CN1172003C - N-乙酰神经氨酸的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供不用添加丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸等高价原料，而能便宜地制造N-乙酰神经氨酸的方法。N-乙酰神经氨酸的制造方法，是在水介质中培养具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶或N-乙酰神经氨酸合成酶活性的微生物的培养物或该培养物的处理物等，使N-乙酰神经氨酸在水介质中生成、蓄积，从该水介质中提取N-乙酰神经氨酸。
Description
本发明是有关利用具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性或N-乙酰神经氨酸合成酶活性的微生物，制造N-乙酰神经氨酸的制造方法的发明。
作为N-乙酰神经氨酸的制造方法已知有萃取法、分解法、利用酶催化的方法。
作为萃取法有从海燕窝萃取等方法[碳水化合物研究(Carbohydrate Research)，56，423(1977)]。
作为分解法有对大肠杆菌等细菌生产的N-乙酰神经氨酸聚合物多聚乙酰神经氨酸进行分解等方法[生物化学杂志(J.Biochem.)，82，1425(1977)]。
作为利用酶催化的方法有用N-乙酰神经氨酸醛缩酶、丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺进行制造的方法[美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，110，6481(1988)、J.Am.Chem.Soc.，110，7159(1988)]，有在碱性条件下用N-乙酰神经氨酸醛缩酶、丙酮酸和N-乙酰葡糖胺进行制造的方法[美国专利第5,665,574号]、用N-乙酰神经氨酸醛缩酶、N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶、丙酮酸和N-乙酰葡糖胺进行制造的方法[应用化学，国际英文版(Angew.Chem.Int.Ed.Eng.)，30，827(1991)、Carbohydrate Research，306，575(1998)]、用N-乙酰神经氨酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺进行制造的方法[特开平10-4961、糖生物学(Glycobiology)，7，697(1997)]。
无论上述N-乙酰神经氨酸的哪一种制造方法，由于操作都烦琐或者是必须使用高价的原料丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸，所以还没有确立N-乙酰神经氨酸的成本低廉的制造方法。
到目前为止，有关利用微生物的培养物或该培养物的处理物可能制造N-乙酰神经氨酸的记载或提示还没有。
关于N-乙酰神经氨酸醛缩酶，已知有来自动植物的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，微生物中已知属于埃希氏菌属的微生物也具有该酶活性。已知在属于埃希氏菌属(Escherichia)的微生物的大肠杆菌(Escherichia coli)中也有编码该酶的基因nanA[核酸研究(Nucleicacids Res.)，13，8843(1985)]。
关于N-乙酰神经氨酸合成酶，已知属于埃希氏菌属、奈瑟氏球菌属、链球菌属的微生物中含有此酶，大肠杆菌中有编码该酶的基因nauB[细菌学杂志(J.Bacteriol.)，177，312(1995)]。
关于N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶，已知在猪和大鼠中存在此酶，已就来自猪的该酶的性质进行了研究[生物化学(Biochemistry)，17，3363(1970)]、已经获得了编码该酶的基因[生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，271，16294(1996)]。但到目前为止，具有该酶活性的微生物还不知道。
作为丙酮酸的制造方法已知有利用大肠杆菌的变异株制造丙酮酸的方法[生物科学.生物技术.生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)，58，2164(1994)]。
作为磷酸烯醇式丙酮酸的制造方法有利用属于酵母属Saccharomyces微生物制造磷酸烯醇式丙酮酸的方法[特开平6-197778]。
本发明的目的是提供不添加丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸等高价原料，廉价制造N-乙酰神经氨酸的方法。另外还提供不用高价的N-乙酰甘露糖胺制造N-乙酰神经氨酸的方法。
本发明人为了解决上述课题进行了深入的研究，发现通过利用具有生产丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸能力的微生物由价格便宜的原料可以高效生产N-乙酰神经氨酸，从而完成了本发明。
本发明包括以下(1)～(11)项内容。
(1)N-乙酰神经氨酸的制造方法，其特征是：使水介质中①含有具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶或N-乙酰神经氨酸合成酶活性的微生物的培养物或该培养物的处理物，②在上述①中使用具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的微生物时，含有具有丙酮酸生成能力的微生物的培养物或该培养物的处理物，在上述①中使用具有N-乙酰神经氨酸合成酶活性的微生物时，含有具有磷酸烯醇式丙酮酸生成能力的微生物的培养物或该培养物的处理物，③含有N-乙酰甘露糖胺、以及④丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸生成时所必需的能源，使N-乙酰神经氨酸在该水介质中生成、蓄积，从该水介质中提取N-乙酰神经氨酸。
(2)在上述(1)的制造方法中，N-乙酰甘露糖胺是通过使水介质中含有具有N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的微生物的培养物或该培养物的处理物以及N-乙酰葡糖胺，然后使N-乙酰甘露糖胺在该水介质中生成、蓄积得到的。
(3)在上述(2)的制造方法中，具有N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性的微生物是带有重组DNA的微生物，该重组DNA是由编码N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的DNA片段与载体重组形成的。
(4)在上述(3)的制造方法中，编码N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的DNA是来自属于集胞蓝细菌Synechocystis属的微生物的DNA。
(5)在上述(3)或(4)的制造方法中，编码N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的DNA是以下(a)或(b)中的DNA：
(a)编码由序列1记载的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA
(b)具有序列2记载的碱基序列的DNA。
(6)在上述(1)～(5)记载的任一种制造方法中，具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的微生物是属于埃希氏菌属或棒杆菌属的微生物。
(7)在上述(1)～(6)记载的任一种制造方法中，具有N-乙酰神经氨酸合成酶活性的微生物是从属于埃希氏菌属、奈瑟氏球菌属、链球菌属的微生物中选出来的微生物。
(8)在上述(1)～(7)记载的任一种制造方法中，具有丙酮酸生成能力的微生物是从属于埃希氏菌属、棒杆菌属和酵母属的微生物中选出来的微生物。
(9)在上述(1)～(8)记载的任一种制造方法中，具有磷酸烯醇式丙酮酸生成能力的微生物是从属于埃希氏菌属、棒杆菌属和酵母属的微生物中选出来的微生物。
(10)在上述(6)～(9)记载的任一种制造方法中，属于埃希氏菌属的微生物是大肠杆菌Escherichia coli。
(11)上述(6)、(8)或(9)记载的制造方法中，属于棒杆菌属的微生物是产氨棒杆菌Corynebacterium ammoniagenes、谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum、嗜乙酰乙酸棒杆菌Corynebacteriumacetoacidophilum。
附图的简单说明
[图1]表示N-乙酰神经氨酸醛缩酶表达质粒pTA3的构建过程。
[图2]表示N-乙酰神经氨酸合成酶表达质粒pYP18的构建过程。
[图3]表示N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶表达质粒pYP16的构建过程。
符号说明
Ampr：氨苄青霉素抗性基因
PL：PL启动子
cI857：cI857阻遏物
Plac：lac启动子
slr1975：N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶基因
nanA：N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因
neuB：N-乙酰神经氨酸合成酶基因
以下对本发明进行详细说明。
作为本发明中使用的具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的微生物，只要是具有该酶活性的微生物无论哪一种都可以，例如可以用属于埃希氏菌属、棒杆菌属的微生物。
属于埃希氏菌属的微生物有大肠杆菌等。属于棒杆菌属的微生物有产氨棒杆菌、谷氨酸棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌。
另外可以用通过基因重组增强了该酶活性的转化菌。作为转化菌有含有来自大肠杆菌的nanA基因[Nucleic acids Res.，13，8843(1985)]的重组DNA的微生物，例如大肠杆菌NM522/pTA3菌株。
作为本发明中使用的具有N-乙酰神经氨酸合成酶活性的微生物，只要是具有该酶活性的微生物无论哪一种都可以，例如可以用属于埃希氏菌属、奈瑟氏球菌属、链球菌属的微生物。
属于埃希氏菌属的微生物有大肠杆菌等。
另外可以使用通过基因重组增强了该酶活性的转化菌。作为转化菌有含有来自大肠杆菌的neuB基因[J.Bacteriol.，177，312(1995)]的重组DNA的微生物，例如大肠杆菌NM522/pYP18菌株。
作为具有丙酮酸生成能力的微生物，只要是具有丙酮酸生成活性的微生物无论哪一种都可以用，例如大肠杆菌、产氨棒杆菌、谷氨酸棒杆菌、乙酰乙酸棒杆菌、酿酒酵母Sacchromyces cerevisiae等。另外也可以利用通过变异手法或基因重组手法增强该活性的微生物。例如可以用Biosci.Biotech.Biochem.，58，2164(1994)记载的大肠杆菌的变异株。
作为具有磷酸烯醇式丙酮酸生成能力的微生物，只要是具有该生成活性的微生物无论哪一种都可以用，例如大肠杆菌、产氨棒杆菌、谷氨酸棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、酿酒酵母等。作为酿酒酵母可以用特开平6-197778记载的菌株。另外也可以利用通过变异手法或基因重组手法增强该活性的微生物。
作为具有N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性的微生物，只要是具有该生成活性的微生物无论哪一种都可以用，例如可以用通过变异手法或基因重组手法增强该酶活性的重组菌株。作为该转化菌株的具体例子有含有来自猪的N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶基因的重组DNA(pEPI1)的大肠杆菌(FERM BP-4602：美国专利第5,795,767号)，或含有来自属于集胞蓝细菌Synechocystis属微生物的N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶基因的重组DNA的大肠杆菌NM522/pYP16菌株等。
作为来自属于集胞蓝细菌属微生物的N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶基因，具有编码存在于Synechocystis sp.PCC6803菌株的染色体中的编码具有序列1所示氨基酸序列的多肽的基因。具体讲，是具有序列2所示碱基序列的基因(slr1975)。具有序列1所示的氨基酸序列的多肽和具有序列2所示碱基序列的DNA，就象后面实施例所述的那样，是本发明人首次获得的产物。
在具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性和丙酮酸生成能力的微生物中，只用其中的一种微生物就可以由N-乙酰甘露糖胺制造N-乙酰神经氨酸。在上述活性或生产能力任一方面弱或欠缺的微生物中，可以通过与能够祢补上述缺陷的微生物适当组合，也能够制造N-乙酰神经氨酸。
N-乙酰神经氨酸制造中用的N-乙酰甘露糖胺有市售的标准品。另外可以使用由N-乙酰葡糖胺在碱性条件下通过化学方法或使用N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的酶学方法进行变换得到的N-乙酰甘露糖胺。还可以通过使水介质中含有具有N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性的微生物培养物或该培养物的处理物和N-乙酰葡糖胺，生成、积蓄的N-乙酰甘露糖胺，使用含有该N-乙酰甘露糖胺的标准品，或用从该标准品中纯化的N-乙酰甘露糖胺。
在具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性和N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性以及丙酮酸生成能力的微生物中，只用其中的一种微生物就可以由N-乙酰葡糖胺制造N-乙酰神经氨酸。在上述活性或生产能力任一方面弱或欠缺的微生物中，可以通过与能够祢补上述缺陷的微生物适当组合，也能够制造N-乙酰神经氨酸。
N-乙酰神经氨酸制造中用的N-乙酰葡糖胺有市售的标准品。
在具有N-乙酰神经氨酸合成酶活性和磷酸烯醇式丙酮酸生成能力的微生物中，只用其中的一种微生物就可以由N-乙酰甘露糖胺制造N-乙酰神经氨酸。在上述活性或生产能力任一方面弱或欠缺的微生物中，可以通过与能够祢补上述缺陷的微生物适当组合，也能够制造N-乙酰神经氨酸。
在具有N-乙酰神经氨酸合成酶活性和N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性以及磷酸烯醇式丙酮酸生成能力的微生物中，只用其中的一种微生物就可以由N-乙酰葡糖胺制造N-乙酰神经氨酸。在上述活性或生产能力任一方面弱或欠缺的微生物中，可以通过与能够祢补上述缺陷的微生物适当组合，也能够制造N-乙酰神经氨酸。
另外供给N-乙酰神经氨酸或N-乙酰甘露糖胺生成反应用的微生物可以是伴随增殖状态的，也可以是培养结束后的微生物的培养物或该处理物。
象上述那样，在N-乙酰神经氨酸或N-乙酰甘露糖胺的制造中，也可以利用基因重组的微生物，从含有该基因的质粒的微生物中进行的质粒DNA分离纯化、质粒DNA的限制酶切割、切割后的DNA片段的分离纯化、DNA片段的酶促结合、利用重组DNA进行的转化等有关基因重组的各种操作都是按照众所周知的方法[例如《分子克隆，实验室手册》第2版，冷泉港实验室出版社(1989年)(Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))(以下简称为《分子克隆》第2版)、《分子生物学中的常规操作》Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons(1987-1997)(以下简称为《分子生物学中的常规操作)》]进行的。另外聚合酶链式反应(以下简称为PCR)按照众所周知的方法[《PCR规则》PCR Protocols，Academic Press(1990)]进行的。
为了使与N-乙酰神经氨酸或N-乙酰甘露糖胺的制造有关的基因在宿主内表达，将含有该基因的DNA片段用限制性内切酶或PCR进行处理作成含有该基因的适当长度的DNA片段后，插入到适当的表达载体的启动子下游，然后将插入了上述DNA的表达载体导入适合该表达载体的宿主细胞来实现。
作为宿主细胞可以使用细菌、酵母等细胞，只要是能够表达目的基因的宿主细胞都可以用。
作为表达载体，可以利用在上述宿主细胞内能自主复制或者能重组到染色体，在能够转录目的DNA的位置含有启动子的载体。
用细菌等原核生物作为宿主细胞时，基因表达载体在原核生物中能自主复制的同时，最好是由启动子、核糖体结合序列、目的DNA、转录终止序列构成的重组DNA。即使含有控制启动子的基因也可以。
作为表达载体有pBTrp2、pBTac1、pBTac2、pHelix1(都是ロシュ·ダィアグノスティス公司制造的)、pKK233-2、pKK223-3、pGEX(都是Amersham Pharmacia Biotechnology公司出售的)、pSE280(ィンビトロジェン)、pGEMEX-1(Promega公司制造)、pQE-8、pQE-30(都是キアゲン公司制造)、pET-3(ノバジェン公司制造)、pKYP10(特开昭58-110600)、pKYP200[农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)，48，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGEL 1[美国国家科学院院报(Pro.Natl.Acad.Sci.，USA)，82，4306(1985)]、pBluescriptII SK+(STRATAGENE公司制造)、pBluescript II SK-(STRATAGENE公司制造)、pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrS32[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5408)制备]、pUC19[Gene，33，103(1985)]、pSTV28(宝酒造公司制造)、pUC118(宝酒造公司制造)、pPAC31(WO98/12343)、pPA1(特开昭63-233798)、pPA1(特开昭63-233798)等。
作为启动子只要是在大肠杆菌等宿主细胞中能够表达的都可以。例如trp启动子(Ptrp)、lac启动子(Plac)、PL启动子、PR启动子、PSE启动子等、来自大肠杆菌或噬菌体的启动子、SP01启动子、SP02启动子、penP启动子等。而象将两个Ptrp直线排列的启动子、tac启动子、lacT7启动子、let I启动子那样人为设计改变了的启动子也可以利用。
使用将核糖体结合序列SD(Shine-Dalgarno)序列和起始密码之间隔有适当距离(例如6～18碱基)的质粒最理想。
在本发明的重组DNA中，在目的DNA表达中不一定需要转录终止序列，如果设置，最好是将转录终止序列设置在紧靠结构基因的下面。
作为原核生物有属于埃希氏菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、微杆菌属、假单孢菌属的微生物，例如大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌W1485、大肠杆菌NM522、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、无花果沙雷氏菌Serratia ficaria、居泉沙雷氏菌Serratia fonticola、液化沙雷氏菌Serratia liquefaciens、粘质沙雷氏菌Serratia marcescens、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyliliquefaciens、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、解糖短杆菌Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、产氨棒杆菌、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14067、谷氨酸棒杆菌ATCC13869、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870、嗜氨微杆菌Microbacteriumammoniaphilum ATCC 15354、Pseudomonas sp.D-0110等。
作为重组DNA的导入方法，只要是能将DNA导入上述宿主细胞的方法都可以用，例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.69，2110(1972)]、原生质体法(特开昭63-248394)、电穿孔法[Nucleicacids Res.，16，6127(1988)]等方法。
用酵母菌株作为宿主细胞时，作为表达载体可以用YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
作为启动子，只要是在酵母菌株中能够表达的都可以用，例如可以用PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal 1启动子、gal 10启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子、CUP 1启动子等。
作为宿主细胞有属于酵母属、裂殖酵母属Schizosaccharomyces、克鲁维酵母属Kluyveromyces、丝孢酵母属Tichosporon、许旺酵母属Schwanniomyces、毕赤酵母属Pichia、假丝酵母属Candida的酵母菌株，具体讲有酿酒酵母、粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe、乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis、茁芽丝孢酵母Tichosporonpullulans、河岸许旺酵母Schwanniomyces alluvius、毕赤酵母Pichiapastoris、产朊假丝酵母Candida utilis等。
作为重组DNA的导入方法，只要是能将DNA导入上述酵母的方法都可以用，例如使用电穿孔法[酶学方法Methods in Enzymol.，194，182(1990)]、原生质球法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.81，4889(1984)]、醋酸锂法[J.Bacteriol.，153，163(1983)]等方法。
本发明的转化菌株在培养基中培养的方法可以按照宿主细胞培养用的常规方法进行。
作为对以大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物为宿主得到的转化菌株进行培养的培养基，只要是含有该生物能够消化吸收的碳源、氮源、无机物等，能有效进行转化菌株培养的培养基，无论是天然培养基，还是合成的培养基都可以用。
作为碳源只要是该生物能消化吸收的就可以，可以用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解产物等碳水化合物、醋酸、丙酸等有机酸、乙醇、丙醇等醇类。
作为氮源可以用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其它的含氮化合物、以及胨、肉汤、酵母提取液、玉米浆、酪蛋白水解产物、大豆粕和大豆粕水解产物、各种发酵菌体、以及其消化物。
作为无机物可以用磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养通常是在振荡培养或深部通气搅拌培养等好氧条件下进行。培养温度最好为15～40℃，培养时间通常为5小时～7天。培养中pH保持在3.0～9.0。调pH用无机或有机的酸、碱性溶液、尿素、碳酸钙、氨等。
另外根据培养的需要，也可以在培养基中添加氨苄青霉素或四环素等抗生素。
对用含有诱导性启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，根据需要也可以在培养基中添加诱导物。例如对用含有lac启动子的表达载体转化的微生物进行培养时培养基中可以添加异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷等，对用含有trp启动子的表达载体转化的微生物进行培养时培养基中可以添加吲哚丙烯酸等。
作为培养物的处理物有培养物的浓缩物、培养物的干燥物、培养物离心后得到的菌体、该菌体的干燥物、该菌体的冷冻干燥物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的超声处理物、该菌体的机械磨碎处理物、该菌体的溶剂处理物、该菌体的酶处理物、该菌体的蛋白级分物、该菌体的固定化物或从该菌体提取的酶标准品等。
在N-乙酰神经氨酸或N-乙酰甘露糖胺的生成中用的微生物量，就所用的各种微生物来说，湿菌体为1～500g/l，理想的是1～300g/l。
作为丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸生成中用的能源，只要是促进生成的能源都可以用，葡萄糖或果糖比较合适。这些能源通常使用的浓度为10～300g/l。
作为丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸生成中用的水介质，有水、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液、甲醇、乙醇等醇类、醋酸乙酯等酯类、丙酮等酮类、乙酰胺等酰胺类。另外N-乙酰神经氨酸或N-乙酰甘露糖胺生成中用的微生物培养基、培养物等也可以作为水介质。
在N-乙酰神经氨酸或N-乙酰甘露糖胺的生成中根据需要也可添加植酸等螯合剂、表面活性剂或有机溶剂。
作为表面活性剂有聚环氧乙烷·十八(烷)胺(例如ナィミ-ンS-215，日本油脂公司制)等非离子表面活性剂、溴化十六烷基三甲基氨或烷基二甲基苄基氯化铵(例如Cation F2-40E、日本油脂公司制造)等阳离子表面活性剂、十二烷酰·肌氨酸苷(ラゥロィルザルコミネ-ト)等阴离子表面活性剂、烷基二甲基胺(例如叔胺FB、日本油脂公司制造)等三级胺类等，只要是促进N-乙酰神经氨酸或N-乙酰甘露糖胺的生成的都可以用，可以用一种或数种混合用。所用的表面活性剂的浓度通常为0.1～50g/l。
作为有机溶剂，有二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮、醋酸乙酯等，通常的使用浓度为0.1～50ml/l。
N-乙酰神经氨酸或N-乙酰甘露糖胺的生成反应是在水介质中pH5～10、理想的是pH6～8、20～50℃的条件下进行1～96小时。
为了促进该生成反应，可添加腺嘌呤、腺苷-5′-一磷酸(AMP)、腺苷-5′-三磷酸(ATP)、硫酸镁、氯化镁等。通常使用的腺嘌呤、AMP、ATP浓度为0.01～100mmol/l。
水介质中生成的N-乙酰神经氨酸或N-乙酰甘露糖胺的定量分析可以用Dionex公司制造的糖分析装置进行[分析生物化学，Anal.Biochem.，189，151(1990)]。
反应液中生成的N-乙酰神经氨酸或N-乙酰甘露糖胺的提取可以通过使用活性碳或离子交换树脂等通常用的方法进行。
以下给出本发明的实施例，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1.来自大肠杆菌的N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因表达菌株的构建
按照《分子生物学中的常规操作》记载的方法对大肠杆菌W3110(ATCC27325)培养后，分离纯化该微生物的染色体DNA。
利用パ-セプティブ·バィォシステムズ公司制造的8905型DNA合成仪分别合成序列3和序列4记载的DNA引物。
以大肠杆菌W3110(ATCC27325)菌株的染色体DNA作模板，上述合成的DNA为引物，进行PCR：用含有染色体DNA 0.1μg、引物各0.5μmol/l、Pfu DNA聚合酶(STRATAGENE公司制造)2.5单位、Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液(STRATAGENE公司制造)4μl、脱氧NTP各200μmol/l的反应液40μl，进行30轮循环反应，每循环反应过程为94℃-1分钟、42℃-2分钟、72℃-3分钟。
取该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认目的片段扩增后，添加与剩下的反应液等量的TE[10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/l EDTA]饱和酚/氯仿(1vol/1vol)，进行混合。将该混合液离心分离后，向得到的上层液中加入2倍容量的冷乙醇，混合。于-80℃下放置30分钟。然后离心得到DNA沉淀。
将该DNA沉淀溶解于20μl的TE中。取该溶解液5μl，用限制性内切酶HindIII和BamHI切DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，利用genecleanII试剂盒(Bio101公司制造)回收1.2kb片段。用限制性内切酶HindIII和BamHI切0.2μg的pUC19DNA[Gene，33，103(1985)]，经琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，回收2.7kb片段。
使用连接反应试剂盒于16℃对上述回收的1.2kb和2.7kb的片段进行连接反应(进行16小时)。用该连接反应液按照上述众所周知的方法对具有丙酮酸生产能力的大肠杆菌NM522菌株进行转化，将该转化菌株涂布于含有氨苄青霉素50μg/ml的LB琼脂培养基后，于30℃下培养过夜。
从繁殖起来的转化菌株的菌落获得带有N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因nanA的转化菌株大肠杆菌NM522/pTA3。按照常规方法从该菌株中提取质粒，得到N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因表达质粒pTA3。通过限制性内切酶消化可以确认该质粒的构造(图1)。
实施例2.N-乙酰神经氨酸的生产
将实施例1中得到的大肠杆菌NM522/pTA3接种于加入了含有氨苄青霉素50μg/ml的LB琼脂培养基125ml的容积为1L的带有折流板的三角烧瓶中，在28℃，220rpm的条件下培养17个小时。将该培养液125ml接种于由葡萄糖10g/l、细菌胰蛋白胨(ミクトトリプトン)(ディフコ公司制造)12g/l、酵母提取液(ディフコ公司制造)24g/l、KH2PO42.3g/l、K2HPO412.5g/l、氨苄青霉素50μg/ml组成的液体培养基(没调pH)2.5L的5L容积的培养槽，于37℃、600rpm、通气量2.5L/分的条件下培养6小时。培养过程中，用28％氨水将培养液的pH维持在7.0。另外根据培养过程中的需要添加葡萄糖。将该培养液离心分离，获得湿菌体。根据需要可以将该湿菌体于-20℃下保存，使用前解冻。
向200ml容积的烧杯中加入由大肠杆菌NM522/pTA3湿菌体50g/l、果糖65g/l、N-乙酰甘露糖胺40g/l、KH2PO4 25g/l、MgSO4·7H2O5g/l、植酸5g/l、ナィミ-ンS-215 4g/l、二甲苯10ml/l组成的反应液30ml，该反应液用磁力搅拌器搅拌(900rpm)，于32℃反应25小时。反应中用4N NaOH将该反应液的pH维持在7.2，根据需要添加果糖、KH2PO4。
反应结束后，用ダィォネツクス公司制造的糖分析仪(DX-500)分析反应的生成物，确认反应液中生成了0.34g/l的N-乙酰神经氨酸。
实施例3.来自大肠杆菌的N-乙酰神经氨酸合成酶基因表达菌株的构建
按照记载的分子生物学中的常规操作方法对大肠杆菌K235(ATCC13027)进行培养后，分离纯化该微生物的染色体DNA。
利用パ-セプティブ·バィォシステムズ公司制造的8905型DNA合成仪分别合成序列5和序列6记载的DNA引物。
以大肠杆菌K235(ATCC13027)菌株的染色体DNA作模板，上述合成的DNA为引物，进行PCR：用含有染色体DNA 0.1μg、引物各0.5μmol/l、Pfu DNA聚合酶(STRATAGENE公司制造)2.5单位、Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液(STRATAGENE公司制造)4μl、脱氧NTP各200μmol/l的反应液40μl，进行30轮循环反应，每循环反应过程为94℃-1分钟、42℃-2分钟、72℃-3分钟。
取该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认目的片段扩增后，添加与剩下的反应液等量的TE饱和酚/氯仿(1vol/1vol)，进行混合。将该混合液离心分离后，向得到的上层液中加入2倍容量的冷乙醇，混合。于-80℃下放置30分钟。然后离心得到DNA沉淀。
将该DNA沉淀溶解于20μl的TE中。取该溶解液5μl，用限制性内切酶ClaI和BamHI切DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，利用genecleanII试剂盒(Bio101公司制造)回收1.1kb片段。用限制性内切酶ClaI和BamHI切0.2μg的pPAC31 DNA(WO98/12343)，经琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，回收5.5kb片段。
使用连接反应试剂盒于16℃对上述回收的1.1kb和5.5kb的片段进行连接反应(进行16小时)。用该连接反应液按照上述众所周知的方法对具有磷酸烯醇式丙酮酸生产能力的大肠杆菌NM522菌株进行转化，将该转化菌株涂布于含有氨苄青霉素50μg/ml的LB琼脂培养基后，与30℃下培养过夜。
从繁殖起来的转化菌株的菌落获得带有N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB的转化菌株大肠杆菌NM522/pYP18。根据常规方法从该菌株中提取质粒，得到N-乙酰神经氨酸合成酶基因表达质粒pYP18。通过限制性内切酶消化可以确认该质粒的构造(图2)。
实施例4. N-乙酰神经氨酸的生产
将实施例3中得到的大肠杆菌NM522/pYP18接种于加入了含有氨苄青霉素50μg/ml的LB琼脂培养基125ml的容积为1L的带有折流板的三角烧瓶中，在28℃，220rpm的条件下培养17个小时。将该培养液125ml接种于由葡萄糖10g/l、细菌胰蛋白胨(ディフコ公司制造)12g/l、酵母提取液(ディフコ公司制造)24g/l、KH2PO42.3g/l、K2HPO412.5g/l、氨苄青霉素50μg/ml组成的液体培养基(没调pH)2.5L的5L容积的培养槽，于37℃下培养4小时后，再于40℃下、600rpm、通气量2.5L/分的条件下培养3小时。培养过程中，用28％氨水将培养液的pH维持在7.0。另外根据培养过程中的需要添加葡萄糖。
将该培养液离心分离，获得湿菌体。根据需要可以将该湿菌体于-20℃下保存，使用前解冻。
向200ml容积的烧杯中加入由大肠杆菌NM522/pYP18湿菌体50g/l、果糖65g/l、N-乙酰甘露糖胺40g/l、KH2PO4 25g/l、MgSO4·7H2O5g/l、植酸5g/l、ナィミ-ン S-215 4g/l、二甲苯10ml/l组成的反应液30ml，该反应液用磁力搅拌器搅拌(900rpm)，于32℃反应19小时。反应中用4N NaOH将该反应液的pH维持在7.2，根据需要添加果糖、KH2PO4。
反应结束后，用ダィォネツクス公司制造的糖分析仪(DX-500)分析反应的生成物，确认反应液中生成了1.4g/l的N-乙酰神经氨酸。
实施例5. N-乙酰神经氨酸的生产
将实施例3中得到的大肠杆菌NM522/pYP18菌株按照实施例2记载的方法进行培养，通过离心分离获得湿菌体。根据需要可以将该湿菌体于-20℃下保存，使用前解冻。
将产氨棒杆菌ATCC21170菌株接种于加入了由如下试剂组成的液体培养基(用10N NaOH将pH调到7.2)25ml的容积为300ml的带有折流板的三角烧瓶中，在28℃，220rpm的条件下培养24个小时。组成液体培养基的试剂有：葡萄糖50g/l、聚蛋白胨(ポリペプトン)(日本制药公司制造)10g/l、酵母提取液(Oriental酶母公司制造)10g/l、尿素5g/l、(NH4)2SO4 5g/l、KH2PO4 1g/l、K2HPO4 3g/l、MgSO4·7H2O1g/l、CaCl2·2H2O 0.1g/l、FeSO4·7H2O 10mg/l、ZnSO4·7H2O 10mg/l、MnSO4·4～6H2O 20mg/l、L-半胱氨酸20mg/l、D-泛酸钙10mg/l、维生素B1 5mg/l、烟酸5mg/l、以及生物素30μg/l。
将培养液20ml接种于加有与上述同样组成的液体培养基250ml的容积为2L的带有折流板的三角烧瓶中，在28℃，220rpm的条件下培养24个小时。得到的培养液用作种子液。
将该种子培养液250ml接种于加入了由如下试剂组成的液体培养基(用10N NaOH将pOOH调到7.2)2.25L的容积为5L的培养槽中，在32℃，600rpm、通气量2.5L/分的条件下培养24个小时。培养过程中，用氨水将培养液的pH维持在6.8。组成液体培养基的试剂为：葡萄糖150g/l、肉汤(极东制药公司制造)5g/l、KH2PO4 10g/l、K2HPO410g/l、MgSO4·7H2O 10g/l、CaCl2·2H2O 0.1g/l、FeSO4·7H2O20mg/l、ZnSO4·7H2O 10mg/l、MnSO4·4～6H2O 20mg/l(另外灭菌)、β-丙氨酸15mg/l(另外灭菌)、L-半胱氨酸20mg/l、生物素100μg/l、尿素2g/l、以及维生素B1 5mg/l(另外灭菌)。
将该培养液离心分离，获得湿菌体。根据需要可以将该湿菌体于-20℃下保存，使用前解冻。
向200ml容积的烧杯中加入由大肠杆菌NM522/pYP18湿菌体50g/l、产氨棒杆菌ATCC21170菌株湿菌体150g/l、果糖65g/l、N-乙酰甘露糖胺40g/l、KH2PO4 25g/l、MgSO4·7H2O 5g/l、植酸5g/l、ナィミ-ン S-215 4g/l、二甲苯10ml/l组成的反应液30ml，该反应液用磁力搅拌器搅拌(900rpm)，于32℃反应6小时。反应中用4N NaOH将该反应液的pH维持在7.2，根据需要添加果糖、KH2PO4。
反应结束后，用ダィォネツクス公司制造的糖分析仪(DX-500)分析反应的生成物，确认反应液中生成蓄积了3.1g/l的N-乙酰神经氨酸。
实施例6.来自集胞蓝细菌的N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶基因表达菌株的构建
以来自猪的N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的氨基酸序列[J.Biol.Chem.，271，16294(1996)]作为搜索项，于基因库(Genbank)的Blast Search和作为Synechocystis sp.(PCC6803)菌株的基因组序列的数据库的CyanoBase(http：//www.kazusa.or.jp/cyano/)中进行同源性检索(Similarity Search)，检索结果表明该氨基酸序列与来自和作为肾素结合蛋白(renin-binding protein)记载的Synechocystis sp.(PCC6803)的序列(slr1975)具有很高的同源性。
按照基因微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)，111，1(1979)记载的方法对Synechocystis sp.(PCC6803)培养后，按《分子生物学中的常规操作方法》中记载方法分离纯化该微生物的染色体DNA。
利用パ-セプティブ·ミィォシステムズ公司制造的8905型DNA合成仪分别合成序列7和序列8记载的DNA引物。以Synechocystis sp.(PCC6803)的染色体DNA作模板，按照实施例1记载的方法进行PCR操作。
取该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认目的片段扩增后，添加与剩下的反应液等量的TE饱和酚/氯仿(1vol/1vol)，进行混合。
将该混合液离心分离后，向得到的上层液中加入2倍容量的冷乙醇，混合。于-80℃下放置30分钟。然后离心得到DNA沉淀。
将该DNA沉淀溶解于20μl的TE中。
取该溶解液5μl，用限制性内切酶ClaI和BamHI切DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，利用genecleanII试剂盒(Bio101公司制造)回收1.2kb片段。
用限制性内切酶ClaI和BamHI切0.2μg的pPAC31 DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，回收5.5kb片段。
使用连接反应试剂盒于16℃对上述回收的1.2kb和5.5kb的片段进行连接反应(进行16小时)。
用该连接反应液按照上述众所周知的方法对大肠杆菌NM522菌株进行转化，将该转化菌株涂布于含有氨苄青霉素50μg/ml的LB琼脂培养基后，与30℃下培养过夜。
从繁殖起来的转化菌株的菌落获得编码来自Synechocystis sp.的N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的转化菌株大肠杆菌NM522/pYP16。根据常规方法从该菌株中提取质粒，得到表达质粒pYP16。通过限制性内切酶消化可以确认该质粒的构造(图3)。
实施例7. N-乙酰神经氨酸的生产
将在实施例1得到的大肠杆菌NM522/pTA3按照实施例2记载的方法进行培养，经离心获得湿菌体。根据需要可以将该湿菌体于-20℃下保存，使用前解冻。
将实施例6中得到的大肠杆菌NM522/pYP16菌株接种于加入了含有氨苄青霉素50μg/ml的LB琼脂培养基125ml的容积为1L的带有折流板的三角烧瓶中，在28℃，220rpm的条件下培养17个小时。将该培养液125ml接种于由葡萄糖10g/l、细菌蛋白胨(バクトトプトン)(ディフコ公司制造)12g/l、酵母提取液(ディフコ公司制造)24g/l、KH2PO42.3g/l、K2HPO412.5g/l、氨苄青霉素50μg/ml组成的液体培养基(没调pH)2.5L的5L容积的培养槽，于30℃培养4小时后，再于40℃、600rpm、通气量2.5L/分的条件下培养3小时。培养过程中，用28％氨水将培养液的pH维持在7.0。另外根据培养过程中的需要添加葡萄糖。
将该培养液离心分离，获得湿菌体。根据需要可以将该湿菌体于-20℃下保存，使用前解冻。
按照实施例5记载的方法培养产氨棒杆菌ATCC21170菌株，经离心获得湿菌体。根据需要可以将该湿菌体于-20℃下保存，使用前解冻。
向200ml容积的烧杯中加入由大肠杆菌NM522/pTA3湿菌体50g/l、大肠杆菌NM522/pYP16湿菌体50g/l、产氨棒杆菌ATCC 21170湿菌体150g/l、果糖65g/l、N-乙酰葡糖胺180g/l、KH2PO4 25g/l、MgSO4·7H2O 5g/l、植酸5g/l、ナィミ-ン S-215 4g/l、二甲苯10ml/l组成的反应液30ml，该反应液用磁力搅拌器搅拌(900rpm)，于32℃反应24小时。反应中用4N NaOH将该反应液的pH维持在7.2，根据需要添加果糖、KH2PO4。
反应结束后，用ダィォネツクス公司制造的糖分析仪(DX-500)分析反应的生成物，确认反应液中生成了1.0g/l的N-乙酰神经氨酸。
实施例8.N-乙酰神经氨酸的生产
将在实施例3得到的大肠杆菌NM522/pYP18以及在实施例6得到大肠杆菌NM522/pYP16菌株按照实施例4和7记载的方法分别进行培养，经离心获得湿菌体。根据需要可以将该湿菌体于-20℃下保存，使用前解冻。
向200ml容积的烧杯中加入由大肠杆菌NM522/pYP16湿菌体50g/l、大肠杆菌NM522/pYP18湿菌体50g/l、果糖65g/l、N-乙酰葡糖胺180g/l、KH2PO4 25g/l、MgSO4·7H2O 5g/l、植酸5g/l、ナィミ-ン S-215 4g/l、二甲苯10ml/l组成的反应液30ml，该反应液用磁力搅拌器搅拌(900rpm)，于32℃反应11小时。反应中用4N NaOH将该反应液的pH维持在7.2，根据需要添加果糖、KH2PO4。
反应结束后，用ダィォネツクス公司制造的糖分析仪(DX-500)分析反应的生成物，确认反应液中生成了1.3g/l的N-乙酰神经氨酸。
实施例9. N-乙酰神经氨酸的生产
将实施例3中得到的大肠杆菌NM522/pYP18以及实施例6得到的大肠杆菌NM522/pYP16菌株按照实施例4和7记载的方法分别进行培养，经离心获得湿菌体。根据需要可以将该湿菌体于-20℃下保存，使用前解冻。
按照实施例5记载的方法培养产氨棒杆菌ATCC21170菌株，经离心获得湿菌体。根据需要可以将该湿菌体于-20℃下保存，使用前解冻。
向200ml容积的烧杯中加入由大肠杆菌NM522/pYP16湿菌体50g/l、大肠杆菌NM522/pYP18湿菌体50g/l、产氨棒杆菌ATCC21170湿菌体150g/l、果糖65g/l、N-乙酰葡糖胺180g/l、KH2PO4 25g/l、MgSO4·7H2O 5g/l、植酸5g/l、ナィミ-ン S-215 4g/l、二甲苯10ml/l组成的反应液30ml，该反应液用磁力搅拌器搅拌(900rpm)，于32℃反应24小时。反应中用4N NaOH将该反应液的pH维持在7.2，根据需要添加果糖、KH2PO4。
反应结束后，用ダィォネツクス公司制造的糖分析仪(DX-500)分析反应的生成物，确认反应液中生成了4.3g/l的N-乙酰神经氨酸。
实施例10. N-乙酰神经氨酸的生产
将实施例3中得到的大肠杆菌NM522/pYP18以及实施例6得到的大肠杆菌NM522/pYP16菌株按照实施例4和7记载的方法分别进行培养，经离心获得湿菌体。根据需要可以将该湿菌体于-20℃下保存，使用前解冻。
按照实施例5记载的方法培养产氨棒杆菌ATCC21170菌株，经离心获得湿菌体。根据需要可以将该湿菌体于-20℃下保存，使用前解冻。
向200ml容积的烧杯中加入由大肠杆菌NM522/pYP16湿菌体50g/l、大肠杆菌NM522/pYP18湿菌体50g/l、产氨棒杆菌ATCC21170湿菌体150g/l、葡萄糖100g/l、N-乙酰葡糖胺180g/l、腺嘌呤5g/l、KH2PO4 15g/l、MgSO4·7H2O 5g/l、植酸5g/l、ナィミ-ン S-215 4g/l、二甲苯10ml/l组成的反应液30ml，该反应液用磁力搅拌器搅拌(900rpm)，于32℃反应22小时。反应中用4N NaOH将该反应液的pH维持在7.2，根据需要添加葡萄糖、KH2PO4。
反应结束后，用ダィォネツクス公司制造的糖分析仪(DX-500)分析反应的生成物，确认反应液中生成了12.3g/l的N-乙酰神经氨酸。利用本发明可以不用添加丙酮酸等高价原料而能有效地制造N-乙酰神经氨酸。
本发明所获得的各微生物的保藏情况如下：
大肠杆菌NM522/pTA3(Escherichia coli NM522/pTA3)菌株于2000年8月28交日本国工业技术院生命工学工业技术研究所(地址：日本国茨城县筑波市东1丁目3番，邮政编码305-8566)保藏，保藏号FERM BP-7284。
大肠杆菌NM522/pYP18(Escherichia coli NM522/pYP18)菌株于2000年8月28交日本国工业技术院生命工学工业技术研究所(地址：日本国茨城县筑波市东1丁目3番，邮政编码305-8566)保藏，保藏号FERM BP-7283。
大肠杆菌NM522/pYP16(Escherichia coli NM522/pYP16)菌株于2000年8月28交日本国工业技术院生命工学工业技术研究所(地址：日本国茨城县筑波市东1丁目3番，邮政编码305-8566)保藏，保藏号FERM BP-7282。
序列表
<110>协和发酵工业株式会社
<120>N-乙酰神经氨酸的制造方法
<130>H11-0691N2
<140>
<141>
<160>8
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>391
<212>PRT
<213>Synechocystis sp.(PCC6803)
<400>1
Met Ile Ala His Arg Arg Gln Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Tyr Gln Ala
1 5 10 15
Leu His Gln Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Lys Tyr Ser Leu Asp Arg
20 25 30
Gln Gly Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Lys Gly Gln Val Phe
35 40 45
Asp Thr Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Gln Phe
50 55 60
Ala Val Phe Tyr Asn Arg Leu Glu Pro Lys Pro Gln Trp Leu Glu Ile
65 70 75 80
Ala Arg His Gly Ala Asp Phe Leu Ala Arg His Gly Arg Asp Gln Asp
85 90 95
Gly Asn Trp Tyr Phe Ala Leu Asp Gln Glu Gly Lys Pro Leu Arg Gln
100 105 110
Pro Tyr Asn Val Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln
115 120 125
Tyr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Gln Glu Ala Lys Ala Ile Ala Leu Gln
130 135 140
Ala Tyr Asn Ash Val Leu Arg Arg Gln His Asn Pro Lys Gly Gln Tyr
145 150 155 160
Glu Lys Ser Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Leu Lys Ser Leu Ala Val Pro
165 170 175
Met Ile Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Pro
180 185 190
Thr Thr Val Glu Glu Val Leu Ala Gln Thr Val Arg Glu Val Met Thr
195 200 205
Asp Phe Leu Asp Pro Glu Ile Gly Leu Met Arg Glu Ala Val Thr Pro
210 215 220
Thr Gly Glu Phe Val Asp Ser Phe Glu Gly Arg Leu Leu Asn Pro Gly
225 230 235 240
His Gly Ile Glu Ala Met Trp Phe Met Met Asp Ile Ala Gln Arg Ser
245 250 255
Gly Asp Arg Gln Leu Gln Glu Gln Ala Ile Ala Val Val Leu Asn Thr
260 265 270
Leu Glu Tyr Ala Trp Asp Glu Glu Phe Gly Gly Ile Phe Tyr Phe Leu
275 280 285
Asp Arg Gln Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu
290 295 300
Trp Trp Val His Leu Glu Thr Leu Val Ala Leu Ala Lys Gly His Gln
305 310 315 320
Ala Thr Gly Gln Glu Lys Cys Trp Gln Trp Phe Glu Arg Val His Asp
325 330 335
Tyr Ala Trp Ser His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly
340 345 350
Tyr Leu Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys
355 360 365
Trp Lys Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Leu Trp Leu Cys Ala Glu
370 375 380
Thr Leu Gln Leu Pro Val Ser
385 390
<210>2
<211>1173
<212>DNA
<213>Synechocystis sp.(PCC6803)
<400>2
atg att gcc cat cgc cgt cag gag tta gcc cag caa tat tac cag gct 48
Met Ile Ala His Arg Arg Gln Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Tyr Gln Ala
1 5 10 15
tta cac cag gac gta ttg ccc ttt tgg gaa aaa tat tcc ctc gat cgc 96
Leu His Gln Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Lys Tyr Ser Leu Asp Arg
20 25 30
cag ggg ggc ggt tac ttt acc tgc tta gac cgt aaa ggc cag gtt ttt 144
Gln Gly Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Lys Gly Gln Val Phe
35 40 45
gac aca gat aaa ttc att tgg tta caa aac cgt cag gta tgg cag ttt 192
Asp Thr Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Gln Phe
50 55 60
gcc gtt ttc tac aac cgt ttg gaa cca aaa ccc caa tgg tta gaa att 240
Ala Val Phe Tyr Asn Arg Leu Glu Pro Lys Pro Gln Trp Leu Glu Ile
65 70 75 80
gcc cgc cat ggt gct gat ttt tta gct cgc cac ggc cga gat caa gac 288
Ala Arg His Gly Ala Asp Phe Leu Ala Arg His Gly Arg Asp Gln Asp
85 90 95
ggt aat tgg tat ttt gct ttg gat cag gaa ggc aaa ccc ctg cgt caa 336
Gly Asn Trp Tyr Phe Ala Leu Asp Gln Glu Gly Lys Pro Leu Arg Gln
100 105 110
ccc tat aac gtt ttt tcc gat tgc ttc gcc gcc atg gcc ttt agt caa 384
Pro Tyr Ash Val Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln
115 120 125
tat gcc tta gcc agt ggg gcg cag gaa gct aaa gcc att gcc ctg cag 432
Tyr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Gln Glu Ala Lys Ala Ile Ala Leu Gln
130 135 140
gcc tac aat aac gtc cta cgc cgt cag cac aat ccc aaa ggt caa tac 480
Ala Tyr Asn Asn Val Leu Arg Arg Gln His Asn Pro Lys Gly Gln Tyr
145 150 155 160
gag aag tcc tat cca ggt act aga ccc ctc aaa tcc ctg gcg gtg ccg 528
Glu Lys Ser Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Leu Lys Ser Leu Ala Val Pro
165 170 175
atg att tta gcc aac ctc acc ctg gag atg gaa tgg tta tta ccg cct 576
Met Ile Leu Ala Ash Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Pro
180 185 190
act acc gtg gaa gag gtg ttg gcc caa acc gtc aga gaa gtg atg acg 624
Thr Thr Val Glu Glu Val Leu Ala Gln Thr Val Arg Glu Val Met Thr
195 200 205
gat ttc ctc gac cca gaa ata gga tta atg cgg gaa gcg gtg acc ccc 672
Asp Phe Leu Asp Pro Glu Ile Gly Leu Met Arg Glu Ala Val Thr Pro
210 215 220
aca gga gaa ttt gtt gat agt ttt gaa ggg cgg ttg ctc aac cca gga 720
Thr Gly Glu Phe Val Asp Ser Phe Glu Gly Arg Leu Leu Asn Pro Gly
225 230 235 240
cac ggc att gaa gcc atg tgg ttc atg atg gac att gcc caa cgc tcc 768
His Gly Ile Glu Ala Met Trp Phe Met Met Asp Ile Ala Gln Arg Ser
245 250 255
ggc gat cgc cag tta cag gag caa gcc att gca gtg gtg ttg aac acc 816
Gly Asp Arg Gln Leu Gln Glu Gln Ala Ile Ala Val Val Leu Asn Thr
260 265 270
ctg gaa tat gcc tgg gat gaa gaa ttt ggt ggc ata ttt tat ttc ctt 864
Leu Glu Tyr Ala Trp Asp Glu Glu Phe Gly Gly Ile Phe Tyr Phe Leu
275 280 285
gat cgc cag ggc cac cct ccc caa caa ctg gaa tgg gac caa aag ctc 912
Asp Arg Gln Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu
290 295 300
tgg tgg gta cat ttg gaa acc ctg gtt gcc cta gcc aag ggc cac caa 960
Trp Trp Val His Leu Glu Thr Leu Val Ala Leu Ala Lys Gly His Gln
305 310 315 320
gcc act ggc caa gaa aaa tgt tgg caa tgg ttt gag cgg gtc cat gat 1008
Ala Thr Gly Gln Glu Lys Cys Trp Gln Trp Phe Glu Arg Val His Asp
325 330 335
tac gcc tgg agt cat ttc gcc gat cct gag tat ggg gaa tgg ttt ggc 1056
Tyr Ala Trp Ser His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly
340 345 350
tac ctg aat cgc cgg gga gag gtg tta ctc aac cta aaa ggg ggg aaa 1104
Tyr Leu Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys
355 360 365
tgg aaa ggg tgc ttc cac gtg ccc cga gct ctg tgg ctc tgt gcg gaa 1152
Trp Lys Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Leu Trp Leu Cys Ala Glu
370 375 380
act ctc caa ctt ccg gtt agt 1173
Thr Leu Gln Leu Pro Val Ser
385 390
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>3
gtgtaagctt tctgtatggg gtgt
24
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>4
gcagggatcc caaccaggca gcggaa
26
<210>5
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>5
tttatcgata ttaattaggg ggaatgaatg ag 32
<210>6
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
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tttggatcct cattattccc cctgattttt gaa 33
<210>7
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>合成DNA
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taaatcgata tttgtatgat tgcccatcgc cgtcag 36
<210>8
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>8
aaaggatcct taactaaccg gaag ttggag agtttc 36
Claims (27)
1.N-乙酰神经氨酸的制造方法，其特征是：使水介质中①含有具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶或N-乙酰神经氨酸合成酶活性的微生物的培养物或该培养物的处理物，②在上述①中使用具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的微生物时，含有具有丙酮酸生成能力的微生物的培养物或该培养物的处理物，在上述①中使用具有N-乙酰神经氨酸合成酶活性的微生物时，含有具有磷酸烯醇式丙酮酸生成能力的微生物的培养物或该培养物的处理物，③含有N-乙酰甘露糖胺、以及④丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸生成时所必需的能源，使N-乙酰神经氨酸在该水介质中生成、蓄积，从该水介质中提取N-乙酰神经氨酸。
2.权利要求1记载的制造方法，N-乙酰甘露糖胺是通过使水介质中含有具有N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性的微生物的培养物或该培养物的处理物以及N-乙酰葡糖胺，然后使N-乙酰甘露糖胺在该水介质中生成、蓄积得到的。
3.权利要求2记载的制造方法，具有N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶活性的微生物是带有重组DNA的微生物，该重组DNA是由编码N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的DNA片段与载体重组形成的。
4.权利要求3记载的制造方法，编码N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的DNA是来自属于集胞蓝细菌属(Synechocystis)的微生物的DNA。
5.权利要求3或4记载的制造方法，编码N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶的DNA是以下(a)或(b)中的DNA：
(a)编码由序列1记载的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA，
(b)具有序列2记载的碱基序列的DNA。
6.权利要求1～4记载的任一种制造方法，具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的微生物是属于埃希氏菌属(Escherichia)或棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物。
7.权利要求5记载的方法，具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的微生物是属于埃希氏菌属或棒杆菌属的微生物。
8.权利要求1～4记载的任一种制造方法，具有N-乙酰神经氨酸合成酶活性的微生物是从属于埃希氏菌属、奈瑟氏球菌属(Naisseria)、链球菌属(Streptococcus)的微生物中选出来的微生物。
9.权利要求7记载的方法，具有N-乙酰神经氨酸合成酶活性的微生物是从属于埃希氏菌属、奈瑟氏球菌属、链球菌属的微生物中选出来的微生物。
10.权利要求1～4记载的任一种制造方法，具有丙酮酸生成能力的微生物是从属于埃希氏菌属、棒杆菌属和酵母属(Sacchromyces)的微生物中选出来的微生物。
11.权利要求9记载的方法，具有丙酮酸生成能力的微生物是从属于埃希氏菌属、棒杆菌属和酵母属的微生物中选出来的微生物。
12.权利要求1～4记载的任一种制造方法，具有磷酸烯醇式丙酮酸生成能力的微生物是从属于埃希氏菌属、棒杆菌属和酵母属的微生物中选出来的微生物。
13.权利要求11记载的方法，具有磷酸烯醇式丙酮酸生成能力的微生物是从属于埃希氏菌属、棒杆菌属和酵母属的微生物中选出来的微生物。
14.权利要求6记载的制造方法，属于埃希氏菌属的微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)。
15.权利要求7记载的制造方法，属于埃希氏菌属的微生物是大肠杆菌。
16.权利要求8记载的制造方法，属于埃希氏菌属的微生物是大肠杆菌。
17.权利要求9记载的制造方法，属于埃希氏菌属的微生物是大肠杆菌。
18.权利要求10记载的制造方法，属于埃希氏菌属的微生物是大肠杆菌。
19.权利要求11记载的制造方法，属于埃希氏菌属的微生物是大肠杆菌。
20.权利要求12记载的制造方法，属于埃希氏菌属的微生物是大肠杆菌。
21.权利要求13记载的制造方法，属于埃希氏菌属的微生物是大肠杆菌。
22.权利要求6记载的制造方法，属于棒杆菌属的微生物是产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)。
23.权利要求7记载的制造方法，属于棒杆菌属的微生物是产氨棒杆菌、谷氨酸棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌。
24.权利要求10记载的制造方法，属于棒杆菌属的微生物是产氨棒杆菌、谷氨酸棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌。
25.权利要求11记载的制造方法，属于棒杆菌属的微生物是产氨棒杆菌、谷氨酸棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌。
26.权利要求12记载的制造方法，属于棒杆菌属的微生物是产氨棒杆菌、谷氨酸棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌。
27.权利要求13记载的制造方法，属于棒杆菌属的微生物是产氨棒杆菌、谷氨酸棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌。
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