CN1920048A - Cmp－n－乙酰神经氨酸的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及CMP－N－乙酰神经氨酸(CMP－NeuAc)的制造方法，其特征为在含有N－乙酰葡糖胺(GlcNAc)、丙酮酸和胞苷5′－一磷酸(CMP)的反应体系中，加入酵母菌体、N－乙酰葡糖胺－6－磷酸－2－表异构酶(GlcNAc－6P2－表异构酶)、N－乙酰神经氨酸裂合酶(NeuAc裂合酶)及CMP－N－乙酰神经氨酸合成酶(CMP－NeuAc合成酶)进行反应。本发明还涉及CMP－NeuAc的制造方法，其特征为在含GlcNAc和CMP的反应体系中，加入酵母菌体、GlcNAc－6P2－表异构酶、NeuAc合成酶和CMP－NeuAc合成酶进行反应。

Description

CMP-N-乙酰神经氨酸的制造方法
本发明专利申请是下述发明专利申请原案的分案申请：国际申请号为PCT/JP2003/000258，国际申请日为2003年1月15日的PCT专利申请，其在进入中国国家阶段的国家申请号为03817070.1，名称为“CMP-N-乙酰神经氨酸的制造方法”的发明专利申请。
技术领域
本发明涉及作为糖链合成的重要原料的CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP-NeuAc)的改良制造方法。
背景技术
近年来，有关糖链结构与功能的研究快速进步，具有生理活性的寡聚糖、糖脂、糖蛋白等医药品或者作为功能性材料的用途开发，令人注目。其中，末端含有N-乙酰神经氨酸(NeuAc)的含唾液酸的糖链，是具有细胞粘着、作为病毒感染时的受体等重要功能的糖链。
含唾液酸的糖链，通常通过唾液酸转移酶的催化作用而合成。唾液酸转移酶是将CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP-NeuAc)作为糖的供体、使唾液酸转移至糖链等受体的酶。
然而，用作糖的供体的CMP-NeuAc，现在的状况是价格非常贵，并且其数量也只能供给试剂水平的小量。
CMP-NeuAc的制造方法，已知有以胞苷-5′-三磷酸(CTP)和NeuAc作为底物，用CMP-NeuAc合成酶催化合成的方法(Appl.Microbiol.Biotechnol.，44，59-67(1995))，但作为原料的CTP和NeuAc价格昂贵，用它们作为直接原料合成的CMP-NeuAc也只能成为高价的试剂。
最近，小泉等开发了将能把乳清酸转变成尿苷-5′-三磷酸(UTP)的产氨棒杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)菌体、将生产催化UTP转化成CTP的反应的CTP合成酶的重组大肠杆菌和生产CMP-NeuAc合成酶的重组大肠杆菌组合，以乳清酸和NeuAc作原料合成CMP-NeuAc的方法(Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，257-261(2000))。该方法是不使用高价的CTP的方法，但由于必须调制多种菌体等工序繁杂，同时其实施必须准备大型设备，且仍用高价的NeuAc作为原料，很难说是实用的方法。
另一方面，关于NeuAc的制造方法，已知有从微生物回收唾液酸多聚体，即多聚乙酰神经氨酸、将其化学分解而回收的方法，但最近开发了利用酶的方法。
利用酶的方法，据报道有：(1)用NeuAc裂合酶或NeuAc合成酶，从N-乙酰苷露糖胺(Man NAc)制造的方法(J.Am.Chem.Soc.，110，6481(1988)、J.Am.Chem.Soc.，110，7159(1988)、日本特许公开公报平10-4961号)、(2)在碱性条件下，将N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)转化成N-乙醇甘露糖胺(Man NAc)，而使NeuAc裂合酶或NeuAc合成酶作用于它制造NeuAc的方法(日本特许公开公报平5-211884号，Biotechnology and Bioengineering，Vol.66，No.2(1999)，EnzymeMicrob.Technol.，Vol.20(1997))，(3)使用催化GlcNAc转化成Man NAc的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)2-表异构酶和NeuAc裂合酶或NeuAc合成酶，从Glc NAc制造的方法(WO 95/26399，日本特许公开公报平3-180190号，日本特许公开公报2001-136982号)。
然而，存在下列问题：(1)的方法中原料Man NAc价昂，(2)的方法虽是用廉价的Glc NAc作原料的方法，但从GlcNAc和Man NAc的混合物精制ManNAc的工序繁杂。而如下所示，(3)的方法中所用的GlcNAc 2-表异构酶需要ATP，所以要添加高价的ATP，或者用微生物从ATP的前体腺嘌呤生成ATP，很难说这一方法使人满意。
<(3)的方法>
ATP或其前体     丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸
       ↓       ↓
Glc NAc→Man NAc→NeuAc
       (a)      (b)
(a)：GlcNAc 2-表异构酶
(b)：NeuAc裂合酶或NeuAc合成酶
发明内容
本发明者探讨用大肠杆菌菌体内的酶以Glc NAc作为底物合成NeuAc，几乎未能合成GlcNAc，而由于GlcNAc转化成GlcNAc-6-磷酸(Glc NAc-6P)，试图构成下列途径由GlcNAc合成NeuAc的体系。
结果发现，如增强Glc NAc-6P 2-表异构酶(EC 5.1.3.9)和NeuAc裂合酶或NeuAc合成酶的活性，便能高收率地生成NeuAc，且该合成体系不需要高价的ATP。
