JP2004254544A - 新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子及びｌ−リジンの製造法 - Google Patents
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Abstract
【課題】メタノール資化菌、特にメチロフィラス属細菌のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子とそれを用いたＬ−リジン製造法を提供する。
【解決手段】下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡと同一の塩基配列を有する遺伝子、又は同ＤＮＡと相同組換えが起こり得る程度の相同性を有する遺伝子が破壊されたことにより、該遺伝子の発現が抑えられ、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下または消失したメチロフィラス属細菌を、メタノールを主要炭素源とする液体培地に培養し、培養物中にＬ−リジンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−リジンを採取する。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
【選択図】 なし
【解決手段】下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡと同一の塩基配列を有する遺伝子、又は同ＤＮＡと相同組換えが起こり得る程度の相同性を有する遺伝子が破壊されたことにより、該遺伝子の発現が抑えられ、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下または消失したメチロフィラス属細菌を、メタノールを主要炭素源とする液体培地に培養し、培養物中にＬ−リジンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−リジンを採取する。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−リジンの分解に関与するメチロフィラス属細菌の新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子、当該遺伝子の発現が抑えられたメチロフィラス属細菌及び当該細菌を用いたＬ−リジンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−リジンの分解酵素として、Ｌ−リジンの脱炭酸によりカダベリンを生成する反応を触媒するリジンデカルボキシラーゼ（リジン脱炭酸酵素）が知られている。例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）では、ＣａｄＡとＬｄｃと名づけられた２つの酵素がある（特許文献１）。更には、バチラス・ハロジュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｌａｎｓ）、バチラス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セレノモナス・ルミナンチウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、ニコチアナ・グルチノーサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）などの細菌において、ゲノム上の遺伝子配列情報からや、あるいは実験的結果に基づき、その酵素があることが示唆されている（非特許文献１〜３）。しかしながら、メタノール資化性菌において、そのような酵素の存在は定かではない。
【０００３】
一方、メチロフィラス属細菌を用いたＬ−リジンの製造方法として、リジンアナログ、例えば、ＡＥＣ（Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン）に耐性な変異株、またはＬ−リジンの生合成に関与する遺伝情報を担うデオキシリボ核酸を組み込んだベクターを保有する組換え体を培養する方法が知られている（特許文献２）。しかしながら、メチロフィラス属細菌ではリジンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は知られておらず、同遺伝子の発現が抑えられた、あるいは欠損させたメチロフィラス属細菌を用いたＬ−リジン生産についての報告もない。
【０００４】
【特許文献１】
国際公開第９６／１７９３０号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第００／６１７２３号パンフレット
【非特許文献１】
ＫＥＧＧ データベース （Ｒｅｌｅａｓｅ ２５．０， Ｊａｎｕａｒｙ ２００３）
【非特許文献２】
Ｙ． Ｔａｋａｔｓｕｋａ， ｅｔ ａｌ．， ”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”， （２０００） ｖｏｌ．１８２， ｐ．６７３２−６７４１
【非特許文献３】
Ｙ．−Ｓ．Ｌｅｅ ａｎｄ Ｙ．−Ｄ． Ｃｈｏ， ”Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｐｏｕｒｎａｌ”， （２００１） ｖｏｌ．３６０， ｐ．６５７−６６５
