成目的の糖鎖に応じて、あるいは使用する転移酵素に応じて、既知の単糖、オリゴ糖あるいはそれら糖化合物を、必要によりスペーサーを介して担体に結合させた担持物から適宜選択すれば良く、特に制限されるものではない。

４位ハロゲン化ガラクトース含有オリゴ糖の合成は、０．１〜１００ｍＭの４位ハロゲン化ガラクトース糖ヌクレオチドと受容体としての糖化合物０．０１〜２０ｍＭを使用し、トリス塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液等の緩衝液（ｐＨ５．０〜１０．０）中、糖転移酵素を０．００１ユニット／ｍＬ以上、好ましくは０．０１ユニット／ｍＬ以上添加し、５０℃以下、好ましくは約５〜５０℃の温度条件下、１〜５０時間程度、必要により攪拌しながら反応させることにより実施できる。

このような４位ハロゲン化ガラクトース糖含有オリゴ糖を例示すれば、例えば下記式（Ｉ）で表される４−デオキシ−４−ハロゲノ−α−Ｄ−ガラクトース誘導体を例示することができる。このオリゴ糖は、単糖、オリゴ糖もしくはそれらの担持物を受容体とし、４位ハロゲン化ガラクトース糖ヌクレオチドとガラクトース転移酵素を用いることで合成することができる。

（Ｘはハロゲン原子を示し、Ｒは単糖、オリゴ糖又は担体を示す）
上記式（Ｉ）化合物の具体的な例としては、４−デオキシ−４−ハロゲノ−α−Ｄ−ガラクトシルβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミン含有糖鎖誘導体（下記式（Ｉ’）化合物）、あるいは４−デオキシ−４−ハロゲノ−α−Ｄ−ガラクトシルβ１−３Ｎ−アセチルグルコサミン含有糖鎖誘導体等を挙げることができる。

（式中、Ｘはハロゲン原子を示し、Ｒ_５は水素原子、水酸基、単糖、オリゴ糖又は担体を示す）

Ｘで示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、フッ素原子が好ましい。ＲあるいはＲ_５で示される単糖としては、ガラクトース、グルコース、マンノース、フルクトース、リボース、アラビノース、キシロース、キシリロース、リブロース、エリトロース、トレオース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、タガトース、ソルボース、プシコース、Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトヘプトース、Ｄ−グリセロ−グルコヘプトース、ＤＬ−グリセロ−Ｄ−マンノヘプトース、アロヘプツロース、アルトヘプツロース、タロヘプツロース、マンノヘプツロース、オクツロース、ノヌロース、Ｄ−グリセロ−Ｌ−ガラクトオクツロース、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノオクツロース、ノムロース、フコース、ラムノース、アロメチロース、キノボース、アンチアロース、タロメチロース、ジキタロース、ジギドキソース、シマロース、チベロース、アベロース、パラトース、コリトース、アスカリロース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、イズロン酸、グルロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチル−Ｏ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコイルノイラミン酸、ムラミン酸、並びにその誘導体が挙げられる。

また、オリゴ糖としては、例えばマルトース、セロビオース、ラクトース、キシロビオース、イソマルトース、ケンチオビオース、メリビオース、プランテオビオース、ルチノース、プリメベロース、ビシアノース、ニゲロース、ラミナリビオース、ツラノース、コージビオース、ソホロース、スクロース、トレハロース、キトビース、ヒアロビオウロン酸、コンドロシン、セロビオウロン酸、ラフィノース、ゲンチアノース、メレジトース、ブランテオース、ケストース、マルトトリオース、パノース、イソマルトトリオース、スタキオース、ベルバスコース、シクロデキストリン、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、乳汁オリゴ糖（例えばフコシルラクトース、シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースなど）、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などのグリコサミノグリカン、ＡＢＯ型血液型糖鎖、各種Ｎ−結合型糖鎖、各種ムチン（Ｏ−結合）型糖鎖、スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質などの糖脂質糖鎖、並びに以上の誘導体などが挙げられる。

なお、単糖、オリゴ糖としては、蛍光標識したものであってもかまわない。具体的には、ベンズアミジン、ｐ−メトキシベンズアミジン、１，２−ジ−（パラメトキシフェニル）−エチレンジアミン、Ｆｍｏｃ−ヒドラジン、エチル４−アミノベンゼン、２−アミノ安息香酸、２−アミノピリジン、２−アミノアクリドン、８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸、３−（アセチルアミノ）−６アミノアクリジン、５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホン酸などで単糖又はオリゴ糖の還元末端が標識されたもの、あるいはオリゴ糖鎖内部が標識されたものが挙げられる。さらに、ｐ−ニトロフェノール、核酸塩基などの紫外線吸収を示す化合物と結合した単糖又はオリゴ糖であってもかまわない。

また、担体としては、例えば、タンパク質、脂質、核酸などの生体試料、金、白金などの金属微粒子、鉄、酸化鉄などの磁性金属微粒子、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アガロース、デキストランなどの高分子ポリマーなどが挙げられる。これらの担体と糖鎖とのスペーサーとしては、例えば（ポリ）エチレングリコール、種々のアルキル鎖（例えば、炭素数１〜２０のアルキル）などが挙げられる。