      (c)              (1)             (c)      (2)或(3)
Glc NAc→Glc NAc 6-磷酸→Man NAc 6-磷酸→Man NAc→NeuAc
(d)：丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸
(c)：菌体反应
(1)：GlcNAc-6P 2-表异构酶
(2)：NeuAc裂合酶
(3)：NeuAc合成酶
其次，对于用于进行CMP-NeuAc合成反应的CTP合成体系，用种种微生物探讨以廉价的CMP作原料的微生物转化成CTP的体系与上述NeuAc合成体系的组合。于是发现，利用大肠杆菌等酵母以外的微生物时只能合成少量CMP-NeuAc，而如用酵母菌体可高收率地合成CMP-NeuAc。特别是NeuAc合成酶反应所需的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，可利用酵母菌体内的该物质，不需要重新加至反应体系中这一新优点，完成了本发明。
即本发明涉及CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP-NeuAc)的制造方法，其特征是，在含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、丙酮糖和胞苷-5′-一磷酸(CMP)的反应体系中，加入酵母菌体、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-表异构酶(GlcNAc-6P 2-表异构酶)、N-乙酰神经氨酸裂合酶(CMP-NeuAc裂合酶)和CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶(CMP-NeuAC合成酶)，进行反应。
本发明还涉及CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP-NeuAc)的制造方法，其特征是，在含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和胞苷-5′-一磷酸(CMP)的反应体系中，加入酵母菌体、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-表异构酶(GlcNAc-6P 2-表异构酶)、N-乙酰神经氨酸合成酶(NeuAc合成酶)和CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶(CMP-NeuAc合成酶)，进行反应。
具体实施方式
模式地表示本发明的CMP-NeuAc合成反应途径，是以下的(A)采用NeuAc裂合酶的方法和(B)采用NeuAc合成酶的方法。此外，(B)的反应体系需的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)由酵母和大肠杆菌的菌体(代谢)反应自培养基中的葡萄糖合成、供给，因此反应体系中不必加入磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。
(A)利用NeuAc裂合酶的方法
(B)利用NeuAc合成酶的方法
上述模式图(A)和(B)中的记号表示以下意义：
(1)：GlcNAc-6P 2-表异构酶
(2)：NeuAc裂合酶
(3)：CMP-NeuAc合成酶
(4)：NeuAc合成酶
(1)酶等的调制
加入上述(A)和(B)的反应体系中的N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-表异构酶(GlcNAc-6P 2-表异构酶)，是指具有催化上述(1)的Glc NAc-6-磷酸转化为ManNAc-6-磷酸的反应的活性的酶；加入上述(A)的反应体系中的N-乙酰神经氨酸裂合酶(NeuAc裂合酶)，是指具有催化上述(2)的底物的Man NAc与丙酮酸合成NeuAc的反应的活性的酶；加入上述(B)的反应体系中的N-乙酰神经氨酸合成酶(NeuAc合成酶)，是指具有催化上述(4)的底物MaNAc和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)合成NeuAc的反应的活性的酶；加入上述(A)和(B)的反应体系中的CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶(CMP-NeuAc合成酶)，是指具有催化上述(3)的底物NeuAc和CTP合成CMP-NeuAc的反应的活性的酶。
作为具有这些酶活性的材料，可以列举具有该活性的细胞(包括转化体)或其处理物，从调制的简便性等考虑，较好是使用来自微生物的材料。来自微生物的Glc NAc-6P 2-表异构酶、N-乙酰神经氨酸裂合酶、N-乙酰神经氨酸合成酶和CMP-NeuAc合成酶都是公知的酶，可按常法调制。
而作为增强该酶活性的手段，较好是采用利用将该酶基因组(J.Bacteriol.，181，47-54，1999；J.Bacteriol.，181，4526-4532，1999；Nucleic Acids.Res.，13，8843-8852，1985；Agric.Biol.Chem.，50，2155-2158，1986；FEMS Microbiol.Lett.，75，161-166，1992；J.Biol.Chem.，271，15373-15380，1996；J.Biol.Chem.，264，14769-14774，1989；J.Bacteriol.，177，312-319，1995；Mol.Microbiol.，35，1120-1134，2000)克隆，使其在菌体内大量表达的微生物的、所谓重组DNA技术。