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、メタノール資化性細菌であるメチロフィラス・メチロトロファスのリジンデカルボキシラーゼ遺伝子を取得し、この遺伝子を利用して、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現が抑えられたメチロフィラス属に属するＬ−リジン生産菌を造成し、また、これらメチロフィラス属細菌を培養することによるＬ−リジン製造法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、メチロフィラス属細菌にリジンデカルボキシラーゼが存在しているか否かにつき鋭意研究を行った結果、メチロフィラス・メチロトロファスのゲノム上のＤＮＡ配列から、他の微生物由来である既知のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子とやや相同性のあるオープンリーディングフレーム（以下、「ｏｒｆ」と略する）を発見した。そのアミノ酸配列の相同性としては、例えば、エシェリヒア・コリのｃａｄＡ産物（Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＮＣＢＩ：ＡＣＣ７７０９２）との相同性（同一アミノ酸となる割合）は３８．１８％、またｌｄｃＣ産物（Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＮＣＢＩ：ＡＣＣ７３２９７）との相同性は３７．８５％であった。また、このｏｒｆのアミノ酸配列は、エシェリヒア・コリのａｄｉＡの遺伝子産物（Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＮＣＢＩ：ＡＣＣ７７０７８）であるアルギニンデカルボキシラーゼにも約３８．１１％の相同性を有しており、その実体は不明であった。
【０００７】
そこで、メチロフィラス・メチロトロファスの当該ｏｒｆを破壊したところ、通常、メチロフィラス・メチロトロファスの野生株が生育するＳＥＩＩ培地には生育しなくなった。これは意外なことで、エシェリヒア・コリなどでは、ｃａｄＡ及びｌｄｃＣを欠損させても、特別な栄養要求性を示さない。
【０００８】
メチロフィラス・メチロトロファスの場合は、当該ｏｒｆの欠損により、ＳＥＩＩ培地成分では不足している栄養分があると考えられたため、培地へＬ−リジンの分解産物であるカダベリン又はＬ−アルギニンの分解産物であるアグマチンを適量添加したところ、その欠損株は生育可能となった。
【０００９】
従って、メチロフィラス・メチロトロファスでは当該ｏｒｆにコードされるタンパク質は、通常の最少培地に生育するためには必須であること、そして、そのｏｒｆの欠損株の生育にはカダベリン又はアグマチンが必要であることが判明した。このことから、このｏｒｆを含む遺伝子を、ｌｄｃ遺伝子と命名した。
【００１０】
そして、メチロフィラス・メチロトロファスから育種したＬ−リジン生産菌において、ｌｄｃ遺伝子の発現を抑えたところ、生成されるＬ−リジンの生産量が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下のとおりである。
【００１１】
（１）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
（２）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
（３）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（２）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列の塩基番号６８４〜２９３０からなる塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列の塩基番号６８４〜２９３０からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）メチロフィラス属細菌の染色体に由来することを特徴とする（２）又は（３）に記載のＤＮＡ。
（５）Ｌ−リジン生産能を有し、かつ、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下または消失するように改変されたメチロフィラス属細菌。
（６）染色体上の遺伝子であって、かつ、（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡと同一の塩基配列を有する遺伝子、又は同ＤＮＡと相同組換えが起こり得る程度の相同性を有する遺伝子が破壊されたことにより、該遺伝子の発現が抑えられ、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下または消失した（５）に記載のメチロフィラス属細菌。
（７）（６）に記載のメチロフィラス属細菌を、メタノールを主要炭素源とする液体培地に培養し、培養物中にＬ−リジンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明のリジンデカルボキシラーゼ及びそれをコードするＤＮＡ
本発明のリジンデカルボキシラーゼは、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質である。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【００１３】
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１４】
また、本発明のＤＮＡは、上記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである。
【００１５】
