CN115927507A - 一种糖苷磷酸化酶联合单糖激酶及聚磷酸激酶制备寡糖的方法 - Google Patents
一种糖苷磷酸化酶联合单糖激酶及聚磷酸激酶制备寡糖的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种糖苷磷酸化酶联合单糖激酶及聚磷酸激酶制备寡糖的方法。包括步骤以供体单糖、受体糖、聚磷酸盐、低当量腺苷磷酸为底物，向底物中加入氯化镁，然后由聚磷酸酶、单糖激酶及糖苷磷酸化酶在25～40℃下联合催化反应1.5～22h，生成寡糖粗产物，经纯化后，得到寡糖。本发明提供了一种以单糖、受体底物、聚磷酸盐、低当量腺苷磷酸为底物，实现重要寡糖制备的方法，通过聚磷酸激酶以聚磷酸盐为底物实现ATP再生，有效解决了生物酶法合成寡糖过程中因需要添加大量昂贵糖核苷酸供体和辅助因子ATP，导致成本过高无法规模化生产的问题。应用本发明方法成功合成了乳酰‑N‑二糖、半乳酰‑N‑二糖、几丁二糖、蛋白N‑糖链核心三糖衍生物。
Description
技术领域
本发明涉及了一种糖苷磷酸化酶联合单糖激酶及聚磷酸激酶制备寡糖的方法，属于生物合成技术领域。
背景技术
糖类化合物是自然界中最丰富的生物聚合物，作为大多数活生物体的一部分，广泛存在于植物、动物和微生物中。这些糖类化合物由单糖及其衍生物聚合形成寡糖、多糖，还可以与蛋白质、脂肪链通过共价键形成糖蛋白、糖脂等糖缀合物。特定结构的寡糖、多糖等糖链具有重要生物学功能，已经并不断应用于医药、人口健康等领域。
除了由天然产物提取，化学合成和酶法合成是糖链制备的重要方法。化学法合成需要多次保护、脱保护和选择性修饰等步骤，存在操作繁琐、产率低、污染环境等问题。生物酶法使用酶催化合成结构特定的寡糖或聚糖，操作简单、产率相对更高、环境友好。在寡糖的酶法合成中，主要包括三类常用的酶：糖基转移酶，糖苷水解酶及其工程化突变体转糖基酶，还有糖苷磷酸化酶(glycoside phosphorylases，GPs)。
酶法合成中最常用的工具酶是糖基转移酶，催化活化的糖基供体糖核苷酸与未活化的糖基受体生成糖苷键。糖基转移酶反应需要利用糖核苷酸作为供体底物，但是糖核苷酸价格昂贵，糖基化过程会受到副产物核苷二磷酸反馈抑制，此外糖基转移酶来源有限等，这些因素限制了糖基转移酶在规模化糖合成方面的应用。
相比于糖基转移酶，糖苷磷酸化酶(GPs)利用单糖-1-磷酸(单糖-1-P)作为供体底物，具有供体底物易于获得、成本低等优势，同时GPs一般具有更宽泛的底物特异性。人们发现最早、应用研究较广的是葡萄糖苷磷酸化酶，典型的应用实例如应用于制备作为化妆品添加剂等使用的甘油葡糖苷，作为功能食品的纤维素寡糖/纤维素糊精等。葡萄糖苷磷酸化酶以葡萄糖-1-磷酸为供体底物合成寡糖，而葡萄糖-1-磷酸可由蔗糖磷酸化酶以蔗糖为底物获得。
除合成葡萄糖苷以外，GPs作为生物催化剂合成其它类型重要糖链也有应用，主要体现在半乳糖(galactose，Gal)、N-乙酰葡糖胺(N-acetyl-glucosamine，GlcNAc)和甘露糖(mannose，Man)相关的GPs的发现及其寡糖合成应用。例如利用婴儿双歧杆菌Bifidobacterium infantis来源的半乳糖基-beta1,3-N-乙酰基-D-己糖胺磷酸化酶(BiGHNP)以半乳糖-1-磷酸(Gal-1-P)合成人乳寡糖组分乳酰-N-二糖(lacto-N-biose，Gal-beta1,3-GlcNAc，LNB)、半乳酰-N-二糖(galacto-N-biose，Gal-beta1,3-GalNAc，GNB)，肿瘤相关糖抗原T-抗原、唾液酸化T-抗原、Lewis a等。还有Vibrio proteolyticus等来源的几丁二糖磷酸化酶(chitobiose phosphorylase，VpCPase)由GlcNAc-1-P合成几丁二糖。以及Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482来源的beta1,4-甘露糖磷酸化酶BtMPase以甘露糖-1-磷酸(Man-1-P)合成1,2-顺式甘露糖苷，包括蛋白N-糖链核心三糖Man-beta1,4-GlcNAc-beta1,4-GlcNAc等。
Gal、GlcNAc及Man相关GPs合成寡糖需要相应的单糖-1-P，即Gal-1-P、GlcNAc-1-P及Man-1-P，这三种单糖-1-P主要是通过ATP(腺苷三磷酸)依赖的单糖激酶(GlyK)催化合成，比如来源于Bifidobacterium infantis、大肠杆菌等的半乳糖激酶GalK催化合成Gal-1-P，来源于Bifidobacterium longum的NahK催化合成GlcNAc-1-P及Man-1-P。单糖激酶与GPs联合进行一锅反应可以由ATP、单糖(Gal、GlcNAc、Man)、受体糖底物制备糖苷产物(半乳糖苷、GlcNAc糖苷、甘露糖苷)，并产生副产物ADP和磷酸根，具体过程如下式所示。
单糖激酶与GPs联合反应可以推动GPs催化的可逆反应向寡糖合成方向进行，使得BiGHNP催化寡糖LNB、GNB合成得率可达90％以上，也为方便制备蛋白N-糖链核心三糖Man-beta1,4-GlcNAc-beta1,4-GlcNAc提供了方法。然而，这些合成反应需要大量的ATP，导致成本很高，严重限制了寡糖的大规模生产。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供了一种糖苷磷酸化酶联合单糖激酶及聚磷酸激酶制备寡糖的方法。通过糖苷磷酸化酶GP联合单糖激酶GlyK、聚磷酸激酶PPK合成寡糖，解决了酶法合成寡糖过程中需要添加大量昂贵糖核苷酸供体和辅助因子ATP的问题，本发明提供了利用微生物来源的聚磷酸盐激酶EbPPK、单糖激酶GalK或NahK、糖苷磷酸化酶BiGHNP或VpCPase或BtMPase催化合成寡糖的方法，并应用于寡糖的制备，实现了四种寡糖LNB、GNB、几丁二糖、蛋白N-糖链核心三糖衍生物的简单、高效酶法合成制备。
本发明的技术方案如下：
一种糖苷磷酸化酶联合单糖激酶及聚磷酸激酶制备寡糖的方法，包括步骤如下：
以供体单糖、受体糖、聚磷酸盐、低当量腺苷磷酸为底物，向底物中加入氯化镁，然后由聚磷酸酶、单糖激酶及糖苷磷酸化酶在25～40℃下联合催化反应1.5～22h，生成寡糖粗产物，经纯化后，得到寡糖。