在本发明中还可使用使两个以上基因共表达而得到的菌体或其处理物，特别合适使用Glc NAc-6P 2-表异构酶和N-乙酰神经氨酸裂合酶的各自酶活性分别得到增强的转化体，或使GlcNAc-6P 2-表异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶的各自酶活性分别得到增强的转化体，但并不限于此。
基因的克隆、利用克隆的DNA片断的表达载体的调制、用表达载体调制具目标酶活性的酶蛋白等，都是分子生物学领域的技术人员周知的技术，具体可根据例如《Molecular Cloning》(Maniatis等编，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，New York(1982)所记载的方法进行。
例如，可以根据所报道的碱基序列合成探针，利用微生物的染色体DNA克隆含有将具有目标酶活性的酶蛋白编码的遗传因子的DNA片断。用于克隆的宿主没有特别限制，从操作性和简单性出发用大肠杆菌较好。
为构建克隆化基因的高表达体系，例如应用Maxam-Gilbert(DNA测序)法(Methods in Enzymology，65，499(1980))或双脱氧链终止(DNA测序)法(Methodsin Enzymology，101，20(1983))等，对克隆化后的DNA片断的碱基序列进行解析，确定该基因的编码区，制备在其上游根据宿主微生物连结有表达的控制信号(转录开始和翻译开始信号)的重组表达载体，使该基因在菌体中可能表达。
作为载体，可使用各种质粒载体、噬菌体载体等，但希望使用在大肠杆菌菌体内可能复制、有适当的耐药性标记和特定的限制酶酶切住点、在菌体内拷贝数高的质粒载体。具体可列举pBR322(Gene，2，95(1975))、pUC18、pUC19(Gene，33，103(1985))等。
用制作的重组载体使大肠杆菌转化。宿主大肠杆菌可使用例如重组DNA实验使用的K12株、C600菌株、JM105菌株、JM109菌株(Gene，33，103-119(1985))等。为了减少合成NeuAc以外的丙酮酸代谢，也可使用引入与丙酸代谢相关的lip基因发生变异等的大肠杆菌(例如W1485 lip 2(ATCC 25645))作为宿主。
转化大肠杆菌的方法已有多种方法报导，可通过低温下以氯化钙处理、将质粒导入菌体内的方法(J.Mol.Biol.，53，159(1970))等使大肠杆菌转化。
使所得转化体在该微生物可能增殖的培养基中增殖，再诱导克隆化的有目标酶活性的蛋白质表达，进行培养直到该酶蛋白在菌体内大量蓄积。转化体的培养可用含有碳源、氮源等该微生物增殖必需的营养源的培养基按常法进行。例如，可使用肉汤培养基、LB培养基(1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％食盐)或2YT培养基(1.6％胰化蛋白胨、1％酵母提取物、0.5％食盐)等大肠杆菌的培养常用的培养基作为培养基，于30～50℃的培养温度，根据需要通气搅拌，培养10-50小时左右。而在使用质粒作为载体的场合，为防止培养中质粒的脱落，可在培养液中加适量适当的抗生素(根据质粒的耐药标记，用氨苄西林、卡那霉素等)等药物进行培养。
作为有目标酶活性的菌体，可举出从如上方法获得的培养液用离心分离、膜分离等固液分离手段回收的菌体。也可利用将回收的菌体按机械破坏(用旋转搅切机、弗氏压碎器、匀浆器、乳钵等)、冷冻-融化、自体消化、干燥(用冷冻干燥、风干等)、酶处理(用溶菌酶等)、超声处理、化学处理(用酸、碱处理等)等的一般处理法处理得到的处理物，或对具有目标酶活性的组分进行通常的酶精制手段(盐析处理、等电沉淀处理、有机溶剂沉淀处理、透析处理、各种色谱处理等)从该菌体处理物得到的粗酶或精制酶，作为菌体处理物。
其次，作为用于使CMP转化成CTP的酵母，可用市售的面包酵母或酒酵母，在可省略菌体制造的过程上是极有利的。而且，可能利用酵母活菌体、酵母干燥菌体的任一种形式，但从反应收率、处理的难易等点来考虑，使用干燥的酵母菌体较好。
(2)CMP-NeuAc的合成
CMP-NeuAc合成反应中使用的Glc NAc、丙酮酸和CMP有市售，可使用其市售品。使用浓度可在例如各为1～5000mM、较好为10～1000mM的范围内适当设定。
(使用NeuAc裂合酶的方法)
CMP-NeuAc的合成反应，可在含Glc NAc、CMP和丙酮酸的反应体系中，加入GlcNAc-6P 2-表异构酶、NeuAc裂合酶和CMP-NeuAc合成酶(分别为每1ml反应液0.2mg以上，较好是2～100mg)、干燥酵母1～20％(w/v)，于50℃以下，较好在15～40℃，根据需要搅拌反应1～150小时左右而实行。
而在上述反应中，在含Glc NAc和丙酮酸的反应体系中，加入Glc NAc-6P2-表异构酶和NeuAc裂合酶，于50℃以下，较好在15～40℃反应1～50小时左右，合成NeuAc，然后加入CMP、酵母菌体和CMP-NeuAc合成酶，反应约5～50小时合成CMP-NeuAc，这样进行二阶段反应，可使CMP-NeuAc的合成收率提高。但也可以在NeuAc合成时先在反应体系中添加CMP。
(使用NeuAc合成酶的方法)
CMP-NeuAc的合成反应，可在含GlcNAc和CMP的反应体系中，加入GlcNac-6P 2-表异构酶、NeuAc合成酶和CMP-NeuAc合成酶(每1ml反应液中分别在0.2mg以上，较好为2～100mg)、干燥酵母1～20％(w/v)，于50℃以下，较好在15～40℃，根据需要搅拌反应1～150小时左右而实行。
上述任一CMP-NeuAc合成体系中，较好是都根据需要加入无机磷酸、镁和能源。
作为无机磷酸，可直接使用磷酸钾等，但较好是以磷酸缓冲液的形式使用。使用浓度，例如可在1～1000mM、较好是10～400mM的范围内适当设定。而使用磷酸缓冲液的形式时，缓冲液的pH可在5～10的范围内适当设定。