このようにして得られた４位ハロゲン化ガラクトース含有オリゴ糖誘導体は、通常のオリゴ糖の単離精製手段（イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなど）により単離精製することができる。

（３）糖転移酵素による糖鎖伸長反応の阻害
４位ハロゲン化ガラクトース糖含有オリゴ糖、特に４位フッ素化ガラクトース含有オリゴ糖は、ガラクトースの４位にハロゲン原子、特にフッ素原子が結合しているため、ガラクトースの４位に糖が結合している糖鎖の伸長をストップするか、あるいは糖鎖の伸長を著しく遅延させることが可能であり、転移酵素阻害剤として有用である。
さらに、４位にフッ素が結合していることで、例えば３位の位置に糖を結合する糖転移酵素の反応を阻害することもでき、この機構によりそれ以降の糖鎖の生合成経路が抑制されることも可能で、医薬品などの応用も充分に期待できる阻害剤である。具体的には、４位フッ素化ガラクトース含有糖鎖を反応系に添加することにより、α２，３−シアル酸転移酵素またはα２，６−シアル酸転移酵素によるシアル酸転移反応、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素によるＮ−アセチルグルコサミン転移反応、β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素によるＮ−アセチルガラクトサミン転移反応、α１，３−ガラクトース転移酵素によるガラクトース転移反応、α１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素によるＮ−アセチルガラクトサミン転移反応を阻害することができる。

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。
なお、反応液中の４位フッ素化ガラクトースの定量はＤＩＯＮＥＸ社ＤＸ−３００装置、ＣａｒｂｏＰａｃ^ＴＭＰＡ１カラムを用い、溶出液はＡ液；蒸留水、Ｂ液；０．２Ｍ水酸化ナトリウム、Ｃ液；１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液の混合溶液を使用して行った。また、反応液中のウリジン５’−ジリン酸４−フルオロガラクトース（ＵＤＰ−４Ｆ−Ｇａｌ）などの核酸関連物質の定量はＨＰＬＣ法により行った。具体的には分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＨＳ３０２カラムを用い、溶出液として０．２Ｍトリエチルアミン−リン酸（ｐＨ６．０）溶液を用いた。

実施例１：ウリジン５’−ジリン酸４−フルオロガラクトースの合成
（１）大腸菌ガラクトカイネース（ＧａｌＫ）の調製
大腸菌ＧａｌＫをコードする遺伝子を挿入したｐＴｒｃ−ｇａｌＫプラスミド（特開２００２−３３５９８８）で、大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオより入手）を形質転換した後、当該菌株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地１００ｍＬに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌数が１×１０^８個／ｍＬに達した時点で、培養液に最終濃度０．２ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに８時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ，２０分）により菌体を回収し、１０ｍＬの緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ塩化マグネシウム）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ，１０分）により菌体残さを除去した。

このように得られた上清画分を計１リットルの同上緩衝液で透析した後、ＨｉＴｒａｐＱ５ｍＬカラム（アマシャムバイオサイエンス）を用いて以下の条件で精製を行い（Ａ液；同上緩衝液、Ｂ液；Ａ液＋１Ｍ塩化ナトリウム、５−３５％Ｂ液（２０ＣＶ））、ガラクトカイネース活性を有する画分１５ｍＬを回収した。

これを酵素液とし以下の合成反応に用いた。なお、酵素液におけるガラクトカイネース（ＧａｌＫ）活性を測定した結果を表１に示す。なお、本発明におけるＧａｌＫ活性は武田らの方法（特開２００２−３３５９８８）に従って行った。

（２）大腸菌ガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）の調製
大腸菌をコードする遺伝子を挿入したｐＴｒｃ−ＧａｌＴプラスミド（特開２００２−３３５９８８）で、大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオより入手）を形質転換した後、当該菌株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地５０ｍＬに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌数が１×１０^８個／ｍＬに達した時点で、培養液に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ，２０分）により菌体を回収し、１０ｍＬの緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ硫酸亜鉛、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ塩化ナトリウム）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ，１０分）により菌体残さを除去した。

このように得られた上清画分を計１リットルの同上緩衝液で透析した後、ＨｉＴｒａｐＱ５ｍＬカラム（アマシャムバイオサイエンス）を用いて以下の条件で精製を行い（Ａ液；同上緩衝液、Ｂ液；Ａ液＋１Ｍ塩化ナトリウム、０−５０％Ｂ液（２５ＣＶ））、ＧａｌＴ活性を有する画分５ｍＬを回収した。

これを酵素液とし以下の合成反応に用いた。なお、酵素液におけるガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）活性を測定した結果を表１に示す。本発明におけるＧａｌＴ活性は武田らの方法（特開２００２−３３５９８８）に従って行った。ここで得られたガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼは、ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼと同一酵素で、同一反応を触媒する（Ｅ．Ｃ．２．７．７．１２）。

（３）４位フッ素化ガラクトース−１リン酸（Ｇａｌ−１Ｐ）の合成
１０ｍＭ４Ｆ−Ｇａｌ（ＴｏｒｏｎｔｏＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓＩｎｃより入手）、５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭＡＴＰを含有する１００ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．８）に、上記（１）により調製したガラクトカイネース活性を有する酵素液（２．３ｕｎｉｔｓ／ｍＬ反応液）を添加し、３７℃で、１時間反応を行った。コントロールとして４Ｆ−Ｇａｌなしの反応も行った。