根据本发明优选的，所述供体单糖包括半乳糖(Gal)、N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)和甘露糖(Man)。所述供体单糖相对应的单糖-1-磷酸可以由一种腺苷三磷酸ATP依赖的激酶以单糖和ATP合成获得，并且其单糖-1-磷酸可以作为相应糖苷磷酸化酶的供体底物。
根据本发明优选的，所述供体单糖的终浓度为40～100mM。
根据本发明优选的，所述受体糖包括N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)、N-乙酰-D-氨基半乳糖(GalNAc)、几丁二糖衍生物(GlcNAc-beta1,4-GlcNAc-beta-EthN3)。
根据本发明优选的，所述受体糖的终浓度为40～70mM。
根据本发明优选的，所述寡糖包括乳酰-N-二糖、半乳酰-N-二糖、几丁二糖与蛋白N-糖链核心三糖衍生物，与底物相对应。
根据本发明优选的，所述聚磷酸盐为聚合度为2个磷酸及以上的磷酸化合物的金属盐；
进一步优选的，所述聚磷酸盐为六偏磷酸钠或三聚磷酸钠。
根据本发明优选的，所述聚磷酸盐的终浓度为20～40mM。
根据本发明优选的，所述低当量腺苷磷酸为腺苷一磷酸(AMP)或腺苷二磷酸(ADP)或腺苷三磷酸(ATP)。
根据本发明优选的，所述低当量腺苷磷酸的终浓度为2～3mM。
根据本发明优选的，所述氯化镁的终浓度为40～60mM。
根据本发明优选的，所述单糖激酶(GlyK)为单糖激酶GalK或单糖激酶NahK。
所述单糖激酶GalK来源于Bifidobacterium infantis，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，编码基因序列如SEQ ID NO.2所示；其编码基因序列经过密码子优化，适宜在大肠杆菌中重组表达。
所述单糖激酶NahK来源于Bifidobacterium longum，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码基因序列如SEQ ID NO.8所示；其编码基因序列经过密码子优化，适宜在大肠杆菌中重组表达。
根据本发明优选的，所述单糖激酶的终浓度为0.3～1.5mg/mL。
根据本发明优选的，所述聚磷酸盐激酶(PPK)为聚磷酸盐激酶EbPPK，来源于Erysipelotrichaceae bacterium，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码基因序列如SEQID NO.4所示；其编码基因序列经过密码子优化，适宜在大肠杆菌中重组表达。
根据本发明优选的，所述聚磷酸盐激酶的终浓度为0.1～0.7mg/mL。
根据本发明优选的，所述糖苷磷酸化酶(GP)为糖苷磷酸化酶BiGHNP、糖苷磷酸化酶VpCPase或糖苷磷酸化酶BtMPase；
所述糖苷磷酸化酶BiGHNP来源于Bifidobacterium infantis，氨基酸序列如SEQID NO.5所示，编码基因序列如SEQ ID NO.6所示；其编码基因序列经过密码子优化，适宜在大肠杆菌中重组表达。
所述糖苷磷酸化酶VpCPase来源于Vibrio proteolyticus，氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示，编码基因序列如SEQ ID NO.10所示；其编码基因序列经过密码子优化，适宜在大肠杆菌中重组表达。
所述糖苷磷酸化酶BtMPase来源于于Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482，氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码基因序列如SEQ ID NO.12所示；其编码基因序列经过密码子优化，适宜在大肠杆菌中重组表达。
根据本发明优选的，所述糖苷磷酸化酶的终浓度为0.2～2mg/mL。
根据本发明优选的，所述单糖激酶GalK、单糖激酶NahK、聚磷酸盐激酶EbPPK、糖苷磷酸化酶为BiGHNP、糖苷磷酸化酶VpCPase和糖苷磷酸化酶BtMPase的制备方法，包括步骤如下：
(1)以单糖激酶GalK的编码基因为目的基因，以pET-22b为载体质粒，构建重组表达载体；再分别以单糖激酶NahK、聚磷酸盐激酶EbPPK、糖苷磷酸化酶BiGHNP、糖苷磷酸化酶VpCPase和糖苷磷酸化酶BtMPase的编码基因为目的基因，以pET-30a为载体质粒，构建重组表达载体，然后分别将重组表达载体转化至大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；
(2)选择转化成功的重组大肠杆菌扩大培养，加入终浓度为0.1～1mM的IPTG或者添加0.1～1％的乳糖进行诱导，收集菌液后进行破碎和离心，分别得到重组大肠杆菌的上清液；
(3)采用固定化金属离子亲和层析色谱对上清液进行纯化，分别得到单糖激酶GalK、NahK，聚磷酸盐激酶EbPPK和糖苷磷酸化酶BiGHNP、VpCPase、BtMPase。
根据本发明优选的，生成的寡糖为乳酰-N-二糖(LNB)或半乳酰-N-二糖(GNB)时，具体制备方法如下：
在水中混合作为供体单糖的半乳糖，以及作为受体糖的N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)或N-乙酰-D-氨基半乳糖(GalNAc)、AMP、聚磷酸盐(PolyPn)、氯化镁，调节pH至8.0，加入单糖激酶GalK、糖苷磷酸化酶BiGHNP和聚磷酸盐激酶EbPPK，在37℃，110rpm下反应1.5h，终止反应，分离纯化得到乳酰-N-二糖或半乳酰-N-二糖；
其中，所述半乳糖的终浓度为60～80mM；所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)或N-乙酰-D-氨基半乳糖(GalNAc)终浓度为40～50mM；所述AMP、聚磷酸盐、氯化镁的终浓度依次为2mM、20mM、40mM；所述加入单糖激酶GalK、糖苷磷酸化酶BiGHNP和聚磷酸盐激酶EbPPK的终浓度分别为0.3～0.7mg/mL、0.2～0.5mg/mL、0.1～0.2mg/mL；所述终止反应为加入等体积冷乙醇，4℃、30min终止反应。
根据本发明优选的，生成的寡糖为几丁二糖(GlcNAc-beta1,4-GlcNAc)时，具体制备方法如下：