本発明のＤＮＡ（以下、「ｌｄｃ遺伝子」ということがある）は、メチロフィラス属細菌、例えば、メチロフィラス・メチロトロファスの染色体ＤＮＡから単離、取得することができる。メチロフィラス・メチロトロファスの野生株ＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ Ｎｏ．１０５１５）は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ、住所ＮＣＩＭＢ Ｌｔｓ．， Ｔｏｒｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔａｔｉｏｎ １３５， Ａｂｂｅｙ Ｒｏａｄ， Ａｂｅｒｄｅｅｎ ＡＢ９ ８ＤＧ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）から入手可能である。そしてこの株の一般的な培養方法は、ＮＣＩＭＢのカタログに記載されているが、また実施例に記載したＳＥＩＩ培地でも生育させることができる。
【００１６】
そしてこの株の一般的な培養方法は、ＮＣＩＭＢのカタログに記載されているが、また実施例に記載したＳＥＩＩ培地でも生育させることができる。
ＡＳ１株のゲノムＤＮＡは公知の方法により調製できるが、市販のゲノム調製用キットを使用してもよい。
【００１７】
本発明のＤＮＡは、本発明によってそれらの塩基配列が明らかになったので、それらの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、メチロフィラス属細菌等の細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）により増幅することによって、取得することができる。また、前記塩基配列に基づいて調製したプローブ、又はＰＣＲにより増幅した部分断片をプローブに用いたコロニーハイブリダイゼーションによっても、本発明のＤＮＡは取得され得る。
【００１８】
本発明のＤＮＡのクローニングに用いるゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換等の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２００１）に記載されている。
【００１９】
上記ＰＣＲに用いるプライマーとしては、配列番号１と及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
上記のようにして取得されたメチロフィラス・メチロトロファスのゲノムから単離されたｌｄｃ遺伝子の塩基配列を配列番号３に示す。また、それによってコードされるリジンデカルボキシラーゼのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００２０】
上記アミノ酸配列を、既知のアミノ酸配列のデータベースを用いて、相同性のある配列を検索したところ、エシェリヒア・コリの２種のリジンデカルボキシラーゼ（遺伝子はそれぞれ、ｃａｄＡとｌｄｃＣ）およびアルギニンデカルボキシラーゼ（遺伝子はａｄｉＡ）と、それぞれ３８．１８％、３７．８５％、及び３８．１１％の相同性が認められた。相同性は、比較に用いた領域の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の個数の割合として算出した。
【００２１】
本発明のＤＮＡは、コードされるリジンデカルボキシラーゼの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含んでいてもよい。ここで、数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、リジンデカルボキシラーゼを構成するアミノ酸配列全体に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、リジンデカルボキシラーゼの活性を有するものであってもよい。具体的には、前記「数個」は、好ましくは２〜２０個、より好ましくは ２〜１０個である。前記リジンデカルボキシラーゼの活性とは、Ｌ−リジンを脱炭酸してカダベリンを生成する反応を触媒する活性をいう。
【００２２】
上記のようなリジンデカルボキシラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号３に示す塩基配列を改変することによって取得することができる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、ｌｄｃ遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、およびｌｄｃ遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００２３】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、ｌｄｃ遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【００２４】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現されたリジンデカルボキシラーゼの活性を調べることにより、リジンデカルボキシラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するｌｄｃ遺伝子を保持する細胞から、配列番号３の塩基番号６８４〜２９３０からなる塩基配列を有するＤＮＡ、または同塩基配列から調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、リジンデカルボキシラーゼと実質的に同一のタンパク質を、それぞれコードするＤＮＡが得られる。
【００２５】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましく９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ， ０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ， ０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２６】