反応液を１／１０量の水酸化ナトリウムを添加した後、遠心分離（２０，０００×ｇ，１０分）により不溶性画分を除去した。これをＥＳＩ−イオントラップ質量分析装置（日立ハイテクノロジー社製）を用いて分析を行った結果、コントロール反応液ではなかった［Ｍ−Ｈ］⁻（ｍ／ｚ２６１）のピークを検出したことから、４Ｆ−Ｇａｌ−１Ｐが生成したことを確認した。なお、ＤｉｏｎｅｘＤＸ−３００による分析を行ったところ、コントロールと比べて２．１ｍＭの４Ｆ−Ｇａｌの減少が認められたことから、２．１ｍＭの４Ｆ−Ｇａｌ−１Ｐが生成したことが示唆された。

上記反応液から１０ｍＭ炭酸アンモニウムを溶離液としてＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂カラム（東ソー）（塩化アンモニウムによるグラジエント溶出）、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０（アマシャムバイオサイエンス）を用いて４Ｆ−Ｇａｌ−１Ｐを単離し、得られた画分を凍結乾燥することにより白色粉末を取得した。続いてこれを用いて下記のＵＤＰ−４Ｆ−Ｇａｌ合成反応を行った。

（４）ＵＤＰ−４Ｆ−Ｇａｌの合成
１０ｍＭ４Ｆ−Ｇａｌ−１Ｐ、５ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭウリジン５’−２リン酸グルコース（ＵＤＰ−Ｇｌｃ）を含有する１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に上記（２）より調製したガラクトース−１リン酸ウリジル酸転移酵素活性を有する酵素液（１１ｕｎｉｔ／ｍＬ反応液）を添加し、３７℃、２２時間反応を行った。

反応液を９０℃、５分間の熱処理を行った後、遠心分離（２０，０００×ｇ，１０分）により不溶性画分を除去した。得られた上清画分をＨＰＬＣを用いて分析したところ、２．０６ｍＭのＵＤＰ−４Ｆ−Ｇａｌの合成を確認した。

さらにＨＰＬＣを用いて目的物のピークを分取し、これを凍結乾燥した。凍結乾燥物を蒸留水で溶解後、１０ｍＭ炭酸アンモニウムを展開液としてＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０樹脂カラムによるゲルろ過を行った。ＵＤＰ−４Ｆ−Ｇａｌ画分を凍結乾燥することにより、ＨＰＬＣ純度９８％のＵＤＰ−４Ｆ−Ｇａｌの白色粉末を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ−Ｄ_２Ｏ）δ：７．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３０Ｈｚ，ｕｒｉ−Ｈ”−６），５．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．７６Ｈｚ，ｒｉｂ−Ｈ’−１），５．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３０Ｈｚ，ｕｒｉ−Ｈ”−５），５．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．４８，７．２９Ｈｚ，Ｈ−１），４．８３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．３４，５０．６９Ｈｚ，Ｈ−４），４．２８〜４．２５（２Ｈ，ｍ，ｒｉｂ−Ｈ’−２，３），４．１８〜４．０７（４Ｈ，ｍ，ｒｉｂ−Ｈ’−４，５Ｓ，５Ｒ，Ｈ−５），３．９２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．３４，１０．３１，２９．７０Ｈｚ，Ｈ−３），３．７６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１０．３１，３．４８Ｈｚ，Ｈ−２），３．６８〜３．６６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６ａ，６ｂ）

参考例１
（酵母由来ガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼを用いたＵＤＰ−４Ｆ−Ｇａｌの合成）
１０ｍＭ４Ｆ−Ｇａｌ−１Ｐ、５ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭウリジン５’−２リン酸グルコース（ＵＤＰ−Ｇｌｃ）を含有する１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．７）にシグマ社製酵母由来ガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（２０ｕｎｉｔ／ｍＬ反応液）を添加し、２５℃、３６時間反応を行った。

反応液を９０℃、５分間の熱処理を行った後、遠心分離（２０，０００×ｇ，１０分）により不溶性画分を除去した。得られた上清画分をＨＰＬＣを用いて分析したところ、０．６１ｍＭのＵＤＰ−４Ｆ−Ｇａｌの生成を確認したが、大腸菌由来ガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼに比べて、目的物の生成量が本発明方法の３０％以下と極めて低いことが明らかとなった。

実施例２：β１，４−ガラクトース転移酵素用いた４Ｆ−ガラクトース含有糖鎖の合成
金微粒子にチオール基を有するスペーサーで固定化したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）（参考例２参照）をアクセプターとして（化合物１）、これをＧｌｃＮＡｃ相当量で約５０μＭ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マンガン、２００μＭＵＤＰ−４Ｆ−Ｇａｌを含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）に東洋紡社製ヒト由来β１，４−ガラクトース転移酵素（８０ｍｕｎｉｔｓ／ｍＬ反応液）を添加し、２５℃、２４時間反応を行った。なお、コントロール反応としてＵＤＰ−４Ｆ−Ｇａｌの代わりにＵＤＰ−Ｇａｌを用いた反応も行った。

