JP2001169797A - Ｓ―アデノシル−ｌ−メチオニンの酵素的製造法 - Google Patents
Ｓ―アデノシル−ｌ−メチオニンの酵素的製造法Info
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- JP2001169797A JP2001169797A JP2000155181A JP2000155181A JP2001169797A JP 2001169797 A JP2001169797 A JP 2001169797A JP 2000155181 A JP2000155181 A JP 2000155181A JP 2000155181 A JP2000155181 A JP 2000155181A JP 2001169797 A JP2001169797 A JP 2001169797A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】高価なアデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）
を基質として使用せず、アデノシン５’−モノリン酸
（ＡＭＰ）からのＡＴＰ生成系とＡＴＰとＬ−メチオニ
ンからＳ―アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）を合
成する系を共存させたＳＡＭの酵素的合成法を提供す
る。 【解決手段】酵素としてポリリン酸キナーゼ、アデニレ
ートキナーゼ及びメチオニンアデノシルトランスフェラ
ーゼを用い、反応系にポリリン酸、Ｌ−メチオニン及び
ＡＭＰを添加し、これらを反応させることでＳＡＭを合
成し、合成したＳＡＭを採取することを特徴とするＳＡ
Ｍの酵素的製造法及びそのための反応系に関する。
を基質として使用せず、アデノシン５’−モノリン酸
（ＡＭＰ）からのＡＴＰ生成系とＡＴＰとＬ−メチオニ
ンからＳ―アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）を合
成する系を共存させたＳＡＭの酵素的合成法を提供す
る。 【解決手段】酵素としてポリリン酸キナーゼ、アデニレ
ートキナーゼ及びメチオニンアデノシルトランスフェラ
ーゼを用い、反応系にポリリン酸、Ｌ−メチオニン及び
ＡＭＰを添加し、これらを反応させることでＳＡＭを合
成し、合成したＳＡＭを採取することを特徴とするＳＡ
Ｍの酵素的製造法及びそのための反応系に関する。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、Ｓ―アデノシル−
Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）の酵素的合成法に関するもの
である。
Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）の酵素的合成法に関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】ＳＡＭは、生体内における種々のトラン
スメチラーゼによるメチル化反応のメチル基供与体とし
て重要な役割を演じている生理活性物質である。したが
って、ＳＡＭは、種々の代謝不調疾患に対する化学療法
剤として有用性があり、肝血症、高脂血症、動脈硬化症
などに対する治療効果が報告されている。
スメチラーゼによるメチル化反応のメチル基供与体とし
て重要な役割を演じている生理活性物質である。したが
って、ＳＡＭは、種々の代謝不調疾患に対する化学療法
剤として有用性があり、肝血症、高脂血症、動脈硬化症
などに対する治療効果が報告されている。
【０００３】従来、ＳＡＭの製造法としては、メチオニ
ン含有培地で微生物を培養し、菌体内に蓄積したＳＡＭ
を抽出する、いわゆる培養法が一般的であった（J. Bio
l.Chem., 229, 1051-1057 (1957), Agric. Biol. Che
m., 38, 1669-1672 (1974)）。しかしながら、従来の培
養法においては、菌株、培養条件などを変えてもＳＡＭ
の蓄積量は極めて低く、またＳＡＭを菌体外に漏出させ
ることは極めて困難なことであった。
ン含有培地で微生物を培養し、菌体内に蓄積したＳＡＭ
を抽出する、いわゆる培養法が一般的であった（J. Bio
l.Chem., 229, 1051-1057 (1957), Agric. Biol. Che
m., 38, 1669-1672 (1974)）。しかしながら、従来の培
養法においては、菌株、培養条件などを変えてもＳＡＭ
の蓄積量は極めて低く、またＳＡＭを菌体外に漏出させ
ることは極めて困難なことであった。
【０００４】培養法に代る方法としては酵素的合成法が
知られている。すなわち、酵母など微生物より単離精製
したＳＡＭ合成酵素（メチオニンアデノシルトランスフ
ェラーゼ）を用い、アデノシン５’−トリリン酸（ＡＴ
Ｐ）とＬ−メチオニンを基質としてＳＡＭを酵素的に合
成する方法である（J. Biol. Chem., 231, 481-492 (19
58), 特開昭５１―１２５７１７）。この方法は、培養
法と比べ、ＳＡＭの蓄積量が多く、菌体からのＳＡＭ抽
出操作が必要ないなどの利点はあるものの、酵素の調製
が煩雑であること、得られる酵素の活性が微弱であるこ
と、ＡＴＰ分解活性などの妨害酵素活性を除去する必要
があること、さらに基質であるＡＴＰが極めて高価であ
ることなどの様々な問題を有し、必ずしも実用的な方法
とはなり得なかった。
知られている。すなわち、酵母など微生物より単離精製
したＳＡＭ合成酵素（メチオニンアデノシルトランスフ
ェラーゼ）を用い、アデノシン５’−トリリン酸（ＡＴ
Ｐ）とＬ−メチオニンを基質としてＳＡＭを酵素的に合
成する方法である（J. Biol. Chem., 231, 481-492 (19
58), 特開昭５１―１２５７１７）。この方法は、培養
法と比べ、ＳＡＭの蓄積量が多く、菌体からのＳＡＭ抽
出操作が必要ないなどの利点はあるものの、酵素の調製
が煩雑であること、得られる酵素の活性が微弱であるこ
と、ＡＴＰ分解活性などの妨害酵素活性を除去する必要
があること、さらに基質であるＡＴＰが極めて高価であ
ることなどの様々な問題を有し、必ずしも実用的な方法
とはなり得なかった。
【０００５】しかしながら、近年の遺伝子工学の発展に
より、クローン化したＳＡＭ合成酵素遺伝子を用いて該
酵素の調製がより簡便になり（J. Biol. Chem., 255, 9