作为镁，可使用硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等无机酸的镁盐、柠檬酸镁等有机酸的镁盐，其使用浓度可在1～1000mM的范围内适当设定。
作为能源，可使用葡萄糖、果糖、蔗糖等糖类，醋酸、柠檬酸等有机酸，其使用浓度可在1～5000mM、较好在10～1000mM的范围内适当设定。
这样所得的CMP-NeuAc，可用糖核苷酸通常的分离精制手段(离子交换色谱、吸附色谱、盐析、亲和色谱等)进行分离精制。
实施例
以下，列举实施例，对本发明进行具体说明，但本发明丝毫不受其限制。而实施例中DNA的调制，用限制酶酶切、用T4 DNA连接酶连接DNA以及大肠杆菌的转化完全按《Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Second Edition》(Sambrook等编，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1989))进行。而限制酶、Ampli Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶，来自于宝バイオ(株)。
此外，反应液中CMP-Meu Ac的定量用HPLC进行。具体说，分离用YMC公司制的ODS-HS 302柱，洗脱剂用1mM四丁基铵硫酸盐、50mM醋酸镁溶液。而NeuAc等糖的定量用HPLC按HPAE-PAD法进行。具体说，分离、检出，用ダイオネクス公司制的CarboPac PA1柱、ED40，洗脱剂用A液(0.1N NaOH)和B液(0.1N NaOH，0.5M醋酸钠)，通过A液-B液的梯度进行。
实施例1
(1)编码N-乙酰神经氨酸裂合酶的nanA基因的克隆
以流感嗜血菌(H.influenzae)Rd株的染色体DNA(ATCC 51907d)作模板，按常法合成以下所示的2种引物DNA，用PCR法扩增流感嗜血菌的N-乙酰神经氨酸裂合酶(ana A)基因。
引物(A)：5′-CACCATGGCGAAGATATTGCCGCTCAAACTA-3′
                       (序列号1)
引物(B)：5′-CCGAATTCATTTATGACAAAAATTTCGCTTTCAAG-3′
                       (序列号2)
用PCR使nanA基因扩增，是在反应液100μL(50mM氯化钾、10mM盐酸Tris(pH8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶、0.1μg的模板DNA、引物DNA(A)(B)各0.2μM、Ampli Taq DNA聚合酶2.5单位)中，用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制的DNA热循环仪热变化(94℃、1分钟)、退火(55℃、1.5分)、聚合(72℃、3分)，各步骤反复25次而进行。
基因扩增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液处理反应液，水溶性组分中加入2倍体积的乙醇，使DNA沉淀。沉淀回收的DNA按文献(上述Molecular Cloning)方法经琼脂糖凝胶电泳分离，精制相当于1.2kb的DNA片断。用限制酶NcoI和EcoRI酶切该DNA，用T4DNA连接酶与同样以限制酶NcoI和EcoRI消化的质粒pTrc 99a(得自Pharmacia Biotech.公司)连接。用连接反应液使大肠杆菌JM109株(ATCC53323)转化，由所得的氨苄西林耐药性转化体分离质粒pTrcnanA。pTrcnan A是在pTrc 99A的trc启动子下游的NcoI-EcoRI酶切部位，插入含有流感嗜血菌的nanA基因的结构基因的DNA片断的质粒。
(2)编码GlcNAc-6P 2-表异构酶的nanE基因的克隆
以流感嗜血菌Rd株的染色体DNA作模板，按常法合成以下所示的2种引物DNA，用PCR法扩增流感嗜血菌的GlcNAc-6P 2-表异构酶(nanE)基因。
引物(C)：5′-GGTCTAGATTTAAATGAGGGGTGTTATATGT-3′
                        (序列号3)
引物(D)：5′-TCGTCGACTTATCTTGCAGATTTCACTGAATTAGCAAACCA-3′
                        (序列号4)
用PCR使nanE基因扩增，是在反应液100μL(50mM氯化钾、10mM盐酸Tris(pH8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶、0.1μg的模板DNA、引物DNA(C)(D)各0.2μM、Ampli Taq DNA聚合酶2.5单位)中，用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制的DNA热循环仪热变性(94℃、1分钟)、退火(55℃、1.5分)、聚合(72℃、3分)，各步骤反复25次而进行。
基因扩增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液处理反应液，水溶性组分中加入2倍体积的乙醇，使DNA沉淀。沉淀回收的DNA按文献(上述Molecular Cloning)方法经琼脂糖凝胶电泳分离，精制相当于720b的DNA片断。用限制酶XbaI和SalI酶切该DNA，用T4 DNA连接酶与同样以限制酶XbaI和SalI消化的质粒pTrc99A连接。用连接反应液使大肠杆菌JM109株转化，由所得的氨苄西林耐药性转化体分离质粒pTrc-nanE。PTrc-nanE是在pTrc99A的trc启动子下游的XbaI-SalI酶切部位，插入含有流感嗜血菌的nanE基因的结构基因的DNA片断的质粒。