反応終了液をそのまま１μｌ分取して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ、Ｂｒｕｋｅｒ社製）を用いて測定したところ、原料物質由来の［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｍ／ｚ１０５９．２９７）の化合物２のピークの他に、４Ｆ−ガラクトースが付加した［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｍ／ｚ１２２３．４５７）のピークを検出したことから、４Ｆ−ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミン含有糖鎖（化合物３）が生成したことを確認した。なお、ＵＤＰ−Ｇａｌを用いた反応においても、ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミン含有糖鎖（化合物４）に対応する［Ｍ＋Ｎａ］＋（ｍ／ｚ１２２１．４７６）のピークを検出した。

参考例２

ＳＰｅｎａｄｅｓらの方法（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＡＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ，（２００３），９，１９０９−１９２１）に準じて合成した化合物Ａ（５２ｍｇ，６９μｍｏｌ）、並びに当該化合物の末端にＮ−アセチルグルコサミンを有する化合物Ｂ（１０ｍｇ，７．６μｍｏｌ）をメタノール（３５ｍＬ）−純水（５ｍＬ）混合溶媒に溶解し、テトラクロロ金酸（２５．５ｍｇ，７５μｍｏｌ）を加えた。この溶液に水素化ホウ素ナトリウム水溶液（７０ｍｇ／５ｍＬ）を少量ずつ加え、室温で１２時間撹拌した。ＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓＹＭ−５０（ミリポア社）を用いた遠心型限外濾過装置により微粒子を精製した。微粒子を純水に溶解し、マトリックスとして２，５−ジヒドロキシベンゾイック酸（ＤＨＢ）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭａｓｓによる質量分析を行ったところ、化合物Ａ、化合物Ｂのヘテロジスルフィド体に対応する分子量ピーク（［Ｍ＋Ｎａ］^＋ｍ／ｚ１０５８．３８９）が観察されたことから、金微粒子にチオール基を有するスペーサーで固定化した化合物１の合成を確認した。

実施例３：４Ｆ−ガラクトース含有糖鎖へのα２，３−シアル酸の転移酵素反応
上記反応終了液をそれぞれミリポア社製遠心型限外ろ過ユニット（マイクロコンＹＭ−１０）を用いて純水に置換した後、上記β１，４−ガラクトース転移反応と同量のスケール（約５０μＭ相当量の糖鎖を含有）で、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マンガン、４００μＭＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）にＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製ラット由来α２，３−（Ｎ）−シアル酸転移酵素（７４ｍｕｎｉｔｓ／ｍＬ反応液）を添加し、２５℃、２４時間反応を行った。

反応開始２４時間後、マイクロコンＹＭ−１０を用いて純水に置換後、減圧乾燥を行った。金微粒子から糖鎖部分を切り離すため、メタノールを溶媒とする１ｍＭヨウ素溶液に溶解させ、室温で約２時間攪拌した。再度減圧乾燥を行い、ヨウ素溶液を除去した後、１０％メタノールを添加し充分にけん濁した後、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により金微粒子画分を除去し、このようにして得られた上清をサンプルとしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ、Ｂｒｕｋｅｒ社製）による分析を行った。

その結果、ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミン含有糖鎖を用いた反応ではシアル酸が転移した［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｍ／ｚ１５１２．６２９）、並びに［Ｍ＋２Ｎａ−Ｈ］^＋（ｍ／ｚ１５３４．６２６）に対応した化合物５のピークを検出することができたが、４Ｆ−ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミン含有糖鎖を用いた反応では、シアル酸が転移した際に検出されうる［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｍ／ｚ１５１４）、並びに［Ｍ＋２Ｎａ−Ｈ］^＋（ｍ／ｚ１５３６）に対応する化合物６のピークを検出することができなかった。このことから４Ｆ−ガラクトース含有糖鎖により少なくともα２，３−シアル酸転移酵素反応が阻害されることが判明した。

実施例４：４−メチルウンベリフェリル４Ｆ−Ｎ−アセチルラクトサミン（４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃ）の合成
４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ（シグマ社製、化合物７）をアクセプターとして用いてβ１，４−ガラクトース転移酵素による４Ｆ−ガラクトースの転移反応を行った。すなわち、１０ｍＭ塩化マンガン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＵ／ｍＬ反応液アルカリホスファターゼ、２０μＭＰＡ化キトビオース、２．３５μＭＵＤＰ−４Ｆ−Ｇａｌを含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）緩衝液にヒト由来β１，４−ガラクトース転移酵素（東洋紡）を添加し（２００ｍＵ／ｍＬ反応液）、２５℃で反応を行った。なお、コントロールとして５０μＭＵＤＰ−Ｇａｌを用いた反応も同様に行った。