082-9092 (1980), J. Biol. Chem., 259, 14505-14507
(1984), J. Biol. Chem., 262, 16704-16709 (1987), M
ol. Cell. Biol., 8, 5132-5139 (1988) ）、酵素調製
の問題は解決されつつあるものの、依然として高価なＡ
ＴＰを基質として使用するなどの他の実用上の問題は解
決されていない。
より、クローン化したＳＡＭ合成酵素遺伝子を用いて該
酵素の調製がより簡便になり（J. Biol. Chem., 255, 9
082-9092 (1980), J. Biol. Chem., 259, 14505-14507
(1984), J. Biol. Chem., 262, 16704-16709 (1987), M
ol. Cell. Biol., 8, 5132-5139 (1988) ）、酵素調製
の問題は解決されつつあるものの、依然として高価なＡ
ＴＰを基質として使用するなどの他の実用上の問題は解
決されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】一般に、ＡＴＰは極め
て高価であるのに対し、アデノシン５’−モノリン酸
（ＡＭＰ）は比較的安価に供給され得る。そのため、Ｓ
ＡＭ合成酵素反応系に、高価なＡＴＰを添加するのでは
なく、安価なＡＭＰからＡＴＰを生成する系を共存させ
ることで、反応系でＡＴＰを合成し、そのＡＴＰをＳＡ
Ｍの酵素的合成に利用できるならば、上記問題を解決す
るだけでなく、ＳＡＭの製造コストを大幅に軽減できる
と考えられる。したがって、本発明は、高価なＡＴＰを
基質として使用せず、ＡＭＰからのＡＴＰ生成系とＡＴ
ＰとＬ−メチオニンからＳＡＭを合成する系を共存させ
たＳＡＭの酵素的合成法を提供することを目的とするも
のである。
て高価であるのに対し、アデノシン５’−モノリン酸
（ＡＭＰ）は比較的安価に供給され得る。そのため、Ｓ
ＡＭ合成酵素反応系に、高価なＡＴＰを添加するのでは
なく、安価なＡＭＰからＡＴＰを生成する系を共存させ
ることで、反応系でＡＴＰを合成し、そのＡＴＰをＳＡ
Ｍの酵素的合成に利用できるならば、上記問題を解決す
るだけでなく、ＳＡＭの製造コストを大幅に軽減できる
と考えられる。したがって、本発明は、高価なＡＴＰを
基質として使用せず、ＡＭＰからのＡＴＰ生成系とＡＴ
ＰとＬ−メチオニンからＳＡＭを合成する系を共存させ
たＳＡＭの酵素的合成法を提供することを目的とするも
のである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成すべく研究を重ねた結果、大腸菌ポリリン酸キナー
ゼ（Biochim. Biophy. Acta., 26, 294-300 (1957)）
が、ポリリン酸の存在下で大腸菌アデニレートキナーゼ
と協調することによりＡＭＰからＡＴＰを合成する活性
を有することを見出し、該系をＳＡＭの酵素的合成系と
共存させることで上記目的を達成できることを見いだ
し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、酵素と
してポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼ及びメ
チオニンアデノシルトランスフェラーゼを用い、反応系
にポリリン酸、Ｌ−メチオニン及びＡＭＰを添加し、こ
れらを反応させることでＳＡＭを合成し、合成したＳＡ
Ｍを採取することを特徴とするＳＡＭの酵素的製造法及
びそのための反応系に関するものである。
達成すべく研究を重ねた結果、大腸菌ポリリン酸キナー
ゼ（Biochim. Biophy. Acta., 26, 294-300 (1957)）
が、ポリリン酸の存在下で大腸菌アデニレートキナーゼ
と協調することによりＡＭＰからＡＴＰを合成する活性
を有することを見出し、該系をＳＡＭの酵素的合成系と
共存させることで上記目的を達成できることを見いだ
し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、酵素と
してポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼ及びメ
チオニンアデノシルトランスフェラーゼを用い、反応系
にポリリン酸、Ｌ−メチオニン及びＡＭＰを添加し、こ
れらを反応させることでＳＡＭを合成し、合成したＳＡ
Ｍを採取することを特徴とするＳＡＭの酵素的製造法及
びそのための反応系に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明で使用するポリリン酸キナ
ーゼ、アデニレートキナーゼおよびメチオニンアデノシ
ルトランスフェラーゼはすべて公知の酵素であり、特定
のものに制約されない。すなわち、ポリリン酸キナーゼ
としては、ポリリン酸及びアデニレートキナーゼの存在
下、ポリリン酸をリン酸供与体としてＡＭＰをリン酸化
してアデノシン５’−ジリン酸（ＡＤＰ）及びＡＴＰを
合成する活性を有するものであればよく、アデニレート
キナーゼとしては、ポリリン酸及びポリリン酸キナーゼ
の存在下、ポリリン酸をリン酸供与体としてＡＭＰをリ
ン酸化してＡＤＰ及びＡＴＰを合成する活性を有するも
のであればよく、また、メチオニンアデノシルトランス
フェラーゼとしては、ＡＴＰ及びＬ−メチオニンの存在
下、ＳＡＭを合成する活性を有するものであればよい。
ーゼ、アデニレートキナーゼおよびメチオニンアデノシ
ルトランスフェラーゼはすべて公知の酵素であり、特定
のものに制約されない。すなわち、ポリリン酸キナーゼ
としては、ポリリン酸及びアデニレートキナーゼの存在
下、ポリリン酸をリン酸供与体としてＡＭＰをリン酸化
してアデノシン５’−ジリン酸（ＡＤＰ）及びＡＴＰを
合成する活性を有するものであればよく、アデニレート
キナーゼとしては、ポリリン酸及びポリリン酸キナーゼ
の存在下、ポリリン酸をリン酸供与体としてＡＭＰをリ
ン酸化してＡＤＰ及びＡＴＰを合成する活性を有するも
のであればよく、また、メチオニンアデノシルトランス
フェラーゼとしては、ＡＴＰ及びＬ−メチオニンの存在
下、ＳＡＭを合成する活性を有するものであればよい。
【０００９】そのような酵素は、動物由来、植物由来、
微生物由来など特定の由来に限定されず、調製の簡便さ
などの点から微生物由来のものを使用するのが好都合で
ある。また、近年の遺伝子組み換え技術を利用して目的
とする酵素の遺伝子をクローン化し、大腸菌などを宿主
として当該酵素を大量に製造することも可能である（J.
