JP2002335988A - オリゴ糖の製造法 - Google Patents
オリゴ糖の製造法Info
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- JP2002335988A JP2002335988A JP2001151791A JP2001151791A JP2002335988A JP 2002335988 A JP2002335988 A JP 2002335988A JP 2001151791 A JP2001151791 A JP 2001151791A JP 2001151791 A JP2001151791 A JP 2001151791A JP 2002335988 A JP2002335988 A JP 2002335988A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】安価なヌクレオシド５’−モノリン酸（ＮＭ
Ｐ）もしくはヌクレオシド５’−ジリン酸（ＮＤＰ）か
らのヌクレオシド５’−トリリン酸（ＮＴＰ）再生を伴
う糖ヌクレオチドのサイクル合成と糖転移酵素を組み合
わせたオリゴ糖の効率的な合成法を提供する。 【解決手段】下記式（Ｉ）のオリゴ糖合成系において、
ＮＭＰもしくはＮＤＰからＮＴＰへの反応および糖から
糖−１−リン酸への反応を酵母菌体を用いて行うことを
特徴とするオリゴ糖の製造法に関する。 （Ｉ） また、下記式（ＩＩ）のオリゴ糖合成系において、ＮＭ
ＰからＮＴＰへの反応を酵母菌体を用いて行うことを特
徴とするオリゴ糖の製造法に関する。
Ｐ）もしくはヌクレオシド５’−ジリン酸（ＮＤＰ）か
らのヌクレオシド５’−トリリン酸（ＮＴＰ）再生を伴
う糖ヌクレオチドのサイクル合成と糖転移酵素を組み合
わせたオリゴ糖の効率的な合成法を提供する。 【解決手段】下記式（Ｉ）のオリゴ糖合成系において、
ＮＭＰもしくはＮＤＰからＮＴＰへの反応および糖から
糖−１−リン酸への反応を酵母菌体を用いて行うことを
特徴とするオリゴ糖の製造法に関する。 （Ｉ） また、下記式（ＩＩ）のオリゴ糖合成系において、ＮＭ
ＰからＮＴＰへの反応を酵母菌体を用いて行うことを特
徴とするオリゴ糖の製造法に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、安価なヌクレオシ
ド５’−モノリン酸（ＮＭＰ）もしくはヌクレオシド
５’−ジリン酸（ＮＤＰ）からのヌクレオシド５’−ト
リリン酸（ＮＴＰ）再生を伴う糖ヌクレオチドのサイク
ル合成と糖転移酵素を組み合わせたオリゴ糖の効率的な
合成法を提供するものである。
ド５’−モノリン酸（ＮＭＰ）もしくはヌクレオシド
５’−ジリン酸（ＮＤＰ）からのヌクレオシド５’−ト
リリン酸（ＮＴＰ）再生を伴う糖ヌクレオチドのサイク
ル合成と糖転移酵素を組み合わせたオリゴ糖の効率的な
合成法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、糖鎖についての研究が急速に進
み、その機能が明らかになるにつれ、生理活性を有する
オリゴ糖の医薬品または機能性素材としての用途開発が
注目を集めている。しかし、現在市販されているオリゴ
糖はごく限られた種類のものしかなく、しかも極めて高
価である。また、そのようなオリゴ糖は試薬レベルでし
か製造できず、必ずしもその大量製造法が確立されてい
るとは限らない。従来、オリゴ糖の製造は天然物からの
抽出法、化学合成法あるいは酵素合成法、さらにはそれ
らの併用により行われていたが、その中でも酵素合成法
が大量製造に適した方法であると考えられている。
み、その機能が明らかになるにつれ、生理活性を有する
オリゴ糖の医薬品または機能性素材としての用途開発が
注目を集めている。しかし、現在市販されているオリゴ
糖はごく限られた種類のものしかなく、しかも極めて高
価である。また、そのようなオリゴ糖は試薬レベルでし
か製造できず、必ずしもその大量製造法が確立されてい
るとは限らない。従来、オリゴ糖の製造は天然物からの
抽出法、化学合成法あるいは酵素合成法、さらにはそれ
らの併用により行われていたが、その中でも酵素合成法
が大量製造に適した方法であると考えられている。
【０００３】酵素合成法によりオリゴ糖を合成する方法
としては、オリゴ糖の加水分解酵素の逆反応を利用する
方法および糖転移酵素を利用する方法の２通りの方法が
考えられている。後者の糖転移酵素を用いる方法は、合
成収率や複雑な構造を持つオリゴ糖合成への応用といっ
た点で前者の方法よりも有利であると考えられている。
としては、オリゴ糖の加水分解酵素の逆反応を利用する
方法および糖転移酵素を利用する方法の２通りの方法が
考えられている。後者の糖転移酵素を用いる方法は、合
成収率や複雑な構造を持つオリゴ糖合成への応用といっ
た点で前者の方法よりも有利であると考えられている。
【０００４】糖転移酵素は糖ヌクレオチドを糖供与体と
して、受容体となる糖鎖に糖を転移し、糖鎖伸長を行う
酵素である。例えば、シアリルオリゴ糖は、シチジン
５’−モノホスホリル−Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｃ
ＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を糖供与体としてシアル酸転移酵素
（シアリルトランスフェラーゼ）により合成される。シ
アル酸転移反応によりシチジン５’−モノリン酸（ＣＭ
Ｐ）が生成するが、ＣＭＰはシアル酸転移酵素活性を阻
害するため、ＣＭＰを反応系より除去しないとシアル酸
転移反応の効率は低下してしまう。そのため、通常、ホ
スファターゼなどの添加によりＣＭＰを分解するなどの
操作が必要である。また、原料となるＣＭＰ−ＮｅｕＡ
ｃ等の糖ヌクレオチドは高価であることからも、糖ヌク
レオチドを直接原料としてシアリルオリゴ糖を合成する
ことは実用的な方法とは言えなかった。
して、受容体となる糖鎖に糖を転移し、糖鎖伸長を行う
酵素である。例えば、シアリルオリゴ糖は、シチジン
５’−モノホスホリル−Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｃ
ＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を糖供与体としてシアル酸転移酵素
（シアリルトランスフェラーゼ）により合成される。シ
アル酸転移反応によりシチジン５’−モノリン酸（ＣＭ
Ｐ）が生成するが、ＣＭＰはシアル酸転移酵素活性を阻
害するため、ＣＭＰを反応系より除去しないとシアル酸
転移反応の効率は低下してしまう。そのため、通常、ホ
スファターゼなどの添加によりＣＭＰを分解するなどの
操作が必要である。また、原料となるＣＭＰ−ＮｅｕＡ
ｃ等の糖ヌクレオチドは高価であることからも、糖ヌク
レオチドを直接原料としてシアリルオリゴ糖を合成する
ことは実用的な方法とは言えなかった。
【０００５】そのため、糖ヌクレオチドのサイクル合成
と糖転移反応の組み合せによるオリゴ糖の合成法が考案
されている。糖ヌクレオチドのサイクル合成とは、糖転
移反応により生成するＮＤＰあるいはＮＭＰをリン酸化
して、糖転移酵素活性を阻害するＮＤＰあるいはＮＭＰ
の蓄積を排除するとともに、糖ヌクレオチド合成の基質
となるＮＴＰに再生し、もって酵素的に糖ヌクレオチド
を再生させるというものである。
と糖転移反応の組み合せによるオリゴ糖の合成法が考案
されている。糖ヌクレオチドのサイクル合成とは、糖転
移反応により生成するＮＤＰあるいはＮＭＰをリン酸化
して、糖転移酵素活性を阻害するＮＤＰあるいはＮＭＰ
の蓄積を排除するとともに、糖ヌクレオチド合成の基質
となるＮＴＰに再生し、もって酵素的に糖ヌクレオチド
を再生させるというものである。
【０００６】ＮＭＰもしくはＮＤＰからのＮＴＰの再生
には、（１）ミオキナーゼやピルビン酸キナーゼなどの
酵素と、アデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）あるい
はホスホエノールピルビン酸などのリン酸供与体を用い
てＮＭＰもしくはＮＤＰを酵素的にリン酸化する方法
（Pure & Appl. Chem., 65, 803-808 (1993), J. Am.C
hem., 113, 6300-6302 (1991), U.S. Patent 5,728,55
4、 Nature Biotech., 16, 769-772 (1998)）や、
（２）微生物生菌体（Corynebacterium ammnoniagene
s）を用いてＮＭＰもしくはＮＤＰをリン酸化する方法
（Nature Biotech. 16, 847-850 (1998), Carbohydorat
e Res. 316, 179-183 (1999), Appl. Microbiol. Biote
chnol., 53: 257-261 (2000))が報告されている。
には、（１）ミオキナーゼやピルビン酸キナーゼなどの
酵素と、アデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）あるい
はホスホエノールピルビン酸などのリン酸供与体を用い
てＮＭＰもしくはＮＤＰを酵素的にリン酸化する方法
（Pure & Appl. Chem., 65, 803-808 (1993), J. Am.C
hem., 113, 6300-6302 (1991), U.S. Patent 5,728,55
4、 Nature Biotech., 16, 769-772 (1998)）や、
（２）微生物生菌体（Corynebacterium ammnoniagene
s）を用いてＮＭＰもしくはＮＤＰをリン酸化する方法
（Nature Biotech. 16, 847-850 (1998), Carbohydorat
e Res. 316, 179-183 (1999), Appl. Microbiol. Biote
chnol., 53: 257-261 (2000))が報告されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
（１）の方法は、リン酸供与体となるＡＴＰあるいはホ
スホエノールピルビン酸が高価であるという問題があ
る。また、ＮＴＰを基質とした糖ヌクレオチド合成の際
にピロリン酸が生成し、これが蓄積することにより糖ヌ
クレオチド合成が抑制されるためピロリン酸分解酵素を
添加して無機リン酸に分解する必要がある。しかし、無
機リン酸は、糖転移酵素反応に必要な金属イオン（マグ
ネシウム、マンガンなど）と不溶性沈殿を形成して該酵
素反応の進行を抑制あるいは遅延させるため、反応途中
に金属イオンを再添加しなければならず、煩雑な工程管
理とならざるを得なかった（特表平１１−５０３３２８
号、特表平１１−５０３３２９号）。
（１）の方法は、リン酸供与体となるＡＴＰあるいはホ
スホエノールピルビン酸が高価であるという問題があ
る。また、ＮＴＰを基質とした糖ヌクレオチド合成の際
にピロリン酸が生成し、これが蓄積することにより糖ヌ
クレオチド合成が抑制されるためピロリン酸分解酵素を
添加して無機リン酸に分解する必要がある。しかし、無
機リン酸は、糖転移酵素反応に必要な金属イオン（マグ
ネシウム、マンガンなど）と不溶性沈殿を形成して該酵
素反応の進行を抑制あるいは遅延させるため、反応途中
に金属イオンを再添加しなければならず、煩雑な工程管
理とならざるを得なかった（特表平１１−５０３３２８
号、特表平１１−５０３３２９号）。
【０００８】また、上記の（２）の方法は、ＮＭＰもし
くはＮＤＰのリン酸化反応に膨大な微生物菌体量が必要
であるため、該微生物の調製のための設備及びコスト面
で問題があった。また、（１）と同様にピロリン酸およ
び無機リン酸が蓄積するため、ピロフォスファターゼあ
るいは該酵素の生産菌を添加しなければならないことか
らも必ずしも簡便な方法とは言い難かった。
くはＮＤＰのリン酸化反応に膨大な微生物菌体量が必要
であるため、該微生物の調製のための設備及びコスト面
で問題があった。また、（１）と同様にピロリン酸およ
び無機リン酸が蓄積するため、ピロフォスファターゼあ
るいは該酵素の生産菌を添加しなければならないことか
らも必ずしも簡便な方法とは言い難かった。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、オリゴ糖
の効率的な合成法を見出すべく、糖ヌクレオチドのサイ
クル合成におけるＮＭＰもしくはＮＤＰからのＮＴＰの
再生に酵母菌体を用いることについて検討した。従来、
酵母菌体を用いて糖ヌクレオチドを製造する方法は公知
である（ＷＯ９８／１１２４７など）。しかしながら、
糖転移酵素を共存させた場合や、糖ヌクレオチドのサイ
クル合成に伴い生成するピロリン酸や無機リン酸が酵母
の生存あるいは酵母内の酵素活性に及ぼす影響について
は全く検討されておらず、不明であった。
の効率的な合成法を見出すべく、糖ヌクレオチドのサイ
クル合成におけるＮＭＰもしくはＮＤＰからのＮＴＰの
再生に酵母菌体を用いることについて検討した。従来、
酵母菌体を用いて糖ヌクレオチドを製造する方法は公知
である（ＷＯ９８／１１２４７など）。しかしながら、