反応開始２４時間後に９０℃、５分間の熱処理を行うことで反応を停止させ、これを希釈した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析を行った。分離にはＧＬサイエンス社製のＯＤＳ−３カラムを用い、溶離液として１０％アセトニトリルを用いて分離を行った。検出には蛍光光度計（励起波長３２５ｎｍ、蛍光波長３７２ｎｍ）を用いた。β１，４−ガラクトース転移酵素反応により新たに生成したピークを分取し、これを減圧乾燥した後、ＤＨＢをマトリックスとしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行ったところ、化合物８の［Ｍ＋Ｎａ］^＋に相当するｍ／ｚ５６５．９０のピークを検出したことから、４Ｆ−ガラクトース含有糖鎖、４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃ（化合物８）の生成を確認した。またＨＰＬＣの面積比より１．３４μＭの４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃが生成した。

なお、ＵＤＰ−Ｇａｌを用いたコントロール反応においてもＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにおいて化合物９の［Ｍ＋Ｎａ］^＋に相当するｍ／ｚ５６３．８９のピークを検出し、２０μＭの４ＭＵ−ＬａｃＮＡｃ（化合物９）の生成を確認した。

（２）４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃ（化合物８）及び４ＭＵ−ＬａｃＮＡｃ（化合物９）の大量取得
１０ｍＭ塩化マンガン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＵ／ｍＬ反応液アルカリホスファターゼ、４０μＭ４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ、５５μＭＵＤＰ−４Ｆ−Ｇａｌを含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）にヒト由来β１，４−ガラクトース転移酵素を２００ｍＵ／ｍＬ反応液添加し、２５℃で反応を行った。
１４０時間反応後、９０℃、１０分間の熱処理を行った後、２０，０００ｇ、１０分間の遠心分離により得られた上清を減圧乾燥により濃縮し、ＯＤＳ−３カラムを用いて目的のピークを分取した。分取したものを減圧乾燥し、蒸留水で再溶解させたものをＵｌｔｒａｆｒｅｅＭＣ０．２２μｍ（ミリポア社）を用いて不要物を除去した後、再度減圧乾燥した。これを蒸留水で再溶解させたものを４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃとして以後の実験に供した。
なお、１０ｍＭ塩化マンガン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＵ／ｍＬ反応液アルカリホスファターゼ、１００μＭ４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ、２００μＭＵＤＰ−Ｇａｌを含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）にヒト由来β１，４−ガラクトース転移酵素を４０ｍＵ／ｍＬ反応液添加し、２５℃、４８時間反応を行った後、同様に４ＭＵ−ＬａｃＮＡｃを調製した。

（３）４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃ（化合物８）へのα２，３−シアル酸の転移酵素反応
１０ｍＭ塩化マンガン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２００μＭＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、５０ｍＵ／ｍＬ反応液アルカリホスファターゼ、２０μＭ４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃを含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）にＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製ラット由来α２，３−Ｎ−シアル酸転移酵素を９２．５ｍＵ／ｍＬ反応液添加し、２５℃で反応を行った。なお、コントロールとして４ＭＵ−ＬａｃＮＡｃをアクセプターとして用いた反応も同様に行った。

１、４、１０、２４時間後に一部サンプリングし、４倍量の８０％アセトニトリルを添加し、激しく攪拌することで反応を停止させた。蒸留水で希釈後、ＯＤＳ−３カラム、溶離液として１０％アセトニトリル、２０ｍＭギ酸アンモニウムを用いてＨＰＬＣ分析を行ったところ、α２，３−Ｎ−シアル酸転移酵素によりそれぞれ新たなピークの出現を確認した。これらのピークを分取し、減圧乾燥後、ＤＨＢをマトリックスとしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行った。その結果、４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃを用いた反応においては［Ｍ＋Ｈ］^＋に相当するｍ／ｚ８３５．１３のピークを検出したことから、化合物１０の生成を確認した。また、４ＭＵ−ＬａｃＮＡｃを用いた反応においても［Ｍ＋Ｈ］^＋に相当するｍ／ｚ８３３．０２のピークを検出し化合物１１の生成を確認した。

（４）４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃに対するα２，３−シアル酸転移酵素反応の速度論的解析
４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃが、２０、４０、８０、１５０μＭの各濃度存在下でそれぞれ１０ｍＭ塩化マンガン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＵ／ｍＬ反応液アルカリホスファターゼ、２００μＭＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）にラット由来α２，３−Ｎ−シアル酸転移酵素（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加し（７４ｍＵ／ｍＬ反応液）、２５℃で反応を開始した。
正確に６０分後、４倍量の８０％アセトニトリルを添加し、激しく攪拌することにより反応を停止し、希釈後、ＨＰＬＣによる分析を行った。各濃度での活性を算出後、１／［Ｓ］〜１／ｖプロットを用いて計算したところ、α２，３−シアル酸転移酵素の４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃに対するＫ_ｍ値は１８８μＭ、Ｖ_ｍａｘは１２．６０ｎｍｏｌｅ／ｍｉｎ／ｍｇであった。なお、１Ｕはこの条件下で１分間に１μｍｏｌｅのシアル酸化糖を生成する酵素量として定義した。

また、４ＭＵ−ＬａｃＮＡｃが、２０、４０、８０、１５０μＭの各濃度存在下でそれぞれ１０ｍＭ塩化マンガン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＵ／ｍＬ反応液アルカリホスファターゼ、２００μＭＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）にラット由来α２，３−シアル酸転移酵素を添加し（３７ｍＵ／ｍＬ反応液）、２５℃で８分間反応を行ったところ、ＨＰＬＣ分析により得られた各濃度での活性値から１／［Ｓ］〜１／ｖプロットを用いてＫ_ｍ値は１２９μＭ、Ｖ_ｍａｘは１４６．９ｎｍｏｌｅ／ｍｉｍ／ｍｇであった。

