KR100327272B1 - 뉴클레오시드5'-트리포스페이트의제조법및그응용 - Google Patents

뉴클레오시드5'-트리포스페이트의제조법및그응용 Download PDF

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Abstract

본발명은 아데노신5'-디포스페이트 (ADP) 이외의 뉴클레오시드5'-디포스페이트 (NDP) 으로부터 뉴클레오시드5'-트리포스페이트 (NTP) 을 제조하는 방법으로, 효소로서 폴리포스페이트 키나아제를 사용하고 포스페이트 도우너로서 폴리포스페이트를 사용하는 것을 특징으로 하는 NDP 로부터 NTP 을 제조하는 방법 및 이 방법의 여러 글리코실화 반응으로의 응용에 관한 것이다.
본 발명에 의해 간편하고 저렴한 NDP 로부터의 NTP 의 효소합성이 가능하게 되었다. 당 뉴클레오티드 합성과의 조합에 의한 올리고당의 효소합성계에서 NDP 로부터의 NTP 로의 재생 또는 변환반응에 값비싼 포스포에놀피루베이트또는 ATP 등을 사용하지 않고 저비용으로 당 뉴클레오티드의 리사이클 합성, 이것에 수반되는 예컨대 올리고당 합성이 가능하게 되었다.

Description

뉴클레오시드5'-트리포스페이트의 제조법 및 그 응용
핵산발효 또는 핵산효소분해 등 핵산공업의 발전에 따라 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드5'-모노포스페이트 (NMP) 을 저렴한 가격으로 제조할 수 있게 되고, 이들 일부는 의약품 또는 그 원료로써 제조 판매되고 있다. 또한, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 또는 그 유도체의 의약으로서의 개발도 활발히 행해지고 있다. 또 근래의 당쇄 (糖鎖) 공학의 발전에 따라 올리고당의 효소합성기질인 당 뉴클레오티드의 합성에 관한 연구도 활발히 행해지고 있다.
이와 같이 NMP 는 저렴한 가격으로 제조 공급될 수 있는 반면, NTP 는 화학적 합성법 또는 미생물 또는 효소를 사용한 합성법이 여러 가지 보고되고 있으나, 아데노신5'-트리포스페이트을 비롯한 NTP 의 저렴한 제조법은 현시점에서 확립되어 있지 않으며 시판되고 있는 NTP 는 매우 값비싸다.
최근, 당 뉴클레오티드를 기질로 한 당 전이효소에 의한 올리고당의 합성기술개발이 왕성히 행해지고 있으며, 그 중에서도 주목받는 기술로써 미국 스크립스연구소가 제안한 당 뉴클레오티드 리사이클법 (일본 특허공표공보 평7-500248 호, 일본 공개특허공보 평7-79792 호 참조) 을 들 수 있다. 이 방법은 NTP 및 당1-포스페이트을 기질로 하여 당 뉴클레오티드 피로포스포릴라아제와 당 전이효소를 사용하고 당 뉴클레오티드를 합성하면서 동시에 합성된 당 뉴클레오티드를 모노사카라이드 도우너로 하여 올리고당으로의 당 전이반응을 효율적으로 행하도록 하는 방법이다. 이 방법의 특징은 당 전이반응에 의해 생성되는 NDP 를, 포스포에놀피루빈산과 피루베이트키나아제의 조합으로 NTP 로 재생시켜 재차 당 뉴클레오티드의 합성용 기질로 이루게 함으로써 값비싼 NTP 의 첨가량을 적게 할 수 있으며, 또 당 전이반응을 효율화시킴으로써 올리고당의 제조비용을 저감할 수 있는 것을 크게 기대할 수 있다.
그러나, 상기 리사이클법은 값비싼 NTP 를 대량으로 사용하지 않는다는 이점은 있으나, 그 대신에 NTP 의 재생을 위해 값비싼 포스포에놀피루빈산을 대량으로 필요로 하며 반드시 실용적으로 만족할 수 있는 방법이라고는 되어 있지 않다.
또한, NDP 로부터 NTP 로의 변환반응으로는, 피루빈산키나아제 대신에 뉴클레오시드 디포스페이트키나아제 등 이외의 효소를 사용해도 가능하지만, 여전히 값비싼 아데노신5'-트리포스페이트 (ATP) 이 포스페이트 도우너로서 필요하고 본질적인 해결책이라고는 되어 있지 않다.
따라서, 본발명은 값비싼 포스포에놀피루빈산 또는 ATP 를 사용하지 않는 보다 실용적인 NDP 로부터의 NTP 의 합성 또는 재생법을 제공함과 동시에 그 방법의 올리고당 합성 등으로의 응용방법을 제공하는 것이다.
본발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 연구를 거듭한 결과, 종래 공지된 폴리포스페이트키나아제 (Biochim. Biophys. Acta., 26, 294-300(1957)) 가 ADP 이외의 NDP 도 폴리포스페이트를 포스페이트 도우너로서 인산화시키고, NTP 를 합성하는 활성을 갖는 것을 발견하였다. 이어서, 이 방법의 올리고당 합성으로의 응용에 관해 연구한 바 종래의 상기 당 뉴클레오티드 리사이클법보다도 실용적인 것임을 확인하고 본발명을 완성시켰다.
본발명은 아데노신5'-디포스페이트 (ADP) 이외의 뉴클레오시드5'-디포스페이트 (NDP) 으로부터 뉴클레오시드5'-트리포스페이트 (NTP) 의 제조법 또는 재생법 및 당해 방법의 올리고당 합성 등으로의 응용에 관한 것이다.
도 1 및 도 2 는 액셉터 당류의 갈락토실화 화합물 제조를 위한 반응도를 나타낸다.
도 3 은 액셉터 당류의 글루쿠로닐화 화합물 제조를 위한 반응도를 나타낸다.