在水中混合N-乙酰-D-氨基葡萄糖、AMP、聚磷酸盐、氯化镁，Tris-HCl溶液，调节pH至7.5，加入单糖激酶NahK、糖苷磷酸化酶VpCPase和聚磷酸盐激酶EbPPK，在37℃下反应6h，终止反应，分离纯化得到几丁二糖；
其中，所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖的终浓度为90～100mM；所述AMP、聚磷酸盐、氯化镁、Tris-HCl溶液的终浓度依次为3mM、30mM、60mM、200mM；所述单糖激酶NahK、糖苷磷酸化酶VpCPase和聚磷酸盐激酶EbPPK的终浓度分别0.5～1.5mg/mL、0.5～2mg/mL、0.3～0.7mg/mL；所述终止反应为加入等体积冷乙醇，4℃、30min终止反应。所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖既是供体单糖又是受体糖。
根据本发明优选的，生成的寡糖为蛋白N-糖链核心三糖衍生物(Man-beta1,4-GlcNAc-beta1,4-GlcNAc-beta-EthN3)时，具体制备方法如下：
在水中混合甘露糖、几丁二糖衍生物、AMP、聚磷酸盐、氯化镁，Tris-HCl溶液，调节pH至7.5，单糖激酶NahK、糖苷磷酸化酶BtMPase和聚磷酸盐激酶EbPPK，在37℃下反应22h，终止反应，分离纯化得到蛋白N-糖链核心三糖衍生物；
其中，所述甘露糖的终浓度为60～80mM；所述几丁二糖衍生物的终浓度为40～50mM；所述AMP、聚磷酸盐、氯化镁、Tris-HCl溶液的终浓度依次为2mM、20mM、40mM、100mM；所述单糖激酶NahK、糖苷磷酸化酶BtMPase和聚磷酸盐激酶EbPPK的终浓度分别0.7～1.5mg/mL、0.7～1.5mg/mL、0.3～0.6mg/mL；所述终止反应为加入等体积冷乙醇，4℃、30min终止反应。
所述几丁二糖衍生物(GlcNAc-beta1,4-GlcNAc-beta-EthN3)由几丁二糖经端基化学衍生得到，衍生方法参考文献Beilstein J.Org.Chem.2013,9,1867-1872。端基衍生的目的是便于进行化学结构分析，本方法可以应用于合成Man-beta1,4-GlcNAc-beta1,4-GlcNAc三糖及其端基衍生物。
根据本发明优选的，所述纯化的具体为：离心去除沉淀，以活性炭吸附、分子排阻层析色谱、离子交换色谱法进行纯化；
具体的，当寡糖产物为乳酰-N-二糖或半乳酰-N-二糖时，反应液经选Bio-Gel P2色谱柱纯化，将产物二糖与原料单糖分离得到粗产物；粗产物经DEAE-Cellulose 52纯化得到高纯度产物；其中，DEAE-Cellulose 52纯化粗产物的步骤为：以去离子水为流动相，流速为5～6mL/min，收集流分并用TLC检测产物，将含有产物的流分使用旋转蒸发仪浓缩，再冷冻干燥，得到乳酰-N-二糖或半乳酰-N-二糖；
当寡糖产物为几丁二糖或蛋白N-糖苷核心三糖衍生物时，反应液经活性炭吸附除盐；反应处理液或活性炭吸附除盐后的洗脱液经Bio-Gel P2色谱柱纯化，得到粗产物；粗产物经经DEAE-Cellulose 52纯化得到高纯度产物；其中，活性炭粗纯化的步骤为：首先以去离子水为流动相冲洗三个柱体积；随后以2wt％乙醇为流动相，洗脱杂质；30wt％乙醇水溶液洗脱，收集得到几丁二糖或蛋白N-糖苷核心三糖衍生物。
本发明的技术特点：
本发明是以低当量腺苷磷酸和聚磷酸盐(PolyPn)为底物，由聚磷酸盐激酶催化生成ATP，单糖激酶利用生成的ATP催化单糖生成单糖-1-磷酸和ADP，ADP可以由聚磷酸盐激酶催化再生成ATP，糖苷磷酸化酶GP以单糖-1-磷酸为供体，催化生成相应糖苷，具体过程如式(I)所示。
有益效果：
1、本发明提供了一种以单糖、受体底物、聚磷酸盐、低当量腺苷磷酸(AMP或ADP)为底物，实现重要寡糖制备的方法，通过聚磷酸激酶以聚磷酸盐为底物实现ATP再生，有效解决了生物酶法合成寡糖过程中因需要添加大量昂贵糖核苷酸供体和辅助因子ATP，导致成本过高无法规模化生产的问题。本发明大大减少了腺苷磷酸的使用量，仅仅相当于现有技术的1/20当量。
2、本发明应用该寡糖合成方法制备了乳酰-N-二糖(LNB，Gal-beta1,3-GlcNAc)、半乳酰-N-二糖(GNB，Gal-beta1,3-GalNAc)、几丁二糖(GlcNAc-beta1,4-GlcNAc)、蛋白N-糖链核心三糖衍生物(Man-beta1,4-GlcNAc-beta1,4-GlcNAc-beta-EthN3)。本发明的生物酶法步骤简单、经济高效，适用于重要寡糖或多糖的规模化制备，具有极大的应用价值。
附图说明
图1是制备的单糖激酶GalK的SDS-PAGE电泳图；
其中，1为重组表达大肠杆菌的胞内蛋白样品，2为细胞裂解液离心后的上清液，3为细胞裂解液离心后的沉淀重悬液；4为镍离子亲和层析纯化过程中的流穿液，5为杂蛋白洗脱液，6为目的蛋白洗脱液。
图2是制备的糖苷磷酸化酶BiGHNP的SDS-PAGE电泳图；
其中，1为重组表达大肠杆菌的胞内蛋白样品，2为细胞裂解液离心后的上清液，3为细胞裂解液离心后的沉淀重悬液；4为镍离子亲和层析纯化过程中的流穿液，5为杂蛋白洗脱液，6为目的蛋白洗脱液。
图3是制备的聚磷酸盐激酶EbPPK的SDS-PAGE电泳图；
其中，1为细胞裂解液离心后的上清液，2为镍离子亲和层析纯化过程中的流穿液，3为杂蛋白洗脱液，4为目的蛋白洗脱液。
图4是制备的单糖激酶NahK的SDS-PAGE电泳图；
其中，1为重组表达大肠杆菌的胞内蛋白样品，2为细胞裂解液离心后的上清液，3为细胞裂解液离心后的沉淀重悬液；4为镍离子亲和层析纯化过程中的流穿液，5为杂蛋白洗脱液，6为目的蛋白洗脱液。
图5是制备的糖苷磷酸化酶VpCPase的SDS-PAGE电泳图；
其中，1为细胞裂解液离心后的上清液，2为细胞裂解液离心后的沉淀重悬液；3为镍离子亲和层析纯化过程中的流穿液，4为杂蛋白洗脱液，5为目的蛋白洗脱液。
图6是制备的糖苷磷酸化酶BtMPase的SDS-PAGE电泳图；
其中，1为重组表达大肠杆菌的胞内蛋白样品，2为细胞裂解液离心后的上清液，3为细胞裂解液离心后的沉淀重悬液；4为镍离子亲和层析纯化过程中的流穿液，5为杂蛋白洗脱液，6为目的蛋白洗脱液。
图7是实施例2中酶反应的TLC分析结果图；
其中，1为Gal标准品，2为GlcNAc标准品，3为LNB标准品，4为反应体系。
图8是乳酰-N-二糖(LNB，Gal-beta1,3-GlcNAc)的高分辨质谱检测结果。