以上の結果を下記表２に示す。この表より、４Ｆ−ガラクトース含有糖鎖である４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃに対するラット由来α２，３−シアル酸転移酵素の触媒効率は４ＭＵ−ＬａｃＮＡｃの６％以下であり、４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃが転移酵素の阻害剤として有用であることが示唆された。

（５）４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃへのα２，６−シアル酸の転移酵素反応
１０ｍＭ塩化マンガン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２００μＭＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、５０ｍＵ／ｍＬ反応液アルカリホスファターゼ、２０μＭ４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃを含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）にＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製ラット由来α２，６−Ｎ−シアル酸転移酵素を１０ｍＵ／ｍＬ反応液添加し、２５℃で反応を行った。なお、コントロールとして４ＭＵ−ＬａｃＮＡｃをアクセプターとして用いた反応も同様に行った。

１、４、１０、２４時間後に一部サンプリングし、４倍量の８０％アセトニトリルを添加し、激しく攪拌することで反応を停止させた。蒸留水で希釈後、ＯＤＳ−３カラム、溶離液として１０％アセトニトリル、２０ｍＭギ酸アンモニウムを用いてＨＰＬＣ分析を行ったところ、α２，６−Ｎ−シアル酸転移酵素反応によりそれぞれ新たなピークの出現を確認した。これらのピークを分取し、減圧乾燥後、ＤＨＢをマトリックスとしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行った。その結果、４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃへの反応においては［Ｍ＋Ｎａ］^＋に相当するｍ／ｚ８５６．８８のピークを検出したことから、化合物１２の生成を確認した。また、４ＭＵ−ＬａｃＮＡｃへの反応においても［Ｍ＋Ｎａ］^＋に相当するｍ／ｚ８５５．０６のピークを検出し化合物１３の生成を確認した。

（６）４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃに対するα２，６−シアル酸転移酵素反応の速度論的解析
４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃを、２０、４０、８０、１２０、１５０μＭの各濃度存在下でそれぞれ１０ｍＭ塩化マンガン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＵ／ｍＬ反応液アルカリホスファターゼ、２００μＭＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）にラット由来α２，６−Ｎ−シアル酸転移酵素（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加し（４０ｍＵ／ｍＬ反応液）、２５℃で反応を開始した。

正確に１２０分後、１／５倍量の１ＭＮａＯＨを添加することにより反応を停止し、ＨＰＬＣ溶離液で中和、希釈後、ＨＰＬＣによる分析を行った。各濃度での活性を算出後、１／［Ｓ］〜１／ｖプロットを用いて計算したところ、１／ｖ＝２６０．２７／［Ｓ］−０．１００５の式が得られたため、Ｋ_ｍ値、並びにＶ_ｍａｘ値を算出することが出来なかった。なお、１Ｕはこの条件下で１分間に１μｍｏｌｅのシアル酸化糖を生成する酵素量として定義した。
また、４ＭＵ−ＬａｃＮＡｃを、２０、４０、８０、１２０、１５０μＭの各濃度存在下でそれぞれ１０ｍＭ塩化マンガン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＵ／ｍＬ反応液アルカリホスファターゼ、２００μＭＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）にラット由来α２，６−シアル酸転移酵素を添加し（４０ｍＵ／ｍＬ反応液）、２５℃で１０分間反応を行った。ＨＰＬＣ分析により得られた各濃度での活性値から１／［Ｓ］〜１／ｖプロットを用いてＫ_ｍ値は２１７μＭ、Ｖ_ｍａｘは６５．２４ｎｍｏｌｅ／ｍｉｍ／ｍｇであった。

各濃度での活性を比較すると、下記表３に示すように、４Ｆ−ガラクトース含有糖鎖である４ＭＵ−４Ｆ−ＬａｃＮＡｃに対してラット由来α２，６−シアル酸転移酵素の活性が明らかに減少し、転移酵素の阻害剤として有用であることが示された。

実施例５：ピリジルアミノ化ガラクトシルキトビオースの合成
（１）ピリジルアミノ化４Ｆ−ガラクトシルキトビオースの合成
キトビオース（ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、シグマ）を公知の方法（Ｈａｓｅら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９５，１９７−２０３（１９８４））に従ってピリジルアミノ（ＰＡ）化を行い、ゲルろ過、並びに凍結乾燥により精製標品を取得した（化合物１４）。これをアクセプターとしてβ１，４−ガラクトース転移酵素による４Ｆ−ガラクトースの転移反応を行った。すなわち、１０ｍＭ塩化マンガン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５μＭＰＡ化キトビオース、４．７μＭＵＤＰ−４Ｆ−Ｇａｌを含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）緩衝液にヒト由来β１，４−ガラクトース転移酵素（東洋紡）を１６０ｍＵ／ｍＬ反応液添加し、２５℃で反応を行った。なお、コントロールとして１００μＭＵＤＰ−Ｇａｌを用いた反応も同様に行った。