プローブとしては、ｌｄｃ遺伝子の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、当業者によく知られた方法により、各遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、各遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲ反応により作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は５０℃、２×ＳＳＣ， ０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００２７】
なお、リジンデカルボキシラーゼ活性は、例えばＹ．−Ｓ．Ｌｅｅ ａｎｄ Ｙ．−Ｄ． Ｃｈｏ， ”Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｐｏｕｒｎａｌ”， （２００１） ｖｏｌ．３６０， ｐ．６５７−６６５の方法により測定することができる。
本発明のｌｄｃ遺伝子は、後述するようにｌｄｃ遺伝子破壊株の構築に利用することができることに加えて、例えば、本発明のリジンデカルボキシラーゼの製造に利用することができる。すなわち、ｌｄｃ遺伝子を適当な宿主微生物に導入し、同遺伝子を発現させることにより、リジンデカルボキシラーゼを製造することができる。これは、遺伝子組換え技術を利用した有用タンパク質の製造に用いられる通常の方法と同様にして行うことができる。すなわち、リジンデカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを、適当なプロモーターを含むベクターに挿入し、得られる組換えベクターで大腸菌等の宿主を形質転換し、形質転換体を培養して前記遺伝子を発現させればよい。宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌、酵母等が挙げられる。また、プロモーターは、用いる宿主で機能するものであればよく、一例としはｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｒｅｃＡ、Ｔ７（新生化学実験講座１、タンパク質、ＶＩ合成及び発現、日本生化学会編、ｐ１６６、安枝、松井、１９９２年、東京化学同人刊）、ＰＧＫ、ＡＤＨ１、ＧＰＤ、ＭＦα１、ＳＵＣ２、ＰＨＯ５、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４（新生化学実験講座１、タンパク質、ＶＩ合成及び発現、日本生化学会編、ｐ２１５、酒井ら、１９９２年、東京化学同人刊）等が挙げられる。
【００２８】
宿主微生物からのリジンデカルボキシラーゼの採取は、通常の組換えタンパク質の製造と同様にして行うことができる。
【００２９】
＜２＞本発明のメチロフィラス属細菌
本発明の細菌は、Ｌ−リジン生産能を有し、かつ、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下または消失するように改変されたメチロフィラス属細菌である。
【００３０】
メチロフィラス属細菌としては、メチロフィラス・メチロトロファスが挙げられる。また、本発明において「Ｌ−リジン生産能」とは、本発明の細菌を培地で培養したときに、培地中に有意な量のＬ−リジンを蓄積する能力をいう。
【００３１】
細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性の低下又は消失は、例えば、ｌｄｃ遺伝子の発現を抑えることによって行われる。また、この遺伝子によりコードされるリジンデカルボキシラーゼ酵素の構造を改変して、比活性を低下又は消失させることによっても、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性を低下又は消失させることができる。上記のような細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下又は消失したメチロフィラス属細菌は、例えば、メチロフィラス属細菌を紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、リジンデカルボキシラーゼ活性が低下した変異株を選択する方法が挙げられる。
【００３２】
また、本発明の細菌の好ましい態様として、染色体上のｌｄｃ遺伝子が破壊されたことにより、該遺伝子の発現が抑えられ、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下または消失したメチロフィラス属細菌が挙げられる。ここでいうｌｄｃ遺伝子とは、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するリジンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子、又は同遺伝子と相同組換えが起こり得る程度の相同性を有する遺伝子を含む。前記相同組換えが起こり得る程度の相同性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【００３３】