도 4 는 액셉터 당류의 글루코실화 화합물 제조를 위한 반응도를 나타낸다.
도 5 및 도 6 은 액셉터 당류의 푸코실화 화합물 제조를 위한 반응도를 나타낸다.
도 7 은 액셉터 당류의 만노실화 화합물 제조를 위한 반응도를 나타낸다.
도 8 은 액셉터 당류의 N-아세틸글루코사미닐화 화합물 제조를 위한 반응도를 나타낸다.
도 9 는 액셉터 당류의 N-아세틸갈락토사미닐화 화합물 제조를 위한 반응도를 나타낸다.
도 10 은 액셉터 당류의 시아릴화 화합물 제조를 위한 반응도를 나타낸다.
도 11 은 락토오스 제조를 위한 반응도를 나타낸다.
도 12 는 N-아세틸락토사민 제조를 위한 반응도를 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최량 형태
본발명의 특징은 NDP 로부터 NTP 의 제조에 있어서, 효소로서 폴리포스페이트키나아제를 사용하고 포스페이트 도우너로서 폴리포스페이트를 사용하는 데에 있다. 여기에서 NDP 및 NTP 을 구성하는 뉴클레오시드로는, 구아노신, 이노신, 크산토신, 시티딘, 우리딘, 리보티미딘 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 폴리포스페이트키나아제는, 폴리포스페이트를 포스페이트 공여체로 하고 NDP 을 인산시켜 NTP 을 합성하는 활성을 갖는 폴리포스페이트키나아제 (E.C.2.7.4.1) 이면 특별히 제한되지 않고 동물유래, 식물유래, 미생물유래 등 특정한 유래의 것에 한정되지 않는다. 그 중에서도 효소제조의 간편함 등의 점에서 미생물유래, 특히 대장균유래의 폴리포스페이트키나아제를 사용하는 것이 적합하다. 또 근래의 유전자 재조합 기술을 이용하여 폴리포스페이트키나아제 유전자를 클론화시키고 대장균 등을 숙주로 하여 폴리포스페이트키나아제를 대량 생산시키고 당해 재조합체에서 효소를 제조할 수도 있다 (J. Biol. Chem., 267, 22556-22561(1992)).
반응계에 첨가하는 폴리포스페이트키나아제는 상기 활성을 갖는 한 어떤 형태여도 된다. 구체적으로는 미생물의 균체, 이 균체의 처리물 또는 이 처리물로부터 수득되는 효소제조물 등을 예시할 수 있다.
미생물 균체의 제조는, 당해 미생물이 생육가능한 배지를 사용하며 통상의 방법으로 배양한 후 원심분리 등으로 집균하는 방법으로 행할 수 있다. 구체적으로 바실러스족 또는 대장균류에 속하는 세균을 예로 들어 설명하면, 배지로서는 액체 배지, LB 배지 (1 ％ 트립톤, 0.5 ％ 이스트추출물, 1 ％ 식염) 또는 2×YT 배지 (1.6 ％ 트립톤, 1 ％ 이스트추출물, 0.5 ％ 식염) 등을 사용할 수 있으며, 당해 배지에 종균을 접종한 후 30 ∼ 50 ℃ 에서 10 ∼ 50 시간 정도 필요에 따라 교반하면서 배양하고, 수득된 배양액을 원심분리하여 미생물균체를 집균함으로써 폴리포스페이트키나아제 활성을 갖는 미생물 균체를 제조할 수 있다.
미생물의 균체처리물로는, 상기 미생물 균체를 기계적 파괴 (워링 블렌더, 플렌치 프레스, 호모지나이저 모르타르 등에 의함), 동결융해, 자기소화, 건조 (동결건조, 바람건조 등에 의함), 효소처리 (리조자임에 의함), 초음파처리, 화학처리 (산, 알카리 처리 등에 의함) 등의 일반적인 처리법으로 처리하여 수득되는 균체의 파괴물 또는 균체의 세포벽 또는 세포막의 변성물을 예시할 수 있다.
효소제조물로는, 상기 균체처리물로부터 폴리포스페이트키나아제 활성을 갖는 분획을 통상의 효소의 정제수단 (염석처리, 등전점 (等電点) 침전처리, 유기용매 침전처리, 투석처리, 각종 크로마토그래피처리 등) 을 실시하여 수득되는 조 (粗) 효소 또는 정제효소를 예시할 수 있다.
반응액에 첨가되는 NDP 로는 시판되는 것을 사용할 수 있다. 사용농도로는 예컨대 1 ∼ 200 mM, 바람직하게는 10 ∼ 100 mM 범위에서 적절하게 설정할 수 있다. 또한 첨가하는 폴리포스페이트도 시판되는 것을 사용할 수 있다. 사용농도로는, 무기포스페이트으로 환산하여 1 ∼ 1000 mM, 바람직하게는 10 ∼ 200 mM 범위에서 적절하게 설정할 수 있다.
NDP 로부터 NTP 로의 변환은, pH 4 ∼ 9 범위의 적당한 완충액중에 NDP 및 폴리포스페이트를 첨가하고 추가로 0.001 유니트/㎖ 이상, 바람직하게는 0.001 ∼ 1.0 유니트/㎖ 의 폴리포스페이트키나아제를 첨가하고 30 ℃ 이상, 바람직하게는 32 ∼ 37 ℃ 에서 1 ∼ 50 시간정도, 필요에 따라 교반하면서 반응시킴으로써 실시할 수 있다.
또한, 다른 효소반응에서 생성된 NDP 를 NTP 로 재생하는 경우에는, 상기 반응조건에서 NDP 를 첨가하는 것 이외에는 동일한 방법으로 행해진다.
