JP2001161390A - ウリジン５’−ジリン酸ガラクトースの製造法 - Google Patents
ウリジン５’−ジリン酸ガラクトースの製造法Info
- Publication number
- JP2001161390A JP2001161390A JP2000234253A JP2000234253A JP2001161390A JP 2001161390 A JP2001161390 A JP 2001161390A JP 2000234253 A JP2000234253 A JP 2000234253A JP 2000234253 A JP2000234253 A JP 2000234253A JP 2001161390 A JP2001161390 A JP 2001161390A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- activity
- enzyme
- udp
- gal
- galactose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】オリゴ糖合成の重要な基質である糖ヌクレオチ
ド、ウリジン５’−ジリン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇ
ａｌ）の効率的な製造法を提供する。 【解決手段】酵母菌体、ＵＭＰ、グルコースおよびガラ
クトースを含有する反応系に、ガラクトキナーゼ活性お
よびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラ
ーゼ活性を有する酵素調製物を添加することを特徴とす
るＵＤＰ−Ｇａｌの製造法に関する。
ド、ウリジン５’−ジリン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇ
ａｌ）の効率的な製造法を提供する。 【解決手段】酵母菌体、ＵＭＰ、グルコースおよびガラ
クトースを含有する反応系に、ガラクトキナーゼ活性お
よびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラ
ーゼ活性を有する酵素調製物を添加することを特徴とす
るＵＤＰ−Ｇａｌの製造法に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、オリゴ糖合成の重
要な基質である糖ヌクレオチド、ウリジン５’−ジリン
酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）の効率的な製造法に
関するものである。
要な基質である糖ヌクレオチド、ウリジン５’−ジリン
酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）の効率的な製造法に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、糖鎖についての研究が急速に進
み、その機能が明らかになるにつれ、生理活性を有する
オリゴ糖の医薬品または機能性素材としての用途開発が
注目を集めている。しかし、現在市販されているオリゴ
糖はごく限られた種類のものしかなく、しかも極めて高
価である。また、そのようなオリゴ糖は試薬レベルでし
か製造できず、必ずしもその大量製造法が確立されてい
るとは限らない。従来、オリゴ糖の製造は天然物からの
抽出法、化学合成法あるいは酵素合成法、さらにはそれ
らの併用により行われていたが、その中でも酵素合成法
が大量製造に適した方法であると考えられている。すな
わち、（１）酵素合成法が化学合成法にみられる保護、
脱保護といった煩雑な手順を必要とせず、速やかに目的
のオリゴ糖を合成できる点、（２）酵素の基質特異性に
より、きわめて構造特異性の高いオリゴ糖を合成できる
点などが他の方法より有利と考えられるためである。さ
らに、近年のＤＮＡ組換え技術の発達により種々の合成
酵素が安価にしかも大量に生産できるようになりつつあ
ることが、酵素合成法の優位性をさらに押し上げる結果
となっている。
み、その機能が明らかになるにつれ、生理活性を有する
オリゴ糖の医薬品または機能性素材としての用途開発が
注目を集めている。しかし、現在市販されているオリゴ
糖はごく限られた種類のものしかなく、しかも極めて高
価である。また、そのようなオリゴ糖は試薬レベルでし
か製造できず、必ずしもその大量製造法が確立されてい
るとは限らない。従来、オリゴ糖の製造は天然物からの
抽出法、化学合成法あるいは酵素合成法、さらにはそれ
らの併用により行われていたが、その中でも酵素合成法
が大量製造に適した方法であると考えられている。すな
わち、（１）酵素合成法が化学合成法にみられる保護、
脱保護といった煩雑な手順を必要とせず、速やかに目的
のオリゴ糖を合成できる点、（２）酵素の基質特異性に
より、きわめて構造特異性の高いオリゴ糖を合成できる
点などが他の方法より有利と考えられるためである。さ
らに、近年のＤＮＡ組換え技術の発達により種々の合成
酵素が安価にしかも大量に生産できるようになりつつあ
ることが、酵素合成法の優位性をさらに押し上げる結果
となっている。
【０００３】酵素合成法によりオリゴ糖を合成する方法
としては、オリゴ糖の加水分解酵素の逆反応を利用する
方法および糖転移酵素を利用する方法の２通りの方法が
考えられている。前者の方法は、基質として単価の安い
単糖を用いることができるという利点はあるものの、反
応自体は分解反応の逆反応を利用するものであり、合成
収率や複雑な構造を持つオリゴ糖合成への応用といった
点では必ずしも最良の方法とは考えられていない。一
方、後者は糖転移酵素を用いる合成法であり、合成収率
や複雑な構造を持つオリゴ糖合成への応用といった点で
前者の方法よりも有利であると考えられており、また、
近年のＤＮＡ組換え技術の進歩により各種糖転移酵素の
量産化も該技術の実現化への後押しとなっている。
としては、オリゴ糖の加水分解酵素の逆反応を利用する
方法および糖転移酵素を利用する方法の２通りの方法が
考えられている。前者の方法は、基質として単価の安い
単糖を用いることができるという利点はあるものの、反
応自体は分解反応の逆反応を利用するものであり、合成
収率や複雑な構造を持つオリゴ糖合成への応用といった
点では必ずしも最良の方法とは考えられていない。一
方、後者は糖転移酵素を用いる合成法であり、合成収率
や複雑な構造を持つオリゴ糖合成への応用といった点で
前者の方法よりも有利であると考えられており、また、
近年のＤＮＡ組換え技術の進歩により各種糖転移酵素の
量産化も該技術の実現化への後押しとなっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、糖転移
酵素を利用した合成法で用いる糖供与体である糖ヌクレ
オチドは、一部のものを除き依然として高価で、量的に
も試薬レベルのわずかな供給量でしか提供し得ないのが
現状である。多くの生理活性糖鎖のコア部分に含まれる
ガラクトース残基の供与体であるＵＤＰ−Ｇａｌについ
ても、Ｃａｎｄｉｄａ属酵母を用いる方法（Proc. IV I
FS: Ferment. Technol. Today, p. 463 (1972)、Agric.
Biol. Chem., 37, 1741 (1973)）などが報告されてい
る。しかし、Ｃａｎｄｉｄａ属酵母などを用いてＵＤＰ
−Ｇａｌを製造する方法は、該酵母菌体の培養及び乾燥
菌体の調製が不可欠であることから多大な設備と労力が
必要であり、また、合成収率も必ずしも満足ゆくもので
はないことから、実際には実施されるに至っていない。
酵素を利用した合成法で用いる糖供与体である糖ヌクレ
オチドは、一部のものを除き依然として高価で、量的に
も試薬レベルのわずかな供給量でしか提供し得ないのが
現状である。多くの生理活性糖鎖のコア部分に含まれる
ガラクトース残基の供与体であるＵＤＰ−Ｇａｌについ
ても、Ｃａｎｄｉｄａ属酵母を用いる方法（Proc. IV I
FS: Ferment. Technol. Today, p. 463 (1972)、Agric.