染色体上のｌｄｃ遺伝子の破壊は、実施例に示したように、相同性組換えを利用した遺伝子置換による方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ１ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ（１９７２）； Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．ａｎｄ Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６２，１１９６（１９８５））によって、行うことができる。相同性組換えは、細菌が一般的に持つ能力であり、メチロフィラス属細菌も、相同組換えによる遺伝子置換が可能なことを、本発明者らは見出している。具体的には、正常な機能を有するリジンデカルボキシラーゼを産生しないように改変したｌｄｃ遺伝子（欠失型ｌｄｃ遺伝子）を含むＤＮＡでメチロフィラス属細菌を形質転換し、欠失型ｌｄｃ遺伝子と染色体上のｌｄｃ遺伝子との間で組換えを起こさせる。この後、染色体上のプラスミドが組み込まれた部位で再び組換えが起こると、プラスミドが染色体上から抜け落ちる。その際、組換えが起きる位置によって、欠失型遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちる場合と、正常な遺伝子が染色体上に固定され、欠失型遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちる場合がある。前者のような菌株を選択することにより、染色体上の正常な遺伝子が欠失型遺伝子で置換された菌株を取得することができる。
【００３４】
また、メチロフィラス・メチロトロファスにおいては、染色体上の目的遺伝子と相同な遺伝子を、直鎖状ＤＮＡ断片の形態で導入することにより、細胞内で染色体上の目的遺伝子と導入した直鎖状ＤＮＡ断片上の相同な遺伝子との間で相同組換えが起こり、遺伝子置換ができることを本発明者らは見い出しており、このような手法も適用可能である。なお、この手法により遺伝子の置換を行った例を、後記実施例に記載している。
【００３５】
前記欠失型ｌｄｃ遺伝子としては、同遺伝子のコーディング領域の中の塩基配列中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることによってコードされるタンパク質の比活性が低下又は消失した遺伝子が挙げられる。また、コーディング領域の内部又は末端を欠失させた遺伝子、あるいは、コード領域に、他の配列を挿入した遺伝子等が挙げられる。他の配列としては、カナマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子が挙げられる。
【００３６】
染色体上のｌｄｃ遺伝子の発現を低下又は消失させることは、同遺伝子のプロモーター配列中に、１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせ、プロモーター活性を低下させることによって、転写レベルで遺伝子の発現を抑えること（Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｄ． Ｃｏｕｒｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３（１９７９）ｐ．３１９、Ｐ．Ｙｏｕｄｅｒｉａｎ，Ｓ．Ｂｏｕｖｉｅｒ ａｎｄ Ｍ． Ｓｕｓｓｋｉｎｄ，Ｃｅｌｌ ３０（１９８２）Ｐ．８４３−８５３参照）によっても行うことができる。
【００３７】
また、ｌｄｃ遺伝子の発現は、同遺伝子のＳＤ配列と開始コドンとの間の領域中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることによって、翻訳レベルで抑えることができる（Ｊ．Ｊ．Ｄｕｎｎ，Ｅ．Ｂｕｚａｓｈ−Ｐｏｌｌｅｒｔ ａｎｄ Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７５（１９７８）ｐ．２７４３参照）。
【００３８】
上記のようなプロモーターやＳＤ配列と開始コドンとの間の領域の改変は、前記の遺伝子置換と同様にして行うことができる。
遺伝子中に塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせるには、具体的には、部位特異的変異法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ Ｆｒｉｔｓ，Ｈ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １５４， ３５０（１９８７））や、次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤により処理する方法（Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｄ．ａｎｄ Ｎａｔｈａｎｓ，Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５，２７０（１９７８））が挙げられる。
【００３９】
部位特異的変異法は、合成オリゴヌクレオチドを用いる方法であり、任意の限定された塩基対だけに、任意の置換、欠失、挿入、付加または逆位を導入できる手法である。この方法を利用するには、まず、クローン化され、ＤＮＡ塩基配列が決定されている目的遺伝子を持つプラスミドを変性させて１本鎖を調製する。次に、変異を起こさせたい部分に相補的な合成オリゴヌクレオチドを合成するが、この時合成オリゴヌクレオチドを完全に相補的な配列にせず、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つようにしておく。この後１本鎖ＤＮＡと任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つ合成オリゴヌクレオチドをアニールさせ、さらにＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントとＴ４リガーゼを用いて完全な２本鎖プラスミドを合成し、これをエシェリヒア・コリのコンピテントセルに導入する。このようにして得られた形質転換体の幾つかは、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位が固定された遺伝子を含むプラスミドを持っている。遺伝子に変異を導入し、改変または破壊することができる同様な手法には、リコンビナントＰＣＲ法（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ ｐｒｅｓｓ（１９８９））がある。
