JPWO2004009830A1 - Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ピルビン酸およびシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を含有する反応系に、酵母菌体、Ｎ−アセチルグルコサミン−６リン酸２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＮｅｕＡｃリアーゼ）、およびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を添加し、反応させることを特徴とする、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法に関するものである。また、本発明は、ＧｌｃＮＡｃおよびＣＭＰを含有する反応系に、酵母菌体、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ、ＮｅｕＡｃシンセターゼおよびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを添加し、反応させることを特徴とする、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法に関するものである。

Description

本発明は、糖鎖合成の重要な原料であるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の改良された製造法に関するものである。

近年、糖鎖に関する構造及び機能に関する研究が急速に進み、生理活性を有するオリゴ糖、糖脂質、糖蛋白質などの医薬品または機能性素材としての用途開発が注目を集めている。中でも、末端にＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を含むシアル酸含有糖鎖は、細胞接着やウィルスの感染の際の受容体となる等の重要な機能を有する糖鎖である。
シアル酸含有糖鎖は、一般にシアル酸転移酵素の触媒作用により合成される。シアル酸転移酵素はＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を糖供与体として、糖鎖などの受容体にシアル酸を転移する酵素である。
しかしながら、糖供与体として用いるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃは、非常に高価で、かつ量的にも試薬レベルの僅かな量でしか供給され得ないのが現状である。
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法としては、シチジン５’−トリリン酸（ＣＴＰ）とＮｅｕＡｃを基質としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの触媒により合成する方法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４４，５９−６７（１９９５））が知られているが、その原料となるＣＴＰ及びＮｅｕＡｃは高価であるため、それらを直接原料として合成されたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃも高価な試薬とならざるを得ない。
最近、小泉らにより、オロチン酸からウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）への変換を行うＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ菌体、ＵＴＰからＣＴＰへの変換反応を触媒するＣＴＰ合成酵素を生産する組換え大腸菌およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素を生産する組換え大腸菌を組み合わせて、オロチン酸とＮｅｕＡｃを原料としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成する方法が開発された（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，２５７−２６１，（２０００））。該方法は、高価なＣＴＰを使用しない方法ではあるが、複数種の菌体を調製しなければならないなど工程が煩雑であるとともに、それを実施するための大型の設備を準備しなければならず、また依然として高価なＮｅｕＡｃを原料としていることからも実用的な方法とは言い難かった。
一方、ＮｅｕＡｃの製造法に関しては、シアル酸の多量体であるコロミン酸を微生物から回収し、これを化学分解し回収する方法が知られているが、最近になって酵素を利用した方法が開発されている。
酵素を利用した方法としては、（１）ＮｅｕＡｃリアーゼまたはＮｅｕＡｃシンセターゼを用いて、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）から製造する方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０，６４８１（１９８８）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０，７１５９（１９８８）、特開平１０−４９６１号）、（２）アルカリ条件下で、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）をＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）に変換させ、これにＮｅｕＡｃリアーゼまたはＮｅｕＡｃシンセターゼを作用させてＮｅｕＡｃを製造する方法（特開平５−２１１８８４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ．２（１９９９）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２０（１９９７））、（３）ＧｌｃＮＡｃからＭａｎＮＡｃへの変換を触媒するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）２−エピメラーゼとＮｅｕＡｃリアーゼまたはＮｅｕＡｃシンセターゼを用いて、ＧｌｃＮＡｃから製造する方法（ＷＯ９５／２６３９９、特開平３−１８０１９０号、特開２００１−１３６９８２号）が報告されている。
しかしながら、（１）の方法は原料であるＭａｎＮＡｃが高価であり、（２）の方法は、安価なＧｌｃＮＡｃを原料とする方法ではあるが、ＧｌｃＮＡｃとＭａｎＮＡｃの混合物からＭａｎＮＡｃを精製する工程が煩雑であるという問題があった。また、下記に示すように、（３）の方法で用いるＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼはＡＴＰが必要であるため、高価なＡＴＰを添加するか、あるいは微生物を用いてＡＴＰの前駆体であるアデニンからＡＴＰを生成させる必要があり、この方法も満足いく方法とはいい難かった。
＜（３）の方法＞