Biol. Chem., 267, 22556-22561 (1992)、Nucleic Aci
ds Res., 13, 7139-7151(1985)、J. Biol. Chem., 255,
9082-9092 (1980)、J. Biol. Chem., 259, 14505-1450
7 (1984)、J. Biol. Chem., 262, 16704-16709 (198
7)、Mol. Cell. Biol., 8, 5132-5139 (1988)）。
微生物由来など特定の由来に限定されず、調製の簡便さ
などの点から微生物由来のものを使用するのが好都合で
ある。また、近年の遺伝子組み換え技術を利用して目的
とする酵素の遺伝子をクローン化し、大腸菌などを宿主
として当該酵素を大量に製造することも可能である（J.
Biol. Chem., 267, 22556-22561 (1992)、Nucleic Aci
ds Res., 13, 7139-7151(1985)、J. Biol. Chem., 255,
9082-9092 (1980)、J. Biol. Chem., 259, 14505-1450
7 (1984)、J. Biol. Chem., 262, 16704-16709 (198
7)、Mol. Cell. Biol., 8, 5132-5139 (1988)）。
【００１０】反応系に添加する酵素は、前記の活性を有
する限りどのような形態であっても良い。具体的には、
微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得ら
れる酵素調製物などを例示することができる。微生物の
菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常
法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うこと
ができる。具体的に、バシラス属または大腸菌類に属す
る細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培
地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキ
ス、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプト
ン、１％イーストエキス、０．５％食塩）などを使用す
ることができ、当該培地に種菌を接種後、２０〜５０℃
で１〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得
られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌すること
により目的とする酵素の活性を有する微生物菌体を調製
することができる。
する限りどのような形態であっても良い。具体的には、
微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得ら
れる酵素調製物などを例示することができる。微生物の
菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常
法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うこと
ができる。具体的に、バシラス属または大腸菌類に属す
る細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培
地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキ
ス、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプト
ン、１％イーストエキス、０．５％食塩）などを使用す
ることができ、当該培地に種菌を接種後、２０〜５０℃
で１〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得
られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌すること
により目的とする酵素の活性を有する微生物菌体を調製
することができる。
【００１１】微生物の菌体処理物としては、上記微生物
菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプ
レス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、
自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処
理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理
（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法
に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細
胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
酵素調製物としては、上記菌体処理物から目的とする酵
素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処
理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各
種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵
素または精製酵素を例示することができる。
菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプ
レス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、
自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処
理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理
（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法
に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細
胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
酵素調製物としては、上記菌体処理物から目的とする酵
素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処
理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各
種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵
素または精製酵素を例示することができる。
【００１２】反応液に添加するＡＭＰ、Ｌ−メチオニン
及びポリリン酸は、それぞれ市販のものを使用すること
ができる。使用濃度としては、ＡＭＰおよびＬ−メチオ
ニンは１〜２００ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭ、ポリ
リン酸は無機リン酸に換算して１〜１０００ｍＭ、好ま
しくは１０〜２００ｍＭの各範囲から適宜設定すること
ができる。ＳＡＭの合成反応は、ｐＨ４〜９の範囲の適
当な緩衝液中、ＡＭＰ、Ｌ−メチオニン及びポリリン酸
を添加し、さらに０．００１ユニット／ｍｌ以上、好ま
しくは０．００１〜１．０ユニット／ｍｌのポリリン酸
キナーゼ及びメチオニンアデノシルトランスフェラー
ゼ、０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．１〜
１０．０ユニット／ｍｌ以上のアデニレートキナーゼを
添加し、３０℃以上、好ましくは３２〜３７℃で１〜５
０時間程、必要により撹拌しながら反応させることによ
り実施できる。また、上記の反応系に０．１〜５Ｍ、好
ましくは１〜２Ｍの尿素を添加することにより、ＳＡＭ
の合成収率を向上させることができる。反応液中に生成
したＳＡＭは、活性炭やイオン交換樹脂などを用いたＳ
ＡＭの通常の方法により単離精製することができる。
及びポリリン酸は、それぞれ市販のものを使用すること
ができる。使用濃度としては、ＡＭＰおよびＬ−メチオ
ニンは１〜２００ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭ、ポリ
リン酸は無機リン酸に換算して１〜１０００ｍＭ、好ま
しくは１０〜２００ｍＭの各範囲から適宜設定すること
ができる。ＳＡＭの合成反応は、ｐＨ４〜９の範囲の適
当な緩衝液中、ＡＭＰ、Ｌ−メチオニン及びポリリン酸
を添加し、さらに０．００１ユニット／ｍｌ以上、好ま
しくは０．００１〜１．０ユニット／ｍｌのポリリン酸
キナーゼ及びメチオニンアデノシルトランスフェラー
ゼ、０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．１〜
１０．０ユニット／ｍｌ以上のアデニレートキナーゼを
添加し、３０℃以上、好ましくは３２〜３７℃で１〜５
０時間程、必要により撹拌しながら反応させることによ
り実施できる。また、上記の反応系に０．１〜５Ｍ、好
ましくは１〜２Ｍの尿素を添加することにより、ＳＡＭ
の合成収率を向上させることができる。反応液中に生成
したＳＡＭは、活性炭やイオン交換樹脂などを用いたＳ
ＡＭの通常の方法により単離精製することができる。
【００１３】
【発明の効果】本発明により、従来法の問題点を解決
し、ＡＭＰからの簡便かつ安価なＳＡＭの合成が初めて
可能となった。
し、ＡＭＰからの簡便かつ安価なＳＡＭの合成が初めて
可能となった。
【００１４】
【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切
断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、Ｂａｌ３１
ヌクレアーゼ処理、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤ
ＮＡ末端の平滑化、並びに大腸菌の形質転換法は全て
「Molecular Cloning」（Maniatisら編、Cold spring H
arbor Laboratory, ColdSpring Harbor, New York (198
