JP2000217593A - シチジン５’−トリリン酸の酵素的製造法およびその応用 - Google Patents
シチジン５’−トリリン酸の酵素的製造法およびその応用Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 安価かつ効率的なシチジン５’−トリリン酸
（ＣＴＰ）の製造法 【解決手段】 シチジン５’−トリリン酸シンセターゼ
とアミノ基供与体を用いてウリジン５’−トリリン酸
（ＵＴＰ）からＣＴＰを製造する方法において、式
（Ｉ）で表わされるように、アデノシン５’−トリリン
酸（ＡＴＰ）の供給なしに該酵素反応を行うことを特徴
とするＣＴＰの製造法。また、同製造方法において、式
（ＩＩ）で表わされるように、ＡＴＰの供給なしに該酵
素反応を行わせ、かつ反応により生成したウリジン５’
−ジリン酸（ＵＤＰ）をポリリン酸キナーゼによりＵＴ
Ｐに再生しながら当該酵素反応を行わせることを特徴と
するＣＴＰの製造法。 （式中、ＰｙｒＧはシチジン５’−トリリン酸シンセタ
ーゼ、ＰＰＫはポリリン酸キナーゼ、を示す。）
（ＣＴＰ）の製造法 【解決手段】 シチジン５’−トリリン酸シンセターゼ
とアミノ基供与体を用いてウリジン５’−トリリン酸
（ＵＴＰ）からＣＴＰを製造する方法において、式
（Ｉ）で表わされるように、アデノシン５’−トリリン
酸（ＡＴＰ）の供給なしに該酵素反応を行うことを特徴
とするＣＴＰの製造法。また、同製造方法において、式
（ＩＩ）で表わされるように、ＡＴＰの供給なしに該酵
素反応を行わせ、かつ反応により生成したウリジン５’
−ジリン酸（ＵＤＰ）をポリリン酸キナーゼによりＵＴ
Ｐに再生しながら当該酵素反応を行わせることを特徴と
するＣＴＰの製造法。 （式中、ＰｙｒＧはシチジン５’−トリリン酸シンセタ
ーゼ、ＰＰＫはポリリン酸キナーゼ、を示す。）
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アデノシン５’−
トリリン酸（ＡＴＰ）の供給なしにウリジン５’−トリ
リン酸（ＵＴＰ）からシチジン５’−トリリン酸（ＣＴ
Ｐ）を酵素的に製造する方法および該方法を応用したシ
チジン系化合物の製造法に関するものである。
トリリン酸（ＡＴＰ）の供給なしにウリジン５’−トリ
リン酸（ＵＴＰ）からシチジン５’−トリリン酸（ＣＴ
Ｐ）を酵素的に製造する方法および該方法を応用したシ
チジン系化合物の製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】シチジン５’−ジリン酸コリン（ＣＤＰ
−コリン）やシチジン５’−モノリン酸−Ｎ−アセチル
ノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）などのシチジン系
化合物は医薬品あるいは化成品として有用な化合物であ
る。このようなシチジン系化合物の製造法は、化学合成
法、酵母などの微生物を用いる方法などが古くから知ら
れているが、これらの製造法はいずれも基質として高価
なシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）、シチジン５’
−ジリン酸（ＣＤＰ）、シチジン５’−トリリン酸（Ｃ
ＴＰ）などを用いるため、実用的に満足しうる方法とは
なり得なかった。また最近、オロット酸から酵素処理に
よりＣＤＰ−コリンやＣＭＰ−ＮｅｕＡｃなどを製造す
る方法も開発されている（特開平５−２７６９７４、国
際特許出願ＷＯ９８／１２３４３）。
−コリン）やシチジン５’−モノリン酸−Ｎ−アセチル
ノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）などのシチジン系
化合物は医薬品あるいは化成品として有用な化合物であ
る。このようなシチジン系化合物の製造法は、化学合成
法、酵母などの微生物を用いる方法などが古くから知ら
れているが、これらの製造法はいずれも基質として高価
なシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）、シチジン５’
−ジリン酸（ＣＤＰ）、シチジン５’−トリリン酸（Ｃ
ＴＰ）などを用いるため、実用的に満足しうる方法とは
なり得なかった。また最近、オロット酸から酵素処理に
よりＣＤＰ−コリンやＣＭＰ−ＮｅｕＡｃなどを製造す
る方法も開発されている（特開平５−２７６９７４、国
際特許出願ＷＯ９８／１２３４３）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】一般に、アミノ化反応
など高エネルギーを必要とする酵素反応には、エネルギ
ー供与体としてのＡＴＰが不可欠であると考えられてい
る。シチジン系化合物を酵素的に製造する際、合成原料
であるＣＴＰをシチジン５’−トリリン酸シンセターゼ
とアミノ基供与体を用いたアミノ化反応によりＵＴＰか
ら調製する場合にもＡＴＰなどのエネルギー源の供給が
必要である。しかしながら、市販されているＡＴＰは極
めて高価であり、これをエネルギー供与体として使用す
るとシチジン系化合物の生産コストが増大し、実用的な
方法とはなり得ない。よって、ＡＴＰを使用することな
くＣＴＰの製造をより安価かつ効率的に行うことができ
れば、シチジン系化合物の実用的な酵素的製造が可能に
なると考えられる。
など高エネルギーを必要とする酵素反応には、エネルギ
ー供与体としてのＡＴＰが不可欠であると考えられてい
る。シチジン系化合物を酵素的に製造する際、合成原料
であるＣＴＰをシチジン５’−トリリン酸シンセターゼ
とアミノ基供与体を用いたアミノ化反応によりＵＴＰか
ら調製する場合にもＡＴＰなどのエネルギー源の供給が
必要である。しかしながら、市販されているＡＴＰは極
めて高価であり、これをエネルギー供与体として使用す
るとシチジン系化合物の生産コストが増大し、実用的な
方法とはなり得ない。よって、ＡＴＰを使用することな
くＣＴＰの製造をより安価かつ効率的に行うことができ
れば、シチジン系化合物の実用的な酵素的製造が可能に
なると考えられる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
達成すべく鋭意研究を行った結果、（１）従来、ＵＴＰ
からＣＴＰへの反応を触媒するシチジン５’−トリリン
酸シンセターゼはＡＴＰをエネルギー源としてＵＴＰの
アミノ化を触媒するものと考えられていたが、下記式
（Ｉ）に示すように基質であるＵＴＰ自身がエネルギー
源として利用できること、（２）ＵＴＰは微生物により
大量に製造可能なウリジンより比較的安価に製造できる
こと、（３）式（ＩＩ）に示すように、ポリリン酸に依
存したヌクレオシドジリン酸キナーゼ活性を有するポリ
リン酸キナーゼを組み合わせることで、ウリジン５’−
ジリン酸（ＵＤＰ）をＵＴＰに再生でき、再生したＵＴ
Ｐは再度シチジン５’−トリリン酸シンセターゼによる
アミノ化反応に利用され、もってＣＴＰの合成効率が大
幅に増大すること、（４）式（Ｉ）または式（ＩＩ）の
反応系を応用することで、ＵＴＰからシチジン系化合物
（ＣＤＰ−コリン、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃなど）を合成で
きることを見出し、本発明を完成させた。
達成すべく鋭意研究を行った結果、（１）従来、ＵＴＰ
からＣＴＰへの反応を触媒するシチジン５’−トリリン
酸シンセターゼはＡＴＰをエネルギー源としてＵＴＰの
アミノ化を触媒するものと考えられていたが、下記式
（Ｉ）に示すように基質であるＵＴＰ自身がエネルギー
源として利用できること、（２）ＵＴＰは微生物により
大量に製造可能なウリジンより比較的安価に製造できる
こと、（３）式（ＩＩ）に示すように、ポリリン酸に依
存したヌクレオシドジリン酸キナーゼ活性を有するポリ
リン酸キナーゼを組み合わせることで、ウリジン５’−
ジリン酸（ＵＤＰ）をＵＴＰに再生でき、再生したＵＴ
Ｐは再度シチジン５’−トリリン酸シンセターゼによる
アミノ化反応に利用され、もってＣＴＰの合成効率が大
幅に増大すること、（４）式（Ｉ）または式（ＩＩ）の
反応系を応用することで、ＵＴＰからシチジン系化合物
（ＣＤＰ−コリン、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃなど）を合成で
きることを見出し、本発明を完成させた。
【０００５】
【式５】 （式中、ＰｙｒＧはシチジン５’−トリリン酸シンセタ
ーゼを示す。）
ーゼを示す。）
【０００６】
【式６】 （式中、ＰｙｒＧはシチジン５’−トリリン酸シンセタ
ーゼ、ＰＰＫはポリリン酸キナーゼを示す。）
ーゼ、ＰＰＫはポリリン酸キナーゼを示す。）
【０００７】すなわち、本発明は、シチジン５’−トリ
リン酸シンセターゼとアミノ基供与体を用いてＵＴＰか
らＣＴＰを製造する方法において、上記式（Ｉ）で表わ
されるように、ＡＴＰの供給なしに該酵素反応を行うこ
とを特徴とするＣＴＰの製造法およびその合成系に関す
るものである。また、本発明は、シチジン５’−トリリ
ン酸シンセターゼとアミノ基供与体を用いてＵＴＰから
ＣＴＰを製造する方法において、上記式（ＩＩ）で表わ
されるように、ＡＴＰの供給なしに該酵素反応を行わ
せ、かつ反応により生成したＵＤＰをポリリン酸キナー
ゼによりＵＴＰに再生しながら当該酵素反応を行わせる
ことを特徴とするＣＴＰの製造法およびその合成系に関
するものである。
リン酸シンセターゼとアミノ基供与体を用いてＵＴＰか
らＣＴＰを製造する方法において、上記式（Ｉ）で表わ
されるように、ＡＴＰの供給なしに該酵素反応を行うこ
とを特徴とするＣＴＰの製造法およびその合成系に関す
るものである。また、本発明は、シチジン５’−トリリ
ン酸シンセターゼとアミノ基供与体を用いてＵＴＰから
ＣＴＰを製造する方法において、上記式（ＩＩ）で表わ
されるように、ＡＴＰの供給なしに該酵素反応を行わ
せ、かつ反応により生成したＵＤＰをポリリン酸キナー
ゼによりＵＴＰに再生しながら当該酵素反応を行わせる
ことを特徴とするＣＴＰの製造法およびその合成系に関
するものである。
【０００８】さらに本発明は、酵素反応によりＣＴＰか
らシチジン系化合物を製造する方法において、下記式
（ＩＩＩ）で表わされるように、ＡＴＰの供給なしにシ
チジン５’−トリリン酸シンセターゼとアミノ基供与体
を用いて反応に使用するＣＴＰをＵＴＰから調製するこ
とを特徴とするシチジン系化合物の製造法およびその合
成系に関するものである。
らシチジン系化合物を製造する方法において、下記式
（ＩＩＩ）で表わされるように、ＡＴＰの供給なしにシ
チジン５’−トリリン酸シンセターゼとアミノ基供与体
を用いて反応に使用するＣＴＰをＵＴＰから調製するこ
とを特徴とするシチジン系化合物の製造法およびその合
成系に関するものである。
【０００９】
【式７】 （式中、ＰｙｒＧはシチジン５’−トリリン酸シンセタ
ーゼを示す。）
ーゼを示す。）
【００１０】さらにまた本発明は、酵素反応によりＣＴ
Ｐからシチジン系化合物を製造する方法において、下記
式（ＩＶ）で表わされるように、ＡＴＰの供給なしにシ
チジン５’−トリリン酸シンテターゼとアミノ基供与体
を用いて反応に使用するＣＴＰをＵＴＰから調製し、か
つ反応により生成したＵＤＰをポリリン酸キナーゼによ
りＵＴＰに再生しながら当該酵素反応を行わせることを
特徴とするシチジン系化合物の製造法およびその合成系
に関するものである。
Ｐからシチジン系化合物を製造する方法において、下記
式（ＩＶ）で表わされるように、ＡＴＰの供給なしにシ