本発明者らは、ＧｌｃＮＡｃを基質とした大腸菌の生体内酵素によるＮｅｕＡｃ合成を検討したところ、ＮｅｕＡｃはほとんど合成されなかったが、ＧｌｃＮＡｃがＧｌｃＮＡｃ ６−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ）に変換されたことから、下に示す経路によるＧｌｃＮＡｃからのＮｅｕＡｃ合成系の構築を試みた。
その結果、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．９）およびＮｅｕＡｃリアーゼまたはＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を増強させるとＮｅｕＡｃを高収率で生成できること、また該合成系には高価なＡＴＰを必要としないことを見出した。

次に、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成反応を行うためのＣＴＰ合成系について、安価なＣＭＰを原料としての微生物によるＣＴＰへの変換系を上記ＮｅｕＡｃ合成系と組み合わせるべく、種々の微生物を用いて検討を行った。すると、大腸菌等の酵母以外の微生物を用いたときにはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃがわずかしか合成されなかったのに対して、酵母菌体を用いると高収率でＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成できることを見出した。特に、ＮｅｕＡｃシンセターゼ反応に必要なホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）は、酵母菌体内のものを利用することができ、反応系に新たに添加する必要がないという新たなメリットも確認し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ピルビン酸およびシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を含有する反応系に、酵母菌体、Ｎ−アセチルグルコサミン−６リン酸２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＮｅｕＡｃリアーゼ）、およびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を添加し、反応させることを特徴とする、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法に関するものである。
また、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を含有する反応系に、酵母菌体、Ｎ−アセチルグルコサミン−６リン酸２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＮｅｕＡｃシンセターゼ）およびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を添加し、反応させることを特徴とする、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法に関するものである。

本発明のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成反応経路を模式的に示すと、以下の（Ａ）ＮｅｕＡｃリアーゼを用いた方法と（Ｂ）ＮｅｕＡｃシンセターゼを用いた方法である。なお、（Ｂ）の反応系に必須のホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）は、培地中のグルコースから酵母並びに大腸菌の生体（代謝）反応により合成、供給されるので、反応系にホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を添加する必要はない。
（Ａ）ＮｅｕＡｃリアーゼを用いた方法

（Ｂ）ＮｅｕＡｃシンセターゼを用いた方法

上記模式図（Ａ）及び（Ｂ）における記号は以下のことを意味する。
▲１▼：ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ
▲２▼：ＮｅｕＡｃリアーゼ
▲３▼：ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ
▲４▼：ＮｅｕＡｃシンセターゼ
（１）酵素等の調製
上記（Ａ）及び（Ｂ）の反応系に添加するＮ−アセチルグルコサミン−６リン酸２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）とは、上記▲１▼のＧｌｃＮＡｃ ６−リン酸からＭａｎＮＡｃ ６−リン酸への変換反応を触媒する活性を有するものを意味し、上記（Ａ）の反応系に添加するＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＮｅｕＡｃリアーゼ）とは、上記▲２▼のＭａｎＮＡｃとピルビン酸を基質としてＮｅｕＡｃを合成する反応を触媒する活性を有するものを意味し、上記（Ｂ）の反応系に添加するＮ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＮｅｕＡｃシンセターゼ）とは、上記▲４▼のＭａＮＡｃとホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を基質としてＮｅｕＡｃを合成する反応を触媒する活性を有するものを意味し、上記（Ａ）及び（Ｂ）の反応系に添加するＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）とは、上記▲３▼のＮｅｕＡｃとＣＴＰを基質としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成する反応を触媒する活性を有するものを意味する。
これらの酵素活性を有するものとしては、当該活性を有する細胞（形質転換体を含む）またはその処理物を例示でき、調製の簡便性などの点から、微生物由来のものを使用するのが好都合である。微生物由来のＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼは公知の酵素であり、常法により調製することができる。
また、当該酵素活性を増強させるための手段として、該酵素遺伝子群（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８１，４７−５４，１９９９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８１，４５２６−４５３２，１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１３，８８４３−８８５２，１９８５、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５０，２１５５−２１５８，１９８６、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７５，１６１−１６６，１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１５３７３−１５３８０，１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１４７６９−１４７７４，１９８９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，３１２−３１９，１９９５、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５，１１２０−１１３４，２０００）をクローン化し、菌体内でこれを大量発現させた微生物を用いる、いわゆる組換えＤＮＡ手法を用いるのが好適である。
また、本発明においては、２つ以上の遺伝子を共発現させて得られる菌体またはその処理物を用いることもでき、特に、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼとＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼのそれぞれの酵素活性を増強させた形質転換体、またはＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼとＮ−アセチルノイラミン酸シンセターゼのそれぞれの酵素活性を増強させた形質転換体の使用が好適であるが、これに限定されない。
遺伝子のクローニング、クローン化したＤＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製、発現ベクターを用いた目的とする酵素活性を有する酵素タンパク質の調製などは、分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、具体的には、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｍａｎｉａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２））に記載の方法に従って行うことができる。
たとえば、報告されている塩基配列をもとにプローブを合成し、微生物の染色体ＤＮＡより目的とする酵素活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片をクローニングずればよい。クローン化に用いる宿主は特に限定されないが、操作性及び簡便性から大腸菌とするのが望ましい。
クローン化した遺伝子の高発現系を構築するためには、たとえばマキザムーギルバートの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０））もしくはダイデオキシチェインターミネーター法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，２０（１９８３））などを応用してクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を解析して該遺伝子のコーディング領域を特定し、宿主微生物に応じて該遺伝子が菌体中で発現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベクターを作製する。
ベクターとしては、種々のプラスミドベクター、ファージベクターなどが使用可能であるが、大腸菌菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高いプラスミドベクターを使用するのが望ましい。具体的には、ｐＢＲ３２２（Ｇｅｎｅ，２，９５（１９７５））、ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９（Ｇｅｎｅ、３３，１０３（１９８５））などが挙げられる。
作製した組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換する。宿主となる大腸菌としては、例えば組換えＤＮＡ実験に使用されるＫ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌（Ｇｅｎｅ，３３，１０３−１１９（１９８５））などが使用可能である。ピルビン酸のＮｅｕＡｃ合成以外での代謝を減らすため、ピルビン酸代謝に関するｌｉｐ遺伝子変異などが導入された大腸菌（例えばＷ１４８５ｌｉｐ２（ＡＴＣＣ２５６４５））を宿主として使用することもできる。
大腸菌を形質転換する方法はすでに多くの方法が報告されており、低温下、塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））などにより大腸菌を形質転換することができる。
得られた形質転換体は、当該微生物が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化した目的とする酵素活性を有するタンパク質の発現を誘導して菌体内に当該酵素タンパク質が大量に蓄積するまで培養を行う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従って行えばよい。例えば、培地としてブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、３０〜５０℃の培養温度で１０〜５０時間程度必要により通気攪拌しながら培養することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。
目的の酵素活性を有する菌体としては、上記の方法で得られる培養液から遠心分離、膜分離などの固液分離手段で回収したものを例示することができる。また、回収した菌体を、機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる処理物、もしくは該菌体処理物から目的の酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素も菌体処理物として利用することができる。
次にＣＭＰからＣＴＰへの変換に使用する酵母としては、市販のパン酵母、あるいはワイン酵母でよく、菌体製造の過程が省略できる点で極めて有利である。また、酵母生菌体、酵母乾燥菌体いずれの形態も利用可能であるが、反応収率、取扱いの容易性などの点からは、乾燥酵母菌体を用いるのが好ましい。
（２）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成反応に使用するＧｌｃＮＡｃ、ピルビン酸およびＣＭＰは市販されており、この市販品を使用することができる。使用濃度としては、例えばそれぞれ１〜５０００ｍＭ、好ましくは１０〜１０００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
（ＮｅｕＡｃリアーゼを用いた方法）
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成反応は、ＧｌｃＮＡｃ、ＣＭＰおよびピルビン酸を含有する反応系に、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ、ＮｅｕＡｃリアーゼ、およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを反応液１ｍＬ当たりそれぞれ０．２ｍｇ以上、好ましくは２〜１００ｍｇ、乾燥酵母を１〜２０％（ｗ／ｖ）添加し、５０℃以下、好ましくは１５〜４０℃で１〜１５０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
また、上記反応においては、ＧｌｃＮＡｃおよびピルビン酸を含有する反応系に、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼおよびＮｅｕＡｃリアーゼを添加して、５０℃以下、好ましくは１５〜４０℃で１〜５０時間程度反応させてＮｅｕＡｃを合成し、次いでＣＭＰ、酵母菌体およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを添加し、５〜５０時間程度反応させてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成する２段階の反応を行うことでＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成収率を向上させることができる。なお、ＣＭＰはあらかじめＮｅｕＡｃ合成時に反応系に添加しておいてもかまわない。
（ＮｅｕＡｃシンセターゼを用いた方法）
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成反応は、ＧｌｃＮＡｃ及びＣＭＰを含有する反応系に、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ、ＮｅｕＡｃシンセターゼ、およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを反応液１ｍＬ当たりそれぞれ０．２ｍｇ以上、好ましくは２〜１００ｍｇ、乾燥酵母を１〜２０％（ｗ／ｖ）添加し、５０℃以下、好ましくは１５〜４０℃で１〜１５０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
上記のいずれのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成系においても、必要に応じて無機リン酸、マグネシウムおよびエネルギー源を添加するのが好ましい。
無機リン酸としては、リン酸カリウムなどをそのまま使用することもできるが、好ましくはリン酸緩衝液の形態で使用するのが好ましい。使用濃度は、たとえば１〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜４００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。また、リン酸緩衝液の形式で使用する場合、緩衝液のｐＨは５〜１０の範囲から適宜設定すればよい。
マグネシウムとしては、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の無機酸のマグネシウム塩、クエン酸マグネシウム等の有機酸のマグネシウム塩を使用することができ、その使用濃度としては１〜１０００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
エネルギー源としては、グルコース、フラクトース、ショ糖などの糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸を使用することができ、その使用濃度としては、１〜５０００ｍＭ、好ましくは１０〜１０００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
このようにして得られたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃは、糖ヌクレオチドの通常の単離精製手段（イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析、アフィニティクロマトグラフィーなど）を用いて単離精製することができる。

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されない。なお、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））に従って行った。また、制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは宝バイオ（株）より入手した。
さらに、反応液中のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの定量はＨＰＬＣ法により行った。具体的には、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＨＳ３０２カラムを用い、溶出液として１ｍＭ テトラブチルアンモニウム硫酸塩、５０ｍＭ 酢酸マグネシウム溶液を用いた。また、ＮｅｕＡｃ等の糖の定量にはＨＰＡＥ−ＰＡＤ法によるＨＰＬＣにより行った。具体的には、分離、検出にはダイオネクス社製のＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム、ＥＤ４０を用い、溶出液としてＡ液（０．１Ｎ ＮａＯＨ）とＢ液（０．１Ｎ ＮａＯＨ、０．５Ｍ 酢酸ナトリウム）を用い、Ａ液−Ｂ液のグラジエントにより行った。

（１）Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼをコードするｎａｎＡ遺伝子のクローニング
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｒｄ株の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ５１９０７Ｄ）をテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ｎａｎＡ）遺伝子を増幅した。

ＰＣＲによるｎａｎＡ遺伝子の増幅は、反応液１００μＬ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．００１％ ゼラチン、テンペレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、同じく制限酵素ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃｎａｎＡを単離した。ｐＴｒｃｎａｎＡは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ切断部位にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎａｎＡ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
（２）ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼをコードするｎａｎＥ遺伝子のクローニング
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株の染色体ＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ（ｎａｎＥ）遺伝子を増幅した。

ＰＣＲによるｎａｎＥ遺伝子の増幅は、反応液１００μＬ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）（Ｄ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、前述）に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、７２０ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ及びＳａｌＩで切断し、同じく制限酵素ＸｂａＩ及びＳａｌＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９ＡとＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｎａｎＥを単離した。ｐＴｒｃ−ｎａｎＥは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＸｂａＩ−ＳａｌＩ切断部位にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎａｎＥ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
（３）ｎａｎＡ、ｎａｎＥ遺伝子共発現プラスミドの構築
上記（１）で得られたｐＴｒｃｎａｎＡプラスミドを制限酵素ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、ｎａｎＡ遺伝子を含むＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて回収した。これを同じくＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩで消化した上記（２）で得られたｐＴｒｃ−ｎａｎＥプラスミドとＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結した。この連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃＡＥを単離した。ｐＴｒｃＡＥは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＳａｌＩ切断部位にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎａｎＡ、ｎａｎＥ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
（４）ＮｅｕＡｃの合成
大腸菌Ｗ１４８５ｌｉｐ２（ＡＴＣＣ２５６４５）に上記（３）で構築したプラスミドｐＴｒｃＡＥを保持させ、これを１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地５００ｍＬに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌体数が１×１０^８個／ｍＬに達した時点で、培養液に最終濃度０．２ｍＭになるようにイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３７℃で２６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分）により２５ｍＬ培養液分の菌体５０ｍｇを回収し、これに１００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ グルコース、３００ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．５％（ｖ／ｖ）キシレンを含有する２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍＬを添加し、２８℃で攪拌しながら反応を行った。１４、２４時間後に１１０ｍｇのピルビン酸ナトリウムを添加し、４８時間で反応液を１００℃、５分間の熱処理をすることで反応を停止させた。得られた反応液を糖分析用ＨＰＬＣ（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ、ダイオネクス社）で分析したところ、４３．７ｍＭのＮｅｕＡｃの生成が確認された。
なお、対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドを保持する大腸菌Ｗ１４８５ｌｉｐ２）を用いて同様の反応を行ったが、ＮｅｕＡｃの生成を検出することは出来なかった（０．５ｍＭ以下の生成）。
（５）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼをコードするｎｅｕＡ遺伝子のクローニング
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株の染色体ＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ（ｎｅｕＡ）遺伝子を増幅した。

ＰＣＲによるｎｅｕＡ遺伝子の増幅は、反応液１００μＬ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｅ）（Ｆ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、前述）に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、７２０ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素ＮｃｏＩＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９ＡとＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃｓｉａＢＮＰを単離した。ｐＴｒｃｓｉａＢＮＰは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ切断部位にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎｅｕＡ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
（６）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの調製
プラスミドｐＴｒｃｓｉａＢＮＰを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地１００ｍＬに植菌し、３７℃で振とう培養した。４×１０^８個／ｍＬに達した時点で、培養液に最終濃度０．２５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、５ｍＬの緩衝液（１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により菌体残さを除去した。
このように得られた上清画分を酵素液とし、この酵素液におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を測定した結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌Ｋ−１２株 ＪＭ１０９）と共に下記表１に示す。なお、本発明におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で５’−ＣＭＰとＮ−アセチルノイラミン酸からのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成活性を測定、算出したものである。
（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性の測定と単位の算出法）
５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ＣＴＰおよび１０ｍＭ Ｎ−アセチルノイラミン酸に、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを添加して３７℃で５分反応させる。また、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの代わりにｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９株の菌体破砕液を用い同様の反応を行い、これをコントロールとした。
反応液に２倍量の７０％エタノールを添加して反応を停止し、これを希釈した後ＨＰＬＣによる分析を行った。分離にはＹＭＣ社製ＨＳ−３０２カラムを用い、溶出液として５０ｍＭ酢酸マグネシウムと１ｍＭテトラブチルアンモニウム水溶液の混合液を用いた。ＨＰＬＣ分析結果から反応液中のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの量を算出し，３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成する活性を１単位（ユニット）としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を算出した。

（７）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成
大腸菌 Ｋ−１２株 ＭＥ８４１７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４７：平成１１年８月１８日 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に上記（３）で構築したプラスミドｐＴｒｃＡＥを保持させ、これを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地５００ｍＬに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌体数が４×１０^８個／ｍＬに達した時点で、培養液に最終濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で８．５時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９、０００×ｇ、１０分）により２５ｍＬ培養液分の菌体５０ｍｇを回収し、これに５０ｍＭ ＣＭＰ、１００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ グルコース、２５０ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．５％（ｖ／ｖ）キシレンを含有する２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍＬを添加し、２８℃で攪拌しながら反応を行った。
反応開始２４時間後に乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社製）２５０ｍｇ、上記（６）で調製したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ（３．４ｕｎｉｔｓ／ｍＬ反応液）及び１Ｍ 塩化マグネシウム溶液 １００μＬを添加し、合計６２時間反応させた。なお、反応開始１４時間後に１１０ｍｇのピルビン酸ナトリウムを、２４、３８時間後に１１０ｍｇピルビン酸ナトリウム、１８０ｍｇグルコースを、４８時間後に５５ｍｇピルビン酸ナトリウム、１８０ｍｇグルコースをそれぞれ添加した。
反応液上清をＨＰＬＣにより分析したところ、２１．４ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃが生成することが認められた。
比較例１
（１）ＣＭＰカイネースをコードするｃｍｋ遺伝子のクローニング
大腸菌ＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｙｓ．Ａｃｔａ．，７２，６１９（１９６３））で調製した染色体ＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌のＣＭＰカイネース（ｃｍｋ）遺伝子を増幅した。

ＰＣＲによるｃｍｋ遺伝子の増幅は、反応液１００μＬ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｇ）（Ｈ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、前述）に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、７２０ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩで切断し、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９ＡとＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃＣＭＫＡＢを単離した。ｐＴｒｃＣＭＫＡＢは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ切断部位に大腸菌のｃｍｋ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
（２）ｃｍｋ、ｎｅｕＡ遺伝子共発現プラスミドの構築
実施例１で得られたｐＴｒｃｓｉａＢＮＰプラスミドを制限酵素ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、ｎｅｕＡ遺伝子を含むＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて回収した。これを同じくＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩで消化した上記比較例（１）のｐＴｒｃＣＭＫＡＢプラスミドとＴ４ライゲースを用いて連結した。この連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃＳＢＣＫを単離した。ｐＴｒｃＳＢＣＫは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＳａｃＩ切断部位にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎｅｕＡ遺伝子及び大腸菌のｃｍｋ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
（３）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成
実施例１で調製した大腸菌ＭＥ８４１７／ｐＴｒｃＡＥの２５ｍＬ培養分の集菌体５０ｍｇに、１００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ グルコース、２５０ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．５％（ｖ／ｖ）キシレンを含有する２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）２．５ｍＬを添加し、２８℃で攪拌しながら２４時間反応を行った。
上記（２）で構築したプラスミドｐＴｒｃＳＢＣＫを保持する大腸菌ＭＥ８４１７株の２５ｍＬ培養分の集菌体５０ｍｇと１００ｍＭ ＣＭＰ、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、２５０ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含有する２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）２．５ｍＬを添加後、超音波処理を行った。
反応開始２４時間後、上記の超音波処理液２．５ｍＬを添加し、更に２８℃で攪拌しながら反応を行った。なお、反応開始１４、２４時間後に５５ｍｇ、３８時間後に１１０ｍｇのピルビン酸ナトリウムを添加した。
合計４８時間反応後、反応液上清をＨＰＬＣにより分析したところ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの生成量は６．２８ｍＭであった。

（１）Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼをコードするｎｅｕＢ１遺伝子のクローニング
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ １６５２株の染色体ＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＮ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ｎｅｕＢ１）遺伝子を増幅した。

ＰＣＲによるｎｅｕＢ１遺伝子の増幅は、反応液１００μＬ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、３分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、２．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡ断片をテンプレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、再度ＰＣＲ法によりＣ．ｊｅｊｕｎｉのｎｅｕＢ１遺伝子を増幅した。

ＰＣＲによるｎｅｕＢ１遺伝子の増幅は、反応液１００μＬ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、１．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃｎｅｕＢ１を単離した。ｐＴｒｃｎｅｕＢ１は、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ切断部位にＣ．ｊｅｊｕｎｉのｎｅｕＢ１遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２４８：平成１４年６月２５日 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６））。
（２）ｎａｎＥ、ｎｅｕＢ１遺伝子共発現プラスミドの構築
上記（１）で得られたｐＴｒｃｎｅｕＢ１プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて切断面を平滑化した。これを制限酵素ＰｓｔＩで切断し、ｎｅｕＢ１遺伝子を含む（ＢａｍＨＩ）−ＰｓｔＩ断片をアガロースゲル電気泳動を川いて回収した。続いて実施例１の（２）で得られたｐＴｒｃｎａｎＥプラスミドを制限酵素ＳａｌＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて切断面を平滑化し、更に制限酵素ＰｓｔＩで切断した。これと上記で得られたｎｅｕＢ１遺伝子を含む（ＢａｍＨＩ）−ＰｓｔＩ断片とをＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結した。この連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃＮＥＮＢを単離した。ｐＴｒｃＮＥＮＢは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＸｂａＩ−ＰｓｔＩ切断部位にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎａｎＥ遺伝子、並びにＣ．ｊｅｊｕｎｉのｎｅｕＢ１遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
（３）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成
大腸菌ＭＣ１０６１株（ＡＴＣＣ５３３３８）に上記（２）で調製したプラスミドｐＴｒｃＮＥＮＢを保持させ、この培養菌体５０ｍｇに５０ｍＭ ＣＭＰ、１００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、３０ｍＭ 塩化マグネシウム、２００ｍＭ グルコース、１００ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．５％（ｖ／ｖ）キシレン、４％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社製）、並びに実施例１の（６）で調製したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ（１．７ｕｎｉｔｓ／ｍＬ反応液）を含有する１７５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍＬを添加し、２８℃で攪拌しながら７２時間反応を行った。なお、反応開始１４、２４、３８、４８、６２時間後に１８０ｍｇグルコースをそれぞれ添加した。
反応液上清をＨＰＬＣにより分析したところ、２５．６ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ生成が認められた。

本発明のＮｅｕＡｃリアーゼを用いる方法は、高価なＡＴＰを必要とせず、安価なＧｌｃＮＡｃ、ＣＭＰ及びピルビン酸から効率的にＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを製造することが初めて可能となり、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの大量合成法として極めて有意義な方法である。
また、本発明のＮｅｕＡｃシンセターゼを用いる方法は、高価なＡＴＰを必要とせず、反応系に必須のホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）はグルコースから酵母並びに大腸菌の生体（代謝）反応により合成・供給されるので、反応系にホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を添加する必要がなく、安価なＧｌｃＮＡｃ及びＣＭＰから効率的にＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを製造することが初めて可能となり、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの大量合成法として極めて有意義な方法である。
特に、本発明のＮｅｕＡｃシンセターゼを用いる方法は、本発明のＮｅｕＡｃリアーゼを用いる方法で用いられる２段階の反応を必要としない点で、より簡便で優れた方法である。

【配列表】

Claims (7)

1. Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ピルビン酸およびシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を含有する反応系に、酵母菌体、Ｎ−アセチルグルコサミン−６リン酸 ２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＮｅｕＡｃリアーゼ）およびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を添加し、反応させることを特徴とする、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法。
2. Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびピルビン酸を含有する反応系に、Ｎ−アセチルグルコサミン−６リン酸 ２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）およびＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＮｅｕＡｃリアーゼ）を添加してＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を合成し、続けて、この反応系にシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）、酵母菌体およびシチジン５’−モノリン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を添加してＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成する、請求項１記載の製造法。
3. ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ、ＮｅｕＡｃリアーゼ及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼとして、細胞（形質転換体を含む）またはその処理物を使用する、請求項１記載の製造法。
4. ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼとＮｅｕＡｃリアーゼのそれぞれの活性を増強させた形質転換体とＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を有する菌体処理物を使用する、請求項１記載の製造法。
5. Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を含有する反応系に、酵母菌体、Ｎ−アセチルグルコサミン−６リン酸２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＮｅｕＡｃシンセターゼ）およびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）を添加し、反応させることを特徴とする、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法。
6. ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ、ＮｅｕＡｃシンセターゼ及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼとして、細胞（形質転換体を含む）またはその処理物を使用する、請求項１記載の製造法。
7. ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼとＮｅｕＡｃシンセターゼのそれぞれの活性を増強させた形質転換体とＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を有する菌体処理物を使用する、請求項１記載の製造法。