CN1483077A - Udp-n-乙酰半乳糖胺和含n-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的生产方法 - Google Patents

Udp-n-乙酰半乳糖胺和含n-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的生产方法 Download PDF

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Abstract

依照本发明，利用具有UDP－N－乙酰葡糖胺4－差向异构酶活性的蛋白质可生产UDP－N－乙酰半乳糖胺和含N－乙酰半乳糖胺的碳水化合物。

Description

UDP-N-乙酰半乳糖胺和含N-乙酰半乳糖胺 的碳水化合物的生产方法
技术领域
本发明涉及UDP-N-乙酰半乳糖胺和含有N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的生产方法。某些含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物在癌细胞等中特异性表达，因而可用作抗癌治疗的抗癌疫苗等。进一步，由于脑中存在丰富的含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物，预计其可适用于提高脑功能。UDP-N-乙酰半乳糖胺可用作合成含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的底物。
背景技术
关于UDP-N-乙酰半乳糖胺(以下缩写为UDP-GalNAc)的生产，已有公知的生产方法，其利用源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的无细胞提取物或部分纯化的酶[美国专利号4,569,909；J.Biol.Chem.，234，2801(1959)；Agr.Biol.Chem.，37，1741(1973)；Appl.Environ.Microbio.，41，392(1981)；Microbiol.Immunol.，30，1085(1986)；Agr.Biol.Chem.，49，603(1985)]。然而，上述方法生产UDP-GalNAc的得率低，且源自枯草芽孢杆菌的UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向异构酶(EC5.1.3.7，以下缩写为UDP-GlcNAc 4-差向异构酶)或编码UDP-GlcNAc4-差向异构酶的基因尚未详细说明。
至于源自微生物的UDP-GlcNAc 4-差向异构酶，有报道指出源自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的WbpP蛋白具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶的活性[J.Biol.Chem.，275，19060(2000)]，但尚无用蛋白质或编码该蛋白质的DNA来制备UDP-GalNAc的报道。
另一方面，至于UDP-葡萄糖4-差向异构酶(EC 5.1.3.2)，已知源自仓鼠和人的酶也以UDP-GlcNAc为底物[Cell，44，749(1986)]，但尚无报道显示源自大肠杆菌(Escherichia coli)的UDP-葡萄糖4-差向异构酶[Nucleic Acid Res.，14，7705(1986)]具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶的活性。另外，上文所提及的源自铜绿假单胞菌的WbpP蛋白与已知的UDP-葡萄糖4-差向异构酶没有同源性。
源自下列微生物的已知蛋白质被认为是UDP-葡萄糖4-差向异构酶(galE)，因为其与已知的UDP-葡萄糖4-差向异构酶的氨基酸序列有较高的同源性：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、Arabidopsis thaliana、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、空肠弯曲杆菌空肠亚种(Campylobacter jejuni)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、黏膜炎麽拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、Pisum sativum、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、Cyamopsis tetragonoloba、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、Aquifexaeolicus、集胞蓝细菌属(Synechocystis sp.)、巴西固氮螺菌(Azospiriumbrasilense)、苜宿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、嗜热碱甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、马红球菌(Rhodococcus equi)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、海栖热袍菌(Thermotoga maritma)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、盐杆菌属(Halobacterium sp.)NRC-1、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)和唾液链球菌氏热亚种(Streptococcus thermophilus)。源自微生物如巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、杜氏嗜血菌(Haemophilusducreyi)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的蛋白质也与已知UDP-葡萄糖4-差向异构酶的氨基酸序列有较高的同源性，但其功能尚未阐明。然而，尚不清楚这些蛋白是否具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶的活性及用来制备UDP-GalNAc。
发明公开
本发明的目的是提供生产UDP-N-乙酰半乳糖胺和含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的方法。
本发明人发现因其与已知的UDP-葡萄糖4-差向异构酶的氨基酸序列有较高的同源性，但其功能尚未阐明而被认作是UDP-葡萄糖4-差向异构酶(galE)的蛋白质，或者与已知的UDP-葡萄糖4-差向异构酶的氨基酸序列具有较高同源性的蛋白质，具有UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向异构酶的活性，及发现该酶可用于UDP-N-乙酰半乳糖胺和含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的有效制备。本发明的完成基于上述发现。
本发明涉及下列(1)至(35)。
(1)制备UDP-N-乙酰半乳糖胺(以下缩写为UDP-GalNAc)的方法，其包括：
让酶源和UDP-N-乙酰葡糖胺(以下缩写为UDP-GlcNAc)共存于水介质中，所述的酶源为转化株的培养物，该转化株能产生具UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向异构酶(以下缩写为UDP-GlcNAc 4-差向异构酶)活性的蛋白，或为上述培养物的处理物质；
让UDP-GalNAc在水介质中形成和积聚；及
从水介质中回收UDP-GalNAc。
(2)制备含N-乙酰半乳糖胺(以下缩写为GalNAc)的碳水化合物的方法，其包括：
让酶源、受体碳水化合物、GalNAC转移酶和UDP-GlcNAc共存于水介质中，所述的酶源为转化株的培养物，该转化株能产生具UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白，或为上述培养物的处理物质；
让含GalNAc的碳水化合物在水介质中形成和积聚；及
从水介质中回收含GalNAc的碳水化合物。
(3)制备UDP-GalNAc的方法，其包括：
让酶源、尿苷-5’-三磷酸(以下缩写为UTP)的前体和糖共存于水介质中，所述的酶源为微生物的培养物，该微生物具有从UTP的前体和糖形成UDP-GlcNAc的能力，或为上述培养物的处理物质，及为转化株的培养物，该转化株能产生具UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白或为上述培养物的处理物质；
让UDP-GalNAc在水介质中形成和积聚；及
从水介质中回收UDP-GalNAc。
(4)制备含GalNAc的碳水化合物的方法，其包括：
让酶源、UTP的前体、糖和受体碳水化合物共存于水介质中，所述的酶源为微生物的培养物，该微生物具有从UTP的前体和糖形成UDP-GlcNAc的能力，或为上述培养物的处理物质，为GalNAc转移酶，及为转化株的培养物，该转化株能产生具UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白，或为上述培养物的处理物质；
让含GalNAc的碳水化合物在水介质中形成和积聚；及
从水介质中回收含GalNAc的碳水化合物。
(5)依照(1)至(4)中任何一种所述的方法，其中培养物的处理物质为浓缩的培养物，干燥的培养物，由培养物离心获得的细胞，将细胞进行干燥、冷冻干燥、表面活性剂处理、超声波、机械摩擦、溶剂处理、酶处理、蛋白分级分离或固定而获得的产物，或由细胞提取获得的酶制剂。
(6)依照(2)或(4)所述的方法，其中的受体碳水化合物为复合碳水化合物，其包含在其非还原端具有唾液酸、半乳糖、GalNAc、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸的寡糖。
(7)依照(6)所述的方法，其中在其非还原端具有唾液酸、半乳糖、GalNAc、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸的寡糖为乳糖、N-乙酰乳糖胺、球三糖(globotriose)、唾液酸乳糖、唾液酸-N-乙酰乳糖胺、路易斯X、路易斯a、唾液酸路易斯X、唾液酸路易斯a、硫酸软骨素、デルタマン硫酸、H型1(Fuc α1-2Galβ1-3GlcNAc)或H型2(Fuc α1-2Gal β1-4GlcNAc)。
(8)依照(2)或(4)所述的方法，其中受体碳水化合物为乳糖、N-乙酰乳糖胺、球三糖、唾液酸乳糖、唾液酸-N-乙酰乳糖胺、路易斯X、路易斯a、唾液酸路易斯X、唾液酸路易斯a、硫酸软骨素、デルタマン硫酸、H型1(Fuc α1-2Gal β1-3GlcNAc)或H型2(Fucα1-2Gal β1-4GlcNAc)。
(9)依照(3)或(4)所述的方法，其中前体为乳清酸、乳清酸核苷、尿嘧啶、尿嘧啶核苷或尿嘧啶核苷-5’-一磷酸。
(10)依照(3)或(4)所述的方法，其中糖为葡糖胺或N-乙酰葡糖胺。
(11)依照(3)或(4)所述的方法，其中具有从UTP的前体和糖形成UDP-GlcNAc的能力的微生物选自属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)和糖酵母菌属(Saccharomyces)中的微生物。
(12)依照(11)所述的方法，其中属于埃希氏杆菌属中的微生物为大肠杆菌(Escherichia coli)。
(13)依照(11)所述的方法，其中属于棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物为产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)。
(14)依照(11)所述的方法，其中属于糖酵母菌属(Saccharomyces)的微生物为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
(15)依照(1)至(4)中任一项所述的方法，其中的转化株为将重组DNA导入微生物所获得的转化株。
(16)依照(15)所述的方法，其中的微生物选自属于埃希氏杆菌属、棒杆菌属和糖酵母菌属中的微生物。
(17)依照(16)所述的方法，其中属于埃希氏杆菌属中的微生物为大肠杆菌。
(18)依照(16)所述的方法，其中属于棒杆菌属的微生物为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
(19)依照(16)所述的方法，其中属于糖酵母菌属的微生物为酿酒酵母。
(20)依照(1)至(4)中任一项所述的方法，其中具UDP-GlcNAc4-差向异构酶活性的蛋白为源自属于芽孢杆菌属(Bacillus)或奈瑟氏球菌属(Neisseria)的微生物的具UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白。
(21)依照(20)所述的方法，其中属于芽孢杆菌属的微生物选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。
(22)依照(20)所述的方法，其中属于奈瑟氏球菌属的微生物选自淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)或脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)。
(23)依照(1)至(4)及(20)至(22)中任一项所述的方法，其中具UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白为具有SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列的蛋白。
(24)依照(1)至(4)及(20)至(22)中任一项所述的方法，其中具UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白其组成的氨基酸序列为SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸残基的缺失、替代、插入或加入并具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性。
(25)依照(1)至(4)及(20)至(22)中任一项所述的方法，其中具UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白其组成的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列具有50％或以上的同源性。
(26)依照(15)所述的方法，其中重组DNA包含的DNA编码具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白。
(27)依照(15)所述的方法，其中重组DNA包含的DNA所编码的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶(以下缩写为galE蛋白)具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性。
(28)依照(27)所述的方法，其中galE蛋白来自属于芽孢杆菌属或奈瑟氏球菌属的微生物。
(29)依照(28)所述的方法，其中属于芽孢杆菌属的微生物选自枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌。
(30)依照(28)所述的方法，其中属于奈瑟氏球菌属的微生物为淋病奈瑟氏球菌或脑膜炎奈瑟氏球菌。
(31)依照(15)所述的方法，其中重组DNA包含的DNA编码具有SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列的蛋白。
(32)依照(15)所述的方法，其中重组DNA包含的DNA所编码的蛋白，其组成的氨基酸序列为SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸残基的缺失、替代、插入或加入并具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性。
(33)依照(15)所述的方法，其中重组DNA包含的DNA所编码的蛋白，其组成的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列具有50％或以上的同源性并具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性。
(34)依照(15)所述的方法，其中重组DNA包含的DNA具有SEQ ID NO：3或4所示的核苷酸序列。
(35)依照(15)所述的方法，其中重组DNA包含的DNA与由SEQ ID NO：3或4所示的核苷酸序列组成的DNA在严格条件下进行杂交，且其所编码的蛋白具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性。
任何具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白质都可用于本发明的方法中。合适的实例如下列(1)至(6)。
(1)具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的galE蛋白质
(2)因为与galE蛋白的氨基酸序列有高同源性，其应具有galE蛋白的功能并具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白质
(3)其氨基酸序列与galE蛋白的氨基酸序列的同源性为50％或以上并具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白质
(4)具有如SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列的蛋白质
(5)其组成的氨基酸序列在SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸残基的缺失、替代、插入或加入并具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白质
(6)其组成的氨基酸序列SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列具有50％或以上的同源性并具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白质
具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的galE蛋白的实例源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank登录号X99339)和淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)(GenBank登录号Z215508)。
因其与已知galE蛋白的氨基酸序列有较高同源性而被视为galE蛋白的蛋白质实例源自Bacillus halodurans(GenBank登录号AP001510)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)(GenBank登录号X57315)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)(GenBank登录号U78089)、Arabidopsis thaliana(GenBank登录号AL078468)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)(GenBank登录号AF083467)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)(GenBank登录号X76172)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocoliticia)(GenBank登录号Z47767)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(GenBank登录号CJl1168X4)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)(GenBank登录号AF016844)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)(GenBank登录号AE004405)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatarrhalis)(GenBank登录号AF248584)、Pisum sativum(GenBank登录号U315444)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)(GenBank登录号X83927)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(GenBank登录号M33681)、Cyamopsis tetragonoloba(GenBank登录号AJ005081)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(GenBank登录号AE004568)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(GenBank登录号AJ011653)、Aquifexaeolicus(GenBank登录号AE000721)、集胞蓝细菌属种(Synechocystissp.)(GenBank登录号D90910)、巴西固氮螺菌(Azospiriumbrasilense)(GenBank登录号U09349)、苜宿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)(GenBank登录号X58126)、豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)(GenBank登录号X96507)、嗜热碱甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(GenBank登录号AE000844)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)(GenBank登录号Z49823)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)(GenBank登录号AF221951)、马红球菌(Rhodococcus equi)(GenBank登录号AF277002)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(GenBank登录号AL359989)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)(GenBank登录号M18953)、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)(GenBank登录号AE002053)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)(GenBank登录号AF253311)、海栖热袍菌(Thermotoga maritime)(GenBank登录号AE001727)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)(GenBank登录号M94964)、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(GenBank登录号U67477)、盐杆菌属种(Halobacterium sp.)NRC-1(GenBank登录号AE004975)、Pyrococcushorikoshii(GenBank登录号AP000007)、Pyrococcus abyssi(GenBank登录号AJ248284)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)(GenBank登录号AF0099622)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)(GenBank登录号X86505)、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)(GenBank登录号AE001927)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)(GenBank登录号AE001079)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)(GenBank登录号AF109295)和唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus thermophilus)(GenBank登录号M38175)。
其氨基酸序列与galE蛋白的氨基酸序列的同源性为50％或以上并具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白质的实例源自白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)(GenBank登录号M80338)及源自如巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和无乳链球菌(streptococcus agalactiae)的微生物。
其氨基酸序列与galE蛋白的氨基酸序列的同源性为50％或以上的蛋白质的实例是指那些蛋白，其组成的氨基酸序列与galE蛋白的氨基酸序列的同源性至少为50％或更高，优选60％或高，更优选80％或更高，进一步优选95％或更高。
氨基酸序列和核苷酸序列的同源性可用Karlin和Altschul[Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]的BLAST算法及FASTA[MethodsEnzymol.，183，63(1990)]来确定。在BLAST算法的基础上，已经开发出如BLASTN和BLASTX程序[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]。以BLAST为基础，用BLASTN分析核苷酸序列，所用参数如下，例如，分值＝100和字长＝12。以BLAST为基础，用BLASTX分析氨基序列，所用参数如下，例如，分值＝50和字长＝3。当使用BLAST和GappedBLAST程序时，用各个程序所默认的参数。这类分析的特定技术是已知的(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
用于本发明方法中具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白质的更特定的实例是具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性源自下列微生物的蛋白质，属于枯草杆菌属的如枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌(嗜热脂肪杆菌)，以及属于奈瑟氏球菌属的如淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌。
由其中有一个或多个氨基酸残基缺失、替代或加入的氨基酸序列组成并具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白，例如可通过下列文献所述的定点诱变将突变导入到编码具有SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列的蛋白的DNA中而获得：Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第2版(1989)(下文简称Molecular Cloning，第2版)；CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons(1987-1997)(下文简称Current Protocols in Molecular Biology)；Nucleic Acids Res.，10，6487(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)；Gene，34，315(1985)；Nucleic Acids Res.，13，4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)等。
缺失、替代、插入或加入的氨基酸残基数目没有特别的限制，但通过已知方法如上述定点诱变后，缺失、替代、插入或加入的数目应在可能的范围内。合适的数目为1至数十个，优选为1至20个，更优选为1至10个，进一步优选为1至5个。
表述“一个或多个氨基酸残基在具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的多肽的氨基酸序列中缺失、替代、插入或加入”意为氨基酸序列在其单个或多个任意位点上含有单个或多个氨基酸残基的缺失、替代、插入或加入。缺失、替代、插入和加入可同时包含在一个序列中，替代、插入或加入的氨基酸残基可以是天然的或非天然的。天然的氨基酸残基的实例为L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和L-半胱氨酸。
下列为能够相互替代的氨基酸残基实例。相同组内的氨基酸残基可以相互替代。
A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸
B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基乙二酸、2-氨基辛二酸
C组：天冬酰胺、谷氨酰胺
D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸
E组：脯氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸
F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸
G组：苯丙氨酸、酪氨酸
为了用于本发明的方法中的蛋白质具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性，需要其氨基酸序列与，当按照上文的条件用BLAST、FAST等计算时。理想的是在上述条件下利用BLAST、FASTA等进行计算时，其氨基酸序列与SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列的同源性至少50％或更多，优选60％或更多，更优选80％或更多，甚至优选95％或更多。
用于本发明方法中的DNA编码具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白，其实例为编码上文蛋白(1)至(6)的那些DNA。
特定的实例包括具有SEQ ID NO：3或4所示的核苷酸序列的DNA，和在严格条件下能与上述DNA杂交并且编码具有UDP-GlcNAc4-差向异构酶活性的蛋白的DNA。
上述能够在严格条件下杂交的DNA是指通过克隆杂交、噬菌体杂交、Southern印迹杂交等利用部分或完整的编码依照上述(1)至(6)中的任何一个蛋白的DNA作为探针而获得的DNA。此类DNA的一个特别的实例是其被鉴定为能在65℃，存在0.7至1.0mol/l的氯化钠，使用具克隆或噬菌体来源的DNA固定于其上的滤器来进行杂交，然后在65℃，用0.1至2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液：150mmol/l氯化钠和15mmol/l柠檬酸钠)洗涤滤器。按照《MolecularCloning(分子克隆)，第二版》；《Current Protocols in Molecular Biology(当代分子生物学实验指南)》；《DNA Cloning 1：Core Techniques，A PralticalApproach(DNA克隆1：核心技术，实验方法)，第二版，牛津大学(1995)》等中所描述的方法进行杂交。具体而言，可杂交的DNA包括与SEQ ID NO：3或4所示的核苷酸序列经BLAST或FASTA在上述条件下计算后具至少60％或更高同源性的DNA，优选地，同源性为80％或更高，进一步优选地，同源性为95％或以上。
本发明方法中所使用的能够制备具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白的转化株的获得方法是例如，制备重组DNA，而重组DNA通过将由上文描述的方法制备的编码蛋白的DNA按照《分子克隆，第二版》中所描述的方法连接到载体DNA上，然后按照《分子克隆，第二版》中所描述的方法用重组DNA转化宿主细胞。
本发明方法中所使用的能够表达具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白的转化株的制备描述如下。
(1)编码具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白的DNA的制备
编码具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白的DNA可由源自任一具该酶活性的生物的DNA制备。合适的DNA的实例来自微生物的DNA，优选的微生物属于芽孢杆菌属或奈瑟氏球菌属，更优选的微生物为枯草芽孢杆菌MI112(ATCC 33712)和淋病奈瑟氏球菌(ATCC 33084)。
属于芽孢杆菌属(Bacillus)和奈瑟氏球菌属的微生物可通过已知的方法培养。培养后，通过已知的方法(如，当代分子生物学实验指南)分离和纯化微生物的染色体DNA。
包含编码具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白的DNA的片段可通过聚合酶链反应(PCR)[PCR Protocols(PCR实验指南)，Hamana出版社(1993)]获得，其使用根据已知的编码假定具有UDP-葡萄糖4-差向异构酶(EC5.1.3.2)活性的蛋白的DNA的核苷酸序列而准备的一对引物和作为模板的染色体DNA。合适的核苷酸序列的实例为来自枯草芽孢杆菌、如SEQ ID NO：1所示的序列和来自淋病奈瑟氏球菌、如SEQ ID NO：2所示的序列。
所需的DNA也可通过杂交获得，其使用基于已知核苷酸序列而设计的合成DNA作为探针。
也可以人工合成编码具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白的DNA，其按照常规方法[PCR实验指南，Hamana出版社(1993)]利用合成DNA通过聚合酶链反应获得。
(2)编码具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白的DNA的克隆及核苷酸序列的确认
按上文(1)制备的本发明方法所用的DNA，原样或用合适的限制性内切酶切割后，通过常规方法连接到载体上。
作为DNA所连接的载体，可使用能够在大肠杆菌K12株中自主复制的任何噬菌体载体、质粒载体等。合适的载体实例为ZAP Express[STRATAGENE；Strategies，5，58(1992)]、pBluescript II SK(+)[STRATAGENE；Nucleic Acids Res.，17，9494(1989)]、λzap II(STRATAGENE)、λgt10、λgt11[DNA Cloning，A Practical Approach，1，49(1985)]、λTripl Ex(Clontech)、λExCell(Amersham Pharmacia Biotech)和pUC18[Gene，33，103(1985)]。
作为用作重组DNA的宿主细胞的大肠杆菌，该DNA通过把(1)中制备的本发明方法中所用的DNA连接至载体而获得，属于大肠杆菌的任何微生物均可使用。合适的微生物实例为大肠杆菌XL1-BlueMRF’株[STRATAGENE；Strategies，5，81(1992)]、大肠杆菌C600[Genetics，39，440(1954)]、大肠杆菌Y1088[Science，222，778(1983)]、大肠杆菌Y1090[Science，222，778(1983)]、大肠杆菌NM522[J.Mol.Biol.，166，1(1983)]、大肠杆菌K802[J.Mol.Biol.，16，118(1966)]和大肠杆菌JM105[Gene，38，275(1985)]。
重组DNA的导入可按导入DNA至上述宿主中的任何一种方法来执行，例如，使用钙离子方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、原生质体方法[日本出版的未经审查的专利申请号248394/88(Japanese Published Unexamined Patent Application No.248394/88)]和电穿孔法[Nucleic Acids Res.，16，6127(1988)]。
包含在重组DNA中的本发明的DNA的核苷酸序列可通过从转化株中提取重组DNA后测定，转化株通过上述方式获得。核苷酸序列的测定可使用常规的测序方法，如双脱氧法[Proc.Natl.Acad.SciUSA,74,5463(1977)]或使用核苷酸测序仪如373A DNA测序仪(Perkin-Elmer公司)。
携带按上述方式获得的重组DNA的转化株的实例为大肠杆菌NM522/pGT73，其携带具SEQ ID NO：3所显示的核苷酸序列的质粒DNA，和大肠杆菌NM522/pGT24，其携带具SEQ ID NO：4所显示的核苷酸序列的质粒DNA。
(3)生产具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白的转化株的制备
生产具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白的转化株的制备可按如下方式进行，例如，使用《分子克隆，第二版》和《当代分子生物学实验指南》中所描述的方法。
即，在上述获得的DNA的基础上，按照需要来制备包含编码蛋白区域的合适长度的DNA片段，并将该DNA片段插入到合适表达载体中的启动子的下游以制备重组DNA。然后将重组DNA导入到适合表达载体的宿主细胞中制备成转化株。
作为宿主细胞，能表达所需基因的任何细菌细胞、酵母细胞等均可使用。
可使用的表达载体为能够自主复制或整合到上述宿主细胞的染色体DNA中并在合适的位置包含启动子以转录编码本发明的蛋白的DNA。
当使用原核生物如细菌作为宿主细胞时，优选的是包含能编码具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白的DNA的重组DNA为载体，其能够在原核生物中自主复制并包含启动子、核糖体结合序列、本发明的DNA和转录终止序列。该载体可进一步包含调节启动子的基因。
合适的表达载体的实例为pHelixl(Roche Diagnostics)、pKK233-2(Amersham Pharmacia Biotech)、pSE280(Invitrogen)、pGEMEX-1(Promega)、pQE-8(QIAGEN)、pKYP10(日本出版的未经审查的专利申请号110600/83)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(STRATAGENE)、pTrs30[由大肠杆菌(Escherichia coli)JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[由大肠杆菌(Escherichia coli)JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pPAC31(WO98/12343)、pGHA2[由大肠杆菌(Escherichia coli)IGHA2(FERM B-400)制备；日本出版的未经审查的专利申请号221091/85]、pGKA2[由大肠杆菌(Escherichia coli)IGKA2(FERMBP-6798)制备：日本出版的未经审查的专利申请号221091/85]、pTerm2(US4686191、US4939094和US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.，172，2392(1990)]、pGEX(AmershamPharmacia Biotech)和pET系统(Novagen)。
作为启动子，任何在宿主细胞中具功能的启动子均可使用。例如，来自大肠杆菌(Escherichia coli)或噬菌体的启动子，如可以使用trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子和T7启动子。也可使用人工设计和修饰的启动子，如2个Ptrp启动子合并串联的启动子(Ptrp×2)、tac启动子、lacT7启动子和letI启动子等。
优选使用的质粒是在其中SD序列(核糖体结合序列)和起始密码子之间的距离调整为合适的长度(如，6至18个碱基)。
在本发明的重组DNA中，转录终止序列对于本发明DNA的表达不是必需的，但优选是将转录终止序列的位置紧接着结构基因的下游。
合适的宿主细胞的实例为属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、微杆菌属(Microbacterium)和假单胞菌属(Pseudomonas)的微生物。特定的例子是大肠杆菌(Escherichia coli)XL1-Blue、大肠杆菌(Escherichiacoli)XL2-Blue、大肠杆菌(Escherichia coli)DH1、大肠杆菌(Escherichiacoli)MC1000、大肠杆菌(Escherichia coli)KY3276、大肠杆菌(Escherichia coli)W1485、大肠杆菌(Escherichia coli)JM109、大肠杆菌(Escherichia coli)HB101、大肠杆菌(Escherichia coli)No.49、大肠杆菌(Escherichia coli)W3110、大肠杆菌(Escherichia coli)NY49、大肠杆菌(Escherichia coli)GI698、大肠杆菌(Escherichia coli)TB1、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、Brevibacteriumimmariophilum ATCC 14068，解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)ATCC 14066、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、产谷氨酸短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13869、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC 15354、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和假单胞菌种(Pseudomonas sp.)D-0110。
重组DNA的导入可由导入DNA至上述宿主中的任何一种方法来进行，例如，使用钙离子方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、原生质体方法(日本出版的未经审查的专利申请号248394/88)和下列文献中所描述的方法，Gene，17，107(1982)和Mol.Gen.Genet.，168，111(1979)。
使用酵母为宿主细胞时，可使用YEP13(ATCC 37115)、YEp24(ATCC 37051)、YCp50(ATCC 37419)、pHS19、pHS15等作为表达载体。
作为启动子，在酵母中具功能的任何启动子均可使用。合适的启动子包括糖分解基因的启动子如己糖激酶、PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal 1启动子、gal 10启动子、热激多肽启动子、MF α1启动子和CUP 1启动子。
合适的宿主细胞实例为属于糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、毕赤酵母属(Pichia)和假丝酵母属(Candida)的微生物，具体是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸许旺酵母(Schwanniomyces alluvius)和产朊假丝酵母(Candida utilis)。
重组DNA的导入可由导入DNA至酵母中的任何一种方法来进行，例如，电穿孔法[Methods Enzymol.，194，182(1990)]、原生质球法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929(1978)]、醋酸锂法[J.Bacteriol.，153，163(1983)]和文献Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929(1978)中所描述的方法。
上述制备的转化株的培养可按培养宿主的常规方法来执行，该转化株用于制备UDP-GalNAc和含GalNAc的碳水化合物。
用原核生物如大肠杆菌(Escherichia coli)或真核生物如酵母作为宿主来制备用于本发明方法中的转化株时，任何自然和合成培养基可用作培养转化株的培养基，只要其为适合转化株有效培养的培养基，其包含能被转化株吸收的碳源、氮源、无机盐等。
作为碳源，能被转化株吸收的任何碳源均可使用。合适的碳源的实例包括碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖、包括上述糖的糖蜜、淀粉和淀粉水解物；有机酸如乙酸、丙酸；及醇类如乙醇和丙醇。
作为氮源，氨、有机或无机酸的铵盐如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵，和其他含氮化合物，以及蛋白胨、肉膏、酵母膏、玉米浸渍液、干酪素水解物、豆饼、豆饼水解物和各种发酵过的微生物细胞及其消化产物均可使用。
无机盐的实例包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。
培养在需氧条件下进行，例如，振荡培养或通气下的液下旋转培养，通常在15至40℃下培养16小时至7天。优选的pH为在培养期间维持在3.0至9.0。通过使用有机酸或无机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等来调节pH。
如果需要，可在培养期间向培养基中加入抗生素如氨苄青霉素、四环素和氯霉素。
培养转化有包含可诱导的启动子的重组DNA的微生物时，如果需要，可在培养基中加入诱导剂。例如，在培养转化有包含lac启动子的重组DNA的微生物时，可在培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷或类似物；及在培养转化有包含trp启动子的重组DNA的微生物时，可在培养基中加入吲哚丙烯酸或类似物。
如此所获得的转化株的培养物及其各种处理物质可用作在水介质中生产UDP-GalNAc或含GalNAc的碳水化合物的酶源。
培养物的处理物质包括浓缩的培养物，干燥的培养物，离心培养物获得的细胞，利用各种方式如干燥、冷冻干燥、表面活性剂处理、超声波、机械摩擦、溶剂处理、酶处理、蛋白分级分离和固定化处理细胞所得的产物，提取细胞所获得的酶制剂等。
在生成UDP-GalNAc或含GalNAc的碳水化合物时，使用的酶源浓度为0.1mU/l至10,000U/l，优选为1mU/l至1,000U/l，1个单位(U)定义为在37℃下1分钟内生成1μmol的UDP-GalNAc或含GalNAc的碳水化合物的活性。
用于生成UDP-GalNAc或含GalNAc的碳水化合物的液体培养基包括水、缓冲液如磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和Tris缓冲液，醇类如甲醇和乙醇，酯类如乙酸乙酯，酮类如丙酮，酰胺化合物如乙酰胺等。用作酶源的微生物的培养物也可用作水介质。
如果需要，在生成UDP-GalNAc或含GalNAc的碳水化合物体系中可加入表面活性剂或有机溶剂。任何促进含GalNAc的碳水化合物形成的表面活性剂均可使用。合适的表面活性剂包括非离子表面活性剂如聚氧乙烯十八胺(如，Nymeen S-215，NOF公司)，阳离子表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵和烷基二甲基苄基氯化铵(如，CationF2-40E，NOF公司)，阴离子表面活性剂如月桂酰肌氨酸酯，和叔胺如烷基二甲基胺(如，叔胺FB，NOF公司)，这些表面活性剂可以单独或联合使用。
表面活性剂通常使用的浓度为0.1至50g/l。作为有机溶剂，二甲苯、甲苯、脂族醇、丙酮、乙酸乙酯等通常可使用的浓度为0.1至50ml/l。
用于生成UDP-GalNAc或含GalNAc的碳水化合物的UDP-GacNAc包括可商购的UDP-GacNAc、利用微生物或类似物活性形成的反应溶液及由反应溶液纯化所得的UDP-GacNAc。合适的微生物实例为属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)和糖酵母属(Saccharomuces)的微生物，具体为大肠杆菌(Escherichiacoli)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)和酿酒酵母(Saccharomuces cerevisiae)。这些微生物可单独或联合使用。糖核苷酸底物的使用浓度为0.1至500mmol/l。
UDP-GalNAc的制备方法是让上述的酶源、具有从UTP的前体和糖形成UDP-GlcNAc的能力的微生物的培养物，或上述培养物的处理物质为附加的酶源、UTP的前体和糖共存于水介质中，让UDP-GalNAc在水介质中形成和积聚；及从水介质中回收UDP-GalNAc。
用于本发明方法中UTP前体的实例包括乳清酸、乳清酸核苷、尿嘧啶核苷、尿嘧啶和尿嘧啶核苷-5’-一磷酸。该前体可以为纯化的产物、前体的盐类或由微生物生产的包含该前体的培养物或由培养物获得的部分纯化的产物，只要其中的污染成分在不抑制反应。该类前体的使用浓度为0.1mmol/l至1.0mol/l，优选为0.01至0.5mol/l。
用于本发明方法中的糖的实例包括葡糖胺和N-乙酰葡糖胺。糖可以是纯化的产物，或任何含有糖的产物，只要其中的污染成分在不抑制反应。糖可以在每次反应开始时加入，或部分或连续地在反应期间加入，其所用的浓度为0.1mol/l至2.0mol/l。
含GalNAc的碳水化合物的制备方法是让酶源、具有从UTP的前体和糖形成UDP-GlcNAc的能力的微生物的培养物或上述培养物的处理物质及GalNAc转移酶作为附加酶源、UTP的前体、糖和受体碳水化合物共存于水介质中，让含GalNAc的碳水化合物在水介质中形成和积聚，及从水介质中回收含GalNAc的碳水化合物。
用于形成含GalNAc的碳水化合物中的受体碳水化合物可以是能作为GalNAc转移酶的底物的任一受体碳水化合物。合适的受体碳水化合物的的实例为包含寡糖的受体碳水化合物，所述寡糖在非还原端具有唾液酸、半乳糖、GalNAc、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸。在其非还原端具有唾液酸、半乳糖、GalNAc、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸的寡糖的实例为乳糖、N-乙酰乳糖胺、球三糖、唾液酸乳糖、唾液酸N-乙酰乳糖胺、路易斯X、路易斯a、唾液酸路易斯X、唾液酸路易斯a、硫酸软骨素、デルタマン硫酸、H1型(Fuc α1-2Gal β1-3 GlcNAc)和H2型(Fuc α1-2Galβ1-4GlcNAc)。优选的受体碳水化合物为乳糖、N-乙酰乳糖胺、球三糖、唾液酸乳糖、唾液酸N-乙酰乳糖胺、路易斯X、路易斯a、唾液酸路易斯X、唾液酸路易斯a、硫酸软骨素、デルタマン硫酸、H1型(Fucα1-2Gal β1-3 GlcNAc)和H2型(Fuc α1-2Gal β1-4 GlcNAc)。
受体碳水化合物所用的浓度为0.1至500mmol/l。
如果需要，可在上述形成UDP-GalNAc和含GalNAc的碳水化合物的反应中加入无机盐如MnCl2，β-巯基乙醇及类似物。
形成UDP-GalNAc和含GalNAc的碳水化合物的反应在水介质中执行，其pH为5至10，优选为6至8，在20至50℃下反应1至96小时。
在水介质中形成的UDP-GalNAc和含GalNAc的碳水化合物的测定依照已知的方法进行[Microbiol.Immunol.，30，1085(1986)；Kagaku toKogyo(Chemistry and chemical Industry)，43，953(1990)]。
在反应混合物中形成的UDP-GalNAc和含GalNAc的碳水化合物的回收按照常规方法进行，其使用活性碳、离子交换树脂等。例如，可按Agr.Biol.Chem.37，1741(1973)中描述的方法回收UDP-GalNAc，及按J.Org.Chem.，47，5416(1982)中所描述的方法回收含GalNAc的碳水化合物。
附图简述
图1显示构建质粒pGT73的步骤，该质粒表达能编码具UDP-GacNAc 4-差向异构酶活性的蛋白的基因，其来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
图2显示构建质粒pGT24的步骤，该质粒表达能编码具UDP-GacNAc 4-差向异构酶活性的蛋白的基因，其来自淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)。
图3显示构建质粒pGT87的步骤，该质粒表达β1，4-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因，其来自空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)。
图4显示构建质粒pCJ2的步骤，该质粒表达α1，4-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因，其来自空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)。
图1-4中的符号参照如下。
PL：PL启动子
cI857：cI857阻遏基因
Ampr：氨苄青霉素抗性基因
galE(B.subtilis)：来自枯草杆菌的能编码具UDP-GalNAc4-差向异构酶活性的蛋白质的基因
galE(N.gonorrhoeae)：来自淋病奈瑟氏球菌的能编码具UDP-GalNAc4-差向异构酶活性的蛋白质的基因
β1，4-GalNAc转移酶：来自空肠弯曲杆菌的β1，4-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因
α1，4-GalNac转移酶：来自空肠弯曲杆菌的α1，4-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因
实施本发明的最佳方式
本发明的实施例显示如下。这些实施例不能解释为本发明仅限于此范围内。
实施例1
生产来自枯草芽孢杆菌的UDP-葡萄糖4-差向异构酶的转化株的构建
将枯草芽孢杆菌MI112(ATCC 33712)接种于300-ml培养瓶中的20ml LB培养基(10g/l细菌用胰蛋白胨、10g/l酵母膏和5g/l氯化钠)上，在37℃下培养16小时。然后，按照《当代分子生物学实验指南》中所描述的方法制备微生物的染色体DNA。
以galE基因的核苷酸序列为基础，该基因假定为来自枯草芽孢杆菌、编码具UDP-GalNAc4-差向异构酶活性的蛋白质[Microbiology，142，3113(1996)]，用DNA合成仪(8905型，PerSeptive Biosystems)合成具SEQ ID NO：5和6所显示的核苷酸序列的DNA。按下列方式进行PCR反应，用合成DNA作为一组引物，枯草芽孢杆菌MI112的染色体DNA作为模板。即，PCR反应进行30个循环，每个循环包括94℃反应1分钟、37℃反应2分钟、72℃反应3分钟，反应混合物的体积为40μl，其包括0.1μg染色体DNA、0.5μmol/l各个引物、2.5单位的PfuDNA聚合酶(STRATAGENE)、4μl的PfuDNA聚合酶缓冲液(10X)(STRATAGENE)和200μmol/l的每种dNTP，结果获得大约1.0kb的PCR产物。
用反应后的混合物的十分之一进行琼脂糖凝胶电泳以确认扩增了所需的片段。然后将剩余的反应混合物与等体积的经TE饱和的酚/氯仿混合。
所得的混合物进行离心，获得的上层液与2倍体积的冷乙醇混合并置于-80℃下30分钟。使所得的混合物离心获得DNA沉淀。
将DNA沉淀溶解于20μl的TE[10mmol/l Tris-HCl、1mmol/lEDTA(pH8.0)]溶液中，取5μl的溶液用限制性酶ClaI和BamHI进行反应切割DNA。通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene Clean II试剂盒(Funakoshi)回收包含UDP-葡萄糖4-差向异构酶基因的1.0kb的DNA片段。
用限制性酶ClaI和BamHI切割pPAC31(0.2μg)。通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用同样方式回收5.5kb的DNA片段。
将上述获得的1.0kb和5.5kb的DNA片段用连接试剂盒(TakaraShuzo有限公司)在16℃进行16小时的连接反应。
依照上述描述的已知方法用连接混合物转化大肠杆菌NM522，在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上铺板，于30℃培养过夜。
依照上述描述的已知方法从生长在培养基上的转化株克隆中提取质粒，获得表达质粒pGT73。通过限制性酶消解来确认获得的质粒的结构(图1)。
实施例2
生产来自淋病奈瑟氏球菌的UDP-葡萄糖4-差向异构酶的转化株的构建
依照已知的方法(美国专利号5,545,553)培养淋病奈瑟氏球菌(ATCC 33084)。然后，按照《当代分子生物学实验指南》中所描述的方法制备该微生物的染色体DNA。
以galE基因的核苷酸序列为基础，该基因假定为来自淋病奈瑟氏球菌、编码具UDP-葡萄糖4-差向异构酶活性的蛋白质[Mol.Microbiol.，8，891(1993)]，用DNA合成仪(8905型，PerSeptiveBiosystems)合成具SEQ ID NO：7和8所显示的核苷酸序列的DNA。按下列方式进行PCR反应，用合成DNA作为一组引物，淋病奈瑟氏球菌(ATCC 33084)的染色体DNA作为模板，PCR反应条件与上述描述的相同，结果获得大约1.0kb的PCR产物。
用反应后的混合物的十分之一进行琼脂糖凝胶电泳以确认扩增了所需的片段。然后将剩余的反应混合物与等量的经TE饱和的酚/氯仿混合。
将所得的混合物进行离心，获得的上层液与2倍体积的冷乙醇混合并置于-80℃下30分钟。所得的混合物离心获得DNA沉淀。
把DNA沉淀溶解于20μl的TE溶液中，取5μl的溶液用限制性酶ClaI和BamHI进行反应切割DNA。通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并用Gene Clean II试剂盒回收含有UDP-葡萄糖4-差向异构酶基因的1.0kb的DNA片段。
用限制性酶ClaI和BamHI切割pPAC31(0.2μg)。通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用同样方式回收5.5kb的DNA片段。
将上述获得的1.0kb和5.5kb的DNA片段用连接试剂盒在16℃进行16小时的连接反应。
依照上述描述的已知方法用连接混合物转化大肠杆菌NM522，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上铺板，于30℃培养过夜。
依照上述描述的已知方法从生长在培养基上的转化株克隆中提取质粒，获得表达质粒pGT24。通过限制性酶消解来确认获得的质粒的结构(图2)。
实施例3
生产来自空肠弯曲杆菌的β1，4-N-乙酰半乳糖胺转移酶的转化株的构建
依照已知的方法[Microbiology，144，2049(1998)]培养空肠弯曲杆菌(ATCC 43446)。然后，按照《当代分子生物学实验指南》中所描述的方法制备该微生物的染色体DNA。
以来自空肠弯曲杆菌(ATCC 43446)、编码β1，4-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因的核苷酸序列为基础[J.Biol.Chem.，275，3896(2000)]，用DNA合成仪(8905型，PerSeptive Biosystems)合成具SEQ ID NO：9和10所显示的核苷酸序列的DNA。按下列方式进行PCR反应，用合成DNA作为一组引物，空肠弯曲杆菌(ATCC 43446)的染色体DNA作为模板，PCR反应条件与上述描述的相同，结果获得大约1.0kb PCR产物。
用反应后的混合物的十分之一进行琼脂糖凝胶电泳以确认扩增了所需的片段。然后将剩余的反应混合物与等量的经TE饱和的酚/氯仿混合。
将所得的混合物进行离心，获得的上层液与2倍体积的冷乙醇混合并置于-80℃下30分钟。所得的混合物离心获得DNA沉淀。
把DNA沉淀溶解于20μl的TE溶液中，取5μl的溶液用限制性酶Xho和BamHI进行反应切割DNA。通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并用Gene Clean II试剂盒(Funakoshi)回收β1，4-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因的1.0kb的DNA片段。
另外，以具SEQ ID NO：11和12所显示的核苷酸序列的DNA作为一组引物，以pPAC31为模板，在上述描述的相同条件下进行PCR反应。
用反应后的混合物的十分之一进行琼脂糖凝胶电泳以确认扩增了所需的片段。然后将剩余的反应混合物与等量的经TE饱和的酚/氯仿混合。
将所得的混合物进行离心，获得的上层液与2倍体积的冷乙醇混合并置于-80℃下30分钟。所得的混合物离心获得DNA沉淀。
把DNA沉淀溶解于20μl的TE溶液中，取5μl的溶液用限制性酶XhoI和EcoRI进行反应切割DNA。通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并用Gene Clean II试剂盒(Funakoshi)回收含有PL启动子的0.3kb的DNA片段。
用限制性酶EcoRI和BamHI切割pPAC31(0.2μg)。通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并用同样方式回收5.2kb的DNA片段。
将上述获得的1.0kb、0.3kb和5.2kb的DNA片段用连接试剂盒在16℃进行16小时的连接反应。
依照上述描述的已知方法用连接混合物转化大肠杆菌NM522，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上铺板，于30℃培养过夜。
依照上述描述的已知方法从生长在培养基上的转化株克隆中提取质粒，获得表达质粒pGT87。通过限制性酶消解来确认获得的质粒的结构(图3)。
实施例4
生产来自空肠弯曲杆菌的α1，4-N-乙酰半乳糖胺转移酶的转化株的构建
以来自空肠弯曲杆菌(ATCC 43446)、编码β1，4-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因的核苷酸序列为基础[Microbiology，144，2049(1988)]，用DNA合成仪(8905型，PerSeptive Biosystems)合成具SEQ ID NO：13和14所显示的核苷酸序列的DNA。按下列方式进行PCR反应，用合成DNA作为一组引物，空肠弯曲杆菌(ATCC 43446)的染色体DNA作为模板，PCR反应条件与实施例3相同，结果获得大约1.0kb的PCR产物。
用反应后的混合物的十分之一进行琼脂糖凝胶电泳以确认扩增了所需的片段。然后将剩余的反应混合物与等量的经TE饱和的酚/氯仿混合。
将所得的混合物进行离心，获得的上层液与2倍体积的冷乙醇混合并置于-80℃下30分钟。所得的混合物离心获得DNA沉淀。
把DNA沉淀溶解于20μl的TE溶液中，取5μl的溶液用限制性酶ClaI和BamHI进行反应切割DNA。通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并用Gene Clean II试剂盒回收α1，4-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因的1.0kb的DNA片段。
用限制性酶ClaI和BamHI切割pPAC31(0.2μg)。通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并用同样方式回收5.5kb的DNA片段。
将上述获得的1.0kb和5.5kb的DNA片段用连接试剂盒在16℃进行16小时的连接反应。
依照上述描述的已知方法用连接混合物转化大肠杆菌NM522，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上铺板，于30℃培养过夜。
依照上述描述的已知方法从生长在培养基上的转化株克隆中提取质粒，获得表达质粒pCJ2。通过限制性酶消解来确认获得的质粒的结构(图4)。
实施例5
UDP-GalNAc的生产(1)
将实施例1中获得的大肠杆菌NM522/pGT73菌株和生产半乳糖激酶及半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶的大肠杆菌NM522/pNT25(WO98/12343)菌株接种到1升的配有挡板的Erlenmeyer型培养瓶中的125ml的LB培养基上，培养基中含有50μg/ml的氨苄青霉素，在28℃下，220rpm培养17小时。将所获得的培养物(125ml)接种到5升发酵罐中的2.5升的TB培养基上[10g/l葡萄糖、12g/l细菌用胰蛋白胨(Difco)、12g/l酵母膏(Difco)、2.3g/l KH2PO4和12.5g/l K2HPO4(未调节pH)]，其中含有50μg/ml的氨苄青霉素，在30℃下，600rpm通气(2.5升/分)培养4小时，然后继续在40℃下培养3小时。培养期间，用28％的氨水调节使培养物维持在pH7.0，根据需要向其中加入葡萄糖。培养物离心获得湿细胞。将湿细胞保存在-20℃备用，解冻后即可使用。
将产氨棒杆菌ATCC 21170接种到配有挡板的300-ml Erlenmeyer型培养瓶的25ml的液体培养基中，该培养基包含50g/l葡萄糖、10g/l聚蛋白胨(Nihon制药有限公司)、10g/l酵母膏(Oriental Yeast有限公司)、5g/l尿素、5g/l(NH4)2SO4、1g/l KH2PO4、3g/l K2HPO4、1g/l MgSO4·7H2O、0.1g/l CaCl2·2H2O、10mg/l FeSO4·7H2O、l0mg/l ZnSO4·7H2O、20mg/l MnSO4·4-6H2O、20mg/l L-半胱氨酸、10mg/l D-泛酸钙、5mg/l维生素B1、5mg/l尼克酸和30mg/l生物素(用10mol/l NaOH调节pH为7.2)，于28℃下220rpm培养24小时。
将所获得的培养产物(20ml)接种到含有250ml其组成与上述相同的液体培养基的配有挡板的2升Erlenmeyer型培养瓶中，并于28℃下220rpm培养24小时。所获得的培养物作为种子培养物。
将种子培养物(250ml)接种到接种到装有2.25升液体培养基的5升发酵罐中，该培养基中包含150g/l葡萄糖、5g/l肉膏(KyokutoPharmacentical Ind.有限公司)、10g/l KH2PO4、10g/l K2HPO4、10g/l MgSO4·7H2O、0.1g/l CaCl2·2H2O、20mg/l FeSO4·7H2O、10mg/l ZnSO4·7H2O、20mg/l MnSO4·4-6H2O(单独灭菌)、15mg/l β-丙氨酸(单独灭菌)、20mg/l L-半胱氨酸、100mg/l生物素、2g/l尿素、和5mg/l维生素B1(单独灭菌)(用10mol/l NaOH调节pH为7.2)，于32℃下，600rpm通气(2.5升/分)培养24小时。培养期间，用28％的氨水调节使培养物维持在pH7.0。
培养物离心获得湿细胞。将湿细胞保存在-20℃备用，解冻后即可使用。
将反应混合物(30ml)放进200-ml的烧杯中，该反应混合物包含50g/l大肠杆菌NM522/pNT25的湿细胞、50g/l大肠杆菌NM522/pGT73的湿细胞、150g/l产氨棒杆菌ATCC 21170的湿细胞、100g/l果糖、50g/l N-乙酰葡糖胺、10g/l乳清酸、25g/l KH2PO4、5g/lMgSO4·7H2O、5g/l植酸、4g/l Nymeen S-215和10ml/l二甲苯，反应在32℃下，用磁力搅拌器以900rpm搅拌进行27小时。反应期间，用4mol/l NaOH调节使反应混合物的pH维持在7.2，根据需要可向其中加入果糖、N-乙酰葡糖胺和KH2PO4。
反应完成后，用HPLC分析反应产物，结果确认在反应混合物中形成和积聚了9.6g/l的UDP-GalNAc。
实施例6
UDP-GalNAc的生产(2)
将实施例2中获得的大肠杆菌NM522/pGT24菌株和大肠杆菌NM522/pNT25(WO98/12343)菌株按与实施例5相同的方式培养以获得湿细胞。把湿细胞保存在-20℃备用，解冻后即可使用。
将产氨棒杆菌ATCC 21170按与实施例5相同的方式培养以获得湿细胞。把湿细胞保存在-20℃备用，解冻后即可使用。
将反应混合物(30ml)放进200-ml的烧杯中，该反应混合物包含50g/l大肠杆菌NM522/pNT25的湿细胞、50g/l大肠杆菌NM522/pGT24的湿细胞、150g/l产氨棒杆菌ATCC 21170的湿细胞、100g/l果糖、50g/l N-乙酰葡糖胺、10g/l乳清酸、25g/l KH2PO4、5g/lMgSO4·7H2O、5g/l植酸、4g/l Nymeen S-215和10ml/l二甲苯，反应在32℃下，用磁力搅拌器以900rpm搅拌进行27小时。反应期间，用4mol/l NaOH调节使反应混合物的pH维持在7.2，根据需要可向其中加入果糖、N-乙酰葡糖胺和KH2PO4。
反应完成后，用HPLC分析反应产物，结果确认在反应混合物中形成和积聚了5.5g/l的UDP-GalNAc。
实施例7
GM2碳水化合物链[GalNAc β1，4(NeuAc α2，3)Gal β1，4 Glc]的生产
将实施例1中获得的大肠杆菌NM522/pGT73菌株、大肠杆菌NM522/pNT25(WO98/12343)菌株和实施例4中获得的大肠杆菌NM522/pGT87菌株按与实施例5相同的方式培养以获得湿细胞。把湿细胞保存在-20℃备用，解冻后即可使用。
将产氨棒杆菌ATCC 21170按与实施例5相同的方式培养以获得湿细胞。把湿细胞保存在-20℃备用，解冻后即可使用。
将反应混合物(30ml)放进200-ml的烧杯中，该反应混合物包含50g/l大肠杆菌NM522/pNT25的湿细胞、50g/l大肠杆菌NM522/pGT73的湿细胞、100g/l大肠杆菌NM522/pGT87的湿细胞、150g/l产氨棒杆菌ATCC 21170的湿细胞、100g/l果糖、50g/l N-乙酰葡糖胺、50g/l UDP-N-乙酰葡糖胺、33g/l 3’-唾液酸乳糖、25g/l KH2PO4、5g/l MgSO4·7H2O、5g/l植酸、4g/l Nymeen S-215和10ml/l二甲苯，反应在32℃下，用磁力搅拌器以900rpm搅拌进行27小时。反应期间，用4mol/l NaOH调节使反应混合物的pH维持在7.2，根据需要可向其中加入果糖、N-乙酰葡糖胺、3’-唾液酸乳糖和KH2PO4。
反应完成后，用HPLC分析反应产物，结果确认在反应混合物中形成和积聚了7.9g/l的GM2碳水化合物链。
实施例8
NOS-α(GalNAc α1，4 Gal β1，4 Glc NAc β1，3Gal β1，4 Glc)的生产
将实施例2中获得的大肠杆菌NM522/pGT24菌株、大肠杆菌NM522/pNT25(WO98/12343)菌株和实施例5中获得的大肠杆菌NM522/pCJ2菌株按与实施例5相同的方式培养以获得湿细胞。把湿细胞保存在-20℃备用，解冻后即可使用。
将产氨棒杆菌ATCC 21170按与实施例5相同的方式培养以获得湿细胞。把湿细胞保存在-20℃备用，解冻后即可使用。
将反应混合物(30ml)放进200-ml的烧杯中，该反应混合物包含50g/l大肠杆菌NM522/pNT25的湿细胞、25g/l大肠杆菌NM522/pGT24的湿细胞、50g/l大肠杆菌NM522/pCJ2的湿细胞、150g/l产氨棒杆菌ATCC 21170的湿细胞、100g/l果糖、50g/l N-乙酰葡糖胺、200g/l乳糖-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)、5g/l乳清酸、25g/lKH2PO4、5g/l MgSO4·7H2O、5g/l植酸、4g/l Nymeen S-215和10ml/l二甲苯，反应在32℃下，用磁力搅拌器以900rpm搅拌进行35小时。反应期间，用4mol/l NaOH调节使反应混合物的pH维持在7.2，根据需要可向其中加入果糖和KH2PO4。
反应完成后，用HPLC分析反应产物，结果确认在反应混合物中形成和积聚了2.4g/l的NOS-α。
工业实用性
依照本发明，可以有效地生产UDP-GalNAc和含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物。
[序列表空白文本(Sequence Listing Free Text)]
SEQ ID NO：5-人工序列描述：合成DNA
SEQ ID NO：6-人工序列描述：合成DNA
SEQ ID NO：7-人工序列描述：合成DNA
SEQ ID NO：8-人工序列描述：合成DNA
SEQ ID NO：9-人工序列描述：合成DNA
SEQ ID NO：10-人工序列描述：合成DNA
SEQ ID NO：11-人工序列描述：合成DNA
SEQ ID NO：12-人工序列描述：合成DNA
SEQ ID NO：13-人工序列描述：合成DNA
SEQ ID NO：14-人工序列描述：合成DNA
                            序列表
                            序列表<110>协和发酵工业株式会社(KYOWA HAKKO KOGYO CO.，LTD.)<120>UDP-N-乙酰半乳糖胺和含N-乙酰半乳糖胺的碳水化合物的生产方法
 (Process for the production of UDP-N-acetylgalactosamine and
 carbohydrates containing N-acetylgalactosamine)<130>SCT031230-47<140><141><150>JP 2000-388992<151>2000-12-21<160>14<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>339<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)<400>1Met Ala Ile Leu Val Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Ile Gly Ser His Thr1               5                  10                  15Cys Val Glu Leu Leu Asn Ser Gly Tyr Glu Ile Val Val Leu Asp Asn
        20                  25                  30Leu Ser Asn Ser Ser Ala Glu Ala Leu Asn Arg Val Lys Glu Ile Thr
    35                  40                  45Gly Lys Asp Leu Thr Phe Tyr Glu Ala Asp Leu Leu Asp Arg Glu Ala
50                  55                  60Val Asp Ser Val Phe Ala Glu Asn Glu Ile Glu Ala Val Ile His Phe65                  70                  75                  80Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser Val Ala Ile Pro Leu Lys Tyr
            85                  90                  95Tyr His Asn Asn Leu Thr Gly Thr Phe Ile Leu Cys Glu Ala Met Glu
        100                 105                 110Lys Tyr Gly Val Lys Lys Ile Val Phe Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr
    115                 120                 125Gly Val Pro Glu Thr Ser Pro Ile Thr Glu Asp Phe Pro Leu Gly Ala
130                 135                 140Thr Asn Pro Tyr Gly Gln Thr Lys Leu Met Leu Glu Gln Ile Leu Arg145                 150                 155                 160Asp Leu His Thr Ala Asp Asn Glu Trp Ser Val Ala Leu Leu Arg Tyr
            165                 170                 175Phe Asn Pro Phe Gly Ala His Pro Ser Gly Arg Ile Gly Glu Asp Pro
        180                 185                 190Asn Gly Ile Pro Asn Asn Leu Met Pro Tyr Val Ala Gln Val Ala Val
    195                 200                 205Gly Lys Leu Glu Gln Leu Ser Val Phe Gly Asn Asp Tyr Pro Thr Lys
210                 215                 220Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp Tyr Ile His Val Val Asp Leu Ala Glu225                 230                 235                 240Gly His Val Lys Ala Leu Glu Lys Val Leu Asn Ser Thr Gly Ala Asp
            245                 250                 255Ala Tyr Asn Leu Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Ser Val Leu Glu Met Val
        260                 265                 270Lys Ala Phe Glu Lys Val Ser Gly Lys Glu Val Pro Tyr Arg Phe Ala
    275                 280                 285Asp Arg Arg Pro Gly Asp Ile Ala Thr Cys Phe Ala Asp Pro Ala Lys
290                 295                 300Ala Lys Arg Glu Leu Gly Trp Glu Ala Lys Arg Gly Leu Glu Glu Met305                 310                 315                 320Cys Ala Asp Ser Trp Arg Trp Gln Ser Ser Asn Val Asn Gly Tyr Lys
            325                 330                 335Ser Ala Glu
    339<210>2<211>338<212>PRT<213>淋病奈瑟氏球菌(Neisseeria gonorrhoeae)<400>2Met Thr Val Leu Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Ile Gly Ser His Thr1               5                  10                  15Ala Val Ser Leu Val Gln Ser Gly Tyr Asp Ala Val Ile Leu Asp Asn
        20                  25                  30Leu Cys Asn Ser Ser Ala Ala Val Leu Pro Arg Leu Arg Gln Ile Thr
    35                  40                  45Gly Arg Asn Ile Pro Phe Tyr Gln Gly Asp Ile Arg Asp Cys Gln Ile
50                  55                  60Leu Arg Gln Ile Phe Ser Glu His Glu Ile Glu Ser Val Ile His Phe65                  70                  75                  80Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser Val Ala Glu Pro Thr Lys Tyr
            85                  90                  95Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Gly Ser Leu Val Leu Ala Glu Glu Met Ala
        100                 105                 110Arg Ala Gly Val Leu Lys Ile Val Phe Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr
    115                 120                 125Gly Asp Ala Glu Lys Val Pro Tyr Thr Glu Asp Met Arg Pro Gly Asp
130                 135                 140Thr Ala Asn Pro Tyr Gly Ala Ser Lys Ala Met Val Glu Arg Met Leu145                 150                 155                 160Thr Asp Ile Gln Lys Ala Asp Pro Arg Trp Ser Val Ile Leu Leu Arg
            165                 170                 175Tyr Phe Asn Pro Ile Gly Ala His Glu Ser Gly Leu Ile Gly Glu Gln
        180                 185                 190Pro Asn Gly Val Pro Asn Asn Leu Leu Pro Tyr Ile Cys Gln Val Ala
    195                 200                 205Ser Gly Arg Leu Pro Gln Leu Ser Val Phe Gly Gly Asp Tyr Pro Thr
210                 215                 220Pro Asp Gly Thr Gly Met Arg Asp Tyr Ile His Val Met Asp Leu Ala225                 230                 235                 240Glu Gly His Ile Ala Ala Met Lys Ala Lys Gly Gly Val Ala Gly Val
            245                 250                 255His Leu Phe Asn Leu Gly Ser Gly Arg Ala Tyr Ser Val Leu Glu Ile
        260                 265                 270Ile Arg Ala Phe Glu Ala Ala Ser Gly Leu His Ile Pro Tyr Arg Ile
    275                 280                 285Gln Pro Arg Arg Ala Gly Asp Leu Ala Cys Ser Tyr Ala Asp Pro Ser
290                 295                 300His Thr Lys Gln Gln Thr Gly Trp Glu Thr Lys Arg Gly Leu Gln Gln305                 310                 315                 320Met Met Glu Asp Ser Trp Arg Trp Val Ser Arg Asn Pro Gly Arg Tyr
            325                 330                 335Gly Asp
338<210>3<211>1017<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)<400>3atg gca ata ctt gtt act ggc ggt gcc ggt tac att ggc agc cac aca  48Met Ala Ile Leu Val Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Ile Gly Ser His Thr1               5                  10                  15tgt gtt gaa cta ttg aac agc ggc tac gag att gtt gtt ctt gat aat  96Cys Val Glu Leu Leu Asn Ser Gly Tyr Glu Ile Val Val Leu Asp Asn
        20                  25                  30ctg tcc aac agt tca gct gaa gcg ctg aac cgt gtc aag gag att aca  144Leu Ser Asn Ser Ser Ala Glu Ala Leu Asn Arg Val Lys Glu Ile Thr
    35                  40                  45gga aaa gat tta acg ttc tac gaa gcg gat tta ttg gac cgg gaa gcg  192Gly Lys Asp Leu Thr Phe Tyr Glu Ala Asp Leu Leu Asp Arg Glu Ala
50                  55                  60gta gat tcc gtt ttt gct gaa aat gaa atc gaa gct gtg att cat ttt  240Val Asp Ser Val Phe Ala Glu Asn Glu Ile Glu Ala Val Ile His Phe65                  70                  75                  80gca ggg tta aaa gca gtc ggc gaa tct gtg gcg att ccc ctc aaa tat  288Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser Val Ala Ile Pro Leu Lys Tyr
            85                  90                  95tat cat aac aat ttg aca gga acg ttt att tta tgc gag gcc atg gag  336Tyr His Asn Asn Leu Thr Gly Thr Phe Ile Leu Cys Glu Ala Met Glu
        100                 105                 110aaa tac ggc gtc aag aaa atc gta ttc agt tca tct gcg aca gta tac  384Lys Tyr Gly Val Lys Lys Ile Val Phe Ser Ser Set Ala Thr Val Tyr
    115                 120                 125ggc gtt ccg gaa aca tcg ccg att acg gaa gac ttt cca tta ggc gcg  432Gly Val Pro Glu Thr Ser Pro Ile Thr Glu Asp Phe Pro Leu Gly Ala
130                 135                 140aca aat cct tat ggg cag acg aag ctc atg ctt gaa caa ata ttg cgt  480Thr Asn Pro Tyr Gly Gln Thr Lys Leu Met Leu Glu Gln Ile Leu Arg145                 150                 155                 160gat ttg cat aca gcc gac aat gag tgg agc gtt gcg ctg ctt cgt tac  528Asp Leu His Thr Ala Asp Asn Glu Trp Ser Val Ala Leu Leu Arg Tyr
            165                 170                 175ttt aac ccg ttc ggc gcg cat cca agc gga cgg atc ggt gaa gac ccg  576Phe Asn Pro Phe Gly Ala His Pro Ser Gly Arg Ile Gly Glu Asp Pro
        180                 185                 190aac gga atc cca aat aac ctt atg ccg tat gtg gca cag gta gca gtc  624Asn Gly Ile Pro Asn Asn Leu Met Pro Tyr Val Ala Gln Val Ala Val
    195                 200                 205ggg aag ctc gag caa tta agc gta ttc gga aat gac tat ccg aca aaa  672Gly Lys Leu Glu Gln Leu Ser Val Phe Gly Asn Asp Tyr Pro Thr Lys
210                 215                 220gac ggg aca ggc gta cgc gat tat att cac gtc gtt gat ctc gca gaa  720Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp Tyr Ile His Val Val Asp Leu Ala Glu225                 230                 235                 240ggc cac gtc aag gcg ctg gaa aaa gta ttg aac tct aca gga gcc gat  768Gly His Val Lys Ala Leu Glu Lys Val Leu Asn Ser Thr Gly Ala Asp
            245                 250                 255gca tac aac ctt gga aca ggc aca ggc tac agc gtg ctg gaa atg gtc  816Ala Tyr Asn Leu Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Ser Val Leu Glu Met Val
        260                 265                 270aaa gcc ttt gaa aaa gtg tca ggg aaa gag gtt cca tac cgt ttt gcg  864Lys Ala Phe Glu Lys Val Ser Gly Lys Glu Val Pro Tyr Arg Phe Ala
    275                 280                 285gac cgc cgt ccg gga gac atc gcc aca tgc ttt gca gat cct gcg aaa  912Asp Arg Arg Pro Gly Asp Ile Ala Thr Cys Phe Ala Asp Pro Ala Lys
290                 295                 300gcc aag cga gaa cta ggc tgg gaa gcg aaa cgc ggc ctt gag gaa atg  960Ala Lys Arg Glu Leu Gly Trp Glu Ala Lys Arg Gly Leu Glu Glu Met305                 310                 315                 320tgt gct gat tcc tgg aga tgg cag tct tct aat gtg aat ggg tat aag  1008Cys Ala Asp Ser Trp Arg Trp Gln Ser Ser Asn Val Asn Gly Tyr Lys
            325                 330                 335agt gcg gaa                                                      1017Ser Ala Glu<210>4<211>1014<212>DNA<213>淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)<400>4atg acc gtc ctg att acc ggc ggc acc ggc ttt atc ggt tcg cac acc  48Met Thr Val Leu Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Ile Gly Ser His Thr1               5                  10                  15gcc gtc tcg ctc gtc caa tcc ggt tac gat gcc gtg att ttg gat aat  96Ala Val Ser Leu Val Gln Ser Gly Tyr Asp Ala Val Ile Leu Asp Asn
        20                  25                  30ctg tgc aac tcg tct gcc gcc gtc ctc cca cgc ctt cgg caa att acc  144Leu Cys Asn Ser Ser Ala Ala Val Leu Pro Arg Leu Arg Gln Ile Thr
    35                  40                  45ggc aga aac ata ccg ttt tat cag ggc gac atc cgc gac tgt cag att  192Gly Arg Asn Ile Pro Phe Tyr Gln Gly Asp Ile Arg Asp Cys Gln Ile
50                  55                  60ttg agg cag att ttt tca gaa cat gaa atc gaa tcc gtc atc cat ttt  240Leu Arg Gln Ile Phe Ser Glu His Glu Ile Glu Ser Val Ile His Phe65                  70                  75                  80gcc ggt ttg aag gca gtg ggg gaa agc gtt gcc gag ccg aca aaa tat  288Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser Val Ala Glu Pro Thr Lys Tyr
            85                  90                  95tac ggc aac aat gtt tac ggc agc ctg gtg ctg gcg gaa gaa atg gcg  336Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Gly Ser Leu Val Leu Ala Glu Glu Met Ala
        100                 105                 110cgc gcg ggc gtg ttg aaa atc gta ttc agc tcg tcg gca acc gtt tac  384Arg Ala Gly Val Leu Lys Ile Val Phe Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr
    115                 120                 125ggc gat gcg gaa aaa gtc ccc tat acg gaa gat atg cgc ccg ggc gat  432Gly Asp Ala Glu Lys Val Pro Tyr Thr Glu Asp Met Arg Pro Gly Asp
130                 135                 140acc gct aat cct tac ggt gcg tcc aaa gcg atg gtg gag cgg atg tta  480Thr Ala Asn Pro Tyr Gly Ala Ser Lys Ala Met Val Glu Arg Met Leu145                 150                 155                 160acc gac atc caa aaa gcc gat ccg cgt tgg agc gtg att ttg ttg cgc  528Thr Asp Ile Gln Lys Ala Asp Pro Arg Trp Ser Val Ile Leu Leu Arg
            165                 170                 175tat ttc aac ccg atc ggc gcg cac gaa agc gga ctt atc ggc gaa cag  576Tyr Phe Asn Pro Ile Gly Ala His Glu Ser Gly Leu Ile Gly Glu Gln
        180                 185                 190ccc aac ggc gtt ccc aac aat ctt ttg ccc tat atc tgt caa gtg gct  624Pro Asn Gly Val Pro Asn Asn Leu Leu Pro Tyr Ile Cys Gln Val Ala
    195                 200                 205tcg ggc agg ctg ccg caa ctg tcg gta ttc ggc ggc gac tat ccg acc  672Ser Gly Arg Leu Pro Gln Leu Ser Val Phe Gly Gly Asp Tyr Pro Thr
210                 215                 220ccc gac ggt acg gga atg cgc gac tac atc cat gtg atg gat ttg gca  720Pro Asp Gly Thr Gly Met Arg Asp Tyr Ile His Val Met AsP Leu Ala225                 230                 235                 240gaa ggg cat atc gcg gca atg aag gcg aaa ggc ggc gtt gcc ggc gta  768Glu Gly His Ile Ala Ala Met Lys Ala Lys Gly Gly Val Ala Gly Val
            245                 250                 255cat ttg ttc aac ttg ggt tcg gga cgc gcc tat tcc gtt ttg gaa atc  816His Leu Phe Asn Leu Gly Ser Gly Arg Ala Tyr Ser Val Leu Glu Ile
        260                 265                 270atc cgc gcc ttt gag gcc gca tcc ggt ttg cac att cct tac cga atc  864Ile Arg Ala Phe Glu Ala Ala Ser Gly Leu His Ile Pro Tyr Arg Ile
    275                 280                 285caa ccc cgc cgc gcc ggc gac ttg gcg tgt tcc tat gcc gac ccg tcc  912Gln Pro Arg Arg Ala Gly Asp Leu Ala Cys Ser Tyr Ala Asp Pro Ser
290                 295                 300cat acc aaa caa caa acc ggc tgg gaa acc aaa cgc ggc ttg cag caa  960His Thr Lys Gln Gln Thr Gly Trp Glu Thr Lys Arg Gly Leu Gln Gln305                 310                 315                 320atg atg gaa gat tcg tgg cgt tgg gtc agc cgc aac ccc ggc aga tat 1008Met Met Glu Asp Ser Trp Arg Trp Val Ser Arg Asn Pro Gly Arg Tyr
            325                 330                 335ggg gat                                                         1014Gly Asp<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述：合成DNA<400>5tataatcgat acaggtcatt ttttaggagg gtttac                           36<210>6<211>36<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述：合成DNA<400>6agaaggatcc cattcttatt ccgcactctt ataccc                           36<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述：合成DNA<400>7cccgatcgat tctgaaagga atgtttatga                                  30<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述：合成DNA<400>8ttgcggatcc tttgcattta atccccat                                    28<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述：合成DNA<400>9aatactcgag atgctatttc aatcatac                                    28<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述：合成DNA<400>10taaaggatcc ttaaaacaat gttaag                                      26<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述：合成DNA<400>11caagaattct ctctcaccta ccaa                                        24<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述：合成DNA<400>12aatctcgaga tcgataccct tttttacg                                    28<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述：合成DNA<400>13aggaatcgat atgaaaataa gctttatta                                   29<210>14<211>36<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述：合成DNA<400>14agttggatcc ataacagaaa gtttaggca                                   29

Claims (35)

1.一种制备UDP-N-乙酰半乳糖胺(以下缩写为UDP-GalNAc)的方法，其包括：
让酶源和UDP-N-乙酰葡糖胺(以下缩写为UDP-GlcNAc)共存于水介质中，所述的酶源为转化株的培养物，所述转化株产生具UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向异构酶(以下缩写为UDP-GlcNAc 4-差向异构酶)活性的蛋白，或为上述培养物的处理物质；
让UDP-GalNAc在水介质中形成和积聚；及
从水介质中回收UDP-GalNAc。
2.一种制备含N-乙酰半乳糖胺(以下缩写为GalNAc)的碳水化合物的方法，其包括：
让酶源、受体碳水化合物、GalNAC转移酶和UDP-GlcNAc共存于水介质中，所述的酶源为转化株的培养物，所述转化株产生具UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白，或为上述培养物的处理物质；
让含GalNAc的碳水化合物在水介质中形成和积聚；及
从水介质中回收含GalNAc的碳水化合物。
3.一种制备UDP-GalNAc的方法，其包括：
让酶源、尿苷-5’-三磷酸(以下缩写为UTP)的前体和糖共存于水介质中，所述的酶源为微生物的培养物，所述微生物具有从UTP的前体和糖形成UDP-GlcNAc的能力，或为上述培养物的处理物质，以及为转化株的培养物，所述转化株产生具UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白，或为上述培养物的处理物质；
让UDP-GalNAc在水介质中形成和积聚；及
从水介质中回收UDP-GalNAc。
4.一种制备含GalNAc的碳水化合物的方法，其包括：
让酶源、UTP的前体、糖和受体碳水化合物共存于水介质中，所述的酶源为微生物的培养物，所述微生物具有从UTP的前体和糖形成UDP-GlcNAc的能力，或为上述培养物的处理物质，为GalNAc转移酶，以及为转化株的培养物，所述转化株产生具UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白，或为上述培养物的处理物质；
让含GalNAc的碳水化合物在水介质中形成和积聚；及
从水介质中回收含GalNAc的碳水化合物。
5.依照权利要求1至4中任一项所述的方法，其中培养物的处理物质为浓缩的培养物，干燥的培养物，由培养物离心获得的细胞，将细胞进行干燥、冷冻干燥、表面活性剂处理、超声波、机械摩擦、溶剂处理、酶处理、蛋白分级分离或固定化而获得的产物，或由细胞提取获得的酶制剂。
6.依照权利要求2或4所述的方法，其中的受体碳水化合物为复合碳水化合物，其包含在其非还原端具有唾液酸、半乳糖、GalNAc、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸的寡糖。
7.依照权利要求6所述的方法，其中在其非还原端具有唾液酸、半乳糖、GalNAc、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸的寡糖为乳糖、N-乙酰乳糖胺、球三糖、唾液酸乳糖、唾液酸N-乙酰乳糖胺、路易斯X、路易斯a、唾液酸路易斯X、唾液酸路易斯a、硫酸软骨素、デルタマン硫酸、H型1(Fuc α1-2Gal β1-3GlcNAc)或H型2(Fuc α1-2Gal β1-4GlcNAc)。
8.依照权利要求2或4所述的方法，其中受体碳水化合物为乳糖、N-乙酰乳糖胺、球三糖、唾液酸乳糖、唾液酸N-乙酰乳糖胺、路易斯X、路易斯a、唾液酸路易斯X、唾液酸路易斯a、硫酸软骨素、デルタマン硫酸、H型1(Fuc α1-2Gal β1-3GlcNAc)或H型2(Fucα1-2Gal β1-4GlcNAc)。
9.依照权利要求3或4所述的方法，其中前体为乳清酸、乳清酸核苷、尿嘧啶、尿嘧啶核苷或尿嘧啶核苷-5’-一磷酸。
10.依照权利要求3或4所述的方法，其中糖为葡糖胺或N-乙酰葡糖胺。
11.依照权利要求3或4所述的方法，其中具有从UTP的前体和糖形成UDP-GlcNAc的能力的微生物是一种或多种选自属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)和糖酵母属(Saccharomyces)中的微生物。
12.依照权利要求11所述的方法，其中属于埃希氏杆菌属中的微生物为大肠杆菌(Escherichia coli)。
13.依照权利要求11所述的方法，其中属于棒杆菌属的微生物为产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)。
14.依照权利要求11所述的方法，其中属于糖酵母属的微生物为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
15.依照权利要求1至4中任一项所述的方法，其中的转化株为将重组DNA导入微生物所获得的转化株。
16.依照权利要求15所述的方法，其中的微生物选自属于埃希氏杆菌属、棒杆菌属和酵母属中的微生物。
17.依照权利要求16所述的方法，其中属于埃希氏杆菌属中的微生物为大肠杆菌。
18.依照权利要求16所述的方法，其中属于棒杆菌属的微生物为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
19.依照权利要求16所述的方法，其中属于糖酵母属的微生物为酿酒酵母。
20.依照权利要求1至4中任一项所述的方法，其中具UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白为源自属于芽孢杆菌属(Bacillus)或奈瑟氏球菌属(Neisseria)的微生物的具UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白。
21.依照权利要求20所述的方法，其中属于芽孢杆菌属的微生物选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。
22.依照权利要求20所述的方法，其中属于奈瑟氏球菌属的微生物是淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)或脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)。
23.依照权利要求1至4及20至22中任一项所述的方法，其中具UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白为具有SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列的蛋白。
24.依照权利要求1至4及20至22中任一项所述的方法，其中具UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白，其组成的氨基酸序列在SEQID NO：1或2所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸残基的缺失、替代、插入或加入，并具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性。
25.依照权利要求1至4及20至22中任一项所述的方法，其中具UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白其组成的氨基酸序列与SEQID NO：1或2所示的氨基酸序列的同源性为50％或以上。
26.依照权利要求15所述的方法，其中重组DNA包含的DNA编码具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性的蛋白。
27.依照权利要求15所述的方法，其中重组DNA包含的DNA所编码的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶(以下缩写为galE蛋白)具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性。
28.依照权利要求27所述的方法，其中galE蛋白来自属于芽孢杆菌属或奈瑟氏球菌属的微生物。
29.依照权利要求28所述的方法，其中属于芽孢杆菌属的微生物选自枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌。
30.依照权利要求28所述的方法，其中属于奈瑟氏球菌属的微生物为淋病奈瑟氏球菌或脑膜炎奈瑟氏球菌。
31.依照权利要求15所述的方法，其中重组DNA包含的DNA编码具有SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列的蛋白。
32.依照权利要求15所述的方法，其中重组DNA包含的DNA编码的蛋白，其组成的氨基酸序列在SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸残基的缺失、替代、插入或加入，并具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性。
33.依照权利要求15所述的方法，其中重组DNA包含的DNA编码的蛋白，其组成的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列的同源性为50％或以上，并具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性。
34.依照权利要求15所述的方法，其中重组DNA包含的DNA具有SEQ ID NO：3或4所示的核苷酸序列。
35.依照权利要求15所述的方法，其中重组DNA包含的DNA与由SEQ ID NO：3或4所示的核苷酸序列组成的DNA在严格条件下进行杂交，且其所编码的蛋白具有UDP-GlcNAc 4-差向异构酶活性。
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