2)）に従って行った。また、制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａ
ｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは宝酒造
（株）より入手した。さらに、反応液中のヌクレオチ
ド、ヌクレオシド類の定量にはＨＰＬＣ法により行っ
た。具体的には、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＡＱ３
１２カラムを用い、溶出液として０．５Ｍ リン酸一カ
リウム溶液を用いた。
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切
断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、Ｂａｌ３１
ヌクレアーゼ処理、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤ
ＮＡ末端の平滑化、並びに大腸菌の形質転換法は全て
「Molecular Cloning」（Maniatisら編、Cold spring H
arbor Laboratory, ColdSpring Harbor, New York (198
2)）に従って行った。また、制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａ
ｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは宝酒造
（株）より入手した。さらに、反応液中のヌクレオチ
ド、ヌクレオシド類の定量にはＨＰＬＣ法により行っ
た。具体的には、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＡＱ３
１２カラムを用い、溶出液として０．５Ｍ リン酸一カ
リウム溶液を用いた。
【００１５】実施例 （１）大腸菌ポリリン酸キナーゼ遺伝子のクローニング 大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（宝酒造（株）より入手）
の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochim. Biophy
s. Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡ
をテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマー
ＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌ポ
リリン酸キナーゼ（ｐｐｋ）遺伝子を増幅した。
の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochim. Biophy
s. Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡ
をテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマー
ＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌ポ
リリン酸キナーゼ（ｐｐｋ）遺伝子を増幅した。
【００１６】 プライマー（Ａ）：5'-TACCATGGGTCAGGAAAAGCTATA-3' プライマー（Ｂ）：5'-ATGGATCCTTATTCAGGTTGTTCGAGTGA
-3'
-3'
【００１７】ＰＣＲによるｐｐｋ遺伝子の増幅は、反応
液１００μｌ（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ ト
リス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テ
ンペレートＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ
（Ａ）（Ｂ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼ ２．５ユニット）を Perkin-ELmer Ce
tus Instrument社製 DNA Thermal Cycler を用いて、熱
変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５
分）、ポリメライゼーション（７２℃、１．５分）のス
テップを２５回繰り返すことにより行った。
液１００μｌ（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ ト
リス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テ
ンペレートＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ
（Ａ）（Ｂ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼ ２．５ユニット）を Perkin-ELmer Ce
tus Instrument社製 DNA Thermal Cycler を用いて、熱
変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５
分）、ポリメライゼーション（７２℃、１．５分）のス
テップを２５回繰り返すことにより行った。
【００１８】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．９
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素
ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じく制限酵素Ｎｃ
ｏＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９
Ａ（Pharmacia Biotech.社より入手）とＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ
１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質
転換体よりプラスミド ｐＴｒｃ−ＰＰＫを単離した。
ｐＴｒｃ−ＰＰＫは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモー
ター下流のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に大腸菌ｐｐ
ｋ遺伝子を含有するＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片
が挿入されたものである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．９
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素
ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じく制限酵素Ｎｃ
ｏＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９
Ａ（Pharmacia Biotech.社より入手）とＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ
１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質
転換体よりプラスミド ｐＴｒｃ−ＰＰＫを単離した。
ｐＴｒｃ−ＰＰＫは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモー
ター下流のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に大腸菌ｐｐ
ｋ遺伝子を含有するＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片
が挿入されたものである。
【００１９】（２）大腸菌ポリリン酸キナーゼの調製 プラスミドｐＴｒｃ−ＰＰＫを保持する大腸菌ＪＭ１０
９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２
ｘＹＴ培地 ３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養
した。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終
濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０
℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離
（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、６０
ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、
５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ トライトンＸ−１００、
０．２ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）に懸濁した。３７℃で
１時間保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、
さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌
体残さを除去した。
９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２
ｘＹＴ培地 ３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養
した。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終
濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０
℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離
（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、６０
ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、
５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ トライトンＸ−１００、
０．２ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）に懸濁した。３７℃で
１時間保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、
さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌
体残さを除去した。
【００２０】このように得られた上清画分を５ｍＭ 塩
化マグネシウム及び１ｍＭ ２−メルカプトエタノール
を含有する５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）に対して
透析を行い、粗酵素液とした。粗酵素液におけるポリリ
ン酸キナーゼ比活性は、０．１９ユニット／ｍｇ蛋白質
であり、対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ
１０９菌）の比活性（０．０００１８ユニット／ｍｇ蛋
白質）の約１０００倍であった。次に粗酵素液をＤＥＡ
Ｅトヨパール６５０Ｍ（トーソー（株））を用いて０〜
０．５Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配にて分画し、ポリリン酸
キナーゼ画分を得た。この画分をポリリン酸キナーゼ酵
素標品とした。なお、この酵素標品におけるポリリン酸
キナーゼの比活性は、０．６ユニット／ｍｇ蛋白質であ
った。
化マグネシウム及び１ｍＭ ２−メルカプトエタノール
を含有する５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）に対して
透析を行い、粗酵素液とした。粗酵素液におけるポリリ
ン酸キナーゼ比活性は、０．１９ユニット／ｍｇ蛋白質
であり、対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ
１０９菌）の比活性（０．０００１８ユニット／ｍｇ蛋
白質）の約１０００倍であった。次に粗酵素液をＤＥＡ
Ｅトヨパール６５０Ｍ（トーソー（株））を用いて０〜
０．５Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配にて分画し、ポリリン酸
キナーゼ画分を得た。この画分をポリリン酸キナーゼ酵
素標品とした。なお、この酵素標品におけるポリリン酸
キナーゼの比活性は、０．６ユニット／ｍｇ蛋白質であ
った。
【００２１】なお、本発明におけるポリリン酸キナーゼ
活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算
出したものである。すなわち、５ｍＭ塩化マグネシウ
ム、１００ｍＭ硫安、５ｍＭ ＡＤＰ、及びポリリン酸
（無機リン酸として１００ｍＭ）を含有する２５ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加して、
３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間
の熱処理により反応を停止させる。高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＴＰを定量
し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＡＴＰを生成する
活性を１単位（ユニット）とする。
活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算
出したものである。すなわち、５ｍＭ塩化マグネシウ
ム、１００ｍＭ硫安、５ｍＭ ＡＤＰ、及びポリリン酸
（無機リン酸として１００ｍＭ）を含有する２５ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加して、
３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間
の熱処理により反応を停止させる。高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＴＰを定量
し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＡＴＰを生成する
活性を１単位（ユニット）とする。
【００２２】（３）大腸菌アデニレートキナーゼのクロ
ーニング 大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（宝酒造（株）より入手）
の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochim. Biophy
s. Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡ
をテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマー
ＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌ア
デニレートキナーゼ（ａｄｋ）遺伝子を増幅した。
ーニング 大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（宝酒造（株）より入手）
の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochim. Biophy
s. Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡ
をテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマー
ＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌ア
デニレートキナーゼ（ａｄｋ）遺伝子を増幅した。
【００２３】プライマー（Ｃ）：5'-ATGGATCCCGTTTCAGC
CCCAGGTGCC-3' プライマー（Ｄ）：5'-ATAAGCTTGGCCTGAGATTGCTGATAAG-
3'
CCCAGGTGCC-3' プライマー（Ｄ）：5'-ATAAGCTTGGCCTGAGATTGCTGATAAG-
3'
【００２４】ＰＣＲによるａｄｋ遺伝子の増幅は、反応
液１００μｌ（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ ト
リス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、
テンペレートＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ
（Ａ）（Ｂ）各々 ０．１μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をPerkin-Elmer C
etus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱
変性（９４℃、１分）、アニーリング（５６℃、１．０
分）、ポリメライゼーション（７２℃、３．０分）のス
テップを２５回繰り返すことにより行った。
液１００μｌ（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ ト
リス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、
テンペレートＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ
（Ａ）（Ｂ）各々 ０．１μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をPerkin-Elmer C
etus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱
変性（９４℃、１分）、アニーリング（５６℃、１．０
分）、ポリメライゼーション（７２℃、３．０分）のス
テップを２５回繰り返すことにより行った。
【００２５】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．０
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素
ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同じく制限酵
素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミド
ｐＵＣ１８（宝酒造（株）より入手）とＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ
１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質
転換体よりプラスミドｐＵＣ−ＡＤＫを単離した。ｐＵ
Ｃ−ＡＤＫは、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーター下流の
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に大腸菌ａｄｋ遺
伝子を含有するＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断
片が挿入されたものである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．０
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素
ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同じく制限酵
素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミド
ｐＵＣ１８（宝酒造（株）より入手）とＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ
１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質
転換体よりプラスミドｐＵＣ−ＡＤＫを単離した。ｐＵ