反応開始１０時間後に９０℃、５分間の熱処理により反応を停止させ、これを蒸留水で希釈した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析を行った。分離には野村化学社製のＤｅｖｅｌｏｓｉｌＣ３０−ＵＧ−５カラムを用い、溶離液として１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ３．８）、並びに１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ３．８）＋０．５％（ｗ／ｖ）１−ブタノールを用い、両溶液による勾配をかけることで分離を行った。反応により新たに生成したピークを分取し、これを減圧乾燥による濃縮、ＺｉｐＴｉｐ_Ｃ１８による脱塩後、得られた吸着画分についてＤＨＢをマトリックスとしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ、Ｂｒｕｋｅｒ社）を行った。その結果、化合物１５の［Ｍ＋Ｎａ］^＋に相当するｍ／ｚ６９０．０２のピークを検出したことから、４Ｆ−化ガラクトシル化糖の生成を確認した。またＨＰＬＣの面積比より３．８０μＭのＰＡ化４Ｆ−ガラクトシル化キトビオース（化合物１５）が生成した。なおＵＤＰ−Ｇａｌを用いたコントロール反応においてもＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにおいて化合物１６の［Ｍ＋Ｎａ］^＋に相当するｍ／ｚ６８７．５６のピークを検出し、２３．５μＭのＰＡ化ガラクトースキトビオース（化合物１６）が生成した。

（２）ＰＡ化４Ｆ−ガラクトシルキトビオース（化合物１５）及びＰＡ化ガラクトシルキトビオース（化合物１６）の大量取得
１０ｍＭ塩化マンガン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５μＭＰＡ化キトビオース、２．３５μＭＵＤＰ−４Ｆ−Ｇａｌを含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）にヒト由来β１，４−ガラクトース転移酵素を２００ｍＵ／ｍＬ反応液添加し、２５℃で反応を行った。
３６時間後、９０℃、５分間の熱処理を行った後、減圧乾燥により反応液を濃縮し、ＤｅｖｅｌｏｓｉｌＣ３０−ＵＧ−５カラムを用いて目的のピークを分取した。これを減圧乾燥により濃縮した後、２０ｍＭ炭酸水素アンモニウムで平衡化した東ソー社製ＴＳＫｇｅｌ−Ｏｌｉｇｏ−ＰＷカラムを用いて脱塩処理を行った。目的ピークを回収後、減圧乾燥を行い、これを蒸留水で再溶解させたものをＰＡ化４Ｆ−ガラクトシルキトビオース（化合物１５）として以後の実験に供した。

なお、１０ｍＭ塩化マンガン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５μＭＰＡ化キトビオース、５０μＭＵＤＰ−Ｇａｌを含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）にヒト由来β１，４−ガラクトース転移酵素を２００ｍＵ／ｍＬ反応液添加し、２５℃、８時間反応を行った後、同様にＰＡ化ガラクトシルキトビオース（化合物１６）を調製した。

（３）ＰＡ化４Ｆ−ガラクトシルキトビオースへのα２，３−シアル酸の転移反応
１０ｍＭ塩化マンガン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００μＭＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１０μＭＰＡ化４Ｆ−ガラクトシル化キトビオースを含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）にＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製ラット由来α２，３−Ｎ−シアル酸転移酵素を１００ｍＵ／ｍＬ反応液添加し、２５℃で反応を行った。なお、コントロールとしてＰＡ化ガラクトシルキトビオースをアクセプターとして用いた反応も同様に行った。
２．５、２４時間後に一部サンプリングした後、９倍量の１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ４．３）を添加し、激しく攪拌することで反応を停止させた。これらをＣ３０−ＵＧ−５カラムを用いてＨＰＬＣ分析を行ったところ、α２，３−Ｎ−シアル酸転移酵素反応によりそれぞれ新たなピークが出現したことを確認した。これらのピークを分取し、減圧乾燥後、続いて２０ｍＭ炭酸水素アンモニウムで平衡化した東ソー社製ＴＳＫｇｅｌ−Ｏｌｉｇｏ−ＰＷカラムを用いて目的ピークを回収後減圧乾燥し、ＤＨＢをマトリックスとしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行った。その結果、ＰＡ化４Ｆ−ガラクトシルキトビオースへの反応においては［Ｍ＋Ｈ］^＋に相当するｍ／ｚ９５９．４５のピークを検出したことから、化合物１７が生成したことを確認した。また、ＰＡ化ガラクトシルキトビオースへの反応においても［Ｍ＋Ｈ］^＋に相当するｍ／ｚ９５７．３１のピークを検出し、化合物１８の生成を確認した。
なお、ＨＰＬＣのピーク面積比より両化合物の転換率を比較した結果、ＰＡ化４Ｆ−ガラクトシルキトビオースをアクセプターとする反応ではα２，３−シアル酸酵素の反応率が著しく減少し、阻害剤として有用であることが判明した。