【００４０】
以上のようにして取得した変異が導入されて改変または破壊された遺伝子を、メチロフィラス属細菌の染色体上の正常な遺伝子と置換することにより、細胞中のｌｄｃ遺伝子の発現を抑えることができる。
【００４１】
リジンデカルボキシラーゼ活性を低下または消失させるメチロフィラス属細菌は、Ｌ−リジン生産能を有する細菌である。Ｌ−リジン生産能を有するメチロフィラス属細菌、例えばメチロフィラス・メチロトロファス菌株は、Ｌ−リジン生産能を有しない株に変異処理を施し、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（以下、ＡＥＣと記す）等のリジンアナログに対する耐性を付与することにより取得することができる。変異処理の方法としては、エシェリヒア・コリの菌体にＮＴＧやＥＭＳ等の化学薬剤による処理、あるいは紫外線、放射線照射等の処理を施す方法がある。このような菌株の具体例としては、メチロフィラス・メチロトロファスＡＪ１３６０８が挙げられる。本菌株は、メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株にＡＥＣ耐性を付与することによって育種されたものである。尚、メチロフィラス・メチロトロファスＡＪ１３６０８は、１９９９年６月１０日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター：郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７４１６として寄託され、２０００年３月３１日付にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１２が付与されている。
【００４２】
また、Ｌ−リジン生産能を有するメチロフィラス・メチロトロファス菌株は、Ｌ−リジンの生合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを遺伝子組換え技術により導入、増強することによっても育種することができる。導入される遺伝子は、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、スクシニルジアミノピメリン酸トランスアミナーゼ等、Ｌ−リジンの生合成経路上の酵素をコードする遺伝子であり、ジヒドロジピコリン酸合成酵素のようにＬ−リジンによるフィードバック阻害を受ける酵素遺伝子の場合には、かかる阻害が解除された酵素をコードする変異型遺伝子を用いることが望ましい。
【００４３】
また、Ｌ−リジンの菌体外への排出に関与するタンパク質の活性を強化することによっても、Ｌ−リジン生産能を向上させることができる。Ｌ−リジンの細胞外への排出に関与するタンパク質としては、ｌｙｓＥ遺伝子によってコードされるＬｙｓＥタンパク質が知られている。尚、本発明者らは、ブレビバクテリウム属細菌に由来する野生型ｌｙｓＥ遺伝子は、メチロフィラス属細菌中では全く機能しないが、同細菌で機能するような改変が可能であることを確認している。このようなｌｙｓＥタンパク質の改変体としては、後記実施例に示すｌｙｓＥ２４が挙げられる。
【００４４】
ｌｙｓＥ遺伝子がコードするＬｙｓＥタンパク質は、６個の疎水性へリックス領域を有している。それらの疎水性へリックス領域のいくつかは膜貫通領域であると推定される。また、Ｎ末端から３番目と４番目の疎水性へリックス領域の間の領域は親水性であり、ループ構造をとると推定される。この親水性領域を本願発明においてはループ領域と呼ぶ。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生型ｌｙｓＥの塩基配列及びＬｙｓＥタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２１及び２２に示す。同アミノ酸配列において、疎水性へリックス領域は、５〜２０、３７〜５８、６７〜９３、１４６〜１６８、１８１〜２０３、２１１〜２３２に相当する。また、ループ領域は９４〜１４５に相当する。
【００４５】
本発明者らは、ｌｙｓＥ遺伝子はメチロフィラス属細菌においては致死的に働くが、ループ領域を持たない、あるいは実質的に疎水性ヘリックスのみからなるＬｙｓＥタンパク質の改変体をコードするＤＮＡは、メタノール資化性菌のＬ−リジンの細胞外への排出を促進することを見い出した。ｌｙｓＥ２４は、このような野生型ＬｙｓＥタンパク質が持つループ領域を持たない変異型ＬｙｓＥタンパク質、又は実質的に疎水性ヘリックスのみからなる変異型ＬｙｓＥタンパク質をコードする。
【００４６】
上記のような変異型ｌｙｓＥとしては、少なくとも一つ又は二つ以上の疎水性ヘリックスを有し、メチロフィラス属細菌に導入したときにＬ−リジンもしくはＬ−アルギニン又はこれらの両方のＬ−アミノ酸の細胞外への排出を促進するものであれば特に制限されないが、具体的にはＮ末端から１番目〜６番目の疎水性ヘリックスのすべてを有する変異型ＬｙｓＥをコードするＤＮＡが挙げられる。より具体的には、Ｎ末端から１番目〜３番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドと、４番目〜６番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドとをコードするＤＮＡが挙げられる。前記ｌｙｓＥ２４は、このような１番目〜３番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドと、４番目〜６番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドとをコードする変異型ｌｙｓＥの一例である。ｌｙｓＥ２４遺伝子には、３番目の疎水性ヘリックスをコードする領域の下流に終止コドンが変異により導入されているが、この終止コドンよりも下流の領域を欠失させると、ｌｙｓＥ２４遺伝子を導入したメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株はＬ−リジンを培地中に蓄積しないことを、発明者らは確認している。このことから、１番目〜３番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドと、４番目〜６番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドがそれぞれ別個に翻訳され、メチロフィラス属細菌中で機能しているものと推定される。いずれにしても、ｌｙｓＥ２４遺伝子を メチロフィラス属細菌に導入すれば、Ｌ−リジンの生産量が向上する。