Ｃ−ＡＤＫは、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーター下流の
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に大腸菌ａｄｋ遺
伝子を含有するＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断
片が挿入されたものである。
【００２６】（４）大腸菌アデニレートキナーゼの調製 プラスミドｐＵＣ−ＡＤＫを保持する大腸菌ＪＭ１０９
菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘ
ＹＴ培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養し
た。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃
度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃
で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離
（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、６０
ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、
５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％トライトンＸ−１００、
０．２ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）に懸濁した。３７℃で
１時間保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、
さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌
体残さを除去した。
菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘ
ＹＴ培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養し
た。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃
度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃
で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離
（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、６０
ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、
５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％トライトンＸ−１００、
０．２ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）に懸濁した。３７℃で
１時間保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、
さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌
体残さを除去した。
【００２７】このように得られた上清画分を５ｍＭ 塩
化マグネシウム及び１ｍＭ ２−メルカプトエタノール
を含有する５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）に対して
透析を行い、粗酵素液とした。粗酵素液におけるアデニ
レートキナーゼの比活性は、１３４ユニット／ｍｇ蛋白
質であり、対照菌（ｐＵＣ１８を保持する大腸菌ＪＭ１
０９菌）の比活性（１．９ユニット／ｍｇ蛋白質）の約
８５倍であった。次に粗酵素液をＤＥＡＥトヨパール６
５０Ｍ（トーソー（株））を用いて０〜０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌの濃度勾配にて分画し、アデニレートキナーゼ活性
のある画分を回収した。この画分をアデニレートキナー
ゼ酵素標品とした。なお、この酵素標品におけるポリリ
ン酸キナーゼの比活性は、３４４ユニット／ｍｇ蛋白質
であった。
化マグネシウム及び１ｍＭ ２−メルカプトエタノール
を含有する５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）に対して
透析を行い、粗酵素液とした。粗酵素液におけるアデニ
レートキナーゼの比活性は、１３４ユニット／ｍｇ蛋白
質であり、対照菌（ｐＵＣ１８を保持する大腸菌ＪＭ１
０９菌）の比活性（１．９ユニット／ｍｇ蛋白質）の約
８５倍であった。次に粗酵素液をＤＥＡＥトヨパール６
５０Ｍ（トーソー（株））を用いて０〜０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌの濃度勾配にて分画し、アデニレートキナーゼ活性
のある画分を回収した。この画分をアデニレートキナー
ゼ酵素標品とした。なお、この酵素標品におけるポリリ
ン酸キナーゼの比活性は、３４４ユニット／ｍｇ蛋白質
であった。
【００２８】本発明におけるアデニレートキナーゼ活性
の単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出し
たものである。すなわち、５ｍＭ塩化マグネシウム、５
ｍＭ ＡＴＰ、及び５ｍＭ ＡＭＰを含有する５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加して
３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間
の熱処理により反応を停止させる。ＨＰＬＣを用いて反
応液中のＡＤＰを定量し、３７℃で１分間に２μｍｏｌ
ｅのＡＤＰを生成する活性を１単位（ユニット）とす
る。
の単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出し
たものである。すなわち、５ｍＭ塩化マグネシウム、５
ｍＭ ＡＴＰ、及び５ｍＭ ＡＭＰを含有する５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加して
３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１分間
の熱処理により反応を停止させる。ＨＰＬＣを用いて反
応液中のＡＤＰを定量し、３７℃で１分間に２μｍｏｌ
ｅのＡＤＰを生成する活性を１単位（ユニット）とす
る。
【００２９】（５）発現ベクターｐＴｒｃ１２−６の作
製 プラスミドベクターπＡＧ１（プラスミドベクター π
ＡＧ１を保持した大腸菌 Ｋ−１２株 ＴＮＣ１１１菌
の寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６９０１号：平成１１年
９月３０日生命工学工業技術研究所寄託）を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤ
ＮＡ末端を平滑化し、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て制限酵素ＢｇｌＩＩリンカーを付与した。該ＤＮＡを
制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切断し、カナマイ
シン耐性遺伝子を含む１．８ｋｂのＢｇｌＩＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片を調製した。
製 プラスミドベクターπＡＧ１（プラスミドベクター π
ＡＧ１を保持した大腸菌 Ｋ−１２株 ＴＮＣ１１１菌
の寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６９０１号：平成１１年
９月３０日生命工学工業技術研究所寄託）を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤ
ＮＡ末端を平滑化し、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て制限酵素ＢｇｌＩＩリンカーを付与した。該ＤＮＡを
制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切断し、カナマイ
シン耐性遺伝子を含む１．８ｋｂのＢｇｌＩＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片を調製した。
【００３０】次に、ｐＴｒｃ９９ＡＤＮＡを制限酵素Ｐ
ｖｕＩで切断後、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼによる部分消
化を行い、β―ラクタマーゼ遺伝子を欠失させ、さらに
ｐＢｇｌＩＩリンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
ＤＮＡ末端に付与し、さらに制限酵素ＢｇｌＩＩで切断
した。該ＤＮＡと先に調製したカナマイシン耐性遺伝子
を含むＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
し、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０５菌を形質転換し
た。得られたカナマイシン耐性形質転換体より、プラス
ミドｐＴｒｃ１２−６を得た。ｐＴｒｃ１２−６は、ｐ
Ｔｒｃ９９Ａのβ−ラクタマーゼ遺伝子が完全に欠失し
（position 567 - 1816bp が欠失）、その欠失部位にＴ
ｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたも
のである。
ｖｕＩで切断後、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼによる部分消
化を行い、β―ラクタマーゼ遺伝子を欠失させ、さらに
ｐＢｇｌＩＩリンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
ＤＮＡ末端に付与し、さらに制限酵素ＢｇｌＩＩで切断
した。該ＤＮＡと先に調製したカナマイシン耐性遺伝子
を含むＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