Biol. Chem., 37, 1741 (1973)）などが報告されてい
る。しかし、Ｃａｎｄｉｄａ属酵母などを用いてＵＤＰ
−Ｇａｌを製造する方法は、該酵母菌体の培養及び乾燥
菌体の調製が不可欠であることから多大な設備と労力が
必要であり、また、合成収率も必ずしも満足ゆくもので
はないことから、実際には実施されるに至っていない。
【０００５】最近、小泉らにより、オロチン酸からウリ
ジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）への変換を行うコリネ
バクテリウム属に属する微生物、ＵＴＰからＵＤＰ―グ
ルコースへの変換を触媒する酵素群、ＵＤＰ−グルコー
スからＵＤＰ―ガラクトースへの変換を触媒する酵素群
（ガラクトキナーゼ、ガラクトース１−リン酸ウリジリ
ルトランスフェラーゼなど）などを生産できるように遺
伝子組換えにより育種した大腸菌を混合させることによ
るＵＤＰ−Ｇａｌの製造法（ＷＯ９８／１２３４３）が
報告されているものの、各種酵素を取得するための複数
種の大腸菌の培養が煩雑であると共に、それを実施する
ための大型の設備を準備しなければならず、必ずしも簡
便な方法とは言い難い面を有していた。
ジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）への変換を行うコリネ
バクテリウム属に属する微生物、ＵＴＰからＵＤＰ―グ
ルコースへの変換を触媒する酵素群、ＵＤＰ−グルコー
スからＵＤＰ―ガラクトースへの変換を触媒する酵素群
（ガラクトキナーゼ、ガラクトース１−リン酸ウリジリ
ルトランスフェラーゼなど）などを生産できるように遺
伝子組換えにより育種した大腸菌を混合させることによ
るＵＤＰ−Ｇａｌの製造法（ＷＯ９８／１２３４３）が
報告されているものの、各種酵素を取得するための複数
種の大腸菌の培養が煩雑であると共に、それを実施する
ための大型の設備を準備しなければならず、必ずしも簡
便な方法とは言い難い面を有していた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは酵母菌体を
用いたＵＤＰ−Ｇａｌの簡便で実用的な製造法を見いだ
すべく研究を重ねた結果、酵母菌体、ウリジン５’−モ
ノリン酸（ＵＭＰ）、グルコースおよびガラクトースを
含有する反応系に、ガラクトキナーゼおよびヘキソース
−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有す
る酵素調製物を添加し、反応させることでＵＤＰ−Ｇａ
ｌを効率よく製造できることを見出し、本発明を完成さ
せた。すなわち、本発明は、酵母菌体、ＵＭＰ、グルコ
ースおよびガラクトースを含有する反応系に、ガラクト
キナーゼ活性およびヘキソース−１−リン酸ウリジリル
トランスフェラーゼ活性を有する酵素調製物を添加する
ことを特徴とするＵＤＰ−Ｇａｌの製造法に関するもの
である。
用いたＵＤＰ−Ｇａｌの簡便で実用的な製造法を見いだ
すべく研究を重ねた結果、酵母菌体、ウリジン５’−モ
ノリン酸（ＵＭＰ）、グルコースおよびガラクトースを
含有する反応系に、ガラクトキナーゼおよびヘキソース
−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有す
る酵素調製物を添加し、反応させることでＵＤＰ−Ｇａ
ｌを効率よく製造できることを見出し、本発明を完成さ
せた。すなわち、本発明は、酵母菌体、ＵＭＰ、グルコ
ースおよびガラクトースを含有する反応系に、ガラクト
キナーゼ活性およびヘキソース−１−リン酸ウリジリル
トランスフェラーゼ活性を有する酵素調製物を添加する
ことを特徴とするＵＤＰ−Ｇａｌの製造法に関するもの
である。
【０００７】
【発明の実施の形態】反応系に添加する、ガラクトキナ
ーゼ活性およびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトラ
ンスフェラーゼ活性を有する酵素調製物としては、動物
由来、植物由来、微生物由来など特定の由来のものに限
定されず、すべての由来のものを使用することができ
る。しかし、酵素調製の簡便性などの点から微生物由来
の酵素調製物を使用するのが好都合である。微生物由来
のガラクトキナーゼ及びヘキソース−１−リン酸ウリジ
リルトランスフェラーゼおよびそれらの調製法に関して
は、大腸菌や酵母に属する微生物などにおいて既に報告
がなされている（H.M. Kalckar, Advan. Enzymol., 20,
111(1958), E. S. Maxwell, et al., Methods in Enzy
mol.,vol. 5, pp. 174-189(1961)）。
ーゼ活性およびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトラ
ンスフェラーゼ活性を有する酵素調製物としては、動物
由来、植物由来、微生物由来など特定の由来のものに限
定されず、すべての由来のものを使用することができ
る。しかし、酵素調製の簡便性などの点から微生物由来
の酵素調製物を使用するのが好都合である。微生物由来
のガラクトキナーゼ及びヘキソース−１−リン酸ウリジ
リルトランスフェラーゼおよびそれらの調製法に関して
は、大腸菌や酵母に属する微生物などにおいて既に報告
がなされている（H.M. Kalckar, Advan. Enzymol., 20,
111(1958), E. S. Maxwell, et al., Methods in Enzy
mol.,vol. 5, pp. 174-189(1961)）。
【０００８】また、ガラクトキナーゼ遺伝子およびヘキ
ソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ遺伝
子は既にクローン化されており（Nucleic Acids Res.,1
3(6),1841-1853(1985)、Nucleic Acids Res.,14(19),77
05-7711(1986)）、該クローン化された遺伝子の塩基配
列に基づき、公知の組換えＤＮＡ手法などで当該酵素を
高生産された形質転換体、当該形質転換体の処理物また
は該形質転換体より得られた酵素タンパク質などを酵素
調製物として用いることも可能である。また、ガラクト
キナーゼ遺伝子およびヘキソース−１−リン酸ウリジリ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を共発現させて得られるガ
ラクトキナーゼ活性およびヘキソース−１−リン酸ウリ
ジリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する酵素タン
パク質を酵素調製物として用いることも可能である。遺
伝子のクローニング、クローン化したＤＮＡ断片を用い
た発現ベクターの調製、発現ベクターを用いた目的とす
る酵素活性を有する酵素タンパク質の調製などは、分子
生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であ
り、具体的には、例えば「Molecular Cloning」（Mania
tisら編、Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spr
ing Harbor、New York(1982））に記載の方法に従って
行うことができる。
ソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ遺伝
子は既にクローン化されており（Nucleic Acids Res.,1
3(6),1841-1853(1985)、Nucleic Acids Res.,14(19),77
05-7711(1986)）、該クローン化された遺伝子の塩基配
列に基づき、公知の組換えＤＮＡ手法などで当該酵素を
高生産された形質転換体、当該形質転換体の処理物また
は該形質転換体より得られた酵素タンパク質などを酵素
調製物として用いることも可能である。また、ガラクト
キナーゼ遺伝子およびヘキソース−１−リン酸ウリジリ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を共発現させて得られるガ
ラクトキナーゼ活性およびヘキソース−１−リン酸ウリ
ジリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する酵素タン
パク質を酵素調製物として用いることも可能である。遺
伝子のクローニング、クローン化したＤＮＡ断片を用い
た発現ベクターの調製、発現ベクターを用いた目的とす
る酵素活性を有する酵素タンパク質の調製などは、分子
生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であ
り、具体的には、例えば「Molecular Cloning」（Mania
tisら編、Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spr
ing Harbor、New York(1982））に記載の方法に従って
行うことができる。
【０００９】たとえば、報告されている塩基配列をもと
にプローブを合成し、微生物の染色体ＤＮＡより目的と
する酵素活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝
子を含有するＤＮＡ断片をクローニングすればよい。ク
ローン化に用いる宿主は特に限定されないが、操作性及
び簡便性から大腸菌を宿主とするのが適当である。クロ
ーン化した遺伝子の高発現系を構築するためには、たと
えばマキザムーギルバートの方法（Methods in Enzymol
ogy，65，499(1980））もしくはダイデオキシチェイン
ターミネーター法（Methods in Enzymology，101，20
（1983））などを応用してクローン化したＤＮＡ断片の
塩基配列を解析して該遺伝子のコーディング領域を特定
し、宿主微生物に応じて該遺伝子が微生物菌体中で自発
現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻
訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベク
ターを作製する。
にプローブを合成し、微生物の染色体ＤＮＡより目的と
する酵素活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝
子を含有するＤＮＡ断片をクローニングすればよい。ク
ローン化に用いる宿主は特に限定されないが、操作性及
び簡便性から大腸菌を宿主とするのが適当である。クロ
ーン化した遺伝子の高発現系を構築するためには、たと
えばマキザムーギルバートの方法（Methods in Enzymol
ogy，65，499(1980））もしくはダイデオキシチェイン
ターミネーター法（Methods in Enzymology，101，20
（1983））などを応用してクローン化したＤＮＡ断片の
塩基配列を解析して該遺伝子のコーディング領域を特定
し、宿主微生物に応じて該遺伝子が微生物菌体中で自発
現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻
訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベク
ターを作製する。
【００１０】目的とする酵素活性を有するタンパク質を
大腸菌内で大量発現させるために使用する発現制御シグ
ナルとしては、人為的制御が可能で、目的とする酵素活
性を有するタンパク質の発現量を飛躍的に上昇させるよ
うな強力な転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いるこ
とが望ましい。このような転写開始シグナルとしては、
ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロ
モーター（Proc．Natl．Acad．Sci．USA.,80，21(198
3）、Gene，20，231(1982））、ｔｒｃプロモーター
(J．Biol．Chem．，260，3539(1985））などを例示する
ことができる。
大腸菌内で大量発現させるために使用する発現制御シグ
ナルとしては、人為的制御が可能で、目的とする酵素活
性を有するタンパク質の発現量を飛躍的に上昇させるよ
うな強力な転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いるこ
とが望ましい。このような転写開始シグナルとしては、
ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロ
モーター（Proc．Natl．Acad．Sci．USA.,80，21(198
3）、Gene，20，231(1982））、ｔｒｃプロモーター
(J．Biol．Chem．，260，3539(1985））などを例示する
ことができる。
【００１１】ベクターとしては、種々のプラスミドべク
ター、ファージベクターなどが使用可能であるが、大腸
菌菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと
特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高
いプラスミドベクターを使用するのが望ましい。具体的
には、ｐＢＲ３２２（Gene，2，95（1975））、ｐＵＣ
１８，ｐＵＣ１９（Gene、33，103(1985））などを例示
することができる。作製した組換えべクターを用いて大
腸菌を形質転換する。宿主となる大腸菌としては、例え
ば組換えＤＮＡ実験に使用されるＫ１２株、Ｃ６００
菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌(Gene, 33, 103-119(1
985))などが使用可能である。大腸菌を形質転換する方
法はすでに多くの方法が報告されており、低温下、塩化
カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法
（J．Mol．Biol．，53，159（1970））などにより大腸
菌を形質転換することができる。
ター、ファージベクターなどが使用可能であるが、大腸
菌菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと
特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高
いプラスミドベクターを使用するのが望ましい。具体的
には、ｐＢＲ３２２（Gene，2，95（1975））、ｐＵＣ
１８，ｐＵＣ１９（Gene、33，103(1985））などを例示
することができる。作製した組換えべクターを用いて大
腸菌を形質転換する。宿主となる大腸菌としては、例え
ば組換えＤＮＡ実験に使用されるＫ１２株、Ｃ６００
菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌(Gene, 33, 103-119(1
985))などが使用可能である。大腸菌を形質転換する方
法はすでに多くの方法が報告されており、低温下、塩化
カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法
（J．Mol．Biol．，53，159（1970））などにより大腸
菌を形質転換することができる。
【００１２】得られた形質転換体は、当該微生物が増殖
可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化した目的と
する酵素活性を有するタンパク質の発現を誘導して菌体
内に当該酵素タンパク質が大量に蓄積するまで培養を行
う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微
生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法
に従って行えばよい。例えば、培地としてブイヨン培
地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキ
ストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％
トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食
塩）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、
３０〜５０℃の培養温度で１０〜５０時間程度必要によ
り通気攪拌しながら培養することができる。また、ベク
ターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけ
るプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラ
スミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナ
マイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養す
る。
可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化した目的と
する酵素活性を有するタンパク質の発現を誘導して菌体
内に当該酵素タンパク質が大量に蓄積するまで培養を行
う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微
生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法
に従って行えばよい。例えば、培地としてブイヨン培
地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキ
ストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％
トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食
塩）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、
３０〜５０℃の培養温度で１０〜５０時間程度必要によ
り通気攪拌しながら培養することができる。また、ベク
ターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけ
るプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラ
スミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナ
マイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養す
る。
【００１３】培養中に目的とする酵素活性を有する酵素
タンパク質の発現を誘導する必要がある場合には、用い
たプロモーターで常用されている方法で該遺伝子の発現
を誘導する。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロ
モーターなどを使用した場合には、培養中期に発現誘導
剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド（ＩＰＴＧ）を適当量添加する。また、使用するプロ
モーターが構成的に転写活性を有する場合には、特に発
現誘導剤を添加する必要はない。
タンパク質の発現を誘導する必要がある場合には、用い
たプロモーターで常用されている方法で該遺伝子の発現
を誘導する。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロ
モーターなどを使用した場合には、培養中期に発現誘導
剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド（ＩＰＴＧ）を適当量添加する。また、使用するプロ
モーターが構成的に転写活性を有する場合には、特に発
現誘導剤を添加する必要はない。
【００１４】酵素調製物として形質転換体そのものを利
用する場合には、上記の方法で得られる培養液から遠心
分離、膜分離などの固液分離手段で回収した微生物の菌
体を利用すればよい。また、該形質転換体の処理物、該
処理物から得られる酵素タンパク質を酵素調製物として
利用することもできる。形質転換体の処理物としては、
上記回収した微生物菌体を、機械的破壊（ワーリングブ
レンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢など
による）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾
などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超
音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）な
どの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体処理
物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示す
ることができる。酵素タンパク質としては、上記菌体処
理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製
手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、
透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して
得られる粗酵素または精製酵素を例示することができ
る。
用する場合には、上記の方法で得られる培養液から遠心
分離、膜分離などの固液分離手段で回収した微生物の菌
体を利用すればよい。また、該形質転換体の処理物、該
処理物から得られる酵素タンパク質を酵素調製物として
利用することもできる。形質転換体の処理物としては、
上記回収した微生物菌体を、機械的破壊（ワーリングブ
レンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢など
による）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾
などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超
音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）な
どの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体処理
物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示す
ることができる。酵素タンパク質としては、上記菌体処
理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製
手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、
透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して
得られる粗酵素または精製酵素を例示することができ
る。
【００１５】このような酵素調製物を添加するＵＤＰ−
Ｇａｌ合成系は、酵母菌体、ＵＭＰ、グルコースおよび
ガラクトースより構成される。使用する酵母としては、
市販のパン酵母、あるいはワイン酵母菌体でよく、酵母
菌体製造の過程が省略できる点で極めて有利である。ま
た、酵母生菌体、酵母乾燥菌体いずれの形態も利用可能
であるが、反応収率、取扱いの容易性などの点からは乾
燥酵母菌体を用いるのが好ましい。酵母菌体の使用濃度
としては、乾燥重量として１〜５％（ｗ／ｖ）の範囲か
ら適宜設定することができる。
Ｇａｌ合成系は、酵母菌体、ＵＭＰ、グルコースおよび
ガラクトースより構成される。使用する酵母としては、
市販のパン酵母、あるいはワイン酵母菌体でよく、酵母
菌体製造の過程が省略できる点で極めて有利である。ま
た、酵母生菌体、酵母乾燥菌体いずれの形態も利用可能
であるが、反応収率、取扱いの容易性などの点からは乾
燥酵母菌体を用いるのが好ましい。酵母菌体の使用濃度
としては、乾燥重量として１〜５％（ｗ／ｖ）の範囲か
ら適宜設定することができる。
【００１６】また、ＵＭＰ、グルコースおよびガラクト
ースは市販されており、この市販品を使用することがで
きる。使用濃度としては、たとえばそれぞれ１〜４００
ｍＭ、好ましくは１０〜２００ｍＭの範囲から適宜設定
することができる。ＵＤＰ−Ｇａｌの合成は、酵母菌
体、ＵＭＰ、グルコースおよびガラクトースよりなるＵ
ＤＰ−Ｇａｌ合成系に、上記のガラクトキナーゼ活性お
よびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラ
ーゼ活性を有する酵素調製物をそれぞれ０．０００１ユ
ニット／ｍｌ以上、好ましくは０．００１〜１０ユニッ
ト／ｍｌ程度になるように添加し、５〜３７℃、好まし
くは１６〜２８℃の温度で１〜７２時間程度、必要によ
り撹拌しながら反応させることにより実施することがで
きる。
ースは市販されており、この市販品を使用することがで
きる。使用濃度としては、たとえばそれぞれ１〜４００
ｍＭ、好ましくは１０〜２００ｍＭの範囲から適宜設定
することができる。ＵＤＰ−Ｇａｌの合成は、酵母菌
体、ＵＭＰ、グルコースおよびガラクトースよりなるＵ
ＤＰ−Ｇａｌ合成系に、上記のガラクトキナーゼ活性お
よびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラ
ーゼ活性を有する酵素調製物をそれぞれ０．０００１ユ
ニット／ｍｌ以上、好ましくは０．００１〜１０ユニッ
ト／ｍｌ程度になるように添加し、５〜３７℃、好まし
くは１６〜２８℃の温度で１〜７２時間程度、必要によ
り撹拌しながら反応させることにより実施することがで
きる。
【００１７】上記ＵＤＰ−Ｇａｌ合成系には、必要に応
じて無機リン酸、マグネシウムおよびエネルギー源を添
加するのが好ましい。無機リン酸としては、リン酸カリ
ウムなどをそのまま使用することもできるが、好ましく
はリン酸緩衝液の形態で使用するのが好ましい。使用濃
度は、たとえば１０〜５００ｍＭ、好ましくは１０〜３
００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。また、
リン酸緩衝液の形式で使用する場合、緩衝液のｐＨは６
〜９の範囲から適宜設定すればよい。マグネシウムとし
ては、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグ
ネシウム等の無機酸のマグネシウム塩、クエン酸マグネ
シウム等の有機酸のマグネシウム塩を使用することがで
き、その使用濃度としては５〜５０ｍＭの範囲から適宜
設定することができる。エネルギー源としては、グルコ
ース、フラクトース、ショ糖などの糖類、酢酸、クエン
酸などの有機酸を使用することができ、その使用濃度と
しては、１０〜１０００ｍＭ、好ましくは約１００〜８
００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
じて無機リン酸、マグネシウムおよびエネルギー源を添
加するのが好ましい。無機リン酸としては、リン酸カリ
ウムなどをそのまま使用することもできるが、好ましく
はリン酸緩衝液の形態で使用するのが好ましい。使用濃
度は、たとえば１０〜５００ｍＭ、好ましくは１０〜３
００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。また、
リン酸緩衝液の形式で使用する場合、緩衝液のｐＨは６
〜９の範囲から適宜設定すればよい。マグネシウムとし
ては、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグ
ネシウム等の無機酸のマグネシウム塩、クエン酸マグネ
シウム等の有機酸のマグネシウム塩を使用することがで
き、その使用濃度としては５〜５０ｍＭの範囲から適宜
設定することができる。エネルギー源としては、グルコ
ース、フラクトース、ショ糖などの糖類、酢酸、クエン
酸などの有機酸を使用することができ、その使用濃度と
しては、１０〜１０００ｍＭ、好ましくは約１００〜８
００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
【００１８】ＵＤＰ−Ｇａｌ合成反応終了後、生成した
ＵＤＰ−Ｇａｌは糖ヌクレオチドの精製法として通常使
用されている方法によって分離精製することができる。
例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマト
グラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過法など
各種のクロマトグラフィー、向流分配、向流抽出など二
液相間の分配を利用する方法、濃縮、冷却、有機溶媒添
加など溶解度の差を利用する方法などの糖ヌクレオチド
の分離精製で使用されている一般的な方法を単独で、あ
るいは適宜組み合わせて行えばよい。
ＵＤＰ−Ｇａｌは糖ヌクレオチドの精製法として通常使
用されている方法によって分離精製することができる。
例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマト
グラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過法など
各種のクロマトグラフィー、向流分配、向流抽出など二
液相間の分配を利用する方法、濃縮、冷却、有機溶媒添
加など溶解度の差を利用する方法などの糖ヌクレオチド
の分離精製で使用されている一般的な方法を単独で、あ
るいは適宜組み合わせて行えばよい。
【００１９】
【発明の効果】本発明により、多大な菌体培養設備、菌
体乾燥設備及び煩雑な工程を必要とせずに、極めて簡便
な手段でＵＤＰ−Ｇａｌを効率よく製造することが可能
となった。
体乾燥設備及び煩雑な工程を必要とせずに、極めて簡便
な手段でＵＤＰ−Ｇａｌを効率よく製造することが可能
となった。
【００２０】
【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。なお、実施例において、反応液中のＵＤＰ−Ｇａｌ
の定量にはＨＰＬＣ法により行った。すなわち、分離に
はＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＡＱ３１２カラムを用い、溶出
液として０．５Ｍ リン酸一カリウム溶液、検出波長は
２６０ｎｍを用いた。また、実施例におけるＤＮＡの調
製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤ
ＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecula
r cloning」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor Labor
atort, ColdSpring Harbor, New York (1982)）に従っ
て行った。また、制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは宝酒造（株）より入
手した。
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。なお、実施例において、反応液中のＵＤＰ−Ｇａｌ
の定量にはＨＰＬＣ法により行った。すなわち、分離に
はＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＡＱ３１２カラムを用い、溶出
液として０．５Ｍ リン酸一カリウム溶液、検出波長は
２６０ｎｍを用いた。また、実施例におけるＤＮＡの調
製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤ
ＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecula
r cloning」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor Labor
atort, ColdSpring Harbor, New York (1982)）に従っ
て行った。また、制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは宝酒造（株）より入
手した。
【００２１】実施例１ （１）大腸菌ガラクトキナーゼをコードするｇａｌＫ遺
伝子のクローニング 大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造（株）より入手）の染色体
ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochemica et Biophysica
Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡを
鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常
法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌ｇａｌＫ遺伝
子（EMBL/GENEBANK/DDBJ DATA BANKS、Accession No. D9
0714 AB001340）を増幅した。 プライマー（Ａ）：5’-GATATCCATTTTCGCGAATTCGGAGTGTAA-3’ プライマー（Ｂ）：5’-ACGGCTGACCATCGGGATCCAGTGCGGA-3’ ＰＣＲによるｇａｌＫ遺伝子の増幅は、反応液１００μ
ｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸
（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．
００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ
ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴ
ＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ
（Ａ）（Ｂ）各々 ０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼ ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 Ｄ
ＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性
（９４℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、１５
秒）、伸長反応（７２℃、１分２０秒）のステップを３
０回繰り返すことにより行った。
伝子のクローニング 大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造（株）より入手）の染色体
ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochemica et Biophysica
Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡを
鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常
法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌ｇａｌＫ遺伝
子（EMBL/GENEBANK/DDBJ DATA BANKS、Accession No. D9
0714 AB001340）を増幅した。 プライマー（Ａ）：5’-GATATCCATTTTCGCGAATTCGGAGTGTAA-3’ プライマー（Ｂ）：5’-ACGGCTGACCATCGGGATCCAGTGCGGA-3’ ＰＣＲによるｇａｌＫ遺伝子の増幅は、反応液１００μ
ｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸
（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．
００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ
ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴ
ＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ
（Ａ）（Ｂ）各々 ０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼ ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 Ｄ
ＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性
（９４℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、１５
秒）、伸長反応（７２℃、１分２０秒）のステップを３
０回繰り返すことにより行った。
【００２２】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．２
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同じく制限酵
素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミド
ｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia Biotech．社より入手）と
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用
いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＭＥ８４１７菌
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４７：平成１１年８月１８日
生命工学工業技術研究所に寄託）を形質転換し、得られ
たアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ
−ｇａｌＫを単離した。ｐＴｒｃ−ｇａｌＫは、ｐＴｒ
ｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＥｃｏＲＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ切断部位に大腸菌ｇａｌＫ構造遺伝子および
リボソーム結合部位を含有するＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．２
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同じく制限酵
素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミド
ｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia Biotech．社より入手）と
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用
いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＭＥ８４１７菌
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４７：平成１１年８月１８日
生命工学工業技術研究所に寄託）を形質転換し、得られ
たアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ
−ｇａｌＫを単離した。ｐＴｒｃ−ｇａｌＫは、ｐＴｒ
ｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＥｃｏＲＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ切断部位に大腸菌ｇａｌＫ構造遺伝子および
リボソーム結合部位を含有するＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００２３】（２）ガラクトキナーゼ活性を有する酵素
タンパク質の調整 プラスミドｐＴｒｃ−ｇａｌＫを保持する大腸菌ＭＥ８
４１７菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
る２ｘＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培
養した。４×１０8個／ｍｌに達した時点で、培養液に
最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに
３７℃で６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心
分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、
１０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。超音波処理を行
って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×
ｇ、１０分）により菌体残さを除去した。このように得
られた上清画分を酵素調製物とし、酵素調製物における
ガラクトキナーゼ活性を測定した結果を対照菌（ｐＴｒ
ｃ９９Ａを保持する大腸菌Ｋ−１２株ＭＥ８４１７）と
共に下記表１に示す。なお、本発明におけるガラクトキ
ナーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法でＡ
ＴＰとガラクトースからのガラクトース１−リン酸の合
成活性を測定、算出したものである。
タンパク質の調整 プラスミドｐＴｒｃ−ｇａｌＫを保持する大腸菌ＭＥ８
４１７菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
る２ｘＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培
養した。４×１０8個／ｍｌに達した時点で、培養液に
最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに
３７℃で６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心
分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、
１０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。超音波処理を行
って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×
ｇ、１０分）により菌体残さを除去した。このように得
られた上清画分を酵素調製物とし、酵素調製物における
ガラクトキナーゼ活性を測定した結果を対照菌（ｐＴｒ
ｃ９９Ａを保持する大腸菌Ｋ−１２株ＭＥ８４１７）と
共に下記表１に示す。なお、本発明におけるガラクトキ
ナーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法でＡ
ＴＰとガラクトースからのガラクトース１−リン酸の合
成活性を測定、算出したものである。
【００２４】（ガラクトキナーゼ活性の測定と単位の算
出法）１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、
５ｍＭ 塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍ
Ｍガラクトースを含む溶液に酵素調製物を添加して，３
７℃で１０〜３０分反応させる。反応液を２分間の煮沸
にて反応を停止させ、ＨＰＬＣによる分析を行い、反応
液中の消費されたＡＴＰ量を算出して、ガラクトース１
−リン酸の生成量を求めた。３７℃で１分間に１μｍｏ
ｌｅのガラクトース１−リン酸を生成する活性を１単位
（ユニット）とする。
出法）１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、
５ｍＭ 塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍ
Ｍガラクトースを含む溶液に酵素調製物を添加して，３
７℃で１０〜３０分反応させる。反応液を２分間の煮沸
にて反応を停止させ、ＨＰＬＣによる分析を行い、反応
液中の消費されたＡＴＰ量を算出して、ガラクトース１
−リン酸の生成量を求めた。３７℃で１分間に１μｍｏ
ｌｅのガラクトース１−リン酸を生成する活性を１単位
（ユニット）とする。
【表１】
【００２５】（３）大腸菌ヘキソース―１―リン酸ウリ
ジリルトランスフェラーゼをコードするｇａｌＴ遺伝子
のクローニング 以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合
成し、上記（１）と同様の方法でＰＣＲ法により大腸菌
ｇａｌＴ遺伝子（EMBL/GENBANK/DDBJ DATA BANKS, Acce
ssion No. D90714 AB001340）を増幅した。 プライマー（Ｃ）：5’-TATCCCGATTAAGGAATTCCCATGACGCAA-3’ プライマー（Ｄ）：5’-AGAGATTGTGTTTAAGCTTTCAGACTCATT-3’
ジリルトランスフェラーゼをコードするｇａｌＴ遺伝子
のクローニング 以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合
成し、上記（１）と同様の方法でＰＣＲ法により大腸菌
ｇａｌＴ遺伝子（EMBL/GENBANK/DDBJ DATA BANKS, Acce
ssion No. D90714 AB001340）を増幅した。 プライマー（Ｃ）：5’-TATCCCGATTAAGGAATTCCCATGACGCAA-3’ プライマー（Ｄ）：5’-AGAGATTGTGTTTAAGCTTTCAGACTCATT-3’
【００２６】遺伝子増幅後，反応液から１．２ｋｂ相当
のＤＮＡ断片を，上記（１）と同様に精製した。該ＤＮ
Ａを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じ
く制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラス
ミドｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia Biotech.社より入手）
とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を
用いて大腸菌ＭＥ８４１７菌を形質転換し、得られたア
ンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｇ
ａｌＴを単離した。ｐＴｒｃ−ｇａｌＴは、ｐＴｒｃ９
９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ切断部位に大腸菌ｇａｌＴ構造遺伝子およびリボソー
ム結合部位を含有するＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断
片が挿入されたものである。
のＤＮＡ断片を，上記（１）と同様に精製した。該ＤＮ
Ａを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じ
く制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラス
ミドｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia Biotech.社より入手）
とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を
用いて大腸菌ＭＥ８４１７菌を形質転換し、得られたア
ンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｇ
ａｌＴを単離した。ｐＴｒｃ−ｇａｌＴは、ｐＴｒｃ９
９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ切断部位に大腸菌ｇａｌＴ構造遺伝子およびリボソー
ム結合部位を含有するＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断
片が挿入されたものである。
【００２７】（４）ヘキソース―１―リン酸ウリジリル
トランスフェラーゼ活性を有する酵素タンパク質の調製 プラスミドｐＴｒｃ−ｇａｌＴを保持する大腸菌Ｋ−１
２株ＭＥ８４１７を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含有する２ｘＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で
振とう培養した。４×１０8個／ｍｌに達した時点で、
培養液に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加
し、さらに３７℃で５時間振とう培養を続けた。培養終
了後、遠心分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体
を回収し、１０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸
（ｐＨ７．５））に懸濁した。超音波処理を行って菌体
を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０
分）により菌体残さを除去した。このように得られた上
清画分を酵素調製物とし、酵素調製物におけるヘキソー
ス―１―リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を測
定した。その結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する
大腸菌Ｋ−１２株ＭＥ８４１７）と共に下記表２に示
す。なお、酵素活性の単位（ユニット）は、以下に示す
方法でＵＤＰ―グルコースとガラクトース１−リン酸か
らのＵＤＰ−Ｇａｌの合成活性を測定、算出したもので
ある。
トランスフェラーゼ活性を有する酵素タンパク質の調製 プラスミドｐＴｒｃ−ｇａｌＴを保持する大腸菌Ｋ−１
２株ＭＥ８４１７を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含有する２ｘＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で
振とう培養した。４×１０8個／ｍｌに達した時点で、
培養液に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加
し、さらに３７℃で５時間振とう培養を続けた。培養終
了後、遠心分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体
を回収し、１０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸
（ｐＨ７．５））に懸濁した。超音波処理を行って菌体
を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０
分）により菌体残さを除去した。このように得られた上
清画分を酵素調製物とし、酵素調製物におけるヘキソー
ス―１―リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を測
定した。その結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する
大腸菌Ｋ−１２株ＭＥ８４１７）と共に下記表２に示
す。なお、酵素活性の単位（ユニット）は、以下に示す
方法でＵＤＰ―グルコースとガラクトース１−リン酸か
らのＵＤＰ−Ｇａｌの合成活性を測定、算出したもので
ある。
【００２８】（ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトラ
ンスフェラーゼ活性の測定と単位の算出法）１００ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、５ｍＭ 塩化マグ
ネシウム、１０ｍＭ ＵＤＰ−グルコース、１０ｍＭ
ガラクトース１−リン酸を含む溶液に酵素調製物を添加
し、３７℃で２０〜３０分間反応させる。反応液を２分
間の煮沸にて反応を停止させ、ＨＰＬＣによる分析を行
った。ＨＰＬＣ分析結果から反応液中のＵＤＰ−Ｇａｌ
量を算出し，３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＵＤＰ−
Ｇａｌを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
ンスフェラーゼ活性の測定と単位の算出法）１００ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、５ｍＭ 塩化マグ
ネシウム、１０ｍＭ ＵＤＰ−グルコース、１０ｍＭ
ガラクトース１−リン酸を含む溶液に酵素調製物を添加
し、３７℃で２０〜３０分間反応させる。反応液を２分
間の煮沸にて反応を停止させ、ＨＰＬＣによる分析を行
った。ＨＰＬＣ分析結果から反応液中のＵＤＰ−Ｇａｌ
量を算出し，３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＵＤＰ−
Ｇａｌを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
【表２】
【００２９】（５）大腸菌ｇａｌＫ遺伝子および大腸菌
ｇａｌＴ遺伝子の共発現系の構築 プラスミドｐＴｒｃ−ｇａｌＴを鋳型として、以下に示
す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、Ｐ
ＣＲ法により大腸菌ｇａｌＴ遺伝子を含む領域を増幅し
た。 プライマー（Ｅ）：5’-ATAGATCTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGC-3’ プライマー（Ｆ）：5’-TAAGATCTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCA-3’ ＰＣＲによるｇａｌＴ遺伝子の増幅は、上記（１）と同
じ反応組成、反応器を用いて、熱変性（９４℃、３０
秒）、アニーリング（５０℃、２０秒）、伸長反応（７
２℃、３分）のステップを３０回繰り返すことにより行
った。
ｇａｌＴ遺伝子の共発現系の構築 プラスミドｐＴｒｃ−ｇａｌＴを鋳型として、以下に示
す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、Ｐ
ＣＲ法により大腸菌ｇａｌＴ遺伝子を含む領域を増幅し
た。 プライマー（Ｅ）：5’-ATAGATCTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGC-3’ プライマー（Ｆ）：5’-TAAGATCTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCA-3’ ＰＣＲによるｇａｌＴ遺伝子の増幅は、上記（１）と同
じ反応組成、反応器を用いて、熱変性（９４℃、３０
秒）、アニーリング（５０℃、２０秒）、伸長反応（７
２℃、３分）のステップを３０回繰り返すことにより行
った。
【００３０】遺伝子増幅後、反応液から１．９ｋｂ相当
のＤＮＡ断片を，上記（１）と同様に精製した。該ＤＮ
Ａを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断
し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで
消化したプラスミドｐＴｒｃ−ｇａｌＫとＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形
質転換体よりプラスミドｐＴＧＫＴを単離した。ｐＴＧ
ＫＴは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に大腸菌ｇａｌＫ構造遺
伝子およびリボソーム結合部位を含有するＥｃｏＲＩ−
ＢａｍＨＩＤＮＡ断片が挿入され、その下流にｔｒｃプ
ロモーター、大腸菌ｇａｌＴ構造遺伝子およびリボソー
ム結合部位を有するＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片が
挿入されたものである。
のＤＮＡ断片を，上記（１）と同様に精製した。該ＤＮ
Ａを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断
し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで
消化したプラスミドｐＴｒｃ−ｇａｌＫとＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形
質転換体よりプラスミドｐＴＧＫＴを単離した。ｐＴＧ
ＫＴは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に大腸菌ｇａｌＫ構造遺
伝子およびリボソーム結合部位を含有するＥｃｏＲＩ−
ＢａｍＨＩＤＮＡ断片が挿入され、その下流にｔｒｃプ
ロモーター、大腸菌ｇａｌＴ構造遺伝子およびリボソー
ム結合部位を有するＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片が
挿入されたものである。
【００３１】（６）ガラクトキナーゼ活性およびヘキソ
ース―１―リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を
有する酵素タンパク質の調製 プラスミドｐＴＧＫＴを保持する大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ
１０９を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
２ｘＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養
した。４×１０8個／ｍｌに達した時点で、培養液に最
終濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さら
に３７℃で６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠
心分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収
し、１０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ
７．５））に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕
し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）によ
り菌体残さを除去した。このように得られた上清画分を
酵素調製物とし、酵素調製物におけるガラクトキナーゼ
活性およびヘキソース―１―リン酸ウリジリルトランス
フェラーゼ活性を測定した。その結果を下記表３に示
す。なお、酵素活性の単位（ユニット）は、上記（２）
および（４）と同様に算出したものである。
ース―１―リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を
有する酵素タンパク質の調製 プラスミドｐＴＧＫＴを保持する大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ
１０９を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
２ｘＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養
した。４×１０8個／ｍｌに達した時点で、培養液に最
終濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さら
に３７℃で６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠
心分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収
し、１０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ
７．５））に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕
し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）によ
り菌体残さを除去した。このように得られた上清画分を
酵素調製物とし、酵素調製物におけるガラクトキナーゼ
活性およびヘキソース―１―リン酸ウリジリルトランス
フェラーゼ活性を測定した。その結果を下記表３に示
す。なお、酵素活性の単位（ユニット）は、上記（２）
および（４）と同様に算出したものである。
【表３】
【００３２】（７）ＵＤＰ−Ｇａｌの合成 ２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０），２０ｍＭ塩化
マグネシウム，５０ｍＭ ５’−ＵＭＰ，１００ｍＭガ
ラクトース，２００ｍＭグルコースを含む溶液５ｍｌ
に，上記（２）で調製したガラクトキナーゼ活性を有す
る酵素調製物（０．６５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、
（４）で調製したヘキソース−１−リン酸ウリジリルト
ランスフェラーゼ活性を有する酵素調製物（０．１６ｕ
ｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）および乾燥パン酵母（オリエン
タル酵母工業）０．１ｇを添加し，２８℃で撹拌しつつ
反応を行った。反応開始４、９、２３、３１時間後にグ
ルコースを２００ｍＭずつ添加した。
マグネシウム，５０ｍＭ ５’−ＵＭＰ，１００ｍＭガ
ラクトース，２００ｍＭグルコースを含む溶液５ｍｌ
に，上記（２）で調製したガラクトキナーゼ活性を有す
る酵素調製物（０．６５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、
（４）で調製したヘキソース−１−リン酸ウリジリルト
ランスフェラーゼ活性を有する酵素調製物（０．１６ｕ
ｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）および乾燥パン酵母（オリエン
タル酵母工業）０．１ｇを添加し，２８℃で撹拌しつつ
反応を行った。反応開始４、９、２３、３１時間後にグ
ルコースを２００ｍＭずつ添加した。
【００３３】経時的に反応液の分析を行った結果を図１
に示す。図１から明らかなように、ガラクトキナーゼ活
性およびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフ
ェラーゼ活性を有する２種類の酵素調製物を添加しない
反応液、およびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトラ
ンスフェラーゼ活性を有する酵素調製物を添加した反応
液においては、反応４８時間で３．５ｍＭのＵＤＰ−Ｇ
ａｌしか生成しなかったのに対し、ガラクトキナーゼ活
性を有する酵素調製物を添加した反応液においては１
０．９ｍＭのＵＤＰ−Ｇａｌが、両酵素活性を有する酵
素調製物を添加した反応液においては２３．７ｍＭのＵ
ＤＰ−Ｇａｌが生成することが認められた。
に示す。図１から明らかなように、ガラクトキナーゼ活
性およびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフ
ェラーゼ活性を有する２種類の酵素調製物を添加しない
反応液、およびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトラ
ンスフェラーゼ活性を有する酵素調製物を添加した反応
液においては、反応４８時間で３．５ｍＭのＵＤＰ−Ｇ
ａｌしか生成しなかったのに対し、ガラクトキナーゼ活
性を有する酵素調製物を添加した反応液においては１
０．９ｍＭのＵＤＰ−Ｇａｌが、両酵素活性を有する酵
素調製物を添加した反応液においては２３．７ｍＭのＵ
ＤＰ−Ｇａｌが生成することが認められた。
【００３４】実施例２；ＵＤＰ−Ｇａｌの合成（その
２） ２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０），２０ｍＭ塩化
マグネシウム，１００ｍＭ ５’−ＵＭＰ，１００ｍＭ
ガラクトース，２００ｍＭ グルコースを含む溶液５
ｍｌに，上記（６）により調製したガラクトキナーゼ活
性（２．０８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）およびヘキソー
ス−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性
（３．３６ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を有する酵素調製
物および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）０．２
５ｇを添加し，２８℃で撹拌しつつ反応を行った。反応
開始４、９，２３、３０時間後にグルコースを２００ｍ
Ｍずつ添加した。経時的に反応液の分析を行った結果を
図２に示す。反応４７時間後には８４．７４ｍＭのＵＤ
Ｐ−Ｇａｌが生成することが認められた。
２） ２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０），２０ｍＭ塩化
マグネシウム，１００ｍＭ ５’−ＵＭＰ，１００ｍＭ
ガラクトース，２００ｍＭ グルコースを含む溶液５
ｍｌに，上記（６）により調製したガラクトキナーゼ活
性（２．０８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）およびヘキソー
ス−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性
（３．３６ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を有する酵素調製
物および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）０．２
５ｇを添加し，２８℃で撹拌しつつ反応を行った。反応
開始４、９，２３、３０時間後にグルコースを２００ｍ
Ｍずつ添加した。経時的に反応液の分析を行った結果を
図２に示す。反応４７時間後には８４．７４ｍＭのＵＤ
Ｐ−Ｇａｌが生成することが認められた。
【００３５】実施例３；ＵＤＰ−Ｇａｌの合成（その
３） ２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０），２０ｍＭ塩化
マグネシウム，８５ｍＭ ５’−ＵＭＰ，１００ｍＭ
ガラクトース，２００ｍＭ グルコースを含む溶液２０
００ｍｌに，上記（６）により調製した所定活性量のガ
ラクトキナーゼ活性（２．２５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応
液）およびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランス
フェラーゼ活性（３．２５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を
有する酵素調製物および乾燥パン酵母（オリエンタル酵
母工業）１００ｇを添加し，２８℃で通気・撹拌しつつ
反応を行った。反応開始４、９，２３時間後にグルコー
スを２００ｍＭずつ添加した。経時的に反応液の分析を
行った結果を図３に示す。反応開始２７時間後には８
０．８８ｍＭのＵＤＰ−Ｇａｌが生成することが認めら
れた。
３） ２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０），２０ｍＭ塩化
マグネシウム，８５ｍＭ ５’−ＵＭＰ，１００ｍＭ
ガラクトース，２００ｍＭ グルコースを含む溶液２０
００ｍｌに，上記（６）により調製した所定活性量のガ
ラクトキナーゼ活性（２．２５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応
液）およびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランス
フェラーゼ活性（３．２５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を
有する酵素調製物および乾燥パン酵母（オリエンタル酵
母工業）１００ｇを添加し，２８℃で通気・撹拌しつつ
反応を行った。反応開始４、９，２３時間後にグルコー
スを２００ｍＭずつ添加した。経時的に反応液の分析を
行った結果を図３に示す。反応開始２７時間後には８
０．８８ｍＭのＵＤＰ−Ｇａｌが生成することが認めら
れた。
【００３６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> YAMASA CORPORATION <120> Process for the preparation of uridine 5'-diphosphate garactose <130> YP2000-016 <150> JP P1999-277964 <151> 1999-09-30 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of galK gene <400> 1 gatatccatt ttcgcgaatt cggagtgtaa 30 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of galK gene <400> 2 acggctgacc atcgggatcc agtgcgga 28 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of galT gene <400> 3 tatcccgatt aaggaattcc catgacgcaa 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of galT gene <400> 4 agagattgtg tttaagcttt cagactcatt 30 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of galT and galK genes <400> 5 atagatctgc ataattcgtg tcgctcaagg c 31 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of galT and galK genes <400> 6 taagatctgt agaaacgcaa aaaggccatc cgtca 35
【００３７】
【図１】図１は、ガラクトキナーゼ活性を有する酵素調
製物およびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランス
フェラーゼ活性を有する酵素調製物の添加の有無による
UDP-Gal生成量の経時変化を示したものである。図中、
○はガラクトキナーゼ活性およびヘキソース−１−リン
酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有する２種類の
酵素調製物を添加したときの結果を、△はガラクトキナ
ーゼ活性を有する酵素調製物を添加したときの結果を、
●はヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラ
ーゼ活性を有する酵素調製物を添加したときの結果を、
□は酵素調製物を添加しないときの結果を示したもので
ある。
製物およびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランス
フェラーゼ活性を有する酵素調製物の添加の有無による
UDP-Gal生成量の経時変化を示したものである。図中、
○はガラクトキナーゼ活性およびヘキソース−１−リン
酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有する２種類の
酵素調製物を添加したときの結果を、△はガラクトキナ
ーゼ活性を有する酵素調製物を添加したときの結果を、
●はヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラ
ーゼ活性を有する酵素調製物を添加したときの結果を、
□は酵素調製物を添加しないときの結果を示したもので
ある。
【図２】図２は、5ml反応液において、ガラクトキナー
ゼ活性およびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトラン
スフェラーゼ活性の両方を有する酵素調製物の添加によ
るUDP-Gal生成量の経時変化を示したものである。
ゼ活性およびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトラン
スフェラーゼ活性の両方を有する酵素調製物の添加によ
るUDP-Gal生成量の経時変化を示したものである。
【図３】図３は、2000ml反応液において、ガラクトキナ
ーゼ活性およびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトラ
ンスフェラーゼ活性の両方を有する酵素調製物の添加に
よるUDP-Gal生産量の経時変化を示したものである。
ーゼ活性およびヘキソース−１−リン酸ウリジリルトラ
ンスフェラーゼ活性の両方を有する酵素調製物の添加に
よるUDP-Gal生産量の経時変化を示したものである。
Claims (1)
- 【請求項１】 酵母菌体、ウリジン５’−モノリン酸
（ＵＭＰ）、グルコースおよびガラクトースを含有する
反応系に、ガラクトキナーゼ活性およびヘキソース−１
−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有する酵
素調製物を添加することを特徴とするウリジン５’−ジ
リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000234253A JP3830015B2 (ja) | 1999-09-30 | 2000-08-02 | ウリジン５’−ジリン酸ガラクトースの製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27796499 | 1999-09-30 | ||
| JP11-277964 | 1999-09-30 | ||
| JP2000234253A JP3830015B2 (ja) | 1999-09-30 | 2000-08-02 | ウリジン５’−ジリン酸ガラクトースの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001161390A true JP2001161390A (ja) | 2001-06-19 |
| JP3830015B2 JP3830015B2 (ja) | 2006-10-04 |
Family
ID=26552656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000234253A Expired - Fee Related JP3830015B2 (ja) | 1999-09-30 | 2000-08-02 | ウリジン５’−ジリン酸ガラクトースの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3830015B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006271372A (ja) * | 2005-03-01 | 2006-10-12 | Yamasa Shoyu Co Ltd | 糖鎖の製造法 |
| JP7464707B2 (ja) | 2019-11-05 | 2024-04-09 | マックス プランク ゲゼルシャフト ツゥアー フェデルゥン デル ヴィッセンシャフテン エー フォー | Ｕｄｐ－ガラクトースを調製するための酵素的方法 |
-
2000
- 2000-08-02 JP JP2000234253A patent/JP3830015B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006271372A (ja) * | 2005-03-01 | 2006-10-12 | Yamasa Shoyu Co Ltd | 糖鎖の製造法 |
| JP7464707B2 (ja) | 2019-11-05 | 2024-04-09 | マックス プランク ゲゼルシャフト ツゥアー フェデルゥン デル ヴィッセンシャフテン エー フォー | Ｕｄｐ－ガラクトースを調製するための酵素的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3830015B2 (ja) | 2006-10-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2338985A1 (en) | Thermostable biocatalyst combination for nucleoside synthesis | |
| US20110207179A1 (en) | Process for producing cmp-n-acetylneuraminic acid | |
| JP4505011B2 (ja) | ３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸の酵素合成法 | |
| JP4606419B2 (ja) | ウリジン５’−ジリン酸−ｎ−アセチルガラクトサミンの製造法 | |
| JP2000295996A5 (ja) | ||
| JP3833584B2 (ja) | Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法 | |
| US6040158A (en) | Process for preparing sugar nucleotide | |
| JP3764755B2 (ja) | 「アデノシン５’−三リン酸の製造法及びその応用」 | |
| JP4272377B2 (ja) | ウリジン二リン酸グルコース４−エピメラーゼの新用途 | |
| JP3830015B2 (ja) | ウリジン５’−ジリン酸ガラクトースの製造法 | |
| JP3822006B2 (ja) | シチジン５’−ジリン酸コリンの製造法 | |
| JP3545425B2 (ja) | ウリジン二リン酸―ｎ―アセチルグルコサミンの製造法 | |
| JP5068956B2 (ja) | デオキシリボヌクレオシド一リン酸からのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の製造方法 | |
| JP4509447B2 (ja) | 高純度グアノシン５′−ジリン酸フコースおよびその製造法 | |
| JP2001169797A (ja) | Ｓ―アデノシル−ｌ−メチオニンの酵素的製造法 | |
| JP2000041695A (ja) | Ｓ―アデノシル−ｌ−メチオニンの酵素的製造法 | |
| JPH05219978A (ja) | 核酸関連物質の酵素的製造法及びそれに使用する酵素調製物 | |
| JP2001046097A5 (ja) | ||
| JPH10286097A (ja) | プリンアラビノシドの酵素的製造法 | |
| JP2002085087A (ja) | シチジン５’−トリリン酸の製造法及びその応用 | |
| KR20010112883A (ko) | 서머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 재조합 효소 및이를 이용한 알파-1,4-아밀로오스 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060113 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060222 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060706 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060706 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 3830015 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060222 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090721 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100721 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110721 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110721 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110721 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120721 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120721 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120721 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130721 Year of fee payment: 7 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130721 Year of fee payment: 7 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |