CN1175280A

CN1175280A - 新的赖氨酸脱羧酶基因以及生产l－赖氨酸的方法

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Publication number: CN1175280A
Application number: CN95197577A
Authority: CN
Inventors: 菊池庆实; 铃木智子; 児岛宏子
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1994-12-09
Filing date: 1995-12-05
Publication date: 1998-03-04
Anticipated expiration: 2015-12-05
Also published as: ZA9510442B; MY113738A; ES2256850T5; EP0796912B2; EP0796912A1; PE59996A1; CN100357431C; DE69534801D1; DK0796912T3; RU2188235C2; ES2256850T3; CN101220366B; CZ290070B6; EP0796912B1; DE69534801T2; US5827698A; SK70297A3; EP0796912A4; DE69534801T8; WO1996017930A1

Abstract

通过在液体培养基中培养埃希氏杆菌微生物高效生产L－赖氨酸。在此微生物中与L－赖氨酸降解有关的赖氨酸脱羧酶活性降低或消失。例如,一种埃希氏杆菌属微生物,其编码赖氨酸脱羧酶的新型基因和/或cadA基团的表达受到限制,使其产生L－赖氨酸并在培养液中积累和从中回收L－赖氨酸。

Description

新的赖氨酸脱羧酶基因以及生产L-赖氨酸的方法

技术领域

本发明涉及大肠杆菌的一种新的赖氨酸脱羧酶基因，它与L-赖氨酸的降解有关，本发明还涉及一种属于埃希氏杆菌属的微生物，这种微生物对此基因和/或另外一种被称为cadA的L-赖氨酸脱羧酶基因表现出限制性表达。此外还涉及到一种通过微生物合成L-赖氨酸的方法。最近，对L-赖氨酸作为一种食品添加剂的需求正在迅速增长。

技术背景

赖氨酸脱羧酶催化L-赖氨酸脱羧生成1，5-戊二胺，这个酶被称为大肠杆菌L-赖氨酸降解酶。其基因的核苷酸序列被称为cadA，这个基因编码的氨基酸序列已经发表(Meng，S.和Bennett，G.N.，J.Bacteriol.，174.2659(1992))。有关除大肠杆菌cadA序列以外的编码赖氨酸脱羧酶的基因已有2篇报导，其中描述说，在大肠杆菌突变株中测到过微弱的酶活性(Goldemberg，S.H.，J.Bacteriol.，141，1428(1980)；Wertheimer，S.J.和Leifer，Z.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，114，882(1983))。然而，Goldemberg，S.H.曾报导说此酶活性在60℃加热4分钟后降低约30％。但是，Wertheimer，S.J.等人的报导则没有观察到这个现象。由此，确定了在第二种赖氨酸脱羧酶的存在。

另一方面，用大肠杆菌生产L-赖氨酸的已知方法包括：培养对赖氨酸类似物有抗性的突变株，或培养携载了带有L-赖氨酸生物合成遗传信息的脱氧核酸的载体的重组菌株(日本专利公开No.56-18596)。然而没有任何报导涉及用具有赖氨酸脱羧酶基因限制性表达的埃希氏杆菌属微生物生产L-赖氨酸。

发明公开

本发明的一个目的是：获得大肠杆菌的新的赖氨酸脱羧酶基因；生成一种属于埃希氏杆菌属的产L-赖氨酸微生物，它对此基因和/或cadA基因表现出限制性表达；提供一种通过培养埃希氏杆菌属微生物生产L-赖氨酸的方法。

本发明人在构建一种已知的赖氨酸脱羧酶基因即cadA基因受到损坏的大肠杆菌菌株时，发现作为赖氨酸脱羧酶降解L-赖氨酸的产物的1，5-戊二胺依然在此菌株中产生。因此，本发明人推测在大肠杆菌中应存在一种新的赖氨酸脱羧酶基因，而且通过使用埃希氏杆菌属微生物可对L-赖氨酸发酵产物产生很大影响。在进行了此基因的克隆实验之后，本发明人成功地得到了不同于cadA基因的新的L-赖氨酸脱羧酶基因。另外还发现通过此基因和cadA基因在大肠杆菌L-赖氨酸生产菌株中的限制性表达，使L-赖氨酸降解活性显著降低或消失，并使L-赖氨酸产量明显增加。由此，完成了此项发明。

也就是说，本发明提供一种编码大肠杆菌L-赖氨酸脱羧酶的新的基因。把这个基因命名为“ldc”基因。

另一方面，本发明提供一种属于产L-赖氨酸的埃希氏杆菌属的微生物，这种微生物细胞内的赖氨酸脱羧酶活性降低或消失。

此外，本发明还提供一种生产赖氨酸的方法，这个方法包括：在液体培养基中培养上述埃希氏杆菌属微生物，使之生产L-赖氨酸并积累于培养液中，然后收集L-赖氨酸。

上述属于埃希氏杆菌属的微生物包括这样一种微生物，其细胞内的赖氨酸脱羧酶活性由于ldc基因和/或cadA基因的限制性表达而降低或消失。

本发明的详细内容叙述如下。<1>制备含有新的赖氨酸脱羧酶基因的DNA片段

含有本发明的新的赖氨酸脱羧酶基因(ldc)的DNA片段可从已有的大肠杆菌菌株，例如K-12或其衍生菌株得到。

首先，通过聚合酶链式反应(下称“PCR方法”)从由大肠杆菌中分离到的W3110株的染色体DNA中获得已知的赖氨酸脱羧酶基因，cadA基因。cadA基因的核苷酸序列和由其编码的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：5和6中给出。通过使用质粒或噬菌体载体确认是否在DNA片段中含有新的赖氨酸脱羧酶基因的方法，从大肠杆菌W3110的染色体DNA文库中克隆与cadA基因序列相似的DNA片段。用PCR方法制备探针进行Southern杂交确认克隆中确实含有目的基因。

确认存在于如此得到的DNA片段中的目的基因核苷酸序列的方法如下。首先，将此DNA片段与在大肠杆菌细胞中可自主复制的质粒载体相连接，以制备用于转化大肠杆菌感受态细胞的重组DNA。所得到的转化子在液体培养基中培养，并从增殖细胞中回收重组DNA。用双脱氧法(Sanger，F.等，Proc.Natl.Acad.sci.，74，5463(1977))检测回收重组DNA中所含DNA片段的全部核苷酸序列。对DNA结构进行分析以确定启动子、操纵子、SD序列、起始密码子、终止密码子、开放阅读框架等所在位置。

本发明的新的赖氨酸脱羧酶基因具有序列表中SEQ ID NO：3所示DNA片段中全部核苷酸序列的第1005-1007核苷酸ATG到第3141-3143核苷酸GGA的序列。这个基因编码的赖氨酸脱羧酶氨基酸序列在序列表SEQ ID NO：4中给出。已经发现，新的赖氨酸脱羧酶与cadA基因编码的赖氨酸脱羧酶基因的同源性是69.4％。

本发明的基因可以是序列表中SEQ ID NO：4所给出的赖氨酸脱羧酶氨基酸序列的编码序列，也可以是不限于上述核苷酸序列的一段核酸序列。本发明的基因编码的赖氨酸脱羧酶氨基酸序列可以有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入而不会引起赖氨酸脱羧酶活性的实质退化。具有这类缺失、插入或替换的赖氨酸脱羧酶基因可以从大肠杆菌的自发突变或人工诱变株中得到，也可以从大肠杆菌以外的埃希氏属微生物中得到。对具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的赖氨酸酶基因实行体外突变或定点诱变可获得编码这种具有缺失、插入或替换的赖氨酸脱羧酶突变基因。这些突变的处理可以按照本领域专业人员所熟知的方法进行，如下所述。

然而，本文涉及的编码含有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入的赖氨酸脱羧酶基因包括那些来源于“ldc”基因和可以被认为实质上与ldc-基因相同的基因。这并不是要将此含义延伸到那些不同来源的基因。也不可能对“多个”的确切范围做具体描述。但对本领域的专业人员来说不难理解，例如与SEQ ID NO：3有200个以上的氨基酸残基不同的蛋白质，编码这个蛋白质的cadA基因与本发明的基因是不同的。而对那些编码有同样赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质的基因，即使其编码的蛋白质与SEQ ID NO：3氨基酸序列有2至3个氨基酸残基的差异，仍包括在本发明的范围内。<2>建立能够限制性表达赖氨酸脱羧酶基因的埃希氏杆菌属微生物

本发明的微生物是一种细胞内赖氨酸脱羧酶活性降低或消失的埃希氏杆菌属微生物。这种埃希氏杆菌属微生物包括大肠杆菌。其细胞内赖氨酸脱羧酶活性的降低或消失是通过诸如新的赖氨酸脱羧酶基因(ldc)和上述已知的cadA基因中任意一个或两个基因同时进行的限制性表达实现的。另外，细胞内赖氨酸脱羧酶活性的降低和消失也可以通过修饰酶的结构，使这些基因编码的赖氨酸脱羧酶的专一性活性降低或消失来实现。

使ldc基因和已知的cadA基因进行限制性表达的方法包括基因转录水平的限制性表达。这是通过这类基因的启动子序列中一个或多个核苷酸替换、缺失、插入、添加或倒位而使启动子活性降低的方式实现的(M.Rosenberg和D.Court，Ann.Rev.Genetics 13(1979)P.319，P.Youderian，S.Bouvier和M.Susskind，Cell 30(1982)P.843-853)。另一种方法是通过使SD序列和起始密码之间的区域中一个或多个核苷酸发生替换、缺失、插入、添加或倒位从而在转录水平上限制这些基因的表达(J.T.Dunn，E.Buzash-Pollert和F.W.Studier，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，75(1978)P.2743)。此外，为使赖氨酸脱羧酶专一性降低或消失，可使用一种方法，即使编码区的核苷酸序列中一个或多个核苷酸发生替换、缺失、插入、添加或倒位，从而使赖氨酸基因编码区被修饰或破坏。

除上述ldc或cadA基因外，这类允许发生核苷酸替换、缺失、插入、添加或倒位的基因也可以是有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入却不使其编码的赖氨酸脱羧酶基本活性退化的那些ldc或cadA基因。

引起基因中核苷酸替换、缺失、插入、添加或倒位的方法还包括定点突变的方法(Kramer，W.和Frits，H.J.，Mothods in Engymology.，154，350(1987))，和一种用诸如亚硫酸钠和羟胺等化合物处理的方法(Shortle.D.和Nathans，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，270(1978))。

定点突变是一种用合成的寡核苷酸使选择性替换、缺失、插入、添加或倒位引入到选定的有限核苷酸对的技术。要使用这种技术，首先得使质粒变性成单链，该质粒中克隆有带特定DNA序列的目的基因。然后合成与希望的突变部位互补的寡核苷酸。但此方法中合成的寡核苷酸不要有完全互补的序列，而应被设计成具有可任选的核苷酸替换缺失、插入、添加或倒位。此后，将上述单链DNA与有可任选的替换、缺失、插入、添加或倒位的合成寡核苷酸进行退火。用T4连接酶和DNA聚合酶I的Klenow片段合成完整的双链质粒，并导入大肠杆菌感受态细胞。由此获得转化子。质粒中所具有的可任选的核苷酸替换、缺失、插入、添加或倒位被固定下来。重组PCR方法(PCR Technology，Stockton press(1989))与上述方法类似，也可以引入突变使基因被修饰或受到破坏。

化学试剂法直接用连二亚硫酸钠、羟胺等处理含目的基因的DNA片段，使其发生随机的碱基替换、缺失、插入、添加或倒位等基因突变。

通过用上述诱变中得到的被修饰或被破坏的基因取代埃希氏杆菌属微生物染色体中的正常基因可抑制细胞中ldc基因和/或cadA基因的表达。这种取代基因的方法包括使用同源重组(分子遗传实验，冷泉港实验室出版社(1972)；Matsuyama，S.和Mizushima，S.，J.Bacteriol.，162，1196(1985))。同源重组基于埃希氏杆菌属微生物普遍具有的能力。当与染色体有同源序列的质粒等被引入细胞时，在有同源序列的部位就会发生一定频率的重组，并使整个质粒结合到染色体上。此后若又有重组在此部位发生，这个质粒就会从染色体上脱落。而有时在此过程中引入的突变更容易固定在染色体上。这取决于重组的位置和与质粒一起脱落的原本是正常的基因。筛选这样的菌株可以得到染色体上正常基因己被破坏了的或修饰了的基因所取代的菌株。而通过引入核苷酸替换，缺失，插入、添加或倒位所造成的突变，就可得到这种被破坏或被修饰的基因。

经过基因取代的埃希氏杆菌属微生物具有赖氨酸生产活性。这种有赖氨酸生产活性的埃希氏杆菌属微生物，比如大肠杆菌微生物菌株可以通过对没有赖氨酸生产活性的菌株施以诱变处理而得到。这种诱变处理可使此微生物具有对赖氨酸类似物如S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(下称“AEC”)具有抗性。这类突变处理方法包括用化学试剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍和亚硝酸处理大肠杆菌细胞或用紫外照射、辐射或类似方法处理大肠杆菌细胞。尤其是，这种微生物菌株包括大肠杆菌AJ13069(FERMP14690)。它由大肠杆菌K-12的W3110菌株获得AEC抗性后形成的。大肠杆菌AJ13069于1994年12月6日起保存在国立生命科学和人体技术研究所(邮编：305，1-3，Higashi1-Chome，Tsukuba-Shi，Ibarakiken，Japan)保藏号：FERM P-14690，并于1995年9月29日按布达佩斯协议转送到国际保藏中心。保藏号是FERM BP-5262。

通过基因重组技术引入并增强携带与L-赖氨酸生物合成有关的遗传信息的DNA也可以得到产L-赖氨酸活性的大肠杆菌菌株。所引入的基因是编码L-赖氨酸生物合成途径中各种酶的基因，比如：天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶。当基因所编码的酶被L-赖氨酸反馈抑制，比如天冬氨酸激酶或二氢吡啶二羧酸合成酶的情况下，最好使用突变型基因，这种基因编码的酶由于抑制作用而脱敏。为了引入和增强这类基因，可以采用一种方法即将这类基因连接到在大肠杆菌细胞中可自主复制的载体上，然后转化大肠杆菌以得到重组DNA。或者也可以通过使用转导、转座(Berg，D.E和Berg，C.M.Bio/Technol.，1，417(1983))，Mu噬菌体(日本专利公开No.2-109985)或同源重组(分子遗传实验，冷泉港实验室(1972))将此基因结合到宿主染色体上。

其它获得携带功能损坏的基因的埃希氏杆菌属微生物的方法包括：用化学试剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍和亚硝酸处理，或用紫外照射，辐射等处理带有目的基因的埃希氏杆菌属微生物，使其发生遗传突变。

在下面实施例中，带有功能损坏的基因的埃希氏杆菌菌株是通过下述方法建立的。即，使其编码区部分缺失，在缺失部位插入药物抗性基因。这样就会得到可以利用上述同源重组法的赖氨酸脱羧酶基因以代替大肠杆菌染色体上的赖氨酸脱羧酶基因。

在一个微生物菌株中的本发明的新的赖氨酸脱羧酶基因和cadA基因的表达产生抑制作用或对其中任一种产生抑制作用都是可能的。在具有L-赖氨酸生产能力的埃希氏杆菌属微生物中，赖氨酸脱羧酶基因的表达会受到限制，或按上面介绍的方法，可以使赖氨酸脱羧酶基因呈现限制性表达的埃希氏杆菌属微生物具备L-赖氨酸生产能力。<3>利用赖氨酸脱羧酶基因呈限制性表达的埃希氏杆菌属

微生物的L-赖氨酸生产

通过培养用上述方法获得的具有限制性表达赖氨酸脱羧酶基因的埃希氏杆菌属微生物在培养液中生产和积累可观量的L-赖氨酸。只有通过已知的cadA基因的限制性表达才能增加L-赖氨酸的积累量。但是，本发明的新的赖氨酸脱羧酶基因的表达限制对增加L-赖氨酸的收获量更有效。通过使用cadA基因和本发明的新的基因的表达都受到限制的菌株可达到L-赖氨酸生产的最理想的效果。

L-赖氨酸生产用的培养基是普通培养基，含有碳源、氮源、无机离子和可任选的其它微量有机营养源。碳源可以用糖类如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物；醇类如甘油、山梨醇；有机酸如延胡索酸、柠檬酸、琥珀酸。氮源可用无机铵盐如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵；有机氮源如大豆水解物；氨气；氨水。无机离子有：磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子及其它少量添加物。除此之外，最好还有维生素B₁，适量酵母浸膏等作为微量有机营养源。

培养优选地在有氧条件下持续16-72小时。培养温度控制在30℃至45℃，pH值控制在5至7。可用无机或有机的酸性或碱性的物质，或氨气等调节pH值。

充分培养后，收集发酵液中的L-赖氨酸。收集方法可根据具体情况将普通离子交换树脂法，沉淀法或其它已知方法结合起来进行。

附图简述图1：显示含有新的赖氨酸脱羧酶基因的质粒pUC6F5HH5的结构。图2：显示含有新的赖氨酸脱羧酶基因的温度敏感质粒pTS6F5HH5的结

构以及pTS6F5HH5Cm质粒的构建。其中这个基因的一部分被含

有氯霉素抗性基因的片段替换。图3：显示带有正常赖氨酸脱羧酶基因的菌株WC196和WC196C，

WC196L以及带有受损的赖氨酸脱羧酶基因的菌株WC196LC之

间L-赖氨酸降解活性的比较。

实施本发明的最佳方案

下面参照实施例对本发明做更详细的解释。

实施例1(1)新的赖氨酸脱羧酶基因克隆

按常规方法从来自National of Genetics(Yata 1111，Mishima-Shi，Shizuoka-ken，Japan)的大肠杆菌K-12 W3110菌株细胞中提取染色体DNA。同时，以Meng，S.和Bennett，G.N.，J.Bacteriol，174，2659(1992)中描述的cadA基因的核酸序列(见SEQ ID NO：5)为基准用常规方法合成序列表中给出的SEQ ID NOS：1和2两个合成的DNA引物。它们分别与cadA基因的5′端上游序列和3′端序列同源。在按照Erlich等人(PCR Technology，Stockton press(1989))的方法做PCR实验时使用此染色体DNA和这对DNA引物。这样得到的2.1kb片段含有几乎全部cadA基因。这个片段用随机引物标记盒(Takara Shuzo生产)和[α-³²P]dcTP(Amersham Japan生产)进行标记以制备杂交探针。

下一步，用制备好的探针和大肠杆菌/Gene Mapping膜(TakaraShuzo生产)按常规方法进行杂交(冷泉港实验室出版社，第二版(1989))。Kohara等人的基因文库(大肠杆菌染色体DNAλ噬菌体文库：见Kohara，.Y.等.，Cell 50，495-508(1987))已事先吸附在大肠杆菌/Gene Mapping膜上面。在杂交时，通过弱化探针洗脱条件(2×SSC，55℃30分钟)富集有类似于cadA基因序列的λ噬菌体克隆。结果，除了在含有cadA基因区(21H11，5G7)克隆中找到强标记外，还在三个噬菌体克隆E2B8、6F5H和10F9中成功地发现弱标记信号。三个λ噬菌体克隆E2B8、6F5H、10F9的插入序列是相互交叠连续的大肠杆菌染色体片段。由此，用常规方法分离出Kohara等人的基因文库中6F5Hλ噬菌体DNA并进行各种限制酶解，以便用上述探针以及与上述类似的方法进行印迹杂交。结果表明，用HindIII酶解得到的5kbp DNA片段与cadA基因序列相似。

用T4连接酶将HindIII酶解6F5Hλ噬菌体DNA所得到的5kbp片段与质粒pUC19(Takara Shuzo生产)HindIII酶解物相连。将此混合物转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo生产)得到在加入50mg/ml氨苄青霉素的完全平板培养基(10克蛋白胨，5克酵母浸膏，5克氯化钠溶于1升水中)上能生长的氨苄青霉素抗性菌株。由此得到的微生物菌株含有一插入HindIII酶解6F5Hλ噬菌体DNA所得5kbp片段的质粒。从这些细胞中抽提质粒就得到质粒pUC GF5HH5。图1表示质粒pUC6F5HH5的结构。

含有此质粒的大肠杆菌JM109/pUC6F5HH5被命名为AJ13068于1994年12月6日保藏在国立生命科学与人体技术研究所保藏号是FERMP-14689，并于1995年9月29日按布达佩斯协议转移到国际保藏中心，其保藏号是FERM BP-5251。(2)确定新的赖氨酸脱羧酶基因的核苷酸序列

pUC 6F5HH5中ClaI和HindIII限制酶切点之间的核酸序列按分子克隆(第二版)，冷泉港实验室出版社，1989中描述的方法测定。结果显示此核酸序列就是序列表中SEQ ID NO：3所编码的序列。此DNA序列含有一开放阅读框架，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。(3)制备具有L-赖氨酸生产能力的大肠杆菌

大肠杆菌W3110在完全培养基中37℃培养4小时(含10克蛋白胨，5克酵母浸膏，5克氯化钠，溶于1升水)，得到的微生物细胞用浓度为200微克/毫升的N-甲基-N′硝基-N亚硝基胍37℃处理30分钟，清洗，再转到基本平板培养基(含7克磷酸氢二钠，3克磷酸二氢钾，1克氯化铵，0.5克氯化钠，5克葡萄糖，0.25克7水硫酸镁，15克琼脂溶于1升水)。其中加入5克/升AEC。经37℃48小时培养后分离出现的克隆即得到AEC抗性菌株。WC196株作为其中之一具有L-赖氨酸生产能力。WC196菌株被命名为AJ69于1994年12月6日保藏在国立生命科学和人体技术研究所，保藏号是FERM P-14690，并于1995年9月29日按布达佩斯协议转入国际保藏中心，保藏号是FERM BP-5252。(4)建立新的赖氨酸脱羧酶基因功能受损的WC196菌株

用T4 DNA连接酶将上述HindIII酶解6F5Hλ噬菌体DNA得到的5kbp片段与HindIII酶解的温度敏感质粒pMAN031相连接(Yasueda，H等)，Appl.Microbiol，Biotechnol，36，211(1991))。此反应混合物用于转化大肠杆菌JM109，然后在加有50毫克/升氨苄青霉素的完全培养基中37℃培养24小时以使氨苄青霉素抗性菌株生长。由此得到的微生物菌株带有插入HindIII酶解的6F5Hλ噬菌体DNA 5Kbp片段。从此细胞中提取质粒得到pTS6F5HH5质粒。将质粒pTS6F5HH5用EcoRV酶解以除去其中的1kbp DNA片段。然后用T4连接酶将从pHSG 399(TakaraShuzo)经AccI酶解得到的约1kbp氯霉素抗性基因片段插入其中。由此构建成质粒pTS6F5HH5Cm。此操作结果使我们成功构建了新的赖氨酸脱羧酶基因功能受损的DNA片段质粒。图2表示质粒pTS6F5HH5结构和质粒pTS6F5HH5Cm的结构。

下一步，采用一般同源重组技术(Matsuyama，S.和Mizushima，S.，J.Bacteriol.162，1196(1985))，利用质粒pTS6F5HH5Cm的温度敏感性建立菌株。在此菌株中，WC196染色体上的新的赖氨酸脱羧酶基因被功能受损的新的赖氨酸脱羧酶基因DNA片段所取代。就是说，用质粒pTS6F5HH5Cm转化WC196，先获得在30℃下对青霉素和氯霉素有抗性的菌株。s然后再由此菌株获得42℃下对氨苄青霉素和氯霉素有抗性的菌株。再进一步由此菌株得到30℃下对氨苄青霉素敏感而对氯霉素有抗性的菌株。这样建立的菌株，其WC196株的染色体上新的赖氨酸脱羧酶基因被功能受损的新的赖氨酸脱羧酶基因DNA片段所取代。此菌株被命名为WC196L。(5)建立cadA基因缺陷型WC196菌株和WC196L菌株

已知的赖氨酸脱羧酶基因cadA受损的大肠杆菌己为人们所知，包括例如来源于大肠杆菌K-12的GNB10181菌株(见Auger，E.A.等人Mol，Microbiol，3，609(1989))；此菌株可以从大肠杆菌遗传贮备中心(Connecticut，USA)得到。已经证明此菌株的cadA基因区是缺陷的。因此，GNB10181株的cadA基因缺陷特点由通用的P1噬菌体转导方法转导给WC196从而创建了WC196C菌株。WC196株的cadA基因缺陷由核酸印迹杂交确认。此外，带有cadA基因缺陷的WC196LC菌株也通过与上述类似的方法建立。

实施例2(1)WC196、WC16C、WC196L和WC196LC菌株的赖氨酸降解活性的确定

如上述建立的4个菌株在产赖氨酸培养基中37℃培养17小时(培养基含40克葡萄糖，16克硫酸铵，1克硫酸二氢钾，2克酵母浸膏，10毫克4水或5水硫酸锰，10毫克7水硫酸铁，溶于1升水；pH值用氢氧化钾调到7.0，然后加30克无菌的碳酸钾)。收集的微生物细胞用生理盐水洗2次，悬浮在用于检测的赖氨酸降解培养基中(含17克磷酸氢二钾，3克磷酸二氢钾，0.5克氯化钠，10克L-赖氨酸盐酸盐，溶于1升水)。37℃培养31小时。

图3显示随时间延续，培养基中剩余L-赖氨酸量的变化。L-赖氨酸量由AS-210 Biotech Analyzer(Asahi Chemical Industry)测定。可观察到WC196菌株中L-赖氨酸明显降解。然而在已知赖氨酸脱羧酶基因cadA基因缺陷的WC196菌株，L-赖氨酸降解度略有下降。在带有功能受损的赖氨酸脱羧酶基因的菌株WC196L和WC196LC中没有观察到L-赖氨酸降解。培养时间达3小时时，任何一种菌株内剩余L-赖氨酸的量都有下降。但这种下降是因为L-赖氨酸进入微生物细胞内而不是降解造成的。(2)由WC196、WC196C、WC196L和WC196LC

菌株生产L-赖氨酸

上述四种菌株在前述L-赖氨酸生产用培养基中37℃培养20小时。在培养液中可检测到L-赖氨酸和1，5-戊二胺的产生量和累积量。L-赖氨酸的量可用前述Biotech Analyser AS-210定量测定。1，5-戊二胺则用高压液相层析定量测定。

结果如表1所示。与WC196相比，带有功能受损的cadA.基因的WC196C，其L-赖氨酸的累积量增加而作为L-赖氨酸降解产物的1，5-戊二胺的累积量减少。与WC196和WC196C相比，带有功能受损的新的赖氨酸脱羧酶基因的WC196L菌株也表现同样的结果。而在携带这两种功能受损的赖氨酸脱羧酶基因的WC196LC菌株中只检测到L-赖氨酸累积量的进一步增加却检测不到其降解产物1，5-戊二胺。

表1

微生物菌株 L-赖氨酸累积量 1，5-戊二胺累积量

(克/升) (克/升)

WC196 1.4 0.6

WC196C 1.9 0.4

WC196L 2.3 0.1

WC196LC 3.3 未检测

实施例3

用含有新的赖氨酸脱羧酶基因的pUC6F5HH5转化具有L-赖氨酸降解活性消失特点的大肠杆菌WC196LC以使其获得氨苄青霉素抗性。WC196LC菌株和WC196LC/pUC6F5HH5菌株在添加有5克/升赖氨酸的生产赖氨酸用培养基中37℃培养16小时，然后检测1，5-戊二胺。

结果如表2所示。WC196LC菌株不能将L-赖氨酸转化成1，5-戊二胺而WC196LC/pUC6F5HH5菌株有能力将L-赖氨酸转化成1，5-戊二胺。

表2

微生物菌株 1，5-戊二胺产量(克/升)

WC196LC 未检测

WC196LC/pUC6F5HH5 0.93

工业实用性

本发明的新的赖氨酸脱羧酶基因与大肠杆菌的L-赖氨酸降解有关。培养上述基因和/或cadA基因呈限制表达并具有产L-赖氨酸活性的埃希氏杆菌属菌株还可低成本高效率地生产L-赖氨酸。

序列表(1)一般资料：

(i)申请人：AJINOMOTO Co.，Inc.

(ii)发明名称：NOVEL LYSINE DECARBOXYLASE GENE AND METHOD OFPRODUCING L-LYS INE

(iii)序列数：6

(iv)相关地址：

(A)收信人：

(B)街道：

(C)城市：

(D)州：

(E)国家：

(F)邮编：

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容型

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：FastSEQ Version1.5

(vi)当前申请资料：

(A)申请号：

(B)提交日期：

(C)分类：

(vii)在先申请资料：

(A)申请号：

(B)提交日期：

(viii)律师/代理人资料：

(A)姓名：

(B)注册号：

(ix)远程通讯资料：

(A)电话：

(B)电传：(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“合成DNA”

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(ix)序列描述：SEQ ID NO：1：

TGGATAACCA CACCGCGTCT 20(2)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“合成DNA”

(iii)假设：无

(iv)反义：有

(ix)序列描述：SEQ ID NO：2：GGAAGGATCA TATTGGCGTT 20(2)SEQ ID NO：3的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：3269个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(vi)来源：

(A)生物体：大肠杆菌

(B)菌株：W3110

(ix)特征：

(A)名称/关键字CDS

(B)位置：1005至3143

(ix)序列描述：SEQ ID NO：3：ATCGATTCTC TGACTGCGGT TAGCCGTCAG GATGAGAAAC TGGATATTAA CATCGATGAA 60GAAGTGCATC GTCTGCGTGA AAAAAGCGTA GAACTGACAC GTAAAATCTT CGCCGATCTC 120GGTGCATGGC AGATTGCGCA ACTGGCACGC CATCCACAGC GTCCTTATAC CCTGGATTAC 180GTTCGCCTGG CATTTGATGA ATTTGACGAA CTGGCTGGCG ACCGCGCGTA TGCAGACGAT 240AAAGCTATCG TCGGTGGTAT CGCCCGTCTC GATGGTCGTC CGGTGATGAT CATTGGTCAT 300CAAAAAGGTC GTGAAACCAA AGAAAAAATT CGCCGTAACT TTGGTATGCC AGCGCCAGAA 360GGTTACCGCA AAGCACTGCG TCTGATGCAA ATGGCTGAAC GCTTTAAGAT GCCTATCATC 420ACCTTTATCG ACACCCCGGG GGCTTATCCT GGCGTGGGCG CAGAAGAGCG TGGTCAGTCT 480GAAGCCATTG CACGCAACCT GCGTGAAATG TCTCGCCTCG GCGTACCGGT AGTTTGTACG 540GTTATCGGTG AAGGTGGTTC TGGCGGTGCG CTGGCGATTG GCGTGGGCGA TAAAGTGAAT 600ATGCTGCAAT ACAGCACCTA TTCCGTTATC TCGCCGGAAG GTTGTGCGTC CATTCTGTGG 660AAGAGCGCCG ACAAAGCGCC GCTGGCGGCT GAAGCGATGG GTATCATTGC TCCGCGTCTG 720AAAGAACTGA AACTGATCGA CTCCATCATC CCGGAACCAC TGGGTGGTGC TCACCGTAAC 780CCGGAAGCGA TGGCGGCATC GTTGAAAGCG CAACTGCTGG CGGATCTGGC CGATCTCGAC 840GTGTTAAGCA CTGAAGATTT AAAAAATCGT CGTTATCAGC GCCTGATGAG CTACGGTTAC 900GCGTAATTCG CAAAAGTTCT GAAAAAGGGT CACTTCGGTG GCCCTTTTTT ATCGCCACGG 960TTTGAGCAGG CTATGATTAA GGAAGGATTT TCCAGGAGGA ACAC ATG AAC ATC ATT 1016

Met Asn Ile Ile

1GCC ATT ATG GGA CCG CAT GGC GTC TTT TAT AAA GAT GAG CCC ATC AAA 1064Ala Ile Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp Glu Pro Ile Lys5 10 15 20GAA CTG GAG TCG GCG CTG GTG GCG CAA GGC TTT CAG ATT ATC TGG CCA 1112Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gln Gly Phe Gln Ile Ile Trp Pro

25 30 35CAA AAC AGC GTT GAT TTG CTG AAA TTT ATC GAG CAT AAC CCT CGA ATT 1160Gln Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Glu His Asn Pro Arg Ile

40 45 50TGC GGC GTG ATT TTT GAC TGG GAT GAG TAC AGT CTC GAT TTA TGT AGC 1208Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu Asp Leu Cys Ser

55 60 65GAT ATC AAT CAG CTT AAT GAA TAT CTC CCG CTT TAT GCC TTC ATC AAC 1256Asp Ile Asn Gln Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr Ala Phe Ile Asn

70 75 80ACC CAC TCG ACG ATG GAT GTC AGC GTG CAG GAT ATG CGG ATG GCG CTC 1304Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gln Asp Met Arg Met Ala Leu85 90 95 100TGG TTT TTT GAA TAT GCG CTG GGG CAG GCG GAA GAT ATC GCC ATT CGT 1352Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gln Ala Glu Asp Ile Ala Ile Arg

105 110 115ATG CGT CAG TAC ACC GAC GAA TAT CTT GAT AAC ATT ACA CCG CCG TTC 1400Met Arg Gln Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile Thr Pro Pro Phe

120 125 130ACG AAA GCC TTG TTT ACC TAC GTC AAA GAG CGG AAG TAC ACC TTT TGT 1448Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys Tyr Thr Phe Cys

135 140 145ACG CCG GGG CAT ATG GGC GGC ACC GCA TAT CAA AAA AGC CCG GTT GGC 1496Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Lys Ser Pro Val Gly

150 155 160TGT CTG TTT TAT GAT TTT TTC GGC GGG AAT ACT CTT AAG GCT GAT GTC 1544Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu Lys Ala Asp Val165 170 175 180TCT ATT TCG GTC ACC GAG CTT GGT TCG TTG CTC GAC CAC ACC GGG CCA 1592Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Thr Gly Pro

185 190 195CAC CTG GAA GCG GAA GAG TAC ATC GCG CGG ACT TTT GGC GCG GAA CAG 1640His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe Gly Ala Glu Gln

200 205 210AGT TAT ATC GTT ACC AAC GGA ACA TCG ACG TCG AAC AAA ATT GTG GGT 1688Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn Lys Ile Val Gly

215 220 225ATG TAC GCC GCG CCA TCC GGC AGT ACG CTG TTG ATC GAC CGC AAT TGT 1736Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asn Cys

230 235 240CAT AAA TCG CTG GCG CAT CTG TTG ATG ATG AAC GAT GTA GTG CCA GTC 1784His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp Val Val Pro Val245 250 255 260TGG CTG AAA CCG ACG CGT AAT GCG TTG GGG ATT CTT GGT GGG ATC CCG 1832Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Ile Pro

265 270 275CGC CGT GAA TTT ACT CGC GAC AGC ATC GAA GAG AAA GTC GCT GCT ACC 1880Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys Val Ala Ala Thr

280 285 290ACG CAA GCA CAA TGG CCG GTT CAT GCG GTG ATC ACC AAC TCC ACC TAT 1928Thr Gln Ala Gln Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr Asn Ser Thr Tyr

295 300 305GAT GGC TTG CTC TAC AAC ACC GAC TGG ATC AAA CAG ACG CTG GAT GTC 1976Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp Ile Lys Gln Thr Leu Asp Val

310 315 320CCG TCG ATT CAC TTC GAT TCT GCC TGG GTG CCG TAC ACC CAT TTT CAT 2024Pro Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr Thr His Phe His325 330 335 340CCG ATC TAC CAG GGT AAA AGT GGT ATG AGC GGC GAG CGT GTT GCG GGA 2072Pro Ile Tyr Gln Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu Arg Val Ala Gly

345 350 355AAA GTG ATC TTC GAA ACG CAA TCG ACC CAC AAA ATG CTG GCG GCG TTA 2120Lys Val Ile Phe Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Met Leu Ala Ala Leu

360 365 370TCG CAG GCT TCG CTG ATC CAC ATT AAA GGC GAG TAT GAC GAA GAG GCC 2168Ser Gln Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr Asp Glu Glu Ala

375 380 385TTT AAC GAA GCC TTT ATG ATG CAT ACC ACC ACC TCG CCC AGT TAT CCC 2216Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser Pro Ser Tyr Pro

390 395 400ATT GTT GCT TCG GTT GAG ACG GCG GCG GCG ATG CTG CGT GGT AAT CCG 2264Ile Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu Arg Gly Asn Pro405 410 415 420GGC AAA CGG CTG ATT AAC CGT TCA GTA GAA CGA GCT CTG CAT TTT CGC 2312Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala Leu His Phe Arg

425 430 435AAA GAG GTC CAG CGG CTG CGG GAA GAG TCT GAC GGT TGG TTT TTC GAT 2360Lys Glu Val Gln Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly Trp Phe Phe Asp

440 445 450ATC TGG CAA CCG CCG CAG GTG GAT GAA GCC GAA TGC TGG CCC GTT GCG 2408Ile Trp Gln Pro Pro Gln Val Asp Glu Ala Glu Cys Trp Pro Val Ala

455 460 465CCT GGC GAA CAG TGG CAC GGC TTT AAC GAT GCG GAT GCC GAT CAT ATG 2456Pro Gly Glu Gln Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp Ala Asp His Met

470 475 480TTT CTC GAT CCG GTT AAA GTC ACT ATT TTG ACA CCG GGG ATG GAC GAG 2504Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro Gly Met Asp Glu485 490 495 500CAG GGC AAT ATG AGC GAG GAG GGG ATC CCG GCG GCG CTG GTA GCA AAA 2552Gln Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly Ile Pro Ala Ala Leu Val Ala Lys

505 510 515TTC CTC GAC GAA CGT GGG ATC GTA GTA GAG AAA ACC GGC CCT TAT AAC 2600Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr Gly Pro Tyr Asn

520 525 530CTG CTG TTT CTC TTT AGT ATT GGC ATC GAT AAA ACC AAA GCA ATG GGA 2648Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr Lys Ala Met Gly

535 540 545TTA TTG CGT GGG TTG ACG GAA TTC AAA CGC TCT TAC GAT CTC AAC CTG 2696Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr Asp Leu Asn Leu

550 555 560CGG ATC AAA AAT ATG CTA CCC GAT CTC TAT GCA GAA GAT CCC GAT TTC 2744Arg Ile Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu Asp Pro Asp Phe565 570 575 580TAC CGC AAT ATG CGT ATT CAG GAT CTG GCA CAA GGG ATC CAT AAG CTG 2792Tyr Arg Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Gly Ile His Lys Leu

585 590 595ATT CGT AAA CAC GAT CTT CCC GGT TTG ATG TTG CGG GCA TTC GAT ACT 2840Ile Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg Ala Phe Asp Thr

600 605 610TTG CCG GAG ATG ATC ATG ACG CCA CAT CAG GCA TGG CAA CGA CAA ATT 2888Leu Pro Glu Met Ile Met Thr Pro His Gln Ala Trp Gln Arg Gln Ile

615 620 625AAA GGC GAA GTA GAA ACC ATT GCG CTG GAA CAA CTG GTC GGT AGA GTA 2936Lys Gly Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gln Leu Val Gly Arg Val

630 635 640TCG GCA AAT ATG ATC CTG CCT TAT CCA CCG GGC GTA CCG CTG TTG ATG 2984Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val Pro Leu Leu Met645 650 655 660CCT GGA GAA ATG CTG ACC AAA GAG AGC CGC ACA GTA CTC GAT TTT CTA 3032Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val Leu Asp Phe Leu

665 670 675CTG ATG CTT TGT TCC GTC GGG CAA CAT TAC CCC GGT TTT GAA ACG GAT 3080Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gln His Tyr Pro Gly Phe Glu Thr Asp

680 685 690ATT CAC GGC GCG AAA CAG GAC GAA GAC GGC GTT TAC CGC GTA CGA GTC 3128Ile His Gly Ala Lys Gln Asp Glu Asp Gly Val Tyr Arg Val Arg Val

695 700 705CTA AAA ATG GCG GGA TAACTTGCCA GAGCGGCTTC CGGGCGAGTA ACGTTCTGTT 3183Leu Lys Met Ala Gly

710AACAAATAAA GGAGACGTTA TGCTGGGTTT AAAACAGGTT CACCATATTG CGATTATTGC 3243GACGGATTAT GCGGTGAGCA AAGCTT 3269(2)SEQ ID NO：4的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：713个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(ix)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Asn Ile Ile Ala Ile Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp1 5 10 15Glu Pro Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gln Gly Phe Gln

20 25 30Ile Ile Trp Pro Gln Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Glu His

35 40 45Asn Pro Arg Ile Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu

50 55 60Asp Leu Cys Ser Asp Ile Asn Gln Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr65 70 75 80Ala Phe Ile Asn Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gln Asp Met

85 90 95Arg Met Ala Leu Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gln Ala Glu Asp

100 105 110Ile Ala Ile Arg Met Arg Gln Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile

115 120 125Thr Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys

130 135 140Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Lys145 150 155 160Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu

165 170 175Lys Ala Asp Val Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190His Thr Gly Pro His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe

195 200 205Gly Ala Glu Gln Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn

210 215 220Lys Ile Val Gly Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile225 230 235 240Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp

245 250 255Val Val Pro Val Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu

260 265 270Gly Gly Ile Pro Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys

275 280 285Val Ala Ala Thr Thr Gln Ala Gln Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp Ile Lys Gln305 310 315 320Thr Leu Asp Val Pro Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335Thr His Phe His Pro Ile Tyr Gln Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu

340 345 350Arg Val Ala Gly Lys Val Ile Phe Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Met

355 360 365Leu Ala Ala Leu Ser Gln Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr

370 375 380Asp Glu Glu Ala Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser385 390 395 400Pro Ser Tyr Pro Ile Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu

405 410 415Arg Gly Asn Pro Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala

420 425 430Leu His Phe Arg Lys Glu Val Gln Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly

435 440 445Trp Phe Phe Asp Ile Trp Gln Pro Pro Gln Val Asp Glu Ala Glu Cys

450 455 460Trp Pro Val Ala Pro Gly Glu Gln Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp465 470 475 480Ala Asp His Met Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro

485 490 495Gly Met Asp Glu Gln Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly Ile Pro Ala Ala

500 505 510Leu Val Ala Lys Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540Lys Ala Met Gly Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr545 550 555 560Asp Leu Asn Leu Arg Ile Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu

565 570 575Asp Pro Asp Phe Tyr Arg Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Gly

580 585 590Ile His Lys Leu Ile Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg

595 600 605Ala Phe Asp Thr Leu Pro Glu Met Ile Met Thr Pro His Gln Ala Trp

610 615 620Gln Arg Gln Ile Lys Gly Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gln Leu625 630 635 640Val Gly Arg Val Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655Pro Leu Leu Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val

660 665 670Leu Asp Phe Leu Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gln His Tyr Pro Gly

675 680 685Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Lys Gln Asp Glu Asp Gly Val Tyr

690 695 700Arg Val Arg Val Leu Lys Met Ala Gly705 710(2)SEQ ID NO：5的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：2145个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(vi)来源：

(A)生物体：大肠杆菌

(B)菌株：CS520

(ix)特征：

(A)名称/关键字CDS

(B)位置：1至2145

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：ATG AAC GTT ATT GCA ATA TTG AAT CAC ATG GGG GTT TAT TTT AAA GAA 48Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu1 5 10 15GAA CCC ATC CGT GAA CTT CAT CGC GCG CTT GAA CGT CTG AAC TTC CAG 96Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

20 25 30ATT GTT TAC CCG AAC GAC CGT GAC GAC TTA TTA AAA CTG ATC GAA AAC 144Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45AAT GCG CGT CTG TGC GGC GTT ATT TTT GAC TGG GAT AAA TAT AAT CTC 192Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60GAG CTG TGC GAA GAA ATT AGC AAA ATG AAC GAG AAC CTG CCG TTG TAC 240Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr65 70 75 80GCG TTC GCT AAT ACG TAT TCC ACT CTC GAT GTA AGC CTG AAT GAC CTG 288Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95CGT TTA CAG ATT AGC TTC TTT GAA TAT GCG CTG GGT GCT GCT GAA GAT 336Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110ATT GCT AAT AAG ATC AAG CAG ACC ACT GAC GAA TAT ATC AAC ACT ATT 384Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

115 120 125CTG CCT CCG CTG ACT AAA GCA CTG TTT AAA TAT GTT CGT GAA GGT AAA 432Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140TAT ACT TTC TGT ACT CCT GGT CAC ATG GGC GGT ACT GCA TTC CAG AAA 480Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys145 150 155 160AGC CCG GTA GGT AGC CTG TTC TAT GAT TTC TTT GGT CCG AAT ACC ATG 528Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175AAA TCT GAT ATT TCC ATT TCA GTA TCT GAA CTG GGT TCT CTG CTG GAT 576Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190CAC AGT GGT CCA CAC AAA GAA GCA GAA CAG TAT ATC GCT CGC GTC TTT 624His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205AAC GCA GAC CGC AGC TAC ATG GTG ACC AAC GGT ACT TCC ACT GCG AAC 672Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220AAA ATT GTT GGT ATG TAC TCT GCT CCA GCA GGC AGC ACC ATT CTG ATT 720Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile225 230 235 240GAC CGT AAC TGC CAC AAA TCG CTG ACC CAC CTG ATG ATG ATG AGC GAT 768Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255GTT ACG CCA ATC TAT TTC CGC CCG ACC CGT AAC GCT TAC GGT ATT CTT 816Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270GGT GGT ATC CCA CAG AGT GAA TTC CAG CAC GCT ACC ATT GCT AAG CGC 864Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285GTG AAA GAA ACA CCA AAC GCA ACC TGG CCG GTA CAT GCT GTA ATT ACC 912Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300AAC TCT ACC TAT GAT GGT CTG CTG TAC AAC ACC GAC TTC ATC AAG AAA 960Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys305 310 315 320ACA CTG GAT GTG AAA TCC ATC CAC TTT GAC TCC GCG TGG GTG CCT TAC 1008Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335ACC AAC TTC TCA CCG ATT TAC GAA GGT AAA TGC GGT ATG AGC GGT GGC 1056Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350CGT GTA GAA GGG AAA GTG ATT TAC GAA ACC CAG TCC ACT CAC AAA CTG 1104Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365CTG GCG GCG TTC TCT CAG GCT TCC ATG ATC CAC GTT AAA GGT GAC GTA 1152Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380AAC GAA GAA ACC TTT AAC GAA GCC TAC ATG ATG CAC ACC ACC ACT TCT 1200Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser385 390 395 400CCG CAC TAC GGT ATC GTG GCG TCC ACT GAA ACC GCT GCG GCG ATG ATG 1248Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415AAA GGC AAT GCA GGT AAG CGT CTG ATC AAC GGT TCT ATT GAA CGT GCG 1296Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430ATC AAA TTC CGT AAA GAG ATC AAA CGT CTG AGA ACG GAA TCT GAT GGC 1344Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

435 440 445TGG TTC TTT GAT GTA TGG CAG CCG GAT CAT ATC GAT ACG ACT GAA TGC 1392Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460TGG CCG CTG CGT TCT GAC AGC ACC TGG CAC GGC TTC AAA AAC ATC GAT 1440Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp465 470 475 480AAC GAG CAC ATG TAT CTT GAC CCG ATC AAA GTC ACC CTG CTG ACT CCG 1488Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495GGG ATG GAA AAA GAC GGC ACC ATG AGC GAC TTT GGT ATT CCG GCC AGC 1536Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510ATC GTG GCG AAA TAC CTC GAC GAA CAT GGC ATC GTT GTT GAG AAA ACC 1584Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525GGT CCG TAT AAC CTG CTG TTC CTG TTC AGC ATC GGT ATC GAT AAG ACC 1632Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540AAA GCA CTG AGC CTG CTG CGT GCT CTG ACT GAC TTT AAA CGT GCG TTC 1680Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe545 550 555 560GAC CTG AAC CTG CGT GTG AAA AAC ATG CTG CCG TCT CTG TAT CGT GAA 1728Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575GAT CCT GAA TTC TAT GAA AAC ATG CGT ATT CAG GAA CTG GCT CAG AAT 1776Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590ATC CAC AAA CTG ATT GTT CAC CAC AAT CTG CCG GAT CTG ATG TAT CGC 1824Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605GCA TTT GAA GTG CTG CCG ACG ATG GTA ATG ACT CCG TAT GCT GCA TTC 1872Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620CAG AAA GAG CTG CAC GGT ATG ACC GAA GAA GTT TAC CTC GAC GAA ATG 1920Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met625 630 635 640GTA GGT CGT ATT AAC GCC AAT ATG ATC CTT CCG TAC CCG CCG GGA GTT 1968Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655CCT CTG GTA ATG CCG GGT GAA ATG ATC ACC GAA GAA AGC CGT CCG GTT 2016Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670CTG GAG TTC CTG CAG ATG CTG TGT GAA ATC GGC GCT CAC TAT CCG GGC 2064Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685TTT GAA ACC GAT ATT CAC GGT GCA TAC CGT CAG GCT GAT GGC CGC TAT 2112Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700ACC GTT AAG GTA TTG AAA GAA GAA AGC AAA AAA 2145Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys705 710 715(2)SEQ ID NO：6的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：715个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(ix)序列描述：SEQ ID NO：6：Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu1 5 10 15Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

20 25 30Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr65 70 75 80Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

115 120 125Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys145 150 155 160Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile225 230 235 240Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys305 310 315 320Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser385 390 395 400Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

435 440 445Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp465 470 475 480Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe545 550 555 560Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met625 630 635 640Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys705 710 715

Claims

1.一种编码赖氨酸脱羧酶的基因，它具有序列表中SEQ ID NO：4给出的氨基酸序列。

2.权利要求1的基因，其中该基因具有序列表中SEQ ID NO：3的第1005至3143位密码的核苷酸序列。

3.权利要求1的基因，其中所述氨基酸序列具有一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入，但没有任何赖氨酸脱羧酶活性的实质性退化。

4.一种埃希氏杆菌属的微生物，它具有L-赖氨酸生产能力，并且其细胞内赖氨酸脱羧酶活性降低或消失。

5.权利要求4的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌。

6.权利要求4的微生物，其中细胞内赖氨酸脱羧酶活性的降低或消失是通过限制权利要求1-3中任一权项限定的基因和/或cadA基因的表达而实现的。

7.权利要求6的微生物，其中基因的表达是通过破坏权利要求1-3中任一权项的基因和/或cadA基因而被限制的。

8.权利要求6的微生物，其中权利要求1-3中任一权项限定的基因和/或cadA基因是通过其核苷酸序列中一个或多个核苷酸的替换、缺失、插入、添加或倒位而被破坏的。

9.一种产L-赖氨酸的方法，其包括在液体培养基中培养一种有L-赖氨酸生产能力的埃希氏杆菌属微生物的步骤，该微生物的细胞内赖氨酸脱羧酶活性降低或消失，以便生产L-赖氨酸并在培养液中累积并收集L-赖氨酸。

10.权利要求9的方法，其中通过限制权利要求1-3中任一权项限定的基因和/或cadA基因的表达而使细胞内赖氨酸脱羧酶活性降低或消失。