糖転移酵素を共存させた場合や、糖ヌクレオチドのサイ
クル合成に伴い生成するピロリン酸や無機リン酸が酵母
の生存あるいは酵母内の酵素活性に及ぼす影響について
は全く検討されておらず、不明であった。
【００１０】このような状況下、鋭意検討したところ、
少量の酵母を添加するだけでＮＭＰもしくはＮＤＰから
ＮＴＰおよび糖ヌクレオチドの再生が可能であるだけで
なく、反応液中にピロリン酸および無機リン酸の蓄積が
みられないことから分解酵素の添加等の煩雑な工程を必
要とせずにオリゴ糖の合成が可能であることを見出し、
本発明を完成させた。
少量の酵母を添加するだけでＮＭＰもしくはＮＤＰから
ＮＴＰおよび糖ヌクレオチドの再生が可能であるだけで
なく、反応液中にピロリン酸および無機リン酸の蓄積が
みられないことから分解酵素の添加等の煩雑な工程を必
要とせずにオリゴ糖の合成が可能であることを見出し、
本発明を完成させた。
【００１１】すなわち、本発明は、下記式（ＩＩＩ）の
オリゴ糖合成系において、ＮＭＰもしくはＮＤＰからＮ
ＴＰへの反応および糖から糖−１−リン酸への反応を酵
母菌体を用いて行うことを特徴とするオリゴ糖の製造法
に関するものである。 （ＩＩＩ）
オリゴ糖合成系において、ＮＭＰもしくはＮＤＰからＮ
ＴＰへの反応および糖から糖−１−リン酸への反応を酵
母菌体を用いて行うことを特徴とするオリゴ糖の製造法
に関するものである。 （ＩＩＩ）
【００１２】また、本発明は、下記式（ＩＶ）のオリゴ
糖合成系において、ＮＭＰからＮＴＰへの反応を酵母菌
体を用いて行うことを特徴とするオリゴ糖の製造法に関
するものである。 （ＩＶ）
糖合成系において、ＮＭＰからＮＴＰへの反応を酵母菌
体を用いて行うことを特徴とするオリゴ糖の製造法に関
するものである。 （ＩＶ）
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明のオリゴ糖の製造法は、Ｎ
ＭＰ、糖および糖受容体を含有する反応系に酵母菌体、
糖ヌクレオチド合成酵素および糖転移酵素を添加して実
施するのものである。反応系に添加する酵母菌体として
は、市販のパン酵母あるいはワイン酵母などをあげるこ
とができる。このような酵母菌体は、生酵母、乾燥酵母
いずれであってもかまわないが、反応収率の点からは乾
燥酵母を用いるのが好ましい。
ＭＰ、糖および糖受容体を含有する反応系に酵母菌体、
糖ヌクレオチド合成酵素および糖転移酵素を添加して実
施するのものである。反応系に添加する酵母菌体として
は、市販のパン酵母あるいはワイン酵母などをあげるこ
とができる。このような酵母菌体は、生酵母、乾燥酵母
いずれであってもかまわないが、反応収率の点からは乾
燥酵母を用いるのが好ましい。
【００１４】同じく反応系に添加する糖転移酵素として
は、糖ヌクレオチドの糖残基を糖受容体に転移させる活
性を有するものであればよく、例えば、ガラクトシルト
ランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、フ
コシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラ
ーゼ、シアリルトランスフェラーゼ等があげられる（Ｗ
Ｏ９８／２２６１４、特表平１１−５０３３２９な
ど）。
は、糖ヌクレオチドの糖残基を糖受容体に転移させる活
性を有するものであればよく、例えば、ガラクトシルト
ランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、フ
コシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラ
ーゼ、シアリルトランスフェラーゼ等があげられる（Ｗ
Ｏ９８／２２６１４、特表平１１−５０３３２９な
ど）。
【００１５】また、糖ヌクレオチド合成酵素としては、
糖または糖−１−リン酸とヌクレオチドから糖ヌクレオ
チドを合成する活性を有するものであればよく、例え
ば、ヌクレオシドジリン酸−糖ピロホスホリラーゼ（Ｕ
ＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰマンノース
ピロホスホリラーゼなど）、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素
などがあげられる（ＷＯ９８／１１２４８など）。ま
た、生成した糖ヌクレオチドを他の糖ヌクレオチドに変
換する酵素を使用してもよく、そのような酵素として
は、糖−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ヘ
キソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ
等）があげられる（特表平１１−５０３３２９など）。
糖または糖−１−リン酸とヌクレオチドから糖ヌクレオ
チドを合成する活性を有するものであればよく、例え
ば、ヌクレオシドジリン酸−糖ピロホスホリラーゼ（Ｕ
ＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰマンノース
ピロホスホリラーゼなど）、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素
などがあげられる（ＷＯ９８／１１２４８など）。ま
た、生成した糖ヌクレオチドを他の糖ヌクレオチドに変
換する酵素を使用してもよく、そのような酵素として
は、糖−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ヘ
キソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ
等）があげられる（特表平１１−５０３３２９など）。
【００１６】これらの酵素は目的とする酵素活性を有す
る限りどのような形態であってもよい。酵素調製の簡便
さと共に調製効率を高めるため、該酵素遺伝子をクロー
ン化し、微生物菌体内で大量発現させ、該酵素の大量調
製を行う、いわゆる遺伝子操作技術を用いた酵素生産が
最も都合がよい。酵素標品としては具体的には、微生物
の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵
素調製物などを例示することができる。
る限りどのような形態であってもよい。酵素調製の簡便
さと共に調製効率を高めるため、該酵素遺伝子をクロー
ン化し、微生物菌体内で大量発現させ、該酵素の大量調
製を行う、いわゆる遺伝子操作技術を用いた酵素生産が
最も都合がよい。酵素標品としては具体的には、微生物
の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵
素調製物などを例示することができる。
【００１７】微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育
可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集
菌する方法で行うことができる。具体的に、大腸菌（Es
cherichia coli）属する細菌を例に挙げ説明すれば、培
地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、
０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２
×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキス
トラクト、０．５％食塩）などを使用することができ、
当該培地に種菌を接種後、３０〜５０℃で１０〜５０時
間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液
を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより、目的
の酵素活性を有する微生物菌体を調製することができ
る。
可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集
菌する方法で行うことができる。具体的に、大腸菌（Es
cherichia coli）属する細菌を例に挙げ説明すれば、培
地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、
０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２
×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキス
トラクト、０．５％食塩）などを使用することができ、
当該培地に種菌を接種後、３０〜５０℃で１０〜５０時
間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液
を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより、目的
の酵素活性を有する微生物菌体を調製することができ
る。
【００１８】微生物の菌体処理物としては、上記微生物
菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプ
レス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、
自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処
理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理
（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法
に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細
胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
酵素調製物としては、上記菌体処理物から当該酵素活性
を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電
点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマ
トグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または
精製酵素を例示することができる。
菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプ
レス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、
自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処
理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理
（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法
に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細
胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
酵素調製物としては、上記菌体処理物から当該酵素活性
を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電
点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマ
トグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または
精製酵素を例示することができる。
【００１９】ＮＭＰは市販の製品を使用することができ
る。使用濃度としては１〜２００ｍＭ、好ましくは１０
〜５０ｍＭの範囲から適宜設定できる。また、糖および
糖受容体は生成目的のオリゴ糖に応じて既知のものから
適宜選択して使用すればよく（ＷＯ９８／２２６１４、
ＷＯ９８／１２３４３、ＷＯ９８／１１２４８、特表平
１１−５０３３２９等参照）、市販されている場合には
それら市販品が使用できる。使用濃度としては、１〜２
００ｍＭ、好ましくは５０〜１００ｍＭの範囲から適宜
設定すればよい。
る。使用濃度としては１〜２００ｍＭ、好ましくは１０
〜５０ｍＭの範囲から適宜設定できる。また、糖および
糖受容体は生成目的のオリゴ糖に応じて既知のものから
適宜選択して使用すればよく（ＷＯ９８／２２６１４、
ＷＯ９８／１２３４３、ＷＯ９８／１１２４８、特表平
１１−５０３３２９等参照）、市販されている場合には
それら市販品が使用できる。使用濃度としては、１〜２
００ｍＭ、好ましくは５０〜１００ｍＭの範囲から適宜
設定すればよい。
【００２０】本発明のオリゴ糖合成は、上記のＮＭＰ、
糖および糖受容体を含有する反応系に、酵母菌体を１〜
１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜５％、糖ヌクレオチ