이와 같이 해서 합성 또는 재생된 NTP 는, 필요에 따라 뉴클레오티드류의 통상의 단리정제수단 (이온교환 칼럼크로마토그래피, 흡착 칼럼크로마토그래피, 염석 등) 으로 단리정제할 수도 있다. 또한, 예컨대 이하에 나타낸 바와 같이 당 뉴클레오티드 합성효소 등이 존재하는 계에서는 NTP 는 기질로서 유효하게 이용됨으로써 올리고당 합성 등에 응용할 수 있다.
즉, 글리코실트랜스퍼라아제에 의해 당 뉴클레오티드와 액셉터 당류로부터 이 액셉터 당류의 글리코실화 화합물을 제조함과 동시에 상기 반응에서 생성된 NMP 또는 NDP 를 NTP, 이어서 당 뉴클레오티드로 변환하여 리사이클하는 액셉터 당류의 글리코실화 화합물의 제조법에서, NDP 로부터 NTP 로의 변환을 효소로서 폴리포스페이트키나아제를 사용하고 포스페이트 도우너로서 폴리포스페이트를 사용하여 행함으로써 실용적인 액셉터 당류의 글리코실화 화합물의 합성계를 구축할 수 있다.
이 합성계의 특징은, 글리코실트랜스퍼라아제에 의해 당 뉴클레오티드의 글리코실 잔기를 액셉터 당류로 전환시켜 액셉터 당류의 글리코실화 화합물을 합성함과 동시에 전이반응에 의해 생성되는 NMP 또는 NDP 를 폴리포스페이트와 폴리포스페이트키나아제를 사용하여 NTP 로 재생하며 재차 이용하는 데에 있다.
또 다른 견해는 당 뉴클레오티드 중의 글리코실 잔기를 글리코실트랜스퍼라아제를 사용하여 액셉터 당류로 전이시켜 액셉터 당류의 글리코실화 화합물을 합성하는 반응계와 전이반응에 의해 생성되는 NMP 또는 NDP 를 폴리포스페이트와 폴리포스페이트키나아제를 사용하여 NTP 로 재생하는 반응계가 공존하는 데에 있다.
이 합성계의 글리코실트랜스퍼라아제로는 갈락토실트랜스퍼라아제, 글루코실트랜스퍼라아제, 푸코실트랜스퍼라아제, 만노실트랜스퍼라아제, 글루쿠로닐트랜스퍼라아제, 시아릴트랜스퍼라아제, N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라아제, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 등을 들 수 있다.
따라서, 이 효소를 사용하여 수득되는 액셉터 당류의 글리코실화 화합물로는, 액셉터 당류에 갈락토오스, 글루코오스, 푸코오스, 만노오스, 글루쿠론산, 시아릴산, N-아세틸갈락토사민 또는 N-아세틸글루코사민이 부가된 화합물을 들 수 있다.
또한, 액셉터 당류로는, 상기 글리코실트랜스퍼라아제가 기질로서 인식할 수 있는 당쇄를 갖는 화합물이면 특별히 제한되지 않고 단당류, 올리고 당류, 다당류, 당 단백, 당 지질 등을 들 수 있다. 또 이들 당류를 구성하는 당으로는, 통상적인 당에 한정되지 않고 데옥시당, 아미노산, 우론산, 당류, 당 알콜도 포함될 수 있다.
상기 합성계에서 NTP 로부터 당 뉴클레오티드로의 변환은, NTP 에 NDP-글리코실피로포스포릴라아제 및 당1-포스페이트를 작용시킴으로써 행해진다. 또 이 반응에서 수득되는 당 뉴클레오티드가 원하는 글리코실 잔기와 다른 글리코실 잔기를 보유하는 경우에는, 이것에 에피메라아제, 데히드로게나아제, 신세타아제 등을 작용시킴으로써 원하는 당 뉴클레오티드로 변환할 수 있다.
상기 합성계의 적용범위는 매우 광범위한 것으로, 목적으로 하는 글리코실화 생성물에 따라 상기 합성계를 구성하는 요소인 기질 및 효소를 공지된 것으로부터 적절하게 선택하여 사용하면 되고 상술한 예시에 한정된 것이 아니다.
상기 합성계의 구체적인 요소의 조합에 관하여 이미 몇가지 보고되어 있으며, 이들 기재를 본 명세서에서는 채택할 수 있다 (일본 공개특허공보 평7-79792 호, 일본 특허공표공보 평6-505638 호, 일본 특허공표공보 평7-500248 호, 일본 특허공표공보 평8-509619 호, 미국 특허 5409817 호 등 참조). 단, 이미 알려진 보고에서, NDP 로부터 NTP 로의 변환에 사용되는 포스페이트 도우너와 키나아제의 조합은, 아세틸포스페이트와 아세테이트키나아제 또는 포스포에놀피루베이트와 피루베이트키나아제밖에 예시되어 있지 않으며, 본발명에서는 이들 조합과는 달리 포스페이트 도우너로서 폴리포스페이트를 사용하고 키나아제로서 폴리포스페이트키나아제를 사용하는 것을 특징으로 하고 있다.
이어서, 상기 합성계의 적용예를 나타낸다.
(1) 갈락토실트랜스퍼라아제에 의해 당 뉴클레오티드와 액셉터 당류로부터 이 액셉터 당류의 갈락토실화 화합물을 제조함과 동시에 상기 반응에서 생성된 NDP 를 NTP 로, 이어서 당 뉴클레오티드로 변환하여 리사이클하는 액셉터 당류의 갈락토실화 화합물의 제조법 (도 1 및 2).
(2) 글루쿠로닐트랜스퍼라아제에 의해 당 뉴클레오티드와 액셉터 당류로부터 이 액셉터 당류의 글루쿠로닐화 화합물을 제조함과 동시에 상기 반응에서 생성된 NDP 를 NTP 로, 이어서 당 뉴클레오티드로 변환하여 리사이클하는 액셉터 당류의글루쿠로닐화 화합물의 제조법 (도 3).
(3) 글루코실트랜스퍼라아제에 의해 당 뉴클레오티드와 액셉터 당류로부터 이 액셉터 당류의 글루코실화 화합물을 제조함과 동시에 상기 반응에서 생성된 NDP 를 NTP 로, 이어서 당 뉴클레오티드로 변환하여 리사이클하는 액셉터 당류의 글루코실화 화합물의 제조법 (도 4).
(4) 푸코실트랜스퍼라아제에 의해 당 뉴클레오티드와 액셉터 당류로부터 이 액셉터 당류의 푸코실화 화합물을 제조함과 동시에 상기 반응에서 생성된 NDP 를 NTP 로, 이어서 당 뉴클레오티드로 변환하여 리사이클하는 액셉터 당류의 푸코실화 화합물의 제조법 (도 5 및 도 6).
(5) 만노실트랜스퍼라아제에 의해 당 뉴클레오티드와 액셉터 당류로부터 이 액셉터 당류의 만노실화 화합물을 제조함과 동시에 상기 반응에서 생성된 NDP 를 NTP 로, 이어서 당 뉴클레오티드로 변환하여 리사이클하는 액셉터 당류의 만노실화 화합물의 제조법 (도 7).
(6) N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제에 의해 당 뉴클레오티드와 액셉터 당류로부터 이 액셉터 당류의 N-아세틸글루코사미닐화 화합물을 제조함과 동시에 상기 반응에서 생성된 NDP 를 NTP 로, 이어서 당 뉴클레오티드로 변환하여 리사이클하는 액셉터 당류의 N-아세틸글루코사미닐화 화합물의 제조법 (도 8).
(7) N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라아제에 의해 당 뉴클레오티드와 액셉터 당류로부터 이 액셉터 당류의 N-아세틸갈락토사미닐화 화합물을 제조함과 동시에 상기 반응에서 생성된 NDP 를 NTP 로, 이어서 당 뉴클레오티드로 변환하여 리사이클하는 액셉터 당류의 N-아세틸갈락토사미닐화 화합물의 제조법 (도 9).
또한, 상기 (6) 과 (7) 의 합성계는, NDP-GaℓNAc 에 NDP-GaℓNAc4-에피머라아제를 작용시킴으로써 NDP-GaℓNAc 를 생성시켜 양반응을 동시에 행해도 된다 (도 8 및 도 9 참조).
(8) 시아릴트랜스퍼라아제에 의해 당 뉴클레오티드와 액셉터 당류로부터 이 액셉터 당류의 시아릴화 화합물을 제조함과 동시에 상기 반응에서 생성된 NMP 를 NDP, 이어서 NTP, 또 당 뉴클레오티드로 변환하여 리사이클하는 액셉터 당류의 시아릴화 화합물의 제조법 (도 10).
상기 합성계에서 효소의 사용형태는, 상기 폴리포스페이트키나아제와 동일하게 미생물 균체, 효소조절물 등을 사용할 수 있다. 또한, 본발명의 합성계의 최량의 반응조건은 공지된 범위에서 최종산물인 글리코실화 생성물에 따라 적절하게 소규모 시험으로 결정하면 된다.
구체적으로는, NDP-당피로포스포릴라아제, 글리코실트랜스퍼라아제, 폴리포스페이트키나아제 등의 각 효소는, 0.0001 ∼ 100.0 유니트/㎖, 바람직하게는 0.001 ∼ 10.0 유니트/㎖ 범위에서 적절하게 선택할 수 있다. 또 NTP, 당1-포스페이트, 액셉터 당류, 폴리포스페이트 등의 기질은, 0.01 ∼ 1000 mM, 바람직하게는 1 ∼ 200 mM 범위에서 적절하게 설정할 수 있다. 합성반응은, pH 3 ∼ 10 범위의 적당한 완충액에 각 효소 및 기질을 첨가하고, 30 ℃ 이상, 바람직하게는 32 ∼ 37 ℃ 에서 1 ∼ 100 시간 정도, 필요에 따라 교반하면서 반응시킴으로써 실시할 수 있다.
상기 반응에 의해 수득된 글리코실화 생성물은 공지된 방법 (각종 칼럼크로마토그래피법) 으로 단리정제할 수 있다.
즉, 본발명은 ADP 이외의 NDP 로부터 NTP 를 제조하는 방법으로, 효소로서 폴리포스페이트키나아제를 사용하고 포스페이트 도우너로서 폴리포스페이트를 사용하는 것을 특징으로 하는 NDP 로부터 NTP 을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본발명은 다른 효소반응에서 생성된 ADP 이외의 NDP 를 NTP 로 재생하는 방법으로, 효소로서 폴리포스페이트키나아제를 사용하고 포스페이트 도우너로서 폴리포스페이트를 사용하는 것을 특징으로 하는 NDP 로부터 NTP 을 재생하는 방법에 관한 것이다.
또 본 발명은 글리코실트랜스퍼라아제에 의해 당 뉴클레오티드와 액셉터 당류로부터 상기 액셉터 당류의 글리코실화 화합물을 제조함과 동시에 상기 반응에서 생성된 NMP 또는 NDP 를 NTP, 이어서 당 뉴클레오티드로 변환하여 리사이클하는 액셉터 당류의 글리코실화 화합물의 제조법에서 NDP 로부터 NTP 로의 변환을 효소로서 폴리포스페이트키나아제를 사용하고 포스페이트 도우너로서 폴리포스페이트를 사용하여 행하는 것을 특징으로 하는 액셉터 당류의 글리코실화 화합물의 제조법에관한 것이다.
이하 실시예를 나타내고 본발명을 구체적으로 설명하지만 본발명은 이것에 한정된 것이 아니다. 실시예의 DNA 의 제조, 제한효소에 의한 절단, T4 DNA 리가아제에 의한 DNA 연결 및 대장균의 형질전환법은 모두「Molecular cloning」(Maniatis 등 편저, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)) 에 따라 행하였다. 또한, 제한효소, AmpliTaq DNA 폴리메라아제, T4 DNA 리가아제는 다가라슈조(주) 에서 입수하였다. 또 반응액중의 뉴클레오티드류의 정량에는 HPLC 법으로 행하였다. 구체적으로는 분리에는 YMC 사 제조의 ODS-AQ312 칼럼을 사용하고 용출액으로 0.5 M 포스페이트-칼륨용액을 사용하였다.
실시예 1 : 폴리포스페이트키나아제에 의한 NTP 의 합성
(1) 대장균 폴리포스페이트키나아제 유전자의 클로닝
대장균 K12 주 JM109 균 (옥주조 (주) 에서 입수) 의 염색체 DNA 을 사이또 (齊藤) 와 미우라의 방법 (Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)) 으로 제조하였다. 이 DNA 을 주형으로써 이하에 나타낸 2 종류이 프라이머 DNA 을 통상의 방벙에 따라 합성하고 PCR 법으로 대장균 폴리포스페이트키나아제 (ppk) 유전자를 증폭시켰다.
프라이머 (A) : 5'-TACCATGGGTCAGGAAAAGCTATA-3'
프라이머 (B) : 5'-ATGGATCCTTATTCAGGTTGTTCGAGTGA-3'
PCR 에 의한 ppk 유전자의 증폭은, 반응액 100 ㎕ 중 (50 mM 염화칼륨, 10 mM 트리스염산 (pH 8.3), 1.5 mM 염화마그네슘, 0.001 ％ 젤라틴, 주형 DNA 0.1 ㎍, 프라이머 DNA (A) 및 (B) 각각 0.2 μM, AmpliTaq DNA 폴리메라아제 2.5 유니트) 을 Perkin-Elmer Cetus Instrument 사 제조의 DNA Thermal Cycler 을 사용하고 열변성 (94 ℃, 1 분), 어닐링 (55 ℃, 1.5 분), 중합 (72 ℃, 1.5 분) 의 스텝을 25 회 반복함으로써 행하였다.
유전자 증폭후, 반응액을 페놀/클로로포름 (1 : 1) 혼합액으로 처리하고 수용성 분획에 2 배용 (容) 의 에탄올을 첨가하여 DNA 을 침전시켰다. 침전 회수된 DNA 을 문헌 (Molecular cloning, 상술) 의 방법에 따라 아가로오스겔 전기영동에 의해 분리되고 1.9 kb 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 상기 DNA 을 제한효소 NcoI 및 BamHI 로 절단하고 동일한 제한효소 NcoI 및 BamHI 로 절단시킨 플라스미드 pTrc99A (Pharmacia Biotech. 사에서 입수) 와 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결하였다. 연결반응액을 사용하여 대장균 JM109 균을 형질전환시켜 수득된 암피실린 내성 형질전환체에서 플라스미드 pTrc-PPK 를 단리하였다. pTrc-PPK 는, pTrc99A 의 trc 프로모터 하류의 NcoI-BamHI 절단부위에 대장균 ppk 유전자를 함유하는 NcoI-BamHI DNA 단편이 삽입된 것이다.
(2) 대장균 폴리포스페이트키나아제의 제조
플라스미드 pTrc-PPK 를 보유하는 대장균 JM109 균을 100 ㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 2×YT 배지 300 ㎖ 에 식균하고 37 ℃ 에서 진탕 배양하였다. 4×108균/㎖ 에 달한 시점에서, 배양액에 최종농도 1 mM 이 되도록 IPTG 을 첨가하고 추가로 30 ℃ 에서 5 시간 진탕 배양을 계속하였다. 배양 종료후 원심분리 (9,000×g, 10 분) 로 균체를 회수하고 60 ㎖ 완충액 (50 mM 트리스염산 (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.1 ％ 트라이톤 X-100, 0.2 ㎎/㎖ 리소자임) 으로 현탁하였다. 37 ℃ 에서 1 시간 보온한 후 초음파처리를 행하여 균체를 파쇄하고 또 원심분리 (20,000×g, 10 분) 로 균체 나머지를 제거하였다.
이와 같이 수득된 상청액 분획을 5 mM 염화마그네슘 및 1 mM 2-메르캅토에탄올을 함유하는 50 mM 트리스염산 (pH 7.8) 에 대해 투석을 행하여 조효소 (粗酵素) 시료로 하였다. 조효소 시료의 폴리포스페이트키나아제 비활성 (比活性) 은 0.19 유니트/㎎ 단백질로, 대조군 (pTrc99A 를 유지하는 대장균 JM109 균) 의 비활성 (0.00018 유니트/㎎ 단백질) 의 약 1000 배였다. 또한, 아끼야마 등의 방법 (J. Biol. Chem., 267, 22556-22561 (1992)) 에 따라 폴리포스페이트키나아제를 전기영동적으로 균일하기까지 정제하여 이것을 정제효소 시료로 하였다. 또 정제효소 시료의 비활성은 0.7 유니트/㎎ 단백질였다.
또한, 본발명의 폴리포스페이트키나아제 활성의 단위 (유니트) 는 이하에 나타낸 방법으로 측정, 산출하였다.
5 mM 염화마그네슘, 100 mM 황산암모늄, 5 mM ADP 및, 폴리포스페이트 (무기포스페이트으로 150 mM) 을 함유하는 25 mM 트리스염산완충액 (pH 7.8) 에 효소 시료를 첨가하여 37 ℃ 에서 보온함으로써 반응을 행하고 100 ℃, 1 분간의 열처리로 반응을 정지시킨다. 고속액체 크로마토그래피 (HPLC) 를 사용하여 반응액중의 ATP 를 정량하고 37 ℃ 에서 1 분간 1 μmoℓe 의 ATP 를 생성하는 활성을 1 단위 (유니트) 로 한다.
(3) NTP 의 합성 Ⅰ
10 mM 염화마그네슘, 100 mM 황산암모늄, 폴리포스페이트 (무기포스페이트으로 50 mM), 5 mM NDP (ADP, CDP, GDP, UDP, IDP) 을 함유하는 25 mM 트리스염산완충액 (pH 7.8) 에 폴리포스페이트키나아제의 정제효소 시료를 0.01 유니트/㎖ 첨가시켜 37 ℃ 에서 18 시간 반응시켰다. 그 결과를 표 1 에 나타낸다.
(4) NTP 의 합성 Ⅱ
10 mM 염화마그네슘, 100 mM 황산암모늄, 폴리포스페이트 (무기포스페이트으로 50 mM), 25 mM NDP (ADP, CDP, GDP, UDP) 을 함유하는 100 mM 트리스염산완충액(pH 7.8) 에 폴리포스페이트키나아제의 조효소 시료를 0.17 유니트/㎖ 첨가시켜 37 ℃ 에서 16 시간 반응시켰다. 그 결과를 표 2 에 나타낸다.
(5) 대장균 폴리포스페이트키나아제의 폴리포스페이트 합성 (NDP 생성) 활성
상기 실시예의 역반응인 NTP 를 기질로 하는 폴리포스페이트의 합성활성을 NDP 의 생성을 지표로써 해석하였다. 즉, 10 mM 염화마그네슘, 100 mM 황산암모늄, 5 mM NDP (ATP, CTP, GTP, UTP) 을 함유하는 25 mM 트리스염산완충액 (pH 7.8) 에 폴리포스페이트키나아제의 조효소 시료를 0.01 유니트/㎖ 첨가시켜 37 ℃ 에서 18 시간 인큐베이트하였다.
수득된 반응액을 HPLC 을 사용하여 해석한 결과를 표 3 에 나타낸다. 표 3 으로부터 알 수 있듯이 본 반응 조건하에서는 ATP 이외의 NTP 를 기질로 하는 폴리포스페이트 합성은 보이지않았다.
실시예 2 : 폴리포스페이트키나아제를 사용한 UDP 로부터의 UDP 글루코스 (UDPG) 의 합성
(1) 대장균 UDP 글루코스피로포스포릴라아제 유전자의 클로닝
대장균 K12 주 JM109 균 (다까라슈조 (주) 에서 입수) 의 염색체 DNA 을 사이또와 미우라의 방법 (Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)) 으로 제조하였다. 이 DNA 을 주형으로서 이하에 나타낸 2 종류의 프라이머 DNA 을 통상의 방법에 따라 합성하고 PCR 법으로 대장균 UDP 글루코스피로포스포릴라아제 (galU) 유전자 (Weissborn et al., J. Bacteriol., 176, 2661 (1994)) 를 증폭시켰다.
프라이머 (C) : 5'-GCGAATTCTGATATACTGGGATGCGATAC-3'
프라이머 (D) : 5'-ACGTCGACACCGATACGGATGTATCTT-3'
PCR 에 의한 galU 유전자의 증폭은, 반응액 100 ㎕ 중 (50 mM 염화칼륨,10 mM 트리스염산 (pH 8.3), 1.5 mM 염화마그네슘, 0.001 ％ 젤라틴, 주형 DNA 0.1 ㎍, 프라이머 DNA (C) 및 (D) 각각 0.2 μM, AmpliTaq DNA 폴리메라아제 2.5 유니트) 을 Perkin-Elmer Cetus Instrument 사 제조의 DNA Thermal Cycler 을 사용하고열변성 (94 ℃, 1 분), 어닐링 (55 ℃, 1.5 분), 중합 (72 ℃, 1.5 분) 의 스텝을 25 회 반복함으로써 행하였다.
유전자 증폭후, 반응액을 페놀/클로로포름 (1 : 1) 혼합액으로 처리하고 수용성 분획에 2 배용의 에탄올을 첨가하여 DNA 을 침전시켰다. 침전 회수된 DNA 을 문헌 (Molecular cloning, 상술) 의 방법에 따라 아가로오스겔 전기영동에 의해 분리되고 1.0 kb 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 상기 DNA 을 제한효소 EcoRI 및 SalI 로 절단하고 동일한 제한효소 EcoRI 및 SalI 로 절단시킨 플라스미드 pTrc99A (Pharmacia Biotech. 사에서 입수) 와 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결하였다. 연결반응액을 사용하여 대장균 JM109 균을 형질전환시켜 수득된 암피실린 내성 형질전환체에서 플라스미드 pTrc-galU 를 단리하였다. pTrc-galU 는, pTrc99A 의 trc 프로모터 하류의 EcoRI-SalI 절단부위에 대장균 galU 유전자를 함유하는 EcoRI 및 SalIDNA 단편이 삽입된 것이다.
(2) 대장균 UDP 글루코스피로포스포릴라아제의 제조
플라스미드 pTrc-galU 를 보유하는 대장균 JM109 균을, 100 ㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 2×YT 배지 300 ㎖ 에 식균하고 37 ℃ 에서 진탕 배양하였다. 4×108균/㎖ 에 달한 시점에서, 배양액에 최종농도 1 mM 이 되도록 IPTG 을 첨가하고 추가로 37 ℃ 에서 2.5 시간 진탕 배양을 계속하였다.
배양 종료후 원심분리 (9,000×g, 10 분) 로 균체를 회수하고 60 ㎖ 의 완충액 (50 mM 트리스염산 (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.1 ％ 트라이톤 X-100, 0.2 ㎎/㎖ 리소자임) 으로 현탁하였다. 37 ℃ 에서 1 시간 보온한 후 초음파처리를 행하여 균체를 파쇄하고 또 원심분리 (20,000×g, 10 분) 로 균체 나머지를 제거하였다. 이와 같이 수득된 상청액 분획을 효소 시료로 하였다. 효소 시료의 UDP 글루코스피로포스포릴라아제 활성을 대조균 (pTrc99A 를 유지하는 대장균 JM109 균) 과 함께 하기 표에 나타낸다.
또한, UDP 글루코스피로포스포릴라아제 활성의 단위 (유니트) 는 이하에 나타낸 방법으로 측정, 산출하였다. 즉, 5 mM 염화마그네슘, 6 mM UTP, 6 mM 글루코스1-포스페이트를 함유하는 50 mM 트리스염산완충액 (pH 8.0) 에 효소 시료를 첨가하여 37 ℃ 에서 보온함으로써 반응을 행하고 100 ℃, 5 분간의 열처리로 효소를 불활성화시킨다. HPLC 법으로 반응액 중의 UDPG 을 정량하고 37 ℃ 에서 1 분간 1 μmoℓe 의 UDPG 를 생성활성을 1 단위 (유니트) 로 한다.
(3) UDPG 의 합성
100 mM 황산암모늄, 10 mM 염화마그네슘, 20 mM UDP, 30 mM 글루코스1-포스페이트, 폴리포스페이트 (무기포스페이트으로 50 mM) 을 함유하는 100 mM 트리스염산완충액 (pH 7.8) 에 각각 0.17 유니트/㎖, 2.0 유니트/㎖ 가 되도록 대장균 폴리포스페이트키나아제 조효소 시료 및 대장균 UDPG 피로포스포릴라아제 효소 시료를 첨가시켜 37 ℃ 로 보온하였다. 반응 7.5 시간후에 HPLC 법으로 반응액 중의 UDPG 을 정량한 바, 5.5 mM UDPG 의 생성이 확인되었다. 또한, 반응 24 시간후에는 10.1 mM UDPG 의 생성이 확인되었다. 또 대조적으로 상술한 반응액보다 폴리포스페이트를 첨가하지 않은 것은 반응 7.5 및 24 시간후에는 UDPG 의 생성은 각각 0.23, 0.20 mM 였다.
실시예 3 : 올리고당의 합성
(1) 대장균 UDP 갈락토오스4-에피메라아제 유전자 (galE) 의 클로닝
대장균 K12 주 JM109 균 (옥주조 (주) 에서 입수) 의 염색체 DNA 을 사이또와 미우라의 방법 (Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)) 으로 제조하였다. 이 DNA 을 주형으로써 이하에 나타낸 2 종류의 프라이머 DNA 을 통상의 방법에 따라 합성하고 PCR 법으로 대장균 UDP 갈락토오스4-에피메라아제 유전자 (galE) 를 증폭시켰다.
프라이머 (E) : 5'-TAGAATTCATACCATAAGCCTAATGGA-3'
프라이머 (F) : 5'-TAGGATCCTTAATCGGGATATCCCTGT-3'
PCR 에 의한 galE 유전자의 증폭은, 반응액 100 ㎕ 중 (50 mM 염화칼륨, 10 mM 트리스염산 (pH 8.3), 1.5 mM 염화마그네슘, 0.001 ％ 젤라틴, 주형 DNA 0.1 ㎍, 프라이머 DNA (E) 및 (F) 각각 0.2 μM, AmpliTaq DNA 폴리메라아제 2.5 유니트) 을 Perkin-Elmer Cetus Instrument 사 제조의 DNA Thermal Cycler 을 사용하고 열변성 (94 ℃, 1 분), 어닐링 (55 ℃, 1.5 분), 중합 (72 ℃, 1.5 분) 의 스텝을25 회 반복함으로써 행하였다.
유전자 증폭후, 반응액을 페놀/클로로포름 (1 : 1) 혼합액으로 처리하고 수용성 분획에 2 배용의 에탄올을 첨가하여 DNA 을 침전시켰다. 침전 회수된 DNA 을 문헌 (Molecular cloning, 상술) 의 방법에 따라 아가로오스겔 전기영동에 의해 분리되고 1.0 kb 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 상기 DNA 을 제한효소 EcoRI 및 BamHI 로 절단하고 동일한 제한효소 EcoRI 및 BamHI 로 절단시킨 플라스미드 pTrc99A (Pharmacia Biotech. 사에서 입수) 와 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결하였다. 연결반응액을 사용하여 대장균 JM109 균을 형질전환시켜 수득된 암피실린 내성 형질전환체에서 플라스미드 pTrc-galE를 단리하였다. pTrc-galE 는 pTrc99A 의 trc 프로모터 하류의 EcoRI-BamHI 절단부위에 대장균 galE 유전자를 함유하는 EcoRI-BamHI DNA 단편이 삽입된 것이다.
(2) 대장균 UDP 갈락토오스4-에피메라아제의 제조
플라스미드 pTrc-galE 를 보유하는 대장균 JM109 균을, 100 ㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 2×YT 배지 300 ㎖ 에 식균하고 37 ℃ 에서 진탕 배양하였다. 4×108균/㎖ 에 달한 시점에서, 배양액에 최종농도 1 mM 이 되도록 IPTG 을 첨가하고 추가로 30 ℃ 에서 5 시간 진탕 배양을 계속하였다. 배양 종료후 원심분리 (9,000×g, 10 분) 로 균체를 회수하고 60 ㎖ 의 완충액 (50 mM 트리스염산 (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.2 ㎎/㎖ 리소자임) 으로 현탁하였다. 0 ℃ 에서 20 분간 보온한 후 초음파처리를 행하여 균체를 파쇄하고 또 원심분리 (20,000×g, 10 분) 로균체 나머지를 제거하였다.