图9是乳酰-N-二糖(LNB，Gal-beta1,3-GlcNAc)的核磁共振1H谱。
图10是乳酰-N-二糖(LNB，Gal-beta1,3-GlcNAc)的核磁共振13C谱。
图11是探究最适聚磷酸盐(PolyPn)浓度的TLC分析结果图；
其中，1为半乳糖标准品，2为GlcNAc标准品，3为AMP标准品，4为ATP标准品，5为LNB标准品，6为含5mM PolyPn的反应液，7为含5mM PolyPn的空白对照，8为含10mM PolyPn的反应液，9为含10mM PolyPn的空白对照，10为含15mM PolyPn的反应液，11为含15mM PolyPn的空白对照，12为含20mM PolyPn的反应液，13为含20mM PolyPn的空白对照；
图12是探究最适AMP浓度的TLC分析结果图；
其中，1为Gal标准品，2为GlcNAc标准品，3为AMP标准品，4为ATP标准品，5为LNB标准品，6为含2mM AMP的反应液，7为含2mM AMP的空白对照，8为含5mM AMP的反应液，9为含5mM AMP的空白对照，10为含8mM AMP的反应液，11为含8mM AMP的空白对照，12为含11mMAMP的反应液，13为含11mM AMP的空白对照；
图13是探究最适氯化镁(MgCl2)浓度的TLC分析结果图；
其中，1为Gal标准品，2为GlcNAc标准品，3为AMP标准品，4为ATP标准品，5为LNB标准品，6为含20mM MgCl2的反应液，7为含20mM MgCl2的空白对照，8为含30mM MgCl2的反应液，9为含30mM MgCl2的空白对照，10为含40mM MgCl2的反应液，11为含40mM MgCl2的空白对照，12为含50mM MgCl2的反应液，13为含50mM MgCl2的空白对照；
图14是探究最适pH的TLC分析结果图；
其中，1为Gal标准品，2为GlcNAc标准品，3为AMP标准品，4为ATP标准品，5为LNB标准品，6为pH 4的反应液，7为pH 4的空白对照，8为pH 5的反应液，9为pH 5的空白对照，10为pH 6的反应液，11为pH 6的空白对照，12为pH 7的反应液，13为pH 7的空白对照，14为pH 8的反应液，15为pH 8的空白对照；
图15是实施例4中酶反应的TLC分析结果图；
其中，1为半乳糖标准品，2为GalNAc标准品，3为GNB标准品，4为反应体系。
图16是半乳酰-N-二糖(GNB，Gal-beta1,3-GalNAc)的高分辨质谱检测结果。
图17是半乳酰-N-二糖(GNB，Gal-beta1,3-GalNAc)的核磁共振1H谱。
图18是半乳酰-N-二糖(GNB，Gal-beta1,3-GalNAc)的核磁共振13C谱。
图19是实施例5中酶反应的TLC分析结果图；
其中，1为GlcNAc标准品，2为N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸(GlcNAc-1-P)标准品，3为GlcNAc-beta1,4-GlcNAc标准品，4为反应体系；
图20是几丁二糖(GlcNAc-beta1,4-GlcNAc)的高分辨质谱检测结果。
图21是几丁二糖(GlcNAc-beta1,4-GlcNAc)的核磁共振1H谱。
图22是几丁二糖(GlcNAc-beta1,4-GlcNAc)的核磁共振13C谱。
图23是实施例6中酶反应的TLC分析结果图；
其中，1为Man标准品，2为甘露糖-1-磷酸(Man-1-P)标准品，3为GlcNAc-beta1,4-GlcNAc-beta-EthN3标准品，4为产物三糖标准品，5为反应体系；
图24是蛋白N-糖链核心三糖衍生物(Man-beta1,4-GlcNAc-beta1,4-GlcNAc-beta-EthN3)的高分辨质谱检测结果。
图25是蛋白N-糖链核心三糖衍生物(Man-beta1,4-GlcNAc-beta1,4-GlcNAc-beta-EthN3)的核磁共振1H谱。
图26是蛋白N-糖链核心三糖衍生物(Man-beta1,4-GlcNAc-beta1,4-GlcNAc-beta-EthN3)的核磁共振13C谱。
具体实施方式
为便于应用本发明，下面以实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例。
实施例中，镍离子琼脂糖凝胶购自常州天地人和生物科技有限公司，甘露糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖购自TCI(上海)化成工业发展有限公司，半乳糖购自上海笛柏生物科技有限公司，N-乙酰-D-氨基半乳糖购自上海毕得医药科技有限公司，腺嘌呤核苷一磷酸购自上海吉至生化科技有限公司，活性炭为麦克林所售Activated charcoal，Bio-Gel P2来源于Bio-Rad公司，DEAE-Cellulose 52购自上海笛柏生物科技有限公司，其它化学试剂为市售分析纯以上试剂。
实施例1：单糖激酶GalK、NahK，糖苷磷酸化酶BiGHNP、VpCPase、BtMPase及聚磷酸盐激酶EbPPK的制备
本发明中单糖激酶GalK的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，根据单糖激酶GalK的氨基酸序列设计单糖激酶GalK编码基因，人工合成单糖激酶GalK编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该核苷酸序列经过密码子优化，适宜在大肠杆菌中重组表达。
将人工合成的单糖激酶GalK编码基因插入到载体pET-22b中，得到重组表达载体；将重组表达载体转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含50μg/mL抗生素的LB平板上，37℃培养过夜；挑取单菌落，LB液体培养基培养过夜后保存重组大肠杆菌。
取保存的重组大肠杆菌接种到50mL的LB液体培养基中，在37℃下活化过夜；取活化后的菌液10mL接种到LB液体培养基中(1L)，37℃，180～220rpm培养至OD600约为0.6，取出冰水浴降温；向其中加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃诱导表达20小时；使用立式离心机收集菌体(8000rpm，10min，4℃)，将菌体重悬于缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，500mM NaCl)中，将菌体重悬液置于冰水混合物中进行超声破碎(功率40W，超声3s，间隔2s，破碎30min)；离心破碎后的菌液(4℃，12000rpm，30min)，收集上清。