し、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０５菌を形質転換し
た。得られたカナマイシン耐性形質転換体より、プラス
ミドｐＴｒｃ１２−６を得た。ｐＴｒｃ１２−６は、ｐ
Ｔｒｃ９９Ａのβ−ラクタマーゼ遺伝子が完全に欠失し
（position 567 - 1816bp が欠失）、その欠失部位にＴ
ｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたも
のである。
【００３１】（６）大腸菌メチオニンアデノシルトラン
スフェラーゼ遺伝子のクローニング 大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（宝酒造（株）より入手）
の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochim. Biophy
s. Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡ
をテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマー
ＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌メ
チオニンアデノシルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＫ）遺
伝子を増幅した。
スフェラーゼ遺伝子のクローニング 大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（宝酒造（株）より入手）
の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochim. Biophy
s. Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡ
をテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマー
ＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌メ
チオニンアデノシルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＫ）遺
伝子を増幅した。
【００３２】プライマー（Ｅ）：5'- ATCCATGGCGCTACCA
CAGAAAATCCACACAACAG -3' プライマー（Ｆ）：5'- TACTGCAGGTTGGTGTAATCGGTTTCAG
GTTGTG-3'
CAGAAAATCCACACAACAG -3' プライマー（Ｆ）：5'- TACTGCAGGTTGGTGTAATCGGTTTCAG
GTTGTG-3'
【００３３】ＰＣＲによるｍｅｔＫ遺伝子の増幅は、反
応液１００μｌ（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシ
ウム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴ
Ｐ、テンペレートＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮ
Ａ（Ａ）（Ｂ）各々０．１μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をPerkin-Elmer C
etus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱
変性（９４℃、１分）、アニーリング（３６℃、１．０
分）、ポリメライゼーション（７２℃、３．０分）のス
テップを３５回繰り返すことにより行った。
応液１００μｌ（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシ
ウム、０．００１％ ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＮＴ
Ｐ、テンペレートＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮ
Ａ（Ａ）（Ｂ）各々０．１μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をPerkin-Elmer C
etus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱
変性（９４℃、１分）、アニーリング（３６℃、１．０
分）、ポリメライゼーション（７２℃、３．０分）のス
テップを３５回繰り返すことにより行った。
【００３４】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．４
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素
ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素Ｎｃｏ
Ｉ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−６
とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を
用いて大腸菌ＪＭ１０５菌を形質転換し、得られたカナ
マイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｍｅ
ｔＫを単離した。ｐＴｒｃ−ｍｅｔＫは、ｐＴｒｃ１２
−６のｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ切
断部位に大腸菌ｍｅｔＫ遺伝子を含有するＮｃｏＩ−Ｐ
ｓｔＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．４
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素
ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素Ｎｃｏ
Ｉ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−６
とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を
用いて大腸菌ＪＭ１０５菌を形質転換し、得られたカナ
マイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｍｅ
ｔＫを単離した。ｐＴｒｃ−ｍｅｔＫは、ｐＴｒｃ１２
−６のｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ切
断部位に大腸菌ｍｅｔＫ遺伝子を含有するＮｃｏＩ−Ｐ
ｓｔＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００３５】（７）大腸菌メチオニンアデノシルトラン
スフェラーゼの調製 プラスミドｐＴｒｃ−ｍｅｔＫを保持する大腸菌ＪＭ１
０５菌を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２
ｘＹＴ培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養し
た。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃
度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３
７℃で１８時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心
分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、
３０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。３７℃で１時間
保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに
遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残さ
を除去した上清液を酵素液とした。酵素液におけるメチ
オニンアデノシルトランスフェラーゼの比活性は、０．
８０ユニット／ｍｇ蛋白質であった。
スフェラーゼの調製 プラスミドｐＴｒｃ−ｍｅｔＫを保持する大腸菌ＪＭ１
０５菌を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２
ｘＹＴ培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養し
た。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃
度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３
７℃で１８時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心
分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、
３０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。３７℃で１時間
保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに
遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残さ
を除去した上清液を酵素液とした。酵素液におけるメチ
オニンアデノシルトランスフェラーゼの比活性は、０．
８０ユニット／ｍｇ蛋白質であった。
【００３６】本発明におけるメチオニンアデノシルトラ
ンスフェラーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す
方法で測定、算出したものである。すなわち、２０ｍＭ
塩化マグネシウム、１００ｍＭ 塩化カリウム、５ｍＭ
ＡＴＰ、及び５ｍＭ メチオニンを含有する５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素標品を添加して３
７℃で保温することで反応を行い、塩酸を添加すること
により反応を停止させる。ＨＰＬＣを用いて反応液中の
ＳＡＭを定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＳＡ
Ｍを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
ンスフェラーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す
方法で測定、算出したものである。すなわち、２０ｍＭ
塩化マグネシウム、１００ｍＭ 塩化カリウム、５ｍＭ
ＡＴＰ、及び５ｍＭ メチオニンを含有する５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素標品を添加して３
７℃で保温することで反応を行い、塩酸を添加すること
により反応を停止させる。ＨＰＬＣを用いて反応液中の
ＳＡＭを定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＳＡ
Ｍを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
【００３７】（８）ＳＡＭの酵素的合成 Ｉ ２０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００ｍＭ 塩化カリウ
ム、５ｍＭ ＡＭＰ、５ｍＭメチオニン、ポリリン酸
（リン酸として７５ｍＭ）を含有する１００ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に０．２４ユニット／ｍｌア
デニレートキナーゼ、０．１２ユニット／ｍｌポリリン
酸キナーゼ、０．３６ユニット／ｍｌメチオニンアデノ
シルトランスフェラーゼを添加して３７℃で、７時間保
温した。反応液をＨＰＬＣを用いて分析したところ、
２．０ｍＭのＳＡＭの生成が確認された。
ム、５ｍＭ ＡＭＰ、５ｍＭメチオニン、ポリリン酸
（リン酸として７５ｍＭ）を含有する１００ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に０．２４ユニット／ｍｌア
デニレートキナーゼ、０．１２ユニット／ｍｌポリリン
酸キナーゼ、０．３６ユニット／ｍｌメチオニンアデノ
シルトランスフェラーゼを添加して３７℃で、７時間保
温した。反応液をＨＰＬＣを用いて分析したところ、
２．０ｍＭのＳＡＭの生成が確認された。
【００３８】（９）ＳＡＭの酵素的合成 ＩＩ １７．５ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ 塩化カリ
ウム、１０ｍＭ ＡＭＰ、１０ｍＭメチオニン、ポリリ
ン酸（リン酸として７５ｍＭ）および１．５Ｍ尿素を含
有する１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に
５．０ユニット／ｍｌアデニレートキナーゼ、３．０ユ
ニット／ｍｌポリリン酸キナーゼ、１．２ユニット／ｍ
ｌメチオニンアデノシルトランスフェラーゼを添加して
３７℃で、７．５時間保温した。反応液をＨＰＬＣを用
いて分析したところ、６．３５ｍＭのＳＡＭの生成が確
認された。
ウム、１０ｍＭ ＡＭＰ、１０ｍＭメチオニン、ポリリ
ン酸（リン酸として７５ｍＭ）および１．５Ｍ尿素を含
有する１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に
５．０ユニット／ｍｌアデニレートキナーゼ、３．０ユ
ニット／ｍｌポリリン酸キナーゼ、１．２ユニット／ｍ
ｌメチオニンアデノシルトランスフェラーゼを添加して
３７℃で、７．５時間保温した。反応液をＨＰＬＣを用
いて分析したところ、６．３５ｍＭのＳＡＭの生成が確
認された。
【００３９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> YAMASA CORPORATION <120> Process for the enzymatically preparation of S-adenosyl-L-methioni ne <130> YP2000-009 <140> <141> <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ppk gene <400> 1 taccatgggt caggaaaagc tata 24 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ppk gene <400> 2 atggatcctt attcaggttg ttcgagtga 29 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amolication of adk gene <400> 3 atggatcccg tttcagcccc aggtgcc 27 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of adk gene <400> 4 ataagcttgg cctgagattg ctgataag 28 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of metK gene <400> 5 atccatggcg ctaccacaga aaatccacac aacag 35 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of metK gene <400> 6 tactgcaggt tggtgtaatc ggtttcaggt tgtg 34
【００４０】
【図１】図１は、アデニレートキナーゼとポリリン酸キ
ナーゼによるポリリン酸に依存したＡＭＰからのＡＴＰ
生成系存在下におけるＳＡＭの酵素的合成反応の経時的
変化を示したものである。
ナーゼによるポリリン酸に依存したＡＭＰからのＡＴＰ
生成系存在下におけるＳＡＭの酵素的合成反応の経時的
変化を示したものである。
【００４１】
Claims (4)
- 【請求項１】 酵素としてポリリン酸キナーゼ、アデニ
レートキナーゼ及びメチオニンアデノシルトランスフェ
ラーゼを用い、反応系にポリリン酸、Ｌ−メチオニン及
びアデノシン５’−モノリン酸（ＡＭＰ）を添加し、こ
れらを反応させることでＳ―アデノシル−Ｌ−メチオニ
ン（ＳＡＭ）を合成し、合成したＳＡＭを採取すること
を特徴とするＳＡＭの酵素的製造法。 - 【請求項２】 反応系に尿素を添加する、請求項１記載
のＳＡＭの酵素的製造法。 - 【請求項３】 少なくともポリリン酸キナーゼ、アデニ
レートキナーゼ、メチオニンアデノシルトランスフェラ
ーゼ、ポリリン酸、Ｌ−メチオニン及びＡＭＰから構成
されるＳＡＭを合成するための反応系。 - 【請求項４】 少なくともポリリン酸キナーゼ、アデニ
レートキナーゼ、メチオニンアデノシルトランスフェラ
ーゼ、ポリリン酸、Ｌ−メチオニン、尿素及びＡＭＰか
ら構成されるＳＡＭを合成するための反応系。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000155181A JP2001169797A (ja) | 1999-10-08 | 2000-05-25 | Ｓ―アデノシル−ｌ−メチオニンの酵素的製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28743799 | 1999-10-08 | ||
| JP11-287437 | 1999-10-08 | ||
| JP2000155181A JP2001169797A (ja) | 1999-10-08 | 2000-05-25 | Ｓ―アデノシル−ｌ−メチオニンの酵素的製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001169797A true JP2001169797A (ja) | 2001-06-26 |
Family
ID=26556731
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000155181A Pending JP2001169797A (ja) | 1999-10-08 | 2000-05-25 | Ｓ―アデノシル−ｌ−メチオニンの酵素的製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001169797A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008090905A1 (ja) | 2007-01-25 | 2008-07-31 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | 保存安定性に優れたｓ－アデノシル－ｌ－メチオニン含有乾燥酵母の製造方法、その製造物及びその成型された組成物 |
| CN109136311A (zh) * | 2017-06-15 | 2019-01-04 | 深圳市古特新生生物科技有限公司 | 一种酶法制备s-腺苷甲硫氨酸的方法 |
-
2000
- 2000-05-25 JP JP2000155181A patent/JP2001169797A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008090905A1 (ja) | 2007-01-25 | 2008-07-31 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | 保存安定性に優れたｓ－アデノシル－ｌ－メチオニン含有乾燥酵母の製造方法、その製造物及びその成型された組成物 |
| US9200250B2 (en) | 2007-01-25 | 2015-12-01 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | Method for production of dry yeast containing S-adenosyl-L-methionine and having excellent storage stability, product produced by the method, and molded composition of the dry yeast |
| CN109136311A (zh) * | 2017-06-15 | 2019-01-04 | 深圳市古特新生生物科技有限公司 | 一种酶法制备s-腺苷甲硫氨酸的方法 |
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