（４）ＰＡ化４Ｆ−ガラクトシルキトビオースへのα２，６−シアル酸の転移反応
１０ｍＭ塩化マンガン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００μＭＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１０μＭＰＡ化４Ｆ−ガラクトシル化キトビオースを含有する１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）にＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製ラット由来α２，６−Ｎ−シアル酸転移酵素を４０ｍＵ／ｍＬ反応液添加し、２５℃で反応を行った。なお、コントロールとしてＰＡ化ガラクトシルキトビオースをアクセプターとして用いた反応も同様に行った。

１、２．５、８、２４時間後に一部サンプリングした後、１９倍量の０．５Ｍトリエチルアミン−酢酸（ｐＨ７．３）：アセトニトリル＝２５：７５を添加し、激しく攪拌することで反応を停止させた後、ＨＰＬＣによる分析を行った。分離には東ソー社製のＡｍｉｄｅ−８０カラムを用い、溶離液として１０ｍＭトリエチルアミン−酢酸（ｐＨ７．３）：アセトニトリル＝２５：７５、並びに０．５Ｍトリエチルアミン−酢酸（ｐＨ７．３）：アセトニトリル＝２５：７５を用い、両溶液による勾配をかけることで分離を行った。反応により新たに生成したピークを分取し、これを減圧乾燥した後、ＤＨＢをマトリックスとしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行ったところ、化合物１９の［Ｍ＋Ｈ］^＋に相当するｍ／ｚ６５９．７４のピークを検出したことから、化合物１９の生成を確認した。なお、ＵＤＰ−Ｇａｌを用いたコントロール反応においてもＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにおいて化合物２０の［Ｍ＋Ｈ］^＋に相当するｍ／ｚ６５７．７４のピークを検出したことから、化合物２０の生成も確認した。

なお、ＨＰＬＣのピーク面積比より、各化合物の転換率を比較した結果、ＰＡ化４Ｆ−ガラクトシルキトビオースに対してα２，６−シアル酸酵素の反応率が著しく減少し、阻害剤として有用であることが明らかとなった。

Claims

糖供与体として下記式（II）

（式中、Ｍ^＋は水素イオン又は金属イオンを示し、Ｘはハロゲン原子を示す）
で表されるハロゲン化ＵＤＰ−Ｇａｌを用い、β１，４−ガラストース転移酵素又はβ１，３−ガラクトース転移酵素により、式（Ａ）

（式中、Ｒ^５は水素原子；水酸基；ガラクトース、グルコース、マンノース、フルクトース、リボース、アラビノース、キシロース、キシリロース、リブロース、エリトロース、トレオース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、タガトース、ソルボース、プシコース、Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトヘプトース、Ｄ−グリセロ−グルコヘプトース、ＤＬ−グリセロ−Ｄ−マンノヘプトース、アロヘプツロース、アルトヘプツロース、タロヘプツロース、マンノヘプツロース、オクツロース、ノヌロース、Ｄ−グリセロ−Ｌ−ガラクトオクツロース、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノオクツロース、ノムロース、フコース、ラムノース、アロメチロース、キノボース、アンチアロース、タロメチロース、ジキタロース、ジギドキソース、シマロース、チベロース、アベロース、パラトース、コリトース、アスカリロース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、イズロン酸、グルロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチル−Ｏ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコイルノイラミン酸及びムラミン酸から選ばれる単糖；マルトース、セロビオース、ラクトース、キシロビオース、イソマルトース、ケンチオビオース、メリビオース、プランテオビオース、ルチノース、プリメベロース、ビシアノース、ニゲロース、ラミナリビオース、ツラノース、コージビオース、ソホロース、スクロース、トレハロース、キトビース、ヒアロビオウロン酸、コンドロシン、セロビオウロン酸、ラフィノース、ゲンチアノース、メレジトース、ブランテオース、ケストース、マルトトリオース、パノース、イソマルトトリオース、スタキオース、ベルバスコース及び乳汁オリゴ糖から選ばれるオリゴ糖；又はタンパク質、脂質、核酸、金属微粒子、磁性金属微粒子及び高分子ポリマーから選ばれる担体を示す）
で表されるＮ−アセチルグルコサミン含有受容体に４位ハロゲン化ガラクトース残基を転移することを特徴とする、式（Ｉ）

（式中、Ｒは、式（Ａ）の化合物が３位又は４位で結合した基を示し、Ｘはハロゲン原子を示す）
で表される４−ハロゲン化ガラクトース残基を末端に有するオリゴ糖の製造法。
式（Ｉ）で表される化合物が、式（Ｉ’）

（式中、Ｘ及びＲ^５は前記と同じ）
で表される化合物である請求項１記載の製造法。
式（III）

（式中、Ｘはハロゲン原子を示す）
で表される化合物を大腸菌由来のガラクトカイネースを用いてリン酸化して式（IV）

（式中、Ｒ^４はリン酸残基又はその塩を示し、Ｘはハロゲン原子を示す）
の化合物を得、得られた式（IV）の化合物とウリジン５’−ジリン酸ヘキソースから大腸菌由来のヘキソース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼを用いて式（II）

（式中、Ｍは水素イオン又は金属イオンを示し、Ｘはハロゲン原子を示す）
で表されるハロゲン化ＵＤＰ−Ｇａｌの製造法。
ウリジン５’−ジリン酸ヘキソースが、ウリジン５’−ジリン酸グルコースである請求項３記載の製造法。