单糖激酶NahK，糖苷磷酸化酶BiGHNP、VpCPase、BtMPase及聚磷酸盐激酶EbPPK的制备方法同单糖激酶GalK。所使用的载体质粒为pET-30a，所述单糖激酶NahK的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码基因序列如SEQ ID NO.8所示。所述糖苷磷酸化酶BiGHNP的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码基因序列如SEQ ID NO.6所示。所述糖苷磷酸化酶VpCPase的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码基因序列如SEQ ID NO.10所示。所述糖苷磷酸化酶BtMPase的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码基因序列如SEQ ID NO.12所示。所述聚磷酸盐激酶(PPK)为聚磷酸盐激酶EbPPK的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码基因序列如SEQ ID NO.4所示。
六种酶编码基因表达蛋白带有六个组氨酸，可以使用固定化金属离子亲和层析色谱纯化，因此将上述收集的上清采用镍离子亲和层析进行纯化，纯化步骤参照镍离子琼脂糖凝胶商品说明书进行。用含有20mM咪唑的缓冲液彻底洗去杂蛋白，用含500mM咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白，超滤脱盐并浓缩，用Bradford法测定蛋白浓度；向得到的蛋白中加入20％的甘油，分装保存于-20℃，并用SDS-PAGE验证，验证结果如图1～6所示。
由图1～6可知，纯化后的目的蛋白样品条带单一且明亮，说明单糖激酶GalK、NahK，糖苷磷酸化酶BiGHNP、VpCPase、BtMPase及聚磷酸盐激酶EbPPK成功合成。酶GalK、BiGHNP、NahK、VpCPase、BtMPase、EbPPK大小分别约为43kDa、86.5kDa、41.4kDa、91.4kDa、38.0kDa、36.8kDa。上述操作步骤可参照《精编分子生物学操作实验指南》(科学出版社，2005.1，ISBN：9787030147257)中的相关描述进行操作。
实施例2：利用单糖激酶GalK、糖苷磷酸化酶BiGHNP和聚磷酸盐激酶EbPPK制备乳酰-N-二糖(LNB)
在容器中加入半乳糖(1.009g，5.60mmol)和N-乙酰-D-氨基葡萄糖(0.797g，3.60mmol)，按照反应体系终浓度添加2mM AMP，20mM聚磷酸盐(PolyPn)，40mM MgCl2，加NaOH溶液调整pH为8.0，继续加入46mg纯化的单糖激酶GalK、30mg纯化的糖苷磷酸化酶BiGHNP、10mg纯化的聚磷酸盐激酶EbPPK，加水将反应液的体积定容至80mL，在37℃，110rpm条件下反应1.5小时，TLC检测底物转化完成后(图7)，加入等体积即80mL冷乙醇置于4℃，30min以终止反应，12000rpm，30min离心取上清。
选用10mm×85cm的Bio-Gel P2色谱柱对反应处理液进行纯化，将产物二糖与原料单糖分离得到粗产物：以去离子水为流动相，流速为0.5～1mL/min，收集流分并用TLC检测产物，将含有产物的流分使用旋转蒸发仪浓缩，得到粗产物。
利用DEAE-Cellulose 52进一步纯化粗产物，去除粗产物中带电荷的杂质(如：PolyPn、ATP、ADP、Gal-1-P等)：以去离子水为流动相，流速为5～6mL/min，收集流分并用TLC检测产物，将含有产物的流分使用旋转蒸发仪浓缩，再冷冻干燥，得到白色粉末状的乳酰-N-二糖(LNB)，称重为1.35g，计算产率约为92％；色谱柱以1M NaCl为流动相，冲洗1小时，将吸附在柱子上的杂质洗脱下来；随后去离子水冲洗1小时；在20％乙醇中，4℃长期保存。
取纯化得到的LNB制成10mM的溶液，用TLC分析其纯度，只观察到目的产物一个显色点；制备1mM的LNB溶液进行高分辨质谱分析，质谱结果如图8所示。由图8可知，特征离子峰为m/z[M+Na]+406.1355，与理论值[M+Na]+406.1428一致。
取30mg的LNB溶于500μL D2O中，使用600MHz的核磁共振进行分析，结果如图9和图10所示，谱图解析结果为：1H NMR(600MHz,D2O)d 5.21(d,J＝3.6Hz,0.6H),4.51(d,J＝7.9Hz,0.6H),4.48(d,J＝7.8Hz,0.4H),4.10(d,J＝7.0Hz,0.4H),3.99–3.50(m,12H),2.07(s,3H).13C NMR(151MHz,D2O)δ174.90,174.63,103.60,103.47,94.78,91.13,82.67,80.21,75.50,75.33,75.29,72.60,72.57,71.31,70.81,70.76,68.79,68.74,68.64,61.10,60.81,60.66,55.66,52.97,22.41,22.16。
以上数据说明本发明成功制备得到了乳酰-N-二糖(LNB)。
实施例3：制备乳酰-N-二糖(LNB)反应体系的优化与扩展
(1)聚磷酸盐(PolyPn)的浓度
在水溶液中混合70mM Gal、45mM GlcNAc、7mM AMP、40mM氯化镁、不同浓度的PolyPn(5mM、10mM、15mM、20mM)和58μg纯化的单糖激酶GalK、38μg纯化的糖苷磷酸化酶BiGHNP、14μg纯化的聚磷酸盐激酶EbPPK；反应在37℃，pH 6.5，110rpm条件下进行1小时，采用薄层层析法(TLC)检测产物生成及底物消耗程度；检测结果如图11所示。由图11可知，PolyPn的浓度为20mM时反应效果最好。
(2)腺嘌呤核苷一磷酸(AMP)的浓度