【００４７】
前記のようなＬ−リジンの細胞外への排出に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ、すなわちｌｙｓＥ遺伝子またはその相同遺伝子の供与微生物としては、それらの遺伝子の改変体がメタノール資化性菌中でＬ−リジン排出活性を発現することができるものを保持する微生物であれば、いかなる微生物でも利用できる。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等が挙げられる。
【００４８】
メチロフィラス属細菌菌においてＬ−リジンの排出遺伝子を増強する場合は、その遺伝子断片を、メチロフィラス属細菌菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して、組換えＤＮＡを作製し、これをメタノール資化性細菌の宿主に導入して形質転換すればよい。あるいは、トランスポゾンに搭載し、染色体への組み込みにより、また、メタノール資化性細菌内で強力転写を誘導するようなプロモーターを、その遺伝子の上流に連結させることも可能である。
【００４９】
上記のようなＬ−リジン生合成系遺伝子又はＬ−リジン排出遺伝子等の目的遺伝子をメチロフィラス属細菌に導入、増強するには、メチロフィラス属細菌細胞内で自律複製可能なベクターに遺伝子を連結して組換えＤＮＡを作製し、それでメチロフィラス・メチロトロファスを、例えばエレクトロポレーション法などにより形質転換する方法があり、その他にトランスダクション、トランスポゾン（Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｃ．Ｍ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１，４１７，（１９８３））、Ｍｕファージ、（特開平２−１０９９８５号）または相同組換え（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．（１９７２））を用いた方法で宿主染色体に組み込むこともできる。
【００５０】
前記メチロフィラス属細菌細胞内で自律複製可能なベクターとして具体的には、例えば、広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０及びその誘導体、例えば、ｐＡＹＣ３２（Ｃｈｉｓｔｏｓｅｒｄｏｖ，Ａ．Ｙ．， Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ，Ｙ．Ｄ．， Ｐｌａｓｍｉｄ， １９８６， １６， １６１−１６７）、あるいはｐＭＦＹ４２（Ｇｅｎｅ， ４４， ５３ （１９９０））や、ｐＢＢＲ１及びその誘導体に由来するもの（Ｋｏｖａｃｈ，Ｍ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １６６， １７５−１７６ （１９９５））、さらにはｐＲＫ３１０及びその誘導体に由来のもの（Ｅｄｔｓ． Ｍｕｒｒｅｌｌ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｄａｌｔｏｎ， Ｈ．， Ｍｅｔｈａｎｅ ａｎｄ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｕｔｉｌｉｚｅｒｓ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， １８３−２０６ （１９９２））等が利用できる。
【００５１】
リジン生産能を有し、かつ、リジンデカルボキシラーゼが低下又は消失したメチロフィラス属細菌は、リジンデカルボキシラーゼが低下又は消失したメチロフィラス属細菌にＬ−リジン生産能を付与することによって取得することができる。また、上記細菌は、Ｌ−リジン生産能を有するメチロフィラス属細菌のリジンデカルボキシラーゼが低下又は消失するように改変することによっても、取得することができる。
【００５２】
＜３＞本発明のＬ−リジンの製造法
上記のようにして取得したリジンデカルボキシラーゼ活性が低下又は消失したメチロフィラス属細菌を、メタノールを主要炭素源とする液体培地に培養することにより、培養物中にＬ−リジンを生成蓄積させることができる。Ｌ−リジン生産能を有するメチロフィラス属細菌のリジンデカルボキシラーゼ活性を低下又は消失させることにより、Ｌ−リジン生産能を向上させることができる。
【００５３】
Ｌ−リジン生産のために使用される培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養源を含有する通常の培地である。主要炭素源としては、メタノールであるが、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、でんぷん加水分解物などの糖類、グリセロール、ソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸、ピルビン酸等の有機酸類を併用して用いることができる。「メタノールを主要炭素源とする」とは、全炭素源のうち、メタノールを５０％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは８０％（