(3)nanA、nanE基因共表达质粒的构建
将上述(1)所得的pTrcnan A质粒用限制酶NcoI、EcoRI酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收含nan A基因的NcoI-EcoRI片断。用T4 DNA连接酶将它与同样以NcoI、EcoRI消化的上述(2)所得的pTrc-nanE质粒连接。用该连接反应液使大肠杆菌JM109株转化，从所得的氨苄西林耐药性转化体分离质粒pTrcAE。pTtrcAE是在pTrc 99A的trc启动子下游的NcoI-SalI酶切部位插入含有流感嗜血菌的nanA、nanE基因的结构基因的DNA片断的质粒。
(4)NeuAc的合成
使上述(3)构建的质粒pTrc AE保持在大肠杆菌W1485 lip2(ATCC 25645)中，将其接种于含100μg/ml的氨苄西林的2×YT培养基500ml中，于37℃振荡培养。在菌体数达到1×108个/ml时，加入β-D-硫代半乳吡喃糖异丙苷(IPTG)到培养液中，使培养液的最终浓度为0.2mM，再继续于37℃振荡培养26小时。培养结束后，经离心分离(9000×g、10分钟)回收25ml的一份培养液中的菌体50mg，在其中加入含100mM的Glc NAc、20mM氯化镁、50mM葡萄糖、300mM丙酮酸钠、0.5％(v/v)二甲苯的200mM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)5ml，于28℃搅拌反应。于14、24小时后加入110mg的丙酮酸钠，在48小时时将反应液于100℃热处理5分钟，使反应停止。所得反应液以糖分析用的HPLC(HPAE-PADダイオネクス公司)进行分析，确认有43.7mM的NeuAc生成。
而用对照菌株(保持pTrc 99A质粒的大肠杆菌W1485 lip 2)进行同样的反应，未能检出NeuAc生成(生成0.5mM以下)。
(5)编码CMP-NeuAc合成酶的neuA基因的克隆
以流感嗜血菌Rd株的染色体DNA作模板，按常法合成以下所示的2种引物DNA，用PCR法扩增流感嗜血菌的CMP-NeuAc合成酶(neu A)基因。
引物(E)：5′-TGCCATGGTGAAAATAATAATGACAAGAA-3′
                        (序列号5)
引物(F)：5′-AACTGCAGTGCAGATCAAAAGTGCGGCC-3′
                        (序列号6)
用PCR使neuA基因扩增，是在反应液100μL(500mM的氯化钾、10mM的盐酸Tris(pH8.3)、1.5mM的氯化镁、0.001％明胶、模板DNA0.1μg、引物DNA(E)(F)各0.2μM、Ampli Taq DNA聚合酶2.5单位)中，用Perkin-Elmer CetusInstrument公司制的DNA热循环仪热变性(94℃、1分钟)、退火(55℃、1.5分钟)聚合(72℃、3分)，各步骤反复25次而进行。
基因扩增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液处理反应液，水溶性组分中加入2体积的乙醇，使DNA沉淀。沉淀回收的DNA按文献(上述Molecular Cloning)方法经琼脂糖凝胶电泳分离，精制相当于720b的DNA片断。用限制酶NcoI和PstI酶切该DNA，用T4DNA连接酶与同样以限制酶NcoI和PstI消化的质粒pTrc 99A连接。用连接反应液使大肠杆菌JM109株转化，由所得的氨苄西林耐药性转化体分离质粒pTrcsia BNP。pTrcsia BNP是在pTrc99A的trc启动子下游的NcoI-PstI酶切部位，插入含有流感嗜血菌的neu A基因的结构基因的DNA片断的质粒。
(6)CMP-NeuAc合成酶的调制
将保持质粒pTrcsia BNP的大肠杆菌JM109菌株，接种于含100μg/ml的氨苄西林的2×YT培养基100ml中，于37℃振荡培养。在达到4×108个/ml时，在培养液中添加IPTG使最终浓度为0.25mM，再于37℃继续振荡培养6小时。培养结束后，经离心分离(9000×g，10分钟)回收菌体，悬浮于5ml缓冲液(100mM的盐酸Tris(pH7.8)、10mM的MgCl2)。进行超声波处理，使菌体破碎，再经离心分离(20000×g，10分钟)除去菌体残片。
以这样所得的上清组分作为酶液，将测定该酶液中的CMP-NeuAc合成酶活性的结果与对照菌株(保持pTrc 99A的大肠杆菌K-12株JM109)一起表示于下述表1。此外，本发明中CMP-NeuAc合成酶活性的单位数，是用以下所述方法测定和算出的自5′-CMP和N-乙酰神经氨酸合成CMP-NeuAc的合成活性。
(CMP-NeuAc合成酶活性的测定和单位计算法)
在50mM的盐酸Tris缓冲液(pH8.0)、20mM的氯化镁、5mM的CTP和10mM的N-乙酰神经氨酸中，加入CMP-NeuAc合成酶，于37℃反应5分钟。并用保持pTrc 99A的大肠杆菌JM109菌株的菌体破碎液代替CMP-NeuAc合成酶，进行同样的反应，将其作为对照。
在反应液中加入2倍量的70％乙醇，使反应停止，将其稀释后用HPLC进行分析。分离采用YMC公司制的HS-302柱，以50mM醋酸镁和1mM四丁基铵水溶液的混合液作洗脱液。由HPLC分析结果算出反应液中的CMP-NeuAc的量，将37℃时1分钟内合成1μmol的CMP-NeuAc的活性作为1单位，算出CMP-NeuAc合成酶活性。
                  表1
  菌株/质粒   CMP-NeuAc合成酶活性(单位/mg蛋白)