在水溶液中混合70mM Gal、45mM GlcNAc、不同浓度的AMP(2mM、5mM、8mM、11mM)、40mM氯化镁、20mM PolyPn和58μg纯化的单糖激酶GalK、38μg纯化的糖苷磷酸化酶BiGHNP、14μg纯化的聚磷酸盐激酶EbPPK；反应在37℃，pH 6.5，110rpm条件下进行1小时，采用TLC检测产物生成及底物消耗程度；检测结果如图12所示。由图12可知，AMP的浓度为2mM时最经济且反应效果好。
(3)氯化镁(MgCl2)的浓度
在水溶液中混合70mM Gal、45mM GlcNAc、2mM AMP、不同浓度的MgCl2(20mM、30mM、40mM、50mM)、20mM PolyPn和58μg纯化的单糖激酶GalK、38μg纯化的糖苷磷酸化酶BiGHNP、14μg纯化的聚磷酸盐激酶EbPPK，反应在37℃，pH 6.5，110rpm条件下进行1小时，采用TLC检测产物生成及底物消耗程度；检测结果如图13所示。由图13可知，MgCl2浓度为40mM时反应效果最好。
(4)反应体系pH的确定
在水溶液中混合70mM Gal、45mM GlcNAc、2mM AMP、40mM氯化镁、20mM PolyPn和58μg纯化的单糖激酶GalK、38μg纯化的糖苷磷酸化酶BiGHNP、14μg纯化的聚磷酸盐激酶EbPPK，反应在不同pH(pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)，37℃，110rpm条件下进行1小时，采用TLC检测产物生成及底物消耗程度并通过pH精密试纸检测反应体系pH的变化；检测结果如图14所示。由图14可知，反应体系的pH为8.0时反应效果最好。
实施例4：利用单糖激酶GalK、糖苷磷酸化酶BiGHNP和聚磷酸盐激酶EbPPK制备半乳酰-N-二糖(GNB)
采用一锅三酶催化合成法，在容器中加入半乳糖(0.126g，0.70mmol)和N-乙酰-D-氨基半乳糖(0.099g，0.45mmol)，按照反应体系终浓度添加2mM AMP，20mM聚磷酸盐(PolyPn)，40mM MgCl2，加NaOH溶液调整pH为8.0；加入5.8mg纯化的单糖激酶GalK、3.8mg纯化的糖苷磷酸化酶BiGHNP、1.4mg纯化的聚磷酸盐激酶EbPPK，加水将反应液的体积定容至10mL；在37℃，110rpm条件下反应1.5小时，TLC检测底物转化完成后(图15)，加入等体积即10mL冷乙醇置于4℃，30min以终止反应，12000rpm，30min离心取上清。
选用Bio-Gel P2色谱柱和DEAE-Cellulose 52对反应液进行纯化，处理方法同实施例2；得到白色粉末状的半乳酰-N-二糖(GNB)，称重为172mg，计算产率约为93％。
取纯化得到的GNB制成10mM的溶液，用TLC分析只观察到目的产物一个显色点；制备1mM的GNB溶液进行高分辨质谱分析，质谱结果如图16所示。由图16可知，产物的特征离子峰为m/z[M+Na]+406.1347，与理论值[M+Na]+406.1428一致。
取30mg的GNB溶于500μL D2O中，使用600MHz的核磁共振进行分析，结果如图17和18所示，谱图解析结果为：1H NMR(600MHz,D2O)d 5.25(d,J＝3.6Hz,0.6H),4.73(d,1J＝8.5Hz,0.4H),4.54(d,J＝7.9Hz,0.6H),4.49(d,J＝7.8Hz,0.4H),4.32(dd,J＝3.7and11.1Hz,0.4H),4.28(d,J＝2.9Hz,0.6H),4.21(d,J＝3.3Hz,0.4H),4.17(t,J＝6.1Hz,0.6H),4.07(dd,J＝3.2and 11.1Hz,0.6H),4.03(t,J＝10.7Hz,0.4H),3.96–3.63(m,8H),3.56(t,J＝9.6Hz,1H),2.06(s,3H).13C NMR(151MHz,D2O)δ175.09,174.78,104.90,104.73,95.26,91.29,80.15,77.12,75.04,74.93,72.63,72.58,70.76,70.71,70.30,68.84,68.69,68.17,61.31,61.09,61.07,52.51,49.09,22.43,22.20。
以上数据说明本发明成功制备得到了半乳酰-N-二糖(GNB)。
实施例5：利用单糖激酶NahK、糖苷磷酸化酶VpCPase和聚磷酸盐激酶EbPPK制备几丁二糖(GlcNAc-beta1,4-GlcNAc)
在容器中加入N-乙酰-D-氨基葡萄糖(1.99g，9.0mmol)，按照反应体系终浓度添加200mM Tris-HCl(pH 8.0)，3mM AMP，30mM PolyPn，60mM MgCl2，调整pH为7.5；加入100mg纯化的单糖激酶NahK、100mg纯化的糖苷磷酸化酶VpCPase、50mg纯化的聚磷酸盐激酶EbPPK，加水将反应液的体积定容至90mL；37℃，反应6小时，TLC检测底物转化完成后(图19)，加入等体积即90mL冷乙醇置于4℃，30min以终止反应，12000rpm，30min离心取上清。
反应完成液经活性炭粗纯化：首先以去离子水为流动相冲洗三个柱体积；随后以2wt％乙醇为流动相进行洗脱，将GlcNAc-1-P分离出来，直到GlcNAc-1-P全部收集，换为30wt％乙醇水溶液洗脱，收集得到粗产物。
选用10mm×85cm的Bio-Gel P2色谱柱对粗产物进一步纯化，以去离子水为流动相，流速为0.5～1mL/min，收集流分并用TLC检测产物。
利用DEAE-Cellulose 52进一步纯化，去除带电荷的杂质：以去离子水为流动相，流速为5～6mL/min，收集流分并用TLC检测产物，将含有产物的流分使用旋转蒸发仪浓缩，再冷冻干燥，得到白色粉末状的几丁二糖(GlcNAc-beta1,4-GlcNAc)，称重为760mg，计算产率约为40％。
取GlcNAc-beta1,4-GlcNAc制成20mM的溶液，用TLC分析其纯度，只观察到目的产物一个显色点；制备1mM的GlcNAc-beta1,4-GlcNAc溶液进行高分辨质谱分析，质谱结果如图20所示。由图20可知，特征离子峰为m/z[M+H]+425.1778，与理论值[M+H]+425.4110相符。