ド合成酵素および糖転移酵素をそれぞれ０．００１ユニ
ット／ｍｌ以上、好ましくは、０．０１〜１０ユニット
／ｍｌ程度になるようにそれぞれ添加し、５〜３５℃、
好ましくは１０〜３０℃で１〜５０時間程度、必要によ
り撹拌しながら反応させることにより実施できる。
糖および糖受容体を含有する反応系に、酵母菌体を１〜
１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜５％、糖ヌクレオチ
ド合成酵素および糖転移酵素をそれぞれ０．００１ユニ
ット／ｍｌ以上、好ましくは、０．０１〜１０ユニット
／ｍｌ程度になるようにそれぞれ添加し、５〜３５℃、
好ましくは１０〜３０℃で１〜５０時間程度、必要によ
り撹拌しながら反応させることにより実施できる。
【００２１】上記のオリゴ糖合成系には、必要に応じて
無機リン酸およびエネルギー源を添加するのが好まし
い。無機リン酸としては、リン酸カリウムなどをそのま
ま使用することもできるが、リン酸緩衝液の形態で使用
するのが好ましい。使用濃度は、１〜５００ｍＭ、好ま
しくは５０〜２００ｍＭの範囲から適宜設定することが
できる。また、リン酸緩衝液のｐＨも６．０〜８．０の
範囲から適宜設定すればよい。エネルギー源としては、
グルコース、フラクトースなどの糖類、酢酸、クエン酸
などの有機酸を使用することができ、その使用濃度とし
ては、１〜８００ｍＭ、好ましくは２００〜４００ｍＭ
の範囲から適宜設定することができる。
無機リン酸およびエネルギー源を添加するのが好まし
い。無機リン酸としては、リン酸カリウムなどをそのま
ま使用することもできるが、リン酸緩衝液の形態で使用
するのが好ましい。使用濃度は、１〜５００ｍＭ、好ま
しくは５０〜２００ｍＭの範囲から適宜設定することが
できる。また、リン酸緩衝液のｐＨも６．０〜８．０の
範囲から適宜設定すればよい。エネルギー源としては、
グルコース、フラクトースなどの糖類、酢酸、クエン酸
などの有機酸を使用することができ、その使用濃度とし
ては、１〜８００ｍＭ、好ましくは２００〜４００ｍＭ
の範囲から適宜設定することができる。
【００２２】より具体的に、シアリルオリゴ糖の合成反
応は、リン酸緩衝液中に酵母、シチジン５’−モノリン
酸（ＣＭＰ）、糖ヌクレオチド合成の基質となる糖とし
てＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）、受容体糖
としてオリゴ糖、エネルギー源として糖類を添加し、さ
らにシチジン５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸合成酵素（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼ）およ
びシアリルトランスフェラーゼを０．００１ユニット／
ｍｌ以上、好ましくは０．０１〜１０ユニット／ｍｌ添
加し、５〜３５℃以下、好ましくは１０〜３０℃で１〜
５０時間程度、必要により撹拌しながら反応させること
により実施できる。
応は、リン酸緩衝液中に酵母、シチジン５’−モノリン
酸（ＣＭＰ）、糖ヌクレオチド合成の基質となる糖とし
てＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）、受容体糖
としてオリゴ糖、エネルギー源として糖類を添加し、さ
らにシチジン５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸合成酵素（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼ）およ
びシアリルトランスフェラーゼを０．００１ユニット／
ｍｌ以上、好ましくは０．０１〜１０ユニット／ｍｌ添
加し、５〜３５℃以下、好ましくは１０〜３０℃で１〜
５０時間程度、必要により撹拌しながら反応させること
により実施できる。
【００２３】ガラクトース含有のオリゴ糖の合成反応
は、リン酸緩衝液中に酵母、ウリジン５’−モノリン酸
（ＵＭＰ）、糖ヌクレオチド合成の基質となる糖として
ガラクトース、糖受容体としてオリゴ糖、エネルギー源
としてグルコースなどの糖類、ウリジン５’−ジリン酸
（ＵＤＰ）−グルコースからのＵＤＰ−ガラクトース合
成に関与する酵素（ガラクトキナーゼ及びヘキソース−
１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ）、さらにガ
ラクトシルトランスフェラーゼを添加し、上記シアリル
オリゴ糖の合成と同様に反応させることにより実施でき
る。こうして得られたオリゴ糖は、通常のオリゴ糖の精
製法（イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグ
ラフィー、塩析など）を用いて単離精製することができ
る。
は、リン酸緩衝液中に酵母、ウリジン５’−モノリン酸
（ＵＭＰ）、糖ヌクレオチド合成の基質となる糖として
ガラクトース、糖受容体としてオリゴ糖、エネルギー源
としてグルコースなどの糖類、ウリジン５’−ジリン酸
（ＵＤＰ）−グルコースからのＵＤＰ−ガラクトース合
成に関与する酵素（ガラクトキナーゼ及びヘキソース−
１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ）、さらにガ
ラクトシルトランスフェラーゼを添加し、上記シアリル
オリゴ糖の合成と同様に反応させることにより実施でき
る。こうして得られたオリゴ糖は、通常のオリゴ糖の精
製法（イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグ
ラフィー、塩析など）を用いて単離精製することができ
る。
【００２４】
【発明の効果】本発明のオリゴ糖の製造法は、酵母菌体
を少量添加するだけでＮＭＰもしくはＮＤＰからのＮＴ
Ｐおよび糖ヌクレオチドの再生が可能になっただけでな
く、従来の方法における酵素や微生物の添加等の煩雑な
工程を必要としない、安価かつ効率的な製造法である。
を少量添加するだけでＮＭＰもしくはＮＤＰからのＮＴ
Ｐおよび糖ヌクレオチドの再生が可能になっただけでな
く、従来の方法における酵素や微生物の添加等の煩雑な
工程を必要としない、安価かつ効率的な製造法である。
【００２５】
【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。なお、実施例において、反応液中のオリゴ糖の定量
はＤＩＯＮＥＸ法により行った。すなわち、分離には日
本ダイオネクス社製のＣａｒｂｏＰａｃＴＭＰＡ１カラ
ムを用い、溶出液として０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶
液および０．１Ｍ水酸化ナトリウム＋０．５Ｍ酢酸ナト
リウム水溶液を用いた。また、実施例におけるＤＮＡの
調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる
ＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecu
lar Cloning」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor La
boratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)）に
従って行った。また、制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは宝酒造
（株）より入手した。
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。なお、実施例において、反応液中のオリゴ糖の定量
はＤＩＯＮＥＸ法により行った。すなわち、分離には日
本ダイオネクス社製のＣａｒｂｏＰａｃＴＭＰＡ１カラ
ムを用い、溶出液として０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶
液および０．１Ｍ水酸化ナトリウム＋０．５Ｍ酢酸ナト
リウム水溶液を用いた。また、実施例におけるＤＮＡの
調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる
ＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecu
lar Cloning」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor La
boratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)）に
従って行った。また、制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは宝酒造
（株）より入手した。
【００２６】実施例１ （１）Haemophilus influenzaeβ1,4-ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼをコードするlic2A遺伝子のクローニン
グ Haemophilus influenzae の染色体DNA（ATCC 51907）を
鋳型として、以下に示す２種類のプライマーDNAを常法
に従って合成し、PCR法によりHaemophilus influenzae
lic2A遺伝子（EMBL / GENEBANK / DDBJ DATA BANKS、Ac
cession No. L19441)を増幅した。 プライマー（Ａ）：5'- gcgaattcaggaatttaaatatgagtgc
tatt -3' プライマー（Ｂ）：5'- acggatccaccagcagatgtcaata -
3'
ンスフェラーゼをコードするlic2A遺伝子のクローニン
グ Haemophilus influenzae の染色体DNA（ATCC 51907）を
鋳型として、以下に示す２種類のプライマーDNAを常法
に従って合成し、PCR法によりHaemophilus influenzae
lic2A遺伝子（EMBL / GENEBANK / DDBJ DATA BANKS、Ac
cession No. L19441)を増幅した。 プライマー（Ａ）：5'- gcgaattcaggaatttaaatatgagtgc
tatt -3' プライマー（Ｂ）：5'- acggatccaccagcagatgtcaata -
3'
【００２７】ＰＣＲによるlic2A遺伝子の増幅は、反応
液１００μｌ（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ ト
リス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２
ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー
ＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をPerkin-Elmer
Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用い
て、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５０℃、
３０秒）、伸長反応（７２℃、２分３０秒）のステップ
を３０回繰り返すことにより行った。
液１００μｌ（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ ト
リス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２
ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー
ＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をPerkin-Elmer
Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用い
て、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５０℃、
３０秒）、伸長反応（７２℃、２分３０秒）のステップ
を３０回繰り返すことにより行った。
【００２８】遺伝子増幅後、反応液をフェノール/クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しDNAを沈殿させた。沈殿回収し
たＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に
従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．０ｋ
ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素Ec
oRI及びBamHIで切断し、同じく制限酵素EcoRI及びBamHI
で消化したプラスミドpTrc99A（Pharmacia Biotech.社