  JM 109/pTrc99aJM 109/pTrcsia BNP   ＜0.012.45
(7)CMP-NeuAc的合成
在大肠杆菌K-12株ME8417(FERM BP-6847：平成11年8月18日，独立行政法人产业技术总合研究所特许生物保藏中心(日本国茨城县つくば市东1丁目1番地1，中央第6(邮政编码305-8566))中保持上述(3)构建的质粒pTrc AE，将其接种于含100μg/ml氨苄西林的2×YT培养基500ml中，于37℃振荡培养。在菌体数达到4×108个/ml时，在培养液中加入IPTG。使最终浓度为0.2mM，再于37℃继续振荡培养8.5小时。培养结束后，经离心分离(9,000×g，10分钟)回收25ml的一份培养液中的菌体50mg，在其中加入含50mM的CMP、100mM的Glc NAc、20mM氯化镁、50mM葡萄糖、250mM丙酮酸钠、0.5％(v/v)二甲苯的200mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)5ml，于28℃进行搅拌反应。
反应开始24小时后，加入干燥面包酵母(オリエンタル酵母公司制)250mg、上述(6)调制的CMP-NeuAc合成酶(3.4单位/ml反应液)及1M氯化镁溶液100μl，总共反应62小时。另于反应开始14小时后加入110mg丙酮酸钠，24、38小时后分别加入110mg丙酮酸钠、180mg葡萄糖，48小时后加入55mg丙酮酸钠、180mg葡萄糖。
用HPLC对反应上清液进行分析，发现生成21.4mM的CMP-NeuAc。
比较例1
(1)编码CMP激酶的cmk基因的克隆
以齐藤和三浦的方法(Biochim.Biophys.Acta，72，619(1963)调制的大肠杆菌JM109株的染色体DNA作模板，按常法合成以下所示的2种引物DNA，以PCR法使大肠杆菌的CMP激酶(cmk)基因扩增。
引物(G)：5′-TTGAATTCTAAGGAGATAAAGATGACGGCAATT-3′
                        (序列号7)
引物(H)：5′-TTGAGCTCTGCAAATTCGGTCGCTTATGCG-3′
                        (序列号8)
用PCR使cmk基因扩增，是在反应液100μl(50mM氯化钾、10mM盐酸Tris(pH8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶、模板0.1μg、引物DNA(G)(H)各0.2μg、Ampli Taq DNA聚合酶2.5单位)中，用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制的DNA热循环仪进行热变性(94℃、1分钟)、退火(55℃、1.5分)、聚合(72℃、3分)，各步骤反复25次而进行。
基因扩增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液处理反应液，水溶性组分中加入2倍体积的乙醇，使DNA沉淀。沉淀回收的DNA按文献(上述Molecular Cloning)方法经琼脂糖凝胶电泳分离，精制相当于720b的DNA片断。用限制酶EcoRI和SacI酶切该DNA，用T4 DNA连接酶与同样以限制酶EcoRI和SacI消化的质粒pTrc 99A连接。用连接反应液使大肠杆菌JM109株转化，由所得的氨苄西林耐药性转化体分离质粒pTrc CMKAB。PTrcCMKAB是在pTrc99A的trc启动子下游的EcoRI-SacI酶切部位，插入含有大肠杆菌的cmk基因的结构基因的DNA片断的质粒。
(2)cmk、neuA基因共表达质粒的构建
将实施例1所得的pTrcsia BNP质粒用限制酶NcoI、EcoRI酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收含neuA基因的NcoI-EcoRI片断。将它与同样以NcoI、EcoRI消化的上述比较例(1)的pTrc CMKAB质粒用T4连接。用该连接反应液使大肠杆菌JM109株转化，从所得的氨苄西林耐药性转化体分离质粒pTrc SBCK。PTrcSBCK是在pTrc 99A的trc启动子下游的NcoI-SacI酶切部位插入含流感嗜血菌的neu A基因和大肠杆菌的cmk基因的结构基因的DNA片断的质粒。
(3)CMP-NeuAc的合成
在实施例1调制的大肠杆菌ME 8417/pTrc AE的25ml的一份培养液的集菌体50mg中，加入含100mM GlcNAc、20mM氯化镁、50mM葡萄糖、250mM丙酮酸钠、0.5％(v/v)二甲苯的200mM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)2.5ml，于28℃搅拌反应24小时。
在保持上述(2)构建的质粒pTrc SBCK的大肠杆菌ME 8417株的25ml的一份培养液的菌体50mg中加入含100mM CMP、20mM氯化镁、250mM丙酮酸钠的200mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)2.5ml后，进行超声波处理。
反应开始24小时后，添加上述超过处理液2.5ml，再于28℃进行搅拌反应。另于反应开始14、24小时后添加丙酮酸钠55mg，38小时后添加110mg。
总共反应48小时后，用HPLC分析反应上清液，CMP-NeuAc的生成量为6.28mM。
实施例2
(1)编码N-乙酰神经氨酸合成酶的neuB1基因的克隆
以空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)1652株的染色体DNA作模板，按常法合成以下所示的2种引物DNA，用PCR法扩增N-乙酰神经氨酸合成酶(neuB1)基因。