取10mg的GlcNAc-beta1,4-GlcNAc溶于500μL D2O中，使用600MHz的核磁共振进行分析，结果如图21和图22所示，谱图解析结果为：1H NMR(600MHz,D2O)δ5.20(d,J＝2.8Hz,0.6H),4.70(d,J＝8.1Hz,0.4H),4.59(dd,J＝8.5,5.3Hz,1H),3.95–3.73(m,6H),3.71–3.60(m,3H),3.59–3.45(m,3H),2.07(s,3H),2.04(s,3H).13C NMR(151MHz,D2O)δ174.54,174.40,101.44,101.42,94.76,90.37,79.80,75.85,74.51,73.40,72.48,69.97,69.64,62.44,60.48,59.78,56.02,53.57,22.07,21.84。
以上数据说明本发明成功制备得到了几丁二糖(GlcNAc-beta1,4-GlcNAc)。
实施例6：利用单糖激酶NahK、糖苷磷酸化酶BtMPase和聚磷酸盐激酶EbPPK制备蛋白N-糖链核心三糖衍生物(Man-beta1,4-GlcNAc-beta1,4-GlcNAc-beta-EthN3)
受体糖GlcNAc-beta1,4-GlcNAc-beta-EthN3由几丁二糖经端基化学衍生得到，衍生方法参考文献Beilstein J.Org.Chem.2013,9,1867-1872。端基衍生的目的是便于进行化学结构分析，本实施例方法可以应用于合成Man-beta1,4-GlcNAc-beta1,4-GlcNAc三糖及其端基衍生物。
采用一锅三酶催化合成法，在容器中加入甘露糖(0.054g，0.3mmol)和GlcNAc-beta1,4-GlcNAc-beta-EthN3(0.099g，0.2mmol)，按照反应体系终浓度添加100mM Tris-HCl(pH 8.0)、2mM AMP，20mM聚磷酸盐(PolyPn)，40mM MgCl2，调整pH为7.5；加入5mg纯化的单糖激酶NahK、5mg纯化的糖苷磷酸化酶BtMpse、2.5mg纯化的聚磷酸盐激酶EbPPK，加水将反应液的体积定容至5mL；37℃，反应22小时，TLC检测底物转化完成后(图23)，加入等体积即5mL冷乙醇置于4℃，30min以终止反应，12000rpm，30min离心取上清。
反应完成液经活性炭粗纯化；Bio-Gel P2色谱柱对粗产物进一步纯化；利用DEAE-Cellulose 52进一步纯化，处理方法同实施例5；得到白色粉末状蛋白N-糖链核心三糖衍生物(Man-beta1,4-GlcNAc-beta1,4-GlcNAc-beta-EthN3)，称重为62mg，产率约为47％。
取纯化得到的产物制成10mM的溶液，用TLC分析只观察到目的产物一个显色点；制备1mM的溶液进行高分辨质谱分析，质谱结果如图24所示，产物的特征离子峰为m/z[M+H]+656.2634，与理论值[M+H]+656.2627一致。
取10mg的产物溶于500μL的D2O中，使用600MHz的核磁共振进行分析，结果如图25和26所示，蛋白N-糖链核心三糖衍生物(Man-beta1,4-GlcNAc-beta1,4-GlcNAc-beta-EthN3)谱图解析结果为：1H NMR(600MHz,D2O)δ4.78(s,1H),4.61(d,J＝8.0Hz,1H),4.59(d,J＝8.3Hz,1H),4.07-4.03(m,2H),3.95–3.65(m,14H),3.65–3.57(m,3H),3.55–3.47(m,2H),3.45–3.4(m,2H),2.08(s,3H),2.05(s,3H).13C NMR(151MHz,D2O)δ174.54,174.44,101.25,100.80,99.94,79.15,78.49,76.29,74.46,74.43,72.62,72.35,71.84,70.37,68.65,66.48,60.79,59.94,59.92,54.90,54.79,50.23,22.12,22.00。
以上数据说明本发明成功制备得到了蛋白N-糖链核心三糖衍生物(Man-beta1,4-GlcNAc-beta1,4-GlcNAc-beta-EthN3)。
Claims (10)
1.一种糖苷磷酸化酶联合单糖激酶及聚磷酸激酶制备寡糖的方法，其特征在于，包括步骤如下：
以供体单糖、受体糖、聚磷酸盐、低当量腺苷磷酸为底物，向底物中加入氯化镁，然后由聚磷酸酶、单糖激酶及糖苷磷酸化酶在25～40℃下联合催化反应1.5～22h，生成寡糖粗产物，经纯化后，得到寡糖。
2.如权利要求1所述的制备寡糖的方法，其特征在于，所述供体单糖包括半乳糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖和甘露糖；
所述供体单糖的终浓度为40～100mM。
3.如权利要求1所述的制备寡糖的方法，其特征在于，所述受体糖包括N-乙酰-D-氨基葡萄糖、N-乙酰-D-氨基半乳糖和几丁二糖衍生物；
所述受体糖的终浓度为40～70mM。
4.如权利要求1所述的制备寡糖的方法，其特征在于，所述聚磷酸盐为聚合度为2个磷酸及以上的磷酸化合物的金属盐；
所述聚磷酸盐的终浓度为20～40mM；
进一步优选的，所述聚磷酸盐为六偏磷酸钠或三聚磷酸钠。
5.如权利要求1所述的制备寡糖的方法，其特征在于，所述低当量腺苷磷酸为腺苷一磷酸或腺苷二磷酸或腺苷三磷酸；
所述低当量腺苷磷酸的终浓度为2～3mM；
所述氯化镁的终浓度为40～60mM。
6.如权利要求1所述的制备寡糖的方法，其特征在于，所述单糖激酶为单糖激酶GalK或单糖激酶NahK；
所述单糖激酶GalK来源于Bifidobacteriuminfantis，氨基酸序列如SEQ ID NO.1编码基因序列如SEQ ID NO.2所示；
所述单糖激酶NahK来源于Bifidobacterium longum，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码基因序列如SEQ ID NO.8所示；
所述单糖激酶的终浓度为0.3～1.5mg/mL；
所述聚磷酸盐激酶为聚磷酸盐激酶EbPPK，来源于Erysipelotrichaceae bacterium，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码基因序列如SEQ ID NO.4所示；
所述聚磷酸盐激酶的终浓度为0.1～0.7mg/mL；
所述糖苷磷酸化酶为糖苷磷酸化酶BiGHNP、糖苷磷酸化酶VpCPase或糖苷磷酸化酶BtMPase；