チジン５’−トリリン酸シンテターゼとアミノ基供与体
を用いて反応に使用するＣＴＰをＵＴＰから調製し、か
つ反応により生成したＵＤＰをポリリン酸キナーゼによ
りＵＴＰに再生しながら当該酵素反応を行わせることを
特徴とするシチジン系化合物の製造法およびその合成系
に関するものである。
【００１１】
【式８】 （式中、ＰｙｒＧはシチジン５’−トリリン酸シンセタ
ーゼ、ＰＰＫはポリリン酸キナーゼを示す。）
ーゼ、ＰＰＫはポリリン酸キナーゼを示す。）
【００１２】
【発明の実施の形態】反応に使用する酵素〔シチジン
５’−トリリン酸シンセターゼ（ＰｙｒＧ）、コリンホ
スフェートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＣＴ）、シ
チジン５’−モノリン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸シ
ンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）、ポリ
リン酸キナーゼ（ＰＰＫ）、コリンキナーゼ（ＣＫＩ）
など〕としては、動物由来、植物由来、微生物由来など
特定の由来のものに限定されず、すべての由来のものを
使用することができる。しかし、酵素調製の簡便性、目
的化合物の合成効率などの点から微生物由来の酵素を使
用するのが好適である。また、各種酵素調製の簡便さと
共に調製効率を高めるため、該酵素遺伝子をクローン化
し、微生物菌体内で大量発現させ、該酵素の大量調製を
行う、いわゆる組換えＤＮＡ技術を用いた酵素生産が最
も好都合である。
５’−トリリン酸シンセターゼ（ＰｙｒＧ）、コリンホ
スフェートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＣＴ）、シ
チジン５’−モノリン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸シ
ンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）、ポリ
リン酸キナーゼ（ＰＰＫ）、コリンキナーゼ（ＣＫＩ）
など〕としては、動物由来、植物由来、微生物由来など
特定の由来のものに限定されず、すべての由来のものを
使用することができる。しかし、酵素調製の簡便性、目
的化合物の合成効率などの点から微生物由来の酵素を使
用するのが好適である。また、各種酵素調製の簡便さと
共に調製効率を高めるため、該酵素遺伝子をクローン化
し、微生物菌体内で大量発現させ、該酵素の大量調製を
行う、いわゆる組換えＤＮＡ技術を用いた酵素生産が最
も好都合である。
【００１３】例えば、ＰｙｒＧとしては大腸菌、枯草菌
由来の酵素が例示でき、大腸菌ＰｙｒＧ遺伝子も既にク
ローン化されており、その全塩基配列が決定されている
（J.Biol. Chem., 261, 5568-5574, 1982）。ＣＣＴ及
びＣＫＩとしては、酵母由来の酵素が例示でき、酵母Ｃ
ＣＴ遺伝子は既にクローン化され、その全塩基配列が決
定されている（Eur. J. Biochem., 169, 477-486, 198
7）。 ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼに関しても、大
腸菌より該遺伝子はクローン化され、その全塩基配列が
決定されている（Glycobiology, 1, 187-191 (199
1)）。また、ポリリン酸キナーゼに関しても該遺伝子は
大腸菌よりクローン化されており、その全塩基配列が決
定している（J. Biol. Chem., 267, 22556-22561 (199
2)）。したがって、いずれの遺伝子もＰＣＲ法によりク
ローン化することが可能であり、また各種遺伝子の発現
系の構築、酵素の発現なども公知の方法（Molecular Cl
oning,A Laboratory Manual, Second Edition, Sambroo
kら編、Cold Spring Harbor Laboratory (1989)）に従
って行うことができる。
由来の酵素が例示でき、大腸菌ＰｙｒＧ遺伝子も既にク
ローン化されており、その全塩基配列が決定されている
（J.Biol. Chem., 261, 5568-5574, 1982）。ＣＣＴ及
びＣＫＩとしては、酵母由来の酵素が例示でき、酵母Ｃ
ＣＴ遺伝子は既にクローン化され、その全塩基配列が決
定されている（Eur. J. Biochem., 169, 477-486, 198
7）。 ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼに関しても、大
腸菌より該遺伝子はクローン化され、その全塩基配列が
決定されている（Glycobiology, 1, 187-191 (199
1)）。また、ポリリン酸キナーゼに関しても該遺伝子は
大腸菌よりクローン化されており、その全塩基配列が決
定している（J. Biol. Chem., 267, 22556-22561 (199
2)）。したがって、いずれの遺伝子もＰＣＲ法によりク
ローン化することが可能であり、また各種遺伝子の発現
系の構築、酵素の発現なども公知の方法（Molecular Cl
oning,A Laboratory Manual, Second Edition, Sambroo
kら編、Cold Spring Harbor Laboratory (1989)）に従
って行うことができる。
【００１４】反応液に添加する酵素調製物としては、微
生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られ
る酵素調製物などを例示することができる。微生物の菌
体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法
により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことが
できる。具体的に、大腸菌を例に挙げ説明すれば、培地
としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、
０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２
×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキス
トラクト、０．５％食塩）などを使用することができ、
当該培地に種菌を接種後、３０〜５０℃で１０〜５０時
間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液
を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより酵素活
性を有する微生物菌体を調製することができる。
生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られ
る酵素調製物などを例示することができる。微生物の菌
体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法
により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことが
できる。具体的に、大腸菌を例に挙げ説明すれば、培地
としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、
０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２
×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキス
トラクト、０．５％食塩）などを使用することができ、
当該培地に種菌を接種後、３０〜５０℃で１０〜５０時
間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液
を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより酵素活
性を有する微生物菌体を調製することができる。
【００１５】微生物の菌体処理物としては、上記微生物
菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプ
レス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、
自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処
理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理
（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法
に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細
胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプ
レス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、
自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処
理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理
（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法
に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細
胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
【００１６】酵素調製物としては、上記菌体処理物から
当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩
析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処
理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られ
る粗酵素または精製酵素を例示することができる。
当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩
析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処
理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られ
る粗酵素または精製酵素を例示することができる。
【００１７】本発明で使用するＵＴＰおよびポリリン酸
は、それぞれ市販のものを使用することができる。ま
た、アミノ基供与体としてはグルタミン、グルタミン酸
等のアミノ酸、硫化アンモニウムなどのアンモニウム塩
を利用することができる。
は、それぞれ市販のものを使用することができる。ま
た、アミノ基供与体としてはグルタミン、グルタミン酸
等のアミノ酸、硫化アンモニウムなどのアンモニウム塩
を利用することができる。
【００１８】ＣＴＰの合成反応は、トリス塩酸緩衝液な
どの適当な緩衝液（ｐＨ５〜１０）中、ＵＴＰ（１〜５
０ｍＭ）、アミノ基供与体（１〜５０ｍＭ）およびＰｙ