引物(I)：5′-TACGATTATTTTCCTGATGCTC-3′
                        (序列号9)
引物(J)：5′-TCTCCAAGCTGCATTAAACGCC-3′
                        (序列号10)
用PCR使neu B1基因扩增，是在反应液100μl(50mM氯化钾、10mM盐酸Tris(pH8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶、0.1μg的模板DNA、引物DNA(A)(B)各0.2μM、Ampli Taq DNA聚合酶2.5单位)中，用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制的DNA热循环进行热变性(94℃，1分钟)、退火(55℃、1.5分)、聚合(72℃、3分)，各步骤反复30次而进行。
基因扩增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液处理反应液，水溶性组分中加入2倍体积的乙醇，使DNA沉淀。沉淀回收的DNA按文献(上述Molecular Cloning)方法经琼脂糖凝胶电泳分离，精制相当于2.2kb的DNA片断。以该DNA片断作模板，按常法合成以下所示的2种引物DNA，再次用PCR法扩增空肠弯曲杆菌的neu B1基因。
引物(K)：5′-AAGGATCCTCTAGTGAGGCTTATGGAA-3′
                       (序列号11)
引物(L)：5′-GTCTGCAGATTTAATCTTAGAATAATCAGCCC-3′
                       (序列号12)
用PCR使neu B1基因扩增，是在反应液100μl(50mM氯化钾、10mM盐酸Tris(pH8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶、0.1μg的模板DNA、引物DNA(A)(B)各0.2μM、Ampli Taq DNA聚合酶2.5单位)中，用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制的DNA热循环仪进行热变性(94℃，1分钟)、退火(55℃、1.5分)、聚合(72℃、3分)，各步骤反复25次而进行。
基因扩增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液处理反应液，水溶性组分中加入2倍体积的乙醇，使DNA沉淀。沉淀回收的DNA经琼脂糖凝胶电泳分离，精制相当于1.2kb的DNA片断。用限制酶BanHI和PstI酶切该DNA，用T4 DNA连接酶与同样以限制酶BanHI和PstI消化的质粒pTrc99A(得自PharmaciaBiotech公司)连接。用连接反应液使大肠杆菌JM109株转化，由所得的氨苄西林耐药性转化体分离质粒pTrcneu B1。pTrcneu B1是在pTrc 99A的trc启动子下游的BanHI-PstI酶切部位，插入含有空肠弯曲杆菌的neu B1基因的结构基因的DNA片断的质粒(FERM BP-8248：平成14年6月25日，独立行政法人产业技术总合研究所特许生物保藏中心(日本国茨城县つくげ市东1丁目1番地，中央第6(邮政编码305-8566))。
(2)nanE、neu B1基因共表达质粒的构建
将上述(1)所得的pTrcneu B1质粒用限制酶BanHI酶切后，用T4 DNA聚合酶将酶切面补平。将其用限制酶PstI酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收含neu B1基因的(BamH I)-PstI片断。然后用限制酶SalI酶切实施例1的(2)得到的pTrcnanE质粒后，用T4 DNA聚合酶将酶切面补平，再用限制酶PstI酶切。用T4 DNA连接酶将其与如上所得的含neu B1基因的(BamH I)-Pst I片断连接。用该连接反应液转化大肠杆菌JM109株，由所得的氨苄西林耐药性转化体分离质粒pTrc NENB。PTrc NENB是在pTrc 99A的trc启动子下游的XbaI-PstI酶切部位插入含有流感嗜血菌的nanE基因和空肠弯曲杆菌的neu B1基因的结构基因的DNA片断的质粒。
(3)CMP-NeuAc的合成
在保持上述(2)构建的质粒pTrc NENB的大肠杆菌MC1061株(ATCC53338)的培养菌体50mg中，加入含50mM CMP、100mM Glc NAc、30mM氯化镁、200mM葡萄糖、100mM的丙酮酸钠、0.5％(v/v)二甲苯、4％(w/v)干燥面包酵母(オリエンタル酵母公司制)和实施例1的(6)调制的CMP-NeuAc合成酶(1.7单位/ml反应液)的175mM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)5ml，于28℃搅拌反应72小时。并在反应开始14、24、38、48、62小时后分别添加180mg葡萄糖。
用HPLC分析反应上清液，发现有25.6mM的CMP-NeuAc生成。
产业上利用的可能性
本发明的利用NeuAc裂合酶的方法，不需要高价的ATP，首次使利用廉价的GlcNAc、CMP和丙酮酸有效地制造CMP-NeuAc变为可能，作为CMP-NeuAc的大量合成法是极有意义的方法。
而本发明的利用NeuAc合成酶的方法，不需要高价的ATP，反应体系必需的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)通过酵母和大肠杆菌的菌体(代谢)反应从葡萄糖合成、供给，所以反应体系中不必添加磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，首次使利用廉价的GlcNAc和CMP有效地制造CMP-NeuAc变为可能，作为CMP-NeuAc的大量合成法是极有意义的方法。