所述糖苷磷酸化酶BiGHNP来源于Bifidobacteriuminfantis，氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，编码基因序列如SEQ ID NO.6所示；所述糖苷磷酸化酶VpCPase来源于Vibrioproteolyticus，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码基因序列如SEQ ID NO.10所示；所述糖苷磷酸化酶BtMPase来源于于Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482，氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码基因序列如SEQ ID NO.12所示；
所述糖苷磷酸化酶的终浓度为0.2～2mg/mL；
所述单糖激酶GalK、单糖激酶NahK、聚磷酸盐激酶EbPPK、糖苷磷酸化酶为BiGHNP、糖苷磷酸化酶VpCPase和糖苷磷酸化酶BtMPase的制备方法，包括步骤如下：
(1)以单糖激酶GalK的编码基因为目的基因，以为pET-22b载体质粒，构建重组表达载体；再分别以单糖激酶NahK、聚磷酸盐激酶EbPPK、糖苷磷酸化酶为BiGHNP、糖苷磷酸化酶VpCPase和糖苷磷酸化酶BtMPase的编码基因为目的基因，以pET-30a为载体质粒，构建重组表达载体，然后分别将重组表达载体转化至大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；
(2)选择转化成功的重组大肠杆菌扩大培养，加入终浓度为0.1～1mM的IPTG或者添加0.1～1％的乳糖进行诱导，收集菌液后进行破碎和离心，分别得到重组大肠杆菌的上清液；
(3)采用固定化金属离子亲和层析色谱对上清液进行纯化，分别得到单糖激酶GalK、NahK，聚磷酸盐激酶EbPPK和糖苷磷酸化酶BiGHNP、VpCPase、BtMPase。
7.如权利要求1所述的制备寡糖的方法，其特征在于，生成的寡糖为乳酰-N-二糖或半乳酰-N-二糖时，具体制备方法如下：
在水中混合作为供体单糖的半乳糖，以及作为受体糖的N-乙酰-D-氨基葡萄糖或N-乙酰-D-氨基半乳糖、AMP、聚磷酸盐、氯化镁，调节pH至8.0，加入单糖激酶GalK、糖苷磷酸化酶BiGHNP和聚磷酸盐激酶EbPPK，在37℃，110rpm下反应1.5h，终止反应，分离纯化得到乳酰-N-二糖或半乳酰-N-二糖；
其中，所述半乳糖的终浓度为60～80mM；所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖或N-乙酰-D-氨基半乳糖终浓度为40～50mM；所述AMP、聚磷酸盐、氯化镁的终浓度依次为2mM、20mM、40mM；所述加入单糖激酶GalK、糖苷磷酸化酶BiGHNP和聚磷酸盐激酶EbPPK的终浓度分别为0.3～0.7mg/mL、0.2～0.5mg/mL、0.1～0.2mg/mL；所述终止反应为加入等体积冷乙醇，4℃、30min终止反应。
8.如权利要求1所述的制备寡糖的方法，其特征在于，生成的寡糖为几丁二糖时，具体制备方法如下：
在水中混合N-乙酰-D-氨基葡萄糖、AMP、聚磷酸盐、氯化镁，Tris-HCl溶液，调节pH至7.5，加入单糖激酶NahK、糖苷磷酸化酶VpCPase和聚磷酸盐激酶EbPPK，在37℃下反应6h，终止反应，分离纯化得到几丁二糖；
其中，所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖的终浓度为90～100mM；所述AMP、聚磷酸盐、氯化镁、Tris-HCl溶液的终浓度依次为3mM、30mM、60mM、200mM；所述单糖激酶NahK、糖苷磷酸化酶VpCPase和聚磷酸盐激酶EbPPK的终浓度分别0.5～1.5mg/mL、0.5～2mg/mL、0.3～0.7mg/mL；所述终止反应为加入等体积冷乙醇，4℃、30min终止反应。
9.如权利要求1所述的制备寡糖的方法，其特征在于，生成的寡糖为蛋白N-糖链核心三糖衍生物时，具体制备方法如下：
在水中混合甘露糖、几丁二糖衍生物、AMP、聚磷酸盐、氯化镁，Tris-HCl溶液，调节pH至7.5，单糖激酶NahK、糖苷磷酸化酶BtMPase和聚磷酸盐激酶EbPPK，在37℃下反应22h，终止反应，分离纯化得到蛋白N-糖链核心三糖衍生物；
其中，所述甘露糖的终浓度为60～80mM；所述几丁二糖衍生物的终浓度为40～50mM；所述AMP、聚磷酸盐、氯化镁、Tris-HCl溶液的终浓度依次为2mM、20mM、40mM、100mM；所述单糖激酶NahK、糖苷磷酸化酶BtMPase和聚磷酸盐激酶EbPPK的终浓度分别0.7～1.5mg/mL、0.7～1.5mg/mL、0.3～0.6mg/mL；所述终止反应为加入等体积冷乙醇，4℃、30min终止反应。
10.如权利要求1所述的制备寡糖的方法，其特征在于，所述纯化的具体为：离心去除沉淀，以活性炭吸附、分子排阻层析色谱、离子交换色谱法进行纯化；
具体的，当寡糖产物为乳酰-N-二糖或半乳酰-N-二糖时，反应液经选Bio-Gel P2色谱柱纯化，将产物二糖与原料单糖分离得到粗产物；粗产物经DEAE-Cellulose 52纯化得到高纯度产物；其中，DEAE-Cellulose 52纯化粗产物的步骤为：以去离子水为流动相，流速为5～6mL/min，收集流分并用TLC检测产物，将含有产物的流分使用旋转蒸发仪浓缩，再冷冻干燥，得到乳酰-N-二糖或半乳酰-N-二糖；
当寡糖产物为几丁二糖或蛋白N-糖苷核心三糖衍生物时，反应液经活性炭吸附除盐；反应处理液或活性炭吸附除盐后的洗脱液经Bio-Gel P2色谱柱纯化，得到粗产物；粗产物经DEAE-Cellulose 52纯化得到高纯度产物；其中，活性炭粗纯化的步骤为：首先以去离子水为流动相冲洗三个柱体积；随后以2wt％乙醇为流动相，洗脱杂质；30wt％乙醇水溶液洗脱，收集得到几丁二糖或蛋白N-糖苷核心三糖衍生物。
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| CN113337554A (zh) * | 2021-05-28 | 2021-09-03 | 华东理工大学 | 一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法 |
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