ｒＧ（０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０
４〜１．０ユニット／ｍｌ）添加し、２０〜４０℃、好
ましくは３０〜３７℃で１０〜６０時間程度、必要によ
り撹拌しながら反応させることにより実施できる。ま
た、上記合成系にポリリン酸（無機リン酸として５０〜
１００ｍＭ）とポリリン酸キナーゼ（０．０１以上、好
ましくは０．０４〜１．０ユニット／ｍｌ）をさらに添
加し、上記と同じ反応条件で反応させることで、生成し
たＵＤＰを再生しながらＣＴＰを効率的に合成すること
ができる。このようにして得られたＣＴＰは、通常の単
離精製手段（イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロ
マトグラフィー、塩析など）により単離精製することが
できる。
どの適当な緩衝液（ｐＨ５〜１０）中、ＵＴＰ（１〜５
０ｍＭ）、アミノ基供与体（１〜５０ｍＭ）およびＰｙ
ｒＧ（０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０
４〜１．０ユニット／ｍｌ）添加し、２０〜４０℃、好
ましくは３０〜３７℃で１０〜６０時間程度、必要によ
り撹拌しながら反応させることにより実施できる。ま
た、上記合成系にポリリン酸（無機リン酸として５０〜
１００ｍＭ）とポリリン酸キナーゼ（０．０１以上、好
ましくは０．０４〜１．０ユニット／ｍｌ）をさらに添
加し、上記と同じ反応条件で反応させることで、生成し
たＵＤＰを再生しながらＣＴＰを効率的に合成すること
ができる。このようにして得られたＣＴＰは、通常の単
離精製手段（イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロ
マトグラフィー、塩析など）により単離精製することが
できる。
【００１９】シチジン系化合物の合成は、上記ＣＴＰ合
成系にシチジン系化合物合成酵素と基質を添加し、反応
させることで目的とするシチジン系化合物を合成するこ
とができる。たとえば、シチジン系化合物としてＣＤＰ
−コリンの場合、トリス塩酸緩衝液などの適当な緩衝液
（ｐＨ５〜１０）中、ＵＴＰ（１〜５０ｍＭ）、ホスホ
コリン（１〜５０ｍＭ）、アミノ基供与体（１〜５０ｍ
Ｍ）、ＣＣＴ（０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましく
は０．１０〜５．０ユニット／ｍｌ）、およびＰｙｒＧ
（０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０４〜
１．０ユニット／ｍｌ）添加し、２０〜４０℃以下、好
ましくは３０〜３７℃で１０〜６０時間程度、必要によ
り撹拌しながら反応させることにより実施できる。ま
た、上記合成系にポリリン酸（無機リン酸として５０〜
１００ｍＭ）とポリリン酸キナーゼ（０．０１以上、好
ましくは０．０４〜１．０ユニット／ｍｌ）をさらに添
加し、上記と同じ反応条件で反応させることで、生成し
たＵＤＰを再生しながらＣＤＰ−コリンを効率的に合成
することができる。
成系にシチジン系化合物合成酵素と基質を添加し、反応
させることで目的とするシチジン系化合物を合成するこ
とができる。たとえば、シチジン系化合物としてＣＤＰ
−コリンの場合、トリス塩酸緩衝液などの適当な緩衝液
（ｐＨ５〜１０）中、ＵＴＰ（１〜５０ｍＭ）、ホスホ
コリン（１〜５０ｍＭ）、アミノ基供与体（１〜５０ｍ
Ｍ）、ＣＣＴ（０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましく
は０．１０〜５．０ユニット／ｍｌ）、およびＰｙｒＧ
（０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０４〜
１．０ユニット／ｍｌ）添加し、２０〜４０℃以下、好
ましくは３０〜３７℃で１０〜６０時間程度、必要によ
り撹拌しながら反応させることにより実施できる。ま
た、上記合成系にポリリン酸（無機リン酸として５０〜
１００ｍＭ）とポリリン酸キナーゼ（０．０１以上、好
ましくは０．０４〜１．０ユニット／ｍｌ）をさらに添
加し、上記と同じ反応条件で反応させることで、生成し
たＵＤＰを再生しながらＣＤＰ−コリンを効率的に合成
することができる。
【００２０】また、シチジン系化合物としてＣＭＰ−Ｎ
ｅｕＡｃの場合、トリス塩酸緩衝液などの適当な緩衝液
（ｐＨ５〜１０）中、ＵＴＰ（１〜５０ｍＭ）、Ｎｅｕ
Ａｃ（１〜５０ｍＭ）、アミノ基供与体（１〜５０ｍ
Ｍ）、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ（０．０１ユニ
ット／ｍｌ以上、好ましくは０．０４〜２．０ユニット
／ｍｌ）、およびＰｙｒＧ（０．０１ユニット／ｍｌ以
上、好ましくは０．０４〜１．０ユニット／ｍｌ）添加
し、２０〜４０℃以下、好ましくは３０〜３７℃で１０
〜６０時間程度、必要により撹拌しながら反応させるこ
とにより実施できる。また、上記合成系にポリリン酸
（無機リン酸として５０〜１００ｍＭ）とポリリン酸キ
ナーゼ（０．０１以上、好ましくは０．０４〜１．０ユ
ニット／ｍｌ）をさらに添加し、上記と同じ反応条件で
反応させることで、生成したＵＤＰを再生しながらＣＤ
Ｐ−ＮｅｕＡｃを効率的に合成することができる。
ｅｕＡｃの場合、トリス塩酸緩衝液などの適当な緩衝液
（ｐＨ５〜１０）中、ＵＴＰ（１〜５０ｍＭ）、Ｎｅｕ
Ａｃ（１〜５０ｍＭ）、アミノ基供与体（１〜５０ｍ
Ｍ）、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ（０．０１ユニ
ット／ｍｌ以上、好ましくは０．０４〜２．０ユニット
／ｍｌ）、およびＰｙｒＧ（０．０１ユニット／ｍｌ以
上、好ましくは０．０４〜１．０ユニット／ｍｌ）添加
し、２０〜４０℃以下、好ましくは３０〜３７℃で１０
〜６０時間程度、必要により撹拌しながら反応させるこ
とにより実施できる。また、上記合成系にポリリン酸
（無機リン酸として５０〜１００ｍＭ）とポリリン酸キ
ナーゼ（０．０１以上、好ましくは０．０４〜１．０ユ
ニット／ｍｌ）をさらに添加し、上記と同じ反応条件で
反応させることで、生成したＵＤＰを再生しながらＣＤ
Ｐ−ＮｅｕＡｃを効率的に合成することができる。
【００２１】このようにして得られたＣＤＰ−コリン、
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃなどのシチジン系化合物は、通常の
単離精製手段（イオン交換クロマトグラフィー、吸着ク
ロマトグラフィー、塩析など）により単離精製すること
ができる。
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃなどのシチジン系化合物は、通常の
単離精製手段（イオン交換クロマトグラフィー、吸着ク
ロマトグラフィー、塩析など）により単離精製すること
ができる。
【００２２】
【発明の効果】本発明により、ＡＴＰを使用することな
く、安価かつ効率的なＣＴＰの製造が可能になり、ＣＤ
Ｐ−コリン、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃなどシチジン系化合物
の実用的な製造が可能となった。
く、安価かつ効率的なＣＴＰの製造が可能になり、ＣＤ
Ｐ−コリン、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃなどシチジン系化合物
の実用的な製造が可能となった。
【００２３】
【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。また、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素によ
る切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに
大腸菌の形質転換法は全て「Molecular cloning」（Man
iatisら編、Cold spring Harbor Laboratory, ColdSpri
ng Harbor, New York (1982)）に従って行った。また、
制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼは宝酒造（株）より入手した。
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。また、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素によ
る切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに
大腸菌の形質転換法は全て「Molecular cloning」（Man
iatisら編、Cold spring Harbor Laboratory, ColdSpri
ng Harbor, New York (1982)）に従って行った。また、
制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼは宝酒造（株）より入手した。
【００２４】実施例１ （１）大腸菌ＰｙｒＧ遺伝子のクローニング 大腸菌ＪＭ１０９の染色体ＤＮＡをテンペレートとし
て、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従っ
て合成し、ＰＣＲ法により大腸菌ＰｙｒＧ遺伝子を増幅
した。
て、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従っ
て合成し、ＰＣＲ法により大腸菌ＰｙｒＧ遺伝子を増幅
した。
【００２５】 プライマー（Ａ）：5'-TCGTCTTTTCAACCTAACTTCTCA-3' プライマー（Ｂ）：5'-CCGATGATTTTTACGATTTTGGAC-3'
【００２６】ＰＣＲによるＰｙｒＧ遺伝子の増幅は、反
応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシ
ウム、０．００１％ ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．５μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々 ０．
２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５
ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃ
ｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニー
リング（３７℃、２分）、ポリメライゼーション（７２
℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行っ
た。
応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシ
ウム、０．００１％ ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．５μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々 ０．
２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５
ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃ
ｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニー
リング（３７℃、２分）、ポリメライゼーション（７２
℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行っ
た。
【００２７】遺伝子増幅後、反応液をフェノール/クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．８
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素
ＳｍａＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造
（株）より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０５菌を形質転換
し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミ
ドｐＵＣ−ＰｙｒＧを単離した。ｐＵＣ−ＰｙｒＧは、
ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーター下流のＳｍａＩ切断部
位に大腸菌ＰｙｒＧ遺伝子が挿入されたものである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．８
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素
ＳｍａＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造
（株）より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０５菌を形質転換
し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミ
ドｐＵＣ−ＰｙｒＧを単離した。ｐＵＣ−ＰｙｒＧは、
ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーター下流のＳｍａＩ切断部
位に大腸菌ＰｙｒＧ遺伝子が挿入されたものである。
【００２８】（２）ＰｙｒＧの調製 プラスミドｐＵＣ−ｐｙｒＧを保持する大腸菌ＪＭ１０
５菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２
ｘＹＴ培地 ３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養
した。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終
濃度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに
３７℃で２０時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠
心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収
し、３０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ
７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した後、超音
波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，
０００ｘｇ、１０分）により菌体残さを除去した。この
ように得られた上清画分を酵素液とした。酵素液におけ
るＰｙｒＧ活性は４．０ユニット／ｍｌであった。
５菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２
ｘＹＴ培地 ３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養
した。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終
濃度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに
３７℃で２０時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠
心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収
し、３０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ
７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した後、超音
波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，
０００ｘｇ、１０分）により菌体残さを除去した。この
ように得られた上清画分を酵素液とした。酵素液におけ
るＰｙｒＧ活性は４．０ユニット／ｍｌであった。
【００２９】なお、ＰｙｒＧ活性の測定と単位の算出は
次の方法で行った。すなわち５ｍＭＵＴＰ、５ｍＭ ホ
スホコリン、５ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、５０ｍＭ 硫安、１ユニット／ｍｌ ＣＣＴを含有す
る２００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素
標品を添加し、３７℃で反応を行い、１００℃で１分間
の熱処理により反応を停止させる。反応液中のＣＤＰ−
コリン量をＨＰＬＣ法により定量する。３７℃で１分間
に１μｍｏｌｅのＣＤＰ−コリンの生成する活性を１単
位（ユニット）とする。
次の方法で行った。すなわち５ｍＭＵＴＰ、５ｍＭ ホ
スホコリン、５ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、５０ｍＭ 硫安、１ユニット／ｍｌ ＣＣＴを含有す
る２００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素
標品を添加し、３７℃で反応を行い、１００℃で１分間
の熱処理により反応を停止させる。反応液中のＣＤＰ−
コリン量をＨＰＬＣ法により定量する。３７℃で１分間
に１μｍｏｌｅのＣＤＰ−コリンの生成する活性を１単
位（ユニット）とする。
【００３０】（３）ＣＣＴ遺伝子のクローニング 酵母 Saccharomyces cerevisiae DB746（ATCC 44773）
の染色体ＤＮＡを公知の方法「Methods in Yeast Genet
ics Laboratory Manual」(Cold spring HarborLaborato
ry, Cold spring Harbor, New York(1983) )で調製し
た。このＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種
類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法
により酵母ＣＣＴ遺伝子を増幅した。
の染色体ＤＮＡを公知の方法「Methods in Yeast Genet
ics Laboratory Manual」(Cold spring HarborLaborato
ry, Cold spring Harbor, New York(1983) )で調製し
た。このＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種
類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法
により酵母ＣＣＴ遺伝子を増幅した。
【００３１】 プライマー（Ｃ）：5'-TACCATGGCAAACCCAACAAGGGA-3' プライマー（Ｄ）：5'-TATCTAGAGGGGCTCAGTTCGCTGATT-
3'
3'
【００３２】ＰＣＲによるＣＣＴ遺伝子の増幅は、反応
液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ ト
リス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、０．００１％ ゼラチン、テンペレートＤＮＡ ０．
５μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）（Ｄ）各々０．２μ
Ｍ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユ
ニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙ
ｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリ
ング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７
２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すことによ
り行った。
液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ ト
リス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、０．００１％ ゼラチン、テンペレートＤＮＡ ０．
５μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）（Ｄ）各々０．２μ
Ｍ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユ
ニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙ
ｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリ
ング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７
２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すことによ
り行った。
【００３３】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．８
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素
ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで切断し、同じく制限酵素Ｎｃｏ
Ｉ及びＸｂａＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ
（Pharmacia Biotech.社より入手）とＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１
０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転
換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＣＣＴを単離した。ｐＴ
ｒｃ−ＣＣＴは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター
下流のＮｃｏＩ−ＸｂａＨＩ切断部位に酵母ＣＣＴ遺伝
子を含有するＮｃｏＩ−ＸｂａＩＤＮＡ断片が挿入され
たものである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．８
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素
ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで切断し、同じく制限酵素Ｎｃｏ
Ｉ及びＸｂａＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ
（Pharmacia Biotech.社より入手）とＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１
０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転
換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＣＣＴを単離した。ｐＴ
ｒｃ−ＣＣＴは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター
下流のＮｃｏＩ−ＸｂａＨＩ切断部位に酵母ＣＣＴ遺伝
子を含有するＮｃｏＩ−ＸｂａＩＤＮＡ断片が挿入され
たものである。
【００３４】（４）ＣＣＴの調製 プラスミドｐＴｒｃ−ＣＣＴを保持する大腸菌ＪＭ１０
９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２
ｘＹＴ培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養し
た。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃
度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３
７℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分
離（９，０００ｘｇ、１０分）により菌体を回収し、３
０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した後、超音波処
理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，００
０ｘｇ、１０分）により菌体残さを除去した。このよう
に得られた上清画分を酵素液とした。酵素液におけるＣ
ＣＴ活性は１８ユニット／ｍｌであった。
９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２
ｘＹＴ培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養し
た。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃
度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３
７℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分
離（９，０００ｘｇ、１０分）により菌体を回収し、３
０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した後、超音波処
理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，００
０ｘｇ、１０分）により菌体残さを除去した。このよう
に得られた上清画分を酵素液とした。酵素液におけるＣ
ＣＴ活性は１８ユニット／ｍｌであった。
【００３５】なお、ＣＣＴ活性の測定と単位の算出は次
の方法で行った。すなわち１０ｍＭＣＴＰ、１０ｍＭ
ホスホコリン、１０ｍＭ 塩化マグネシウムを含有する
２００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素
標品を添加し、３７℃で反応させる。反応終了後１００
℃で１分間の熱処理を行い、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）で反応液中のＣＤＰ−コリン量を分析す
る。３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＤＰ−コリンを
生成する活性を１単位（ユニット）とする。
の方法で行った。すなわち１０ｍＭＣＴＰ、１０ｍＭ
ホスホコリン、１０ｍＭ 塩化マグネシウムを含有する
２００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素
標品を添加し、３７℃で反応させる。反応終了後１００
℃で１分間の熱処理を行い、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）で反応液中のＣＤＰ−コリン量を分析す
る。３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＤＰ−コリンを
生成する活性を１単位（ユニット）とする。
【００３６】（５）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ遺
伝子（ｓｉａＢ）のクローニングHaemophilus influenz
ae （ATCC9795）の染色体ＤＮＡを斎藤・三浦の方法（B
iochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)）で調製し
た。このＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種
類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法
によりｓｉａＢ遺伝子を増幅した。
伝子（ｓｉａＢ）のクローニングHaemophilus influenz
ae （ATCC9795）の染色体ＤＮＡを斎藤・三浦の方法（B
iochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)）で調製し
た。このＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種
類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法
によりｓｉａＢ遺伝子を増幅した。
【００３７】 プライマー（Ｅ）：5'-TGCCATGGTGAAAATAATAATGACAAGAA-3' プライマー（Ｆ）：5'-AACTGCAGGTGCAGATCAAAAGTGCGGCC -3'
【００３８】ＰＣＲによるｓｉａＢ遺伝子の増幅は、反
応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネ
シウム、０．００１％ ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．５μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｅ）（Ｆ）各々０．
２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．
５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、ア
ニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーショ
ン（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことに
より行った。
応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネ
シウム、０．００１％ ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．５μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｅ）（Ｆ）各々０．
２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．
５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、ア
ニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーショ
ン（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことに
より行った。
【００３９】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、０．６
８ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵
素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素Ｎｃ
ｏＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ
（Pharmacia Biotech.社より入手）とＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１
０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転
換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｓｉａＢを単離した。ｐ
Ｔｒｃ−ｓｉａＢは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモー
ター下流のＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ切断部位にｓｉａＢ遺伝
子を含有するＮｃｏＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片が挿入され
たものである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、０．６
８ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵
素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素Ｎｃ
ｏＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ
（Pharmacia Biotech.社より入手）とＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１
０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転
換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｓｉａＢを単離した。ｐ
Ｔｒｃ−ｓｉａＢは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモー
ター下流のＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ切断部位にｓｉａＢ遺伝
子を含有するＮｃｏＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片が挿入され
たものである。
【００４０】（６）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの
調製 プラスミドｐＴｒｃ−ｓｉａＢを保持する大腸菌ＪＭ１
０９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
２ｘＹＴ培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養
した。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終
濃度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに
３７℃で６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心
分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、
３０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した後、超音波処
理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，００
０ｘｇ、１０分）により菌体残さを除去した。このよう
に得られた上清画分を酵素液とした。酵素液におけるｓ
ｉａＢ活性は３．４ユニット／ｍｌであった。
調製 プラスミドｐＴｒｃ−ｓｉａＢを保持する大腸菌ＪＭ１
０９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
２ｘＹＴ培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養
した。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終
濃度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに
３７℃で６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心
分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、
３０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した後、超音波処
理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，００
０ｘｇ、１０分）により菌体残さを除去した。このよう
に得られた上清画分を酵素液とした。酵素液におけるｓ
ｉａＢ活性は３．４ユニット／ｍｌであった。
【００４１】なお、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活
性の測定と単位の算出は次の方法で行った。すなわち、
５ｍＭ ＣＴＰ、５ｍＭ ＮｅｕＡｃ、２０ｍＭ 塩化
マグネシウム、０．２ｍＭ ディチオスレオトール（Ｄ
ＴＴ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５）に酵素標品を添加し、３７℃で保温することで反応
を行い、等量の７０％エタノールを添加して反応を停止
させる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用
いて反応液中のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを定量し、３７℃で
１分間に１μｍｏｌｅのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生成する
活性を１単位（ユニット）とする。
性の測定と単位の算出は次の方法で行った。すなわち、
５ｍＭ ＣＴＰ、５ｍＭ ＮｅｕＡｃ、２０ｍＭ 塩化
マグネシウム、０．２ｍＭ ディチオスレオトール（Ｄ
ＴＴ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５）に酵素標品を添加し、３７℃で保温することで反応
を行い、等量の７０％エタノールを添加して反応を停止
させる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用
いて反応液中のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを定量し、３７℃で
１分間に１μｍｏｌｅのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを生成する
活性を１単位（ユニット）とする。
【００４２】（７）大腸菌ポリリン酸キナーゼ遺伝子の
クローニング 大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（宝酒造（株）より入手）
の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochim. Biophy
s. Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡ
をテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマー
ＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌ポ
リリン酸キナーゼ（ｐｐｋ）遺伝子を増幅した。
クローニング 大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（宝酒造（株）より入手）
の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochim. Biophy
s. Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡ
をテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマー
ＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌ポ
リリン酸キナーゼ（ｐｐｋ）遺伝子を増幅した。
【００４３】 プライマー（Ｇ）：5'-TACCATGGGTCAGGAAAAGCTATA-3' プライマー（Ｈ）：5'-ATGGATCCTTATTCAGGTTGTTCGAGTGA-3'
【００４４】ＰＣＲによるｐｐｋ遺伝子の増幅は、反応
液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシ
ウム、０．００１％ ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｇ）（Ｈ）各々 ０．
２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．
５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、ア
ニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーショ
ン（７２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すこ
とにより行った。
液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシ
ウム、０．００１％ ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｇ）（Ｈ）各々 ０．
２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．
５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、ア
ニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーショ
ン（７２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すこ
とにより行った。
【００４５】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．０
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素
ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じく制限酵素Ｎｃ
ｏＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９
Ａ（Pharmacia Biotech.社より入手）とＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ
１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質
転換体よりプラスミド ｐＴｒｃ−ＰＰＫを単離した。
ｐＴｒｃ−ＰＰＫは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモー
ター下流のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に大腸菌ｐｐ
ｋ遺伝子を含有するＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片
が挿入されたものである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．０
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素
ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じく制限酵素Ｎｃ
ｏＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９
Ａ（Pharmacia Biotech.社より入手）とＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ
１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質
転換体よりプラスミド ｐＴｒｃ−ＰＰＫを単離した。
ｐＴｒｃ−ＰＰＫは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモー
ター下流のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に大腸菌ｐｐ
ｋ遺伝子を含有するＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片
が挿入されたものである。
【００４６】（８）大腸菌ポリリン酸キナーゼの調製 プラスミドｐＴｒｃ−ＰＰＫを保持する大腸菌ＪＭ１０
９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２
ｘＹＴ培地 ３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養
した。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終
濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０
℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離
（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、６０
ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、
５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％トライトン Ｘ−１００、
０．２ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）に懸濁した。３７℃で
１時間保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、
さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌
体残さを除去した。このように得られた上清画分を５ｍ
Ｍ 塩化マグネシウム及び１ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノールを含有する５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）に
対して透析を行い、粗酵素液とした。粗酵素液における
ポリリン酸キナーゼ比活性は、０．１９ユニット／ｍｇ
蛋白質であり、対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸
菌ＪＭ１０９菌）の比活性（０．０００１８ユニット／
ｍｇ蛋白質）の約１０００倍であった。次に粗酵素液を
ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（トーソー（株））を用い
て０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配にて分画し、ポリ
リン酸キナーゼ画分を得た。この画分をポリリン酸キナ
ーゼ酵素標品とした。なお、この酵素標品におけるポリ
リン酸キナーゼの比活性は、０．６ユニット／ｍｇ蛋白
質であった。
９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２
ｘＹＴ培地 ３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養
した。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終
濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０
℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離
（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、６０
ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、
５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％トライトン Ｘ−１００、
０．２ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）に懸濁した。３７℃で
１時間保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、
さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌
体残さを除去した。このように得られた上清画分を５ｍ
Ｍ 塩化マグネシウム及び１ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノールを含有する５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）に
対して透析を行い、粗酵素液とした。粗酵素液における
ポリリン酸キナーゼ比活性は、０．１９ユニット／ｍｇ
蛋白質であり、対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸
菌ＪＭ１０９菌）の比活性（０．０００１８ユニット／
ｍｇ蛋白質）の約１０００倍であった。次に粗酵素液を
ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（トーソー（株））を用い
て０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配にて分画し、ポリ
リン酸キナーゼ画分を得た。この画分をポリリン酸キナ
ーゼ酵素標品とした。なお、この酵素標品におけるポリ
リン酸キナーゼの比活性は、０．６ユニット／ｍｇ蛋白
質であった。
【００４７】なお、ポリリン酸キナーゼ活性の測定と算
出は次の方法で行った。すなわち、５ｍＭ塩化マグネシ
ウム、１００ｍＭ硫安、５ｍＭ ＡＤＰ、及びポリリン
酸（無機リン酸として１００ｍＭ）を含有する２５ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加し
て、３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１
分間の熱処理により反応を停止させる。高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＴＰを
定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＡＴＰを生成
する活性を１単位（ユニット）とする。
出は次の方法で行った。すなわち、５ｍＭ塩化マグネシ
ウム、１００ｍＭ硫安、５ｍＭ ＡＤＰ、及びポリリン
酸（無機リン酸として１００ｍＭ）を含有する２５ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加し
て、３７℃で保温することで反応を行い、１００℃、１
分間の熱処理により反応を停止させる。高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＡＴＰを
定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＡＴＰを生成
する活性を１単位（ユニット）とする。
【００４８】（９）ＣＤＰ−コリンの合成Ｉ ２０ｍＭ ＵＴＰ、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、２０
ｍＭ ホスホコリン、２０ｍＭ グルタミン、２．０ユ
ニット／ｍｌ ＣＣＴ、０．６ユニット／ｍｌＰｙｒＧ
を含有する１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）
を３７℃で４０時間保温した。反応開始２０時間後に
７．４ｍＭのＣＤＰ−コリンが、反応４０時間後に７．
６ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成された。
ｍＭ ホスホコリン、２０ｍＭ グルタミン、２．０ユ
ニット／ｍｌ ＣＣＴ、０．６ユニット／ｍｌＰｙｒＧ
を含有する１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）
を３７℃で４０時間保温した。反応開始２０時間後に
７．４ｍＭのＣＤＰ−コリンが、反応４０時間後に７．
６ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成された。
【００４９】（１０）ＣＤＰ−コリンの合成ＩＩ ２０ｍＭ ＵＴＰ、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、２０
ｍＭ 塩化コリン、２０ｍＭ グルタミン、２．０ユニ
ット／ｍｌ ＣＣＴ、０．６ユニット／ｍｌＰｙｒＧ、
ポリリン酸（無機リン酸として７５ｍＭ）及びＰＰＫ
（０．１ユニット／ｍｌ）を含有する１００ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を３７℃で４０時間保温し
た。反応開始２０時間後に１１ｍＭのＣＤＰ−コリン
が、反応４０時間後に１４．８ｍＭのＣＤＰ―コリンが
合成された。
ｍＭ 塩化コリン、２０ｍＭ グルタミン、２．０ユニ
ット／ｍｌ ＣＣＴ、０．６ユニット／ｍｌＰｙｒＧ、
ポリリン酸（無機リン酸として７５ｍＭ）及びＰＰＫ
（０．１ユニット／ｍｌ）を含有する１００ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を３７℃で４０時間保温し
た。反応開始２０時間後に１１ｍＭのＣＤＰ−コリン
が、反応４０時間後に１４．８ｍＭのＣＤＰ―コリンが
合成された。
【００５０】（１１）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成Ｉ ２０ｍＭ ＵＴＰ、５０ｍＭ 塩化マグネシウム、２０
ｍＭ ＮｅｕＡｃ、２０ｍＭ グルタミン、２．０ユニ
ット／ｍｌ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ、０．２
５ユニット／ｍｌ ＰｙｒＧを含有する２５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）を３７℃で２４時間保温し
た。反応７開始時間後に１．２５ｍＭのＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃが、反応２４時間後に１．７８ｍＭのＣＭＰ−Ｎｅ
ｕＡｃが合成された。
ｍＭ ＮｅｕＡｃ、２０ｍＭ グルタミン、２．０ユニ
ット／ｍｌ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ、０．２
５ユニット／ｍｌ ＰｙｒＧを含有する２５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）を３７℃で２４時間保温し
た。反応７開始時間後に１．２５ｍＭのＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃが、反応２４時間後に１．７８ｍＭのＣＭＰ−Ｎｅ
ｕＡｃが合成された。
【００５１】（１２）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成ＩＩ ２０ｍＭ ＵＴＰ、５０ｍＭ 塩化マグネシウム、２０
ｍＭ ＮｅｕＡｃ、２０ｍＭ グルタミン、２．０ユニ
ット／ｍｌ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ、０．２
５ユニット／ｍｌ ＰｙｒＧ、ポリリン酸（無機リン酸
として７５ｍＭ）及びＰＰＫ（０．４ユニット／ｍｌ）
を含有する２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）
を３７℃で２４時間保温した。反応７開始時間後に２．
９２ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃが、反応２４時間後に
４．２２ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃが合成された。
ｍＭ ＮｅｕＡｃ、２０ｍＭ グルタミン、２．０ユニ
ット／ｍｌ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ、０．２
５ユニット／ｍｌ ＰｙｒＧ、ポリリン酸（無機リン酸
として７５ｍＭ）及びＰＰＫ（０．４ユニット／ｍｌ）
を含有する２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）
を３７℃で２４時間保温した。反応７開始時間後に２．
９２ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃが、反応２４時間後に
４．２２ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃが合成された。
【００５２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> YAMASA CORPORATION <120> Process for the enzymatically preparation of Cytidine 5'-triphosphate and application of the same <130> YP99-00002 <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of PyrG gene <400> 1 tcgtcttttc aacctaactt ctca 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of PyrG gene <400> 2 ccgatgattt ttacgatttt ggac 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of CCT gene <400> 3 taccatggca aacccaacaa ggga 24 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of CCT gene <400> 4 tatctagagg ggctcagttc gctgatt 27 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of siaB gene <400> 5 tgccatggtg aaaataataa tgacaagaa 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of siaB gene <400> 6 aactgcaggt gcagatcaaa agtgcggcc 29 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of PPK gene <400> 7 taccatgggt caggaaaagc tata 24 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of PPK gene <400> 8 atggatcctt attcaggttg ttcgagtga 29
Claims (12)
- 【請求項１】 シチジン５’−トリリン酸シンセターゼ
とアミノ基供与体を用いてウリジン５’−トリリン酸か
らシチジン５’−トリリン酸を製造する方法において、
下記式（Ｉ）で表わされるように、アデノシン５’−ト
リリン酸の供給なしに該酵素反応を行うことを特徴とす
るシチジン５’−トリリン酸の製造法。 【式１】 （式中、ＰｙｒＧはシチジン５’−トリリン酸シンセタ
ーゼ、ＣＴＰはシチジン５’−トリリン酸、ＵＴＰはウ
リジン５’−トリリン酸、ＵＤＰはウリジン５’−ジリ
ン酸を示す。） - 【請求項２】 シチジン５’−トリリン酸シンセターゼ
とアミノ基供与体を用いてウリジン５’−トリリン酸か
らシチジン５’−トリリン酸を製造する方法において、
下記式（ＩＩ）で表わされるように、アデノシン５’−
トリリン酸の供給なしに該酵素反応を行わせ、かつ反応
により生成したウリジン５’−ジリン酸をポリリン酸キ
ナーゼによりウリジン５’−トリリン酸に再生しながら
当該酵素反応を行わせることを特徴とするシチジン５’
−トリリン酸の製造法。 【式２】 （式中、ＰｙｒＧはシチジン５’−トリリン酸シンセタ
ーゼ、ＰＰＫはポリリン酸キナーゼ、ＣＴＰはシチジン
５’−トリリン酸、ＵＴＰはウリジン５’−トリリン
酸、ＵＤＰはウリジン５’−ジリン酸を示す。） - 【請求項３】 酵素反応によりシチジン５’−トリリン
酸からシチジン系化合物を製造する方法において、下記
式（ＩＩＩ）で表わされるように、アデノシン５’−ト
リリン酸の供給なしにシチジン５’−トリリン酸シンセ
ターゼとアミノ基供与体を用いて反応に使用するシチジ
ン５’−トリリン酸をウリジン５’−トリリン酸から調
製することを特徴とするシチジン系化合物の製造法。 【式３】 （式中、ＰｙｒＧはシチジン５’−トリリン酸シンセタ
ーゼ、ＣＴＰはシチジン５’−トリリン酸、ＵＴＰはウ
リジン５’−トリリン酸、ＵＤＰはウリジン５’−ジリ
ン酸を示す。） - 【請求項４】 シチジン系化合物がシチジン５’−ジリ
ン酸コリン、酵素がコリンホスフェートシチジルトラン
スフェラーゼ、基質がホスホコリンである、請求項３記
載の方法。 - 【請求項５】 シチジン系化合物がシチジン５’−モノ
リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸、酵素がシチジン
５’−モノリン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセタ
ーゼ、基質がＮ−アセチルノイラミン酸である、請求項
３記載の方法。 - 【請求項６】 酵素反応によりシチジン５’−トリリン
酸からシチジン系化合物を製造する方法において、下記
式（ＩＶ）で表わされるように、アデノシン５’−トリ
リン酸の供給なしにシチジン５’−トリリン酸シンテタ
ーゼとアミノ基供与体を用いて反応に使用するシチジン
５’−トリリン酸をウリジン５’−トリリン酸から調製
し、かつ反応により生成したウリジン５’−ジリン酸を
ポリリン酸キナーゼによりウリジン５’−トリリン酸に
再生しながら当該酵素反応を行わせることを特徴とする
シチジン系化合物の製造法。 【式４】 （式中、ＰｙｒＧはシチジン５’−トリリン酸シンセタ
ーゼ、ＰＰＫはポリリン酸キナーゼ、ＣＴＰはシチジン
５’−トリリン酸、ＵＴＰはウリジン５’−トリリン
酸、ＵＤＰはウリジン５’−ジリン酸を示す。） - 【請求項７】 シチジン系化合物がシチジン５’−ジリ
ン酸コリン、酵素がコリンホスフェートシチジルトラン
スフェラーゼ、基質がホスホコリンである、請求項６記
載の方法。 - 【請求項８】 シチジン系化合物がシチジン５’−モノ
リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸、酵素がシチジン
５’−モノリン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセタ
ーゼ、基質がＮ−アセチルノイラミン酸である、請求項
６記載の方法。 - 【請求項９】 シチジン５’−トリリン酸シンセター
ゼ、アミノ基供与体およびウリジン５’−トリリン酸か
ら構成され、アデノシン５’−トリリン酸を含まないシ
チジン５’−トリリン酸合成系。 - 【請求項１０】 シチジン５’−トリリン酸シンセター
ゼ、ポリリン酸キナーゼ、アミノ基供与体、ウリジン
５’−トリリン酸およびポリリン酸から構成され、アデ
ノシン５’−トリリン酸を含まないシチジン５’−トリ
リン酸合成系。 - 【請求項１１】 シチジン５’−トリリン酸シンセター
ゼ、アミノ基供与体およびウリジン５’−トリリン酸か
ら構成され、アデノシン５’−トリリン酸を含まないシ
チジン５’−トリリン酸の合成系とシチジン系化合物合
成のための酵素と基質を組み合わせたシチジン系化合物
合成系。 - 【請求項１２】 シチジン５’−トリリン酸シンセター
ゼ、ポリリン酸キナーゼ、アミノ基供与体、ウリジン
５’−トリリン酸およびポリリン酸から構成され、アデ
ノシン５’−トリリン酸を含まないシチジン５’−トリ
リン酸の合成系とシチジン系化合物合成のための酵素と
基質を組み合わせたシチジン系化合物合成系。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11024201A JP2000217593A (ja) | 1999-02-01 | 1999-02-01 | シチジン５’−トリリン酸の酵素的製造法およびその応用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11024201A JP2000217593A (ja) | 1999-02-01 | 1999-02-01 | シチジン５’−トリリン酸の酵素的製造法およびその応用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000217593A true JP2000217593A (ja) | 2000-08-08 |
Family
ID=12131718
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11024201A Pending JP2000217593A (ja) | 1999-02-01 | 1999-02-01 | シチジン５’−トリリン酸の酵素的製造法およびその応用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000217593A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008005794A (ja) * | 2006-06-30 | 2008-01-17 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | シチジン‐５´‐一リン酸‐ｎ‐アセチルノイラミン酸およびｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法 |
-
1999
- 1999-02-01 JP JP11024201A patent/JP2000217593A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008005794A (ja) * | 2006-06-30 | 2008-01-17 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | シチジン‐５´‐一リン酸‐ｎ‐アセチルノイラミン酸およびｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法 |
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