より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連
結反応液を用いて大腸菌(E.coli)Ｋ１２株 ＪＭ１０９
菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体
よりプラスミドpGTF-Aを単離した。pGTF-Aは、pTrc99A
のtrcプロモーター下流のEcoRI-BamHI切断部位にHaemop
jhilus influenzae lic2A構造遺伝子およびリボソーム
結合部位を含有するEcoRI-BamHI ＤＮＡ断片が挿入され
たものである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しDNAを沈殿させた。沈殿回収し
たＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に
従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．０ｋ
ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素Ec
oRI及びBamHIで切断し、同じく制限酵素EcoRI及びBamHI
で消化したプラスミドpTrc99A（Pharmacia Biotech.社
より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連
結反応液を用いて大腸菌(E.coli)Ｋ１２株 ＪＭ１０９
菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体
よりプラスミドpGTF-Aを単離した。pGTF-Aは、pTrc99A
のtrcプロモーター下流のEcoRI-BamHI切断部位にHaemop
jhilus influenzae lic2A構造遺伝子およびリボソーム
結合部位を含有するEcoRI-BamHI ＤＮＡ断片が挿入され
たものである。
【００２９】（２）β1,4-ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ活性を有する酵素タンパク質の調製 プラスミドpGTF-Aを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地
１００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。４×１
０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度０．２
５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で
６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離
（９，０００×ｇ，２０分）により菌体を回収し、５ｍ
ｌの緩衝液（１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に懸濁した。超音波処理を行って
菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１
０分）により菌体残さを除去した。
ーゼ活性を有する酵素タンパク質の調製 プラスミドpGTF-Aを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地
１００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。４×１
０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度０．２
５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で
６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離
（９，０００×ｇ，２０分）により菌体を回収し、５ｍ
ｌの緩衝液（１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に懸濁した。超音波処理を行って
菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１
０分）により菌体残さを除去した。
【００３０】このように得られた上清画分を酵素液と
し、酵素液におけるβ1,4-ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ活性を測定した結果を対照菌（pTrc99Aを保持する
大腸菌Ｋ１２株 ＪＭ１０９）と共に下記表１に示す。
なお、本発明におけるβ１，４−ガラクトシルトランス
フェラーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法
でＵＤＰ−ＧａｌとＮ−アセチルグルコサミンからのＮ
−アセチルラクトサミンの合成活性を測定、算出したも
のである。
し、酵素液におけるβ1,4-ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ活性を測定した結果を対照菌（pTrc99Aを保持する
大腸菌Ｋ１２株 ＪＭ１０９）と共に下記表１に示す。
なお、本発明におけるβ１，４−ガラクトシルトランス
フェラーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法
でＵＤＰ−ＧａｌとＮ−アセチルグルコサミンからのＮ
−アセチルラクトサミンの合成活性を測定、算出したも
のである。
【００３１】（β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ
活性の測定と単位の算出法）１００ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０），２０ｍＭ 塩化マグネシウム，１０
ｍＭ Ｎ−アセチルグルコサミン，１０ｍＭ ＵＤＰ−
Ｇａｌに、β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼを添
加して３７℃で１０分反応させる。また、β1,4-ガラク
トシルトランスフェラーゼの代わりにpTrc99Aを保持す
る大腸菌ＪＭ１０９株の菌体破砕液を用い同様の反応を
行い、これをコントロールとした。
活性の測定と単位の算出法）１００ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０），２０ｍＭ 塩化マグネシウム，１０
ｍＭ Ｎ−アセチルグルコサミン，１０ｍＭ ＵＤＰ−
Ｇａｌに、β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼを添
加して３７℃で１０分反応させる。また、β1,4-ガラク
トシルトランスフェラーゼの代わりにpTrc99Aを保持す
る大腸菌ＪＭ１０９株の菌体破砕液を用い同様の反応を
行い、これをコントロールとした。
【００３２】反応液を１分間の煮沸にて反応を停止し、
これを希釈した後ＤＩＯＮＥＸによる分析を行った。分
離には日本ダイオネクス社製のＣａｒｂｏＰａｃＴＭＰ
Ａ１カラムを用い、溶出液として０．１Ｍ水酸化ナトリ
ウム水溶液および０．１Ｍ水酸化ナトリウム＋０．５Ｎ
酢酸ナトリウム水溶液を用いた。ＤＩＯＮＥＸ分析結果
から反応液中のＮ−アセチルラクトサミンの量を算出
し，３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＮ−アセチルラク
トサミンを合成する活性を１単位（ユニット）としてβ
1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を算出した。
これを希釈した後ＤＩＯＮＥＸによる分析を行った。分
離には日本ダイオネクス社製のＣａｒｂｏＰａｃＴＭＰ
Ａ１カラムを用い、溶出液として０．１Ｍ水酸化ナトリ
ウム水溶液および０．１Ｍ水酸化ナトリウム＋０．５Ｎ
酢酸ナトリウム水溶液を用いた。ＤＩＯＮＥＸ分析結果
から反応液中のＮ−アセチルラクトサミンの量を算出
し，３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＮ−アセチルラク
トサミンを合成する活性を１単位（ユニット）としてβ
1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を算出した。
【００３３】
【表１】
【００３４】（３）大腸菌ガラクトキナーゼをコードす
るgalK遺伝子のクローニング 大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造（株）より入手）の染色体
ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochemica et Biophysica
Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡを
鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常
法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌galK遺伝子
（EMBL/GENEBANK/DDBJ DATA BANKS、Accession No. D90
714 AB001340)を増幅した。 プライマー（Ｃ）：5'-GATATCCATTTTCGCGAATTCGGAGTGTA
A-3' プライマー（Ｄ）：5'-ACGGCTGACCATCGGGATCCAGTGCGGA-
3'
るgalK遺伝子のクローニング 大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造（株）より入手）の染色体
ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochemica et Biophysica
Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡを
鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常
法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌galK遺伝子
（EMBL/GENEBANK/DDBJ DATA BANKS、Accession No. D90
714 AB001340)を増幅した。 プライマー（Ｃ）：5'-GATATCCATTTTCGCGAATTCGGAGTGTA
A-3' プライマー（Ｄ）：5'-ACGGCTGACCATCGGGATCCAGTGCGGA-
3'
【００３５】ＰＣＲによるgalK遺伝子の増幅は、反応液
１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ ト
リス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２
ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー
ＤＮＡ（Ｃ）（Ｄ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をPerkin-Elmer
Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、
熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、１
５秒）、伸長反応（７２℃、１分２０秒）のステップを
３０回繰り返すことにより行った。
１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ ト
リス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２
ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー
ＤＮＡ（Ｃ）（Ｄ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をPerkin-Elmer
Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、
熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、１
５秒）、伸長反応（７２℃、１分２０秒）のステップを
３０回繰り返すことにより行った。
【００３６】遺伝子増幅後、反応液をフェノール/クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、1.2 kb
相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素EcoR
I及びHindIIIで切断し、同じく制限酵素EcoRI及びHindI
IIで消化したプラスミドpTrc99A（Pharmacia Biotech.