特别是，在不需要本发明的利用NeuAc裂合酶的方法时所用的2阶段反应这点上，本发明的利用NeuAc合成酶的方法是更简便的优良方法。
                                    序列表
<110>雅玛山公司
<120>胞苷-5’-一磷酸-N-乙酰神经氨酸的制造方法
<130>A02-0095
<140>
<141>
<150>JP2002-208987
<151>2002-07-18
<160>12
<170>PatentIn version 2.1
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于nanA基因扩增的引物
<400>1
caccatggcg aagatattgc cgctcaaact a                      31
<210>2
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于nanA基因扩增的引物
<400>2
ccgaattcat ttatgacaaa aatttcgctt tcaag                  35
<210>3
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于nanE基因扩增的引物
<400>3
ggtctagatt taaatgaggg gtgttatatg t                      31
<210>4
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于nanE基因扩增的引物
<400>4
tcgtcgactt atcttgcaga tttcactgaa ttagcaaacc a         41
<210>5
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于neuA基因扩增的引物
<400>5
tgccatggtg aaaataataa tgacaagaa                       29
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于neuA基因扩增的引物
<400>6
aactgcagtg cagatcaaaa gtgcggcc                        28
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于cmk基因扩增的引物
<400>7
ttgaattcta aggagataaa gatgacggca att                   33
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于cmk基因扩增的引物
<400>8
ttgagctctg caaattcggt cgcttatgcg                       30
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于neuB1基因扩增的引物
<400>9
tacgattatt ttcctgatgc tc                               22
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于neuB1基因扩增的引物
<400>10
tctccaagct gcattaaacg cc                                  22
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于neuB1基因扩增的引物
<400>11
aaggatcctc tagtgaggct tatggaa                             27
<210>12
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于neuB1基因扩增的引物
<400>12
gtctgcagat ttaatcttag aataatcagc cc                       32

Claims (3)

1.CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP-NeuAc)的制造方法，其特征为，在含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和胞苷-5′-一磷酸(CMP)的反应体系中，加入酵母菌体、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-表异构酶(GlcNAc-6P 2-表异构酶)、N-乙酰神经氨酸合成酶(NeuAc合成酶)和CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶(CMP-NeuAc合成酶)，进行反应。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其特征为，使用细胞(包括转化体)或其处理物，作为GlcNAc-6P 2-表异构酶、NeuAc合成酶和CMP-NeuAc合成酶。
3.根据权利要求1所述的制造方法，其特征为，使用GlcNAc-6P 2-表异构酶和NeuAc合成酶的活性分别得到增强的转化体和具有CMP-NeuAc合成酶活性的菌体处理物。
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