이와 같이 수득된 상청액 분획을 조효소 시료로 하였다. 조효소 시료의 UDP-Gaℓ4-에피머라아제 비활성은, 26.6 유니트/㎎ 단백질이고, 대조균 (pTrc99A 를 유지하는 대장균 JM109 균) 의 비활성 (0.011 유니트/㎎ 단백질) 의 약 2400 배였다.
또한, 본 발명의 UDP 갈락토오스4-에피머라아제 활성의 단위 (유니트) 는 이하에 나타낸 방법으로 측정, 산출하였다. 즉, 10 mM UDP 글루코스를 함유한 40 mM 트리스염산완충액 (pH 7.8) 중, 37 ℃ 에서 1 분간에 1 μmoℓe 의 UDP 갈락토오스를 생성하는 활성을 1 단위 (유니트) 로 한다.
(3) 락토오스〔Gal(β1-4)Glc〕의 합성 (도 11 참조)
10 mM 염화마그네슘, 100 mM 염화망간, 20 mM 글루코스, 4 mM UTP, 30 mM 글루코스1-포스페이트, 0.2 ㎎/㎖ α-락토알부민을 함유한 25 mM 트리스염산완충액 (pH 7.8) 에 포스페이트으로서 150 mM 이 되도록 폴리포스페이트를 첨가하고 추가로 0.5 유니트/㎖ 소 우유 유래 갈락토실트랜스퍼라아제 (시그마사에서 입수), 1.0 유니트/㎖ UDP-갈락토오스피로포스포릴라아제, 1.0 유니트/㎖ UDP-갈락토오스4-에피머라아제, 0.1 유니트/㎖ 폴리포스페이트키나아제를 첨가시켜 37 ℃ 에서 20 시간 보온하였다. 반응액을 당 분석장치 (Dionex 사 제조) 로 분석한 바, 12.4 mM 의 락토오스의 생성이 확인되었다.
(4) N-아세틸락토사민〔Gal(β1-4)GlcNAc〕의 합성 (도 12 참조)
10 mM 염화마그네슘, 10 mM 염화망간, 20 mM N-아세틸글루코사민, 4 mM UTP, 30 mM 글루코스1-포스페이트를 함유한 25 mM 트리스염산완충액 (pH 7.8) 에 포스페이트으로서 150 mM 이 되도록 폴리포스페이트를 첨가하고 추가로 0.5 유니트/㎖ 소 우유 유래 갈라토실트랜스퍼라아제 (시구마사에서 입수), 1.0 유니트/㎖ UDP-갈락토오스피로포스포릴라아제, 1.0 유니트/㎖ UDP-갈락토오스4-에피머라아제, 0.1 유니트/㎖ 폴리포스페이트키나아제를 첨가시켜 37 ℃ 에서 20 시간 보온하였다. 반응액을 당 분석장치 (Dionex 사 제조) 로 분석한 바, 13.6 mM N-아세틸락토사민의 생성이 확인되었다.
본발명에 의해 간편하고 저렴한 NDP 로부터의 NTP 의 효소합성이 가능하게 되었다. 또한, 당 뉴클레오티드 합성 등과의 조합에 의한 올리고당의 효소합성계에서 NDP 로부터의 NTP 로의 재생 또는 변환반응에 값비싼 포스포에놀피루빈산 또는 ATP 등을 사용하지 않고 저비용으로 당 뉴클레오티드의 리사이클 합성, 이것에 수반되는 예컨대 올리고당 합성이 가능하게 되었다.

Claims (5)

  1. 아데노신5'-디포스페이트 (ADP) 이외의 뉴클레오시드5'-디포스페이트 (NDP) 으로부터 뉴클레오시드5'-트리포스페이트 (NTP) 을 제조하는 방법으로, 효소로서 폴리포스페이트키나아제를 사용하고 포스페이트 도우너로서 폴리포스페이트를 사용하는 것을 특징으로 하는 NDP 로부터 NTP 을 제조하는 방법.
  2. 다른 효소반응에서 생성된 ADP 이외의 NDP 를 NTP 로 재생하는 방법으로, 효소로서 폴리포스페이트키나아제를 사용하고 포스페이트 도우너로서 폴리포스페이트를 사용하는 것을 특징으로 하는 NDP 로부터 NTP 을 재생하는 방법.
  3. 글리코실트랜스퍼라아제에 의해 당 뉴클레오티드와 액셉터 당류로부터 상기 액셉터 당류의 글리코실화 화합물을 제조함과 동시에 상기 반응에서 생성된 뉴클레오시드5'-모노포스페이트 (NMP) 또는 NDP 를 NTP 로, 이어서 당 뉴클레오티드로 변환하여 리사이클하는 액셉터 당류의 글리코실화 화합물의 제조법에서, NDP 로부터 NTP 로의 변환을 효소로서 폴리포스페이트키나아제를 사용하고 포스페이트 도우너로서 폴리포스페이트를 사용하여 행하는 것을 특징으로 하는 액셉터 당류의 글리코실화 화합물의 제조법.
  4. 제 3 항에 있어서, 글리코실트랜스퍼라아제가, 갈락토실트랜스퍼라아제, 글루코실트랜스퍼라아제, 푸코실트랜스퍼라아제, 만노실트랜스퍼라아제, 글루쿠로닐트랜스퍼라아제, 시아릴트랜스퍼라아제, N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라아제 또는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제이고 ; 액셉터 당류의 글리코실화 화합물로는, 액셉터 당류에 갈락토오스, 글루코오스, 푸코오스, 만노오스, 글루쿠론산, 시아릴산, N-아세틸갈락토사민 또는 N-아세틸글루코사민이 부가된 화합물인 제조법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, NTP 로부터 당 뉴클레오티드로의 변환이, NTP 에 NDP-글리코실피로포스포릴라아제 및 당1-포스페이트를 작용시키고, 필요에 따라 추가로 에피머라아제, 데히드로게나아제 또는 신세타제 등을 작용시킴으로써 행해지는 제조법.
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