社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
連結反応液を用いて大腸菌(E.coli) ＭＥ８４１７菌
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４７：平成１１年８月１８日
特許生物寄託センター（旧 生命工学工業技術研究所）
に寄託）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質
転換体よりプラスミドpTrc-galKを単離した。pTrc-galK
は、pTrc99Aのtrcプロモーター下流のEcoRI-HindIII切
断部位に大腸菌galK構造遺伝子およびリボソーム結合部
位を含有するEcoRI-HindIIIＤＮＡ断片が挿入されたも
のである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、1.2 kb
相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素EcoR
I及びHindIIIで切断し、同じく制限酵素EcoRI及びHindI
IIで消化したプラスミドpTrc99A（Pharmacia Biotech.
社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
連結反応液を用いて大腸菌(E.coli) ＭＥ８４１７菌
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４７：平成１１年８月１８日
特許生物寄託センター（旧 生命工学工業技術研究所）
に寄託）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質
転換体よりプラスミドpTrc-galKを単離した。pTrc-galK
は、pTrc99Aのtrcプロモーター下流のEcoRI-HindIII切
断部位に大腸菌galK構造遺伝子およびリボソーム結合部
位を含有するEcoRI-HindIIIＤＮＡ断片が挿入されたも
のである。
【００３７】（４）大腸菌ヘキソース―１―リン酸ウリ
ジリルトランスフェラーゼをコードするgalT遺伝子のク
ローニング 以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合
成し、上記（３）と同様の方法でＰＣＲ法により大腸菌
galT遺伝子(EMBL/GENBANK/DDBJ DATA BANKS, Accession
No. D90714 AB001340)を増幅した。 プライマー（Ｅ）：5'-TATCCCGATTAAGGAATTCCCATGACGCA
A-3' プライマー（Ｆ）：5'-AGAGATTGTGTTTAAGCTTTCAGACTCAT
T-3'
ジリルトランスフェラーゼをコードするgalT遺伝子のク
ローニング 以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合
成し、上記（３）と同様の方法でＰＣＲ法により大腸菌
galT遺伝子(EMBL/GENBANK/DDBJ DATA BANKS, Accession
No. D90714 AB001340)を増幅した。 プライマー（Ｅ）：5'-TATCCCGATTAAGGAATTCCCATGACGCA
A-3' プライマー（Ｆ）：5'-AGAGATTGTGTTTAAGCTTTCAGACTCAT
T-3'
【００３８】遺伝子増幅後，反応液から１．２ｋｂ相当
のＤＮＡ断片を，上記（３）と同様に精製した。該ＤＮ
Ａを制限酵素EcoRI及びBamHIで切断し、同じく制限酵素
EcoRI及びBamHIで消化したプラスミドpTrc99A（Pharmac
ia Biotech.社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＭＥ８４１７菌
を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よ
りプラスミドpTrc-galTを単離した。pTrc-galTは、pTrc
99Aのtrcプロモーター下流のEcoRI-BamHI切断部位に大
腸菌galT構造遺伝子およびリボソーム結合部位を含有す
るEcoRI-BamHIＤＮＡ断片が挿入されたものである。
のＤＮＡ断片を，上記（３）と同様に精製した。該ＤＮ
Ａを制限酵素EcoRI及びBamHIで切断し、同じく制限酵素
EcoRI及びBamHIで消化したプラスミドpTrc99A（Pharmac
ia Biotech.社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＭＥ８４１７菌
を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よ
りプラスミドpTrc-galTを単離した。pTrc-galTは、pTrc
99Aのtrcプロモーター下流のEcoRI-BamHI切断部位に大
腸菌galT構造遺伝子およびリボソーム結合部位を含有す
るEcoRI-BamHIＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００３９】（５）大腸菌galK遺伝子および大腸菌galT
遺伝子の共発現系の構築 プラスミドpTrc-galTを鋳型として、以下に示す２種類
のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法に
より大腸菌galT遺伝子を含む領域を増幅した。 プライマー（Ｇ）：5'-ATAGATCTGCATAATTCGTGTCGCTCAAG
GC-3' プライマー（Ｈ）：5'-TAAGATCTGTAGAAACGCAAAAAGGCCAT
CCGTCA-3'
遺伝子の共発現系の構築 プラスミドpTrc-galTを鋳型として、以下に示す２種類
のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法に
より大腸菌galT遺伝子を含む領域を増幅した。 プライマー（Ｇ）：5'-ATAGATCTGCATAATTCGTGTCGCTCAAG
GC-3' プライマー（Ｈ）：5'-TAAGATCTGTAGAAACGCAAAAAGGCCAT
CCGTCA-3'
【００４０】ＰＣＲによるgalT遺伝子の増幅は、反応液
１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ ト
リス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２
ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー
ＤＮＡ（Ｇ）（Ｈ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をPerkin-Elmer
Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、
熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５０℃、２
０秒）、伸長反応（７２℃、３分）のステップを３０回
繰り返すことにより行った。
１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ ト
リス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２
ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー
ＤＮＡ（Ｇ）（Ｈ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をPerkin-Elmer
Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、
熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５０℃、２
０秒）、伸長反応（７２℃、３分）のステップを３０回
繰り返すことにより行った。
【００４１】遺伝子増幅後、反応液から１．９ｋｂ相当
のＤＮＡ断片を，上記（３）と同様に精製した。該ＤＮ
Ａを制限酵素BglIIおよびHindIIIで切断し、同じく制限
酵素BamHIおよびHindIIIで消化したプラスミドpTrc-gal
KとＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液
を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたア
ンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドpTGKTを単離
した。pTGKTは、pTrc99Aのtrcプロモーター下流のEcoRI
-BamHI切断部位に大腸菌galK構造遺伝子およびリボソー
ム結合部位を含有するEcoRI-BamHI ＤＮＡ断片が挿入さ
れ、その下流にtrcプロモーター、大腸菌galT構造遺伝
子およびリボソーム結合部位を有するBglII-HindIII断
片が挿入されたものである。
のＤＮＡ断片を，上記（３）と同様に精製した。該ＤＮ
Ａを制限酵素BglIIおよびHindIIIで切断し、同じく制限
酵素BamHIおよびHindIIIで消化したプラスミドpTrc-gal
KとＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液
を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたア
ンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドpTGKTを単離
した。pTGKTは、pTrc99Aのtrcプロモーター下流のEcoRI
-BamHI切断部位に大腸菌galK構造遺伝子およびリボソー
ム結合部位を含有するEcoRI-BamHI ＤＮＡ断片が挿入さ
れ、その下流にtrcプロモーター、大腸菌galT構造遺伝
子およびリボソーム結合部位を有するBglII-HindIII断
片が挿入されたものである。
【００４２】（６）ガラクトキナーゼ活性およびヘキソ
ース―１―リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ酵素液
の調製 プラスミドpTGKTを保持する大腸菌Ｋ１２株 ＪＭ１０
９を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×
ＹＴ培地 １００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養し
た。４×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終
濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに
３７℃で６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心
分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、
１０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
５））に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、
さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により菌
体残さを除去した。このように得られた上清画分を酵素
液とし、酵素液におけるガラクトキナーゼ活性およびヘ
キソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活
性を測定した。その結果を下記表２に示す。
ース―１―リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ酵素液
の調製 プラスミドpTGKTを保持する大腸菌Ｋ１２株 ＪＭ１０
９を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×
ＹＴ培地 １００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養し
た。４×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終
濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに
３７℃で６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心
分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、
１０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
５））に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、
さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により菌
体残さを除去した。このように得られた上清画分を酵素
液とし、酵素液におけるガラクトキナーゼ活性およびヘ
キソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活
性を測定した。その結果を下記表２に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】なお、ガラクトキナーゼ活性およびヘキソ
ース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性の
単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出した
ものである。 （ガラクトキナーゼ活性の測定と単位の算出法）１００
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５ｍＭ 塩化
マグネシウム、１０ｍＭ アデノシン三リン酸、２０ｍ
Ｍ ガラクトースを含む溶液に酵素液を添加して，３７
℃で１０〜３０分反応させる。反応液を２分間の煮沸に
て反応を停止させ、ＨＰＬＣによる分析を行い、反応液
中の消費されたＡＴＰ量を算出して、ガラクトース−１
−リン酸の生成量を求めた。３７℃で１分間に１μｍｏ
ｌｅのガラクトース−１−リン酸を生成する活性を１単
位（ユニット）とする。
ース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性の
単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出した
ものである。 （ガラクトキナーゼ活性の測定と単位の算出法）１００
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５ｍＭ 塩化
マグネシウム、１０ｍＭ アデノシン三リン酸、２０ｍ
Ｍ ガラクトースを含む溶液に酵素液を添加して，３７
℃で１０〜３０分反応させる。反応液を２分間の煮沸に
て反応を停止させ、ＨＰＬＣによる分析を行い、反応液
中の消費されたＡＴＰ量を算出して、ガラクトース−１
−リン酸の生成量を求めた。３７℃で１分間に１μｍｏ
ｌｅのガラクトース−１−リン酸を生成する活性を１単
位（ユニット）とする。
【００４５】（ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトラ
ンスフェラーゼ活性の測定と単位の算出法）１００ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、５ｍＭ 塩化マグ
ネシウム、１０ｍＭ ＵＤＰ−グルコース、１０ｍＭ
ガラクトース−１−リン酸を含む溶液に酵素液を添加
し、３７℃で２０〜３０分間反応させる。反応液を２分
間の煮沸にて反応を停止させ、ＨＰＬＣによる分析を行
った。ＨＰＬＣ分析結果から反応液中のＵＤＰ−Ｇａｌ
量を算出し，３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＵＤＰ−
Ｇａｌを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
ンスフェラーゼ活性の測定と単位の算出法）１００ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、５ｍＭ 塩化マグ
ネシウム、１０ｍＭ ＵＤＰ−グルコース、１０ｍＭ
ガラクトース−１−リン酸を含む溶液に酵素液を添加
し、３７℃で２０〜３０分間反応させる。反応液を２分
間の煮沸にて反応を停止させ、ＨＰＬＣによる分析を行
った。ＨＰＬＣ分析結果から反応液中のＵＤＰ−Ｇａｌ
量を算出し，３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＵＤＰ−
Ｇａｌを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
【００４６】（７）Ｎ−アセチルラクトサミンの合成 １００ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ
ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ５’−ＵＭＰ、２００ｍＭ ガラ
クトース、２００ｍＭ Ｎ−アセチルグルコサミン、２
００ｍＭ グルコースを含む溶液に、上記（２）により
調製したβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活
性を有する酵素液（０．１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応
液）、上記（６）により調製したガラクトキナーゼ活性
（２．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びヘキソース―１
―リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性（７．５ｕ
ｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を有する酵素液および乾燥パン
酵母（オリエンタル酵母工業）３．０％を添加し、２８
℃で撹拌しつつ反応を行った。反応開始９，１８時間後
にグルコースを２００ｍＭ添加した。
ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ５’−ＵＭＰ、２００ｍＭ ガラ
クトース、２００ｍＭ Ｎ−アセチルグルコサミン、２
００ｍＭ グルコースを含む溶液に、上記（２）により
調製したβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活
性を有する酵素液（０．１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応
液）、上記（６）により調製したガラクトキナーゼ活性
（２．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びヘキソース―１
―リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性（７．５ｕ
ｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を有する酵素液および乾燥パン
酵母（オリエンタル酵母工業）３．０％を添加し、２８
℃で撹拌しつつ反応を行った。反応開始９，１８時間後
にグルコースを２００ｍＭ添加した。
【００４７】経時的に反応液の分析を行った結果、β
１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する
酵素液を０．１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ガラクトキナーゼ
活性（２．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びヘキソース
−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性（７．
５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を有する酵素液を添加した
反応液においては反応２４時間で１０７．１ｍＭ（４
１．１ｇ／Ｌ）のＮ−アセチルラクトサミンが生成する
ことが認められた。
１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する
酵素液を０．１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ガラクトキナーゼ
活性（２．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びヘキソース
−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性（７．
５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を有する酵素液を添加した
反応液においては反応２４時間で１０７．１ｍＭ（４
１．１ｇ／Ｌ）のＮ−アセチルラクトサミンが生成する
ことが認められた。
【００４８】実施例２ （１）Haemophilus influenzaeα2,3-シアリルトランス
フェラーゼをコードするlic3A遺伝子のクローニング Haemophilus influenzae染色体DNA（ATCC 51907）を鋳
型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法
に従って合成し、ＰＣＲ法によりHaemophilusinfluenza
e lic3A遺伝子（Microbiology, 145, 3005-3011(199
9)）（EMBL / GENEBANK / DDBJ DATA BANKS、Accession
No. X57315)を増幅した。 プライマー（Ｉ）：5'-taggatccaggagattcaatgaacggtac
aatatg-3' プライマー（Ｊ）：5'-atctgcagtaaaaagtattgttgtagcga
gtgagataa-3'
フェラーゼをコードするlic3A遺伝子のクローニング Haemophilus influenzae染色体DNA（ATCC 51907）を鋳
型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法
に従って合成し、ＰＣＲ法によりHaemophilusinfluenza
e lic3A遺伝子（Microbiology, 145, 3005-3011(199
9)）（EMBL / GENEBANK / DDBJ DATA BANKS、Accession
No. X57315)を増幅した。 プライマー（Ｉ）：5'-taggatccaggagattcaatgaacggtac
aatatg-3' プライマー（Ｊ）：5'-atctgcagtaaaaagtattgttgtagcga
gtgagataa-3'
【００４９】ＰＣＲによるlic3A遺伝子の増幅は、反応
液１００μｌ（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ ト
リス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２
ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー
ＤＮＡ（Ｉ）（Ｊ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をPerkin-Elmer
Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、
熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（３４℃、１
分）、伸長反応（７２℃、３分）のステップを２５回繰
り返すことにより行った。
液１００μｌ（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ ト
リス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２
ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー
ＤＮＡ（Ｉ）（Ｊ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をPerkin-Elmer
Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、
熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（３４℃、１
分）、伸長反応（７２℃、３分）のステップを２５回繰
り返すことにより行った。
【００５０】遺伝子増幅後、反応液をフェノール/クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．０
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該DNAを制限酵素Bam
H I及びPst Iで切断し、同じく制限酵素BamH I及びPst
Iで消化したプラスミドpTrc99A（Pharmacia Biotech.社
より入手）とT4DNAリガーゼを用いて連結した。連結反
応液を用いて大腸菌(E.coli)Ｋ１２株 ＪＭ１０９菌を
形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体より
プラスミドpTrc-M47'を単離した。pTrc-M47'は、pTrc99
Aのtrcプロモーター下流のBamH I-Pst I切断部位にHaem
opjhilus influenzae lic3A構造遺伝子およびリボソー
ム結合部位を含有するBamHI-PstI ＤＮＡ断片が挿入さ
れたものである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．０
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該DNAを制限酵素Bam
H I及びPst Iで切断し、同じく制限酵素BamH I及びPst
Iで消化したプラスミドpTrc99A（Pharmacia Biotech.社
より入手）とT4DNAリガーゼを用いて連結した。連結反
応液を用いて大腸菌(E.coli)Ｋ１２株 ＪＭ１０９菌を
形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体より
プラスミドpTrc-M47'を単離した。pTrc-M47'は、pTrc99
Aのtrcプロモーター下流のBamH I-Pst I切断部位にHaem
opjhilus influenzae lic3A構造遺伝子およびリボソー
ム結合部位を含有するBamHI-PstI ＤＮＡ断片が挿入さ
れたものである。
【００５１】（２）α2,3-シアリルトランスフェラーゼ
活性を有する酵素タンパク質の調製 プラスミドpTrc-M47'を保持する大腸菌ＪＭ１０９菌
を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×Ｙ
Ｔ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。
４×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度
０．２５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３
７℃で２０時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心
分離（９，０００×ｇ，２０分）により菌体を回収し、
５ｍｌの緩衝液（１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に懸濁した。超音波処理
を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００
×ｇ、１０分）により菌体残さを除去した。
活性を有する酵素タンパク質の調製 プラスミドpTrc-M47'を保持する大腸菌ＪＭ１０９菌
を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×Ｙ
Ｔ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。
４×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度
０．２５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３
７℃で２０時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心
分離（９，０００×ｇ，２０分）により菌体を回収し、
５ｍｌの緩衝液（１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に懸濁した。超音波処理
を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００
×ｇ、１０分）により菌体残さを除去した。
【００５２】このように得られた上清画分を酵素液と
し、酵素液におけるα2,3-シアリルトランスフェラーゼ
活性を測定した結果を対照菌（pTrc99Aを保持する大腸
菌Ｋ１２株 ＪＭ１０９）と共に下記表３に示す。な
お、本発明におけるα２，３−シアリルトランスフェラ
ーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法でＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃとラクトースからの3'-シアリルラクト
ースの合成活性を測定、算出したものである。
し、酵素液におけるα2,3-シアリルトランスフェラーゼ
活性を測定した結果を対照菌（pTrc99Aを保持する大腸
菌Ｋ１２株 ＪＭ１０９）と共に下記表３に示す。な
お、本発明におけるα２，３−シアリルトランスフェラ
ーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法でＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃとラクトースからの3'-シアリルラクト
ースの合成活性を測定、算出したものである。
【００５３】（α2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性
の測定と単位の算出法）１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０），２０ｍＭ 塩化マグネシウム，２０ｍ
Ｍラクトース，１０ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ，１ｕｎ
ｉｔ／ｍｌアルカリホスファターゼに、α２，３−シア
リルトランスフェラーゼを添加して３０℃で２０分反応
させる。また、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ
の代わりにpTrc99Aを保持する大腸菌ＪＭ１０９株の菌
体破砕液を用い同様の反応を行い、これをコントロール
とした。
の測定と単位の算出法）１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０），２０ｍＭ 塩化マグネシウム，２０ｍ
Ｍラクトース，１０ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ，１ｕｎ
ｉｔ／ｍｌアルカリホスファターゼに、α２，３−シア
リルトランスフェラーゼを添加して３０℃で２０分反応
させる。また、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ
の代わりにpTrc99Aを保持する大腸菌ＪＭ１０９株の菌
体破砕液を用い同様の反応を行い、これをコントロール
とした。
【００５４】反応液を１分間の煮沸にて反応を停止し、
これを希釈した後ＤＩＯＮＥＸによる分析を行った。分
離には日本ダイオネクス社製のＣａｒｂｏＰａｃＴＭＰ
Ａ１カラムを用い、溶出液として０．１Ｍ水酸化ナトリ
ウム水溶液および０．１Ｍ水酸化ナトリウム＋０．５Ｎ
酢酸ナトリウム水溶液を用いた。ＤＩＯＮＥＸ分析結果
から反応液中の３'−シアリルラクトースの量を算出
し，３０℃で１分間に１μｍｏｌｅの３’−シアリルラ
クトースを合成する活性を１単位（ユニット）としてα
2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を算出した。
これを希釈した後ＤＩＯＮＥＸによる分析を行った。分
離には日本ダイオネクス社製のＣａｒｂｏＰａｃＴＭＰ
Ａ１カラムを用い、溶出液として０．１Ｍ水酸化ナトリ
ウム水溶液および０．１Ｍ水酸化ナトリウム＋０．５Ｎ
酢酸ナトリウム水溶液を用いた。ＤＩＯＮＥＸ分析結果
から反応液中の３'−シアリルラクトースの量を算出
し，３０℃で１分間に１μｍｏｌｅの３’−シアリルラ
クトースを合成する活性を１単位（ユニット）としてα
2,3-シアリルトランスフェラーゼ活性を算出した。
【００５５】
【表３】
【００５６】（３）Haemophilus influenzae CMP-NeuAc
シンテターゼをコードするneuA遺伝子のクローニング Haemophilus influenzae 染色体DNA（ATCC 51907）を鋳
型として、以下に示す２種類のプライマーDNAを常法に
従って合成し、PCR法によりHaemophilus influenzae ne
uA遺伝子（EMBL / GENEBANK / DDBJ DATA BANKS、Acces
sion No. AF101047 U54496)を増幅した。 プライマー（Ｋ）：5'-tgccatggtgaaaataataatgacaagaa
-3' プライマー（Ｌ）：5'-aactgcagtgcagatcaaaagtgcggcc-
3'
シンテターゼをコードするneuA遺伝子のクローニング Haemophilus influenzae 染色体DNA（ATCC 51907）を鋳
型として、以下に示す２種類のプライマーDNAを常法に
従って合成し、PCR法によりHaemophilus influenzae ne
uA遺伝子（EMBL / GENEBANK / DDBJ DATA BANKS、Acces
sion No. AF101047 U54496)を増幅した。 プライマー（Ｋ）：5'-tgccatggtgaaaataataatgacaagaa
-3' プライマー（Ｌ）：5'-aactgcagtgcagatcaaaagtgcggcc-
3'
【００５７】ＰＣＲによるneuA遺伝子の増幅は、反応液
１００μｌ（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリ
ス塩酸（ｐＨ ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２
ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー
ＤＮＡ（Ｋ）（Ｌ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をPerkin-Elmer
Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、
熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１分
３０秒）、伸長反応（７２℃、３分）のステップを２５
回繰り返すことにより行った。
１００μｌ（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリ
ス塩酸（ｐＨ ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２
ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマー
ＤＮＡ（Ｋ）（Ｌ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をPerkin-Elmer
Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、
熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１分
３０秒）、伸長反応（７２℃、３分）のステップを２５
回繰り返すことにより行った。
【００５８】遺伝子増幅後、反応液をフェノール/クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しDNAを沈殿させた。沈殿回収し
たＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に
従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．５ｋ
ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素Nc
o I及びPst Iで切断し、同じく制限酵素Nco I及びPst I
で消化したプラスミドpTrc99A（Pharmacia Biotech.社
より入手）とT4DNAリガーゼを用いて連結した。連結反
応液を用いて大腸菌（E.coli）Ｋ−１２株 ＪＭ１０９
菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体
よりプラスミドpTrcsiaBNPを単離した。pTrcsiaBNPは、
pTrc99Aのtrcプロモーター下流のNcoI-PstI 切断部位に
Haemopjhilus influenzae neuA構造遺伝子およびリボソ
ーム結合部位を含有するNcoI-PstI DNA断片が挿入され
たものである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しDNAを沈殿させた。沈殿回収し
たＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に
従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．５ｋ
ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素Nc
o I及びPst Iで切断し、同じく制限酵素Nco I及びPst I
で消化したプラスミドpTrc99A（Pharmacia Biotech.社
より入手）とT4DNAリガーゼを用いて連結した。連結反
応液を用いて大腸菌（E.coli）Ｋ−１２株 ＪＭ１０９
菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体
よりプラスミドpTrcsiaBNPを単離した。pTrcsiaBNPは、
pTrc99Aのtrcプロモーター下流のNcoI-PstI 切断部位に
Haemopjhilus influenzae neuA構造遺伝子およびリボソ
ーム結合部位を含有するNcoI-PstI DNA断片が挿入され
たものである。
【００５９】（４）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼの
調製 プラスミドpTrcsiaBNPを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌
を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×Ｙ
Ｔ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。
４×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度
０．２５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３
７℃で６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分
離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、５
ｍｌの緩衝液（１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に懸濁した。超音波処理
を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００
×ｇ、１０分）により菌体残さを除去した。
調製 プラスミドpTrcsiaBNPを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌
を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×Ｙ
Ｔ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。
４×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度
０．２５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３
７℃で６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分
離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、５
ｍｌの緩衝液（１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に懸濁した。超音波処理
を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００
×ｇ、１０分）により菌体残さを除去した。
【００６０】このように得られた上清画分を酵素液と
し、酵素液におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼ活
性を測定した結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する
大腸菌Ｋ−１２株 ＪＭ１０９）と共に下記表４に示
す。なお、本発明におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテタ
ーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で５’
−ＣＭＰとＮ−アセチルノイラミン酸からのＣＭＰ−Ｎ
ｅｕＡｃの合成活性を測定、算出したものである。
し、酵素液におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼ活
性を測定した結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する
大腸菌Ｋ−１２株 ＪＭ１０９）と共に下記表４に示
す。なお、本発明におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテタ
ーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で５’
−ＣＭＰとＮ−アセチルノイラミン酸からのＣＭＰ−Ｎ
ｅｕＡｃの合成活性を測定、算出したものである。
【００６１】（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼ活性の
測定と単位の算出法）５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０），２０ｍＭ 塩化マグネシウム，５ｍＭ
５’−ＣＴＰ，１０ｍＭ Ｎ−アセチルノイラミン酸
に、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼを添加して３７℃
で５分反応させる。また、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテタ
ーゼの代わりにpTrc99Aを保持する大腸菌ＪＭ１０９株
の菌体破砕液を用い同様の反応を行い、これをコントロ
ールとした。
測定と単位の算出法）５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０），２０ｍＭ 塩化マグネシウム，５ｍＭ
５’−ＣＴＰ，１０ｍＭ Ｎ−アセチルノイラミン酸
に、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼを添加して３７℃
で５分反応させる。また、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテタ
ーゼの代わりにpTrc99Aを保持する大腸菌ＪＭ１０９株
の菌体破砕液を用い同様の反応を行い、これをコントロ
ールとした。
【００６２】反応液に２倍量の70%エタノールを添加し
て反応を停止し、これを希釈した後HPLCによる分析を行
った。分離にはYMC社製HS-302カラムを用い、溶出液と
して50mM酢酸マグネシウム＋1 mMテトラブチルアンモニ
ウム水溶液を用いた。HPLC分析結果から反応液中のCMP-
NeuAcの量を算出し，３７℃で１分間に１μmoleのCMP-N
euAcを合成する活性を１単位（ユニット）としてCMP-Ne
uAcシンテターゼ活性を算出した。
て反応を停止し、これを希釈した後HPLCによる分析を行
った。分離にはYMC社製HS-302カラムを用い、溶出液と
して50mM酢酸マグネシウム＋1 mMテトラブチルアンモニ
ウム水溶液を用いた。HPLC分析結果から反応液中のCMP-
NeuAcの量を算出し，３７℃で１分間に１μmoleのCMP-N
euAcを合成する活性を１単位（ユニット）としてCMP-Ne
uAcシンテターゼ活性を算出した。
【００６３】
【表４】
【００６４】（５）３’−シアリルラクトースの合成 １００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、３０ｍＭ５’−ＣＭＰ、１００ｍＭ ラクト
ース、１００ｍＭ Ｎ−アセチルノイラミン酸、４００
ｍＭ グルコースを含む溶液に、上記（２）により調製
したα２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有す
る酵素液（０．４０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、上記
（４）により調製したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼ
活性を有する酵素液（１．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）
および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）２．０％
を添加し、２８℃で撹拌しつつ反応を行った。反応開始
１６，２３時間後にグルコースを２００ｍＭ添加した。
ｇＣｌ２、３０ｍＭ５’−ＣＭＰ、１００ｍＭ ラクト
ース、１００ｍＭ Ｎ−アセチルノイラミン酸、４００
ｍＭ グルコースを含む溶液に、上記（２）により調製
したα２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有す
る酵素液（０．４０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、上記
（４）により調製したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼ
活性を有する酵素液（１．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）
および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）２．０％
を添加し、２８℃で撹拌しつつ反応を行った。反応開始
１６，２３時間後にグルコースを２００ｍＭ添加した。
【００６５】経時的に反応液の分析を行った結果、α2,
3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素液を
０．４０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテ
ターゼ活性を有する酵素液を１．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ添
加した反応液においては反応４１時間で５７．３ｍＭ
（３８．３ｇ／Ｌ）の３’−シアリルラクトースが生成
することが認められた。
3-シアリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素液を
０．４０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテ
ターゼ活性を有する酵素液を１．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ添
加した反応液においては反応４１時間で５７．３ｍＭ
（３８．３ｇ／Ｌ）の３’−シアリルラクトースが生成
することが認められた。
【００６６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> YAMASA CORPORATION <120> Process for the preparation of oligosaccharide <130> YP2001-007 <140> <141> <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of lic2A gene <400> 1 gcgaattcag gaatttaaat atgagtgcta tt 32 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of lic2A gene <400> 2 acggatccac cagcagatgt caata 25 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of galK gene <400> 3 gatatccatt ttcgcgaatt cggagtgtaa 30 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of galK gene <400> 4 acggctgacc atcgggatcc agtgcgga 28 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of galT gene <400> 5 tatcccgatt aaggaattcc catgacgcaa 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of galT gene <400> 6 agagattgtg tttaagcttt cagactcatt 30 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of galT gene <400> 7 atagatctgc ataattcgtg tcgctcaagg c 31 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of galT gene <400> 8 taagatctgt agaaacgcaa aaaggccatc cgtca 35 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of lic3A gene <400> 9 taggatccag gagattcaat gaacggtaca atatg 35 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of lic3A gene <400> 10 atctgcagta aaaagtattg ttgtagcgag tgagataa 38 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of neuA gene <400> 11 tgccatggtg aaaataataa tgacaagaa 29 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of neuA gene <400> 12 aactgcagtg cagatcaaaa gtgcggcc 28
【００６７】
【図１】図１は、β1,4-ガラクトシルトランスフェラー
ゼ活性を有する酵素液と、ガラクトキナーゼ活性及びヘ
キソース―１―リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活
性を有する酵素液を添加したときの、Ｎ−アセチルラク
トサミン生成量の経時変化を示したものである。
ゼ活性を有する酵素液と、ガラクトキナーゼ活性及びヘ
キソース―１―リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活
性を有する酵素液を添加したときの、Ｎ−アセチルラク
トサミン生成量の経時変化を示したものである。
【図２】図２は、α2,3-シアリルトランスフェラーゼ活
性を有する酵素液及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼ
活性を有する酵素液を添加したときの、３’−シアリル
ラクトース生成量の経時変化を示したものである。
性を有する酵素液及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼ
活性を有する酵素液を添加したときの、３’−シアリル
ラクトース生成量の経時変化を示したものである。
【００６８】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (6)
- 【請求項１】 下記式（Ｉ）のオリゴ糖合成系におい
て、ヌクレオシド５’−モノリン酸（ＮＭＰ）もしくは
ヌクレオシド５’−ジリン酸（ＮＤＰ）からヌクレオシ
ド５’−トリリン酸（ＮＴＰ）への反応および糖から糖
−１−リン酸への反応を酵母菌体を用いて行うことを特
徴とするオリゴ糖の製造法。 （Ｉ） - 【請求項２】 生成するオリゴ糖がガラクトースを含有
するものである、請求項１の製造法。 - 【請求項３】 糖受容体がＮ−アセチルグルコサミンで
あり、生成するオリゴ糖がＮ−アセチルラクトサミンで
ある、請求項１の製造法。 - 【請求項４】 下記式（ＩＩ）のオリゴ糖合成系におい
て、ヌクレオシド５’−モノリン酸（ＮＭＰ）からヌク
レオシド５’−ジリン酸（ＮＴＰ）への反応を酵母菌体
を用いて行うことを特徴とするオリゴ糖の製造法。 （ＩＩ） - 【請求項５】 生成するオリゴ糖がシアリルオリゴ糖で
ある、請求項４の製造法。 - 【請求項６】 糖受容体がラクトースであり、生成する
オリゴ糖が３’−シアリルラクトースである、請求項４
の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001151791A JP2002335988A (ja) | 2001-05-22 | 2001-05-22 | オリゴ糖の製造法 |
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| JP2002335988A true JP2002335988A (ja) | 2002-11-26 |
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Cited By (3)
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| JP2006271372A (ja) * | 2005-03-01 | 2006-10-12 | Yamasa Shoyu Co Ltd | 糖鎖の製造法 |
| JP4910091B2 (ja) * | 2005-02-16 | 2012-04-04 | 国立大学法人北海道大学 | ４位ハロゲン化ガラクトース含有糖鎖及びその応用 |
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-
2001
- 2001-05-22 JP JP2001151791A patent/JP2002335988A/ja active Pending
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| JP2019047822A (ja) * | 2012-08-20 | 2019-03-28 | アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ | オリゴ糖の大規模酵素合成方法 |
| JP2021168693A (ja) * | 2012-08-20 | 2021-10-28 | アカデミア シニカAcademia Sinica | オリゴ糖の大規模酵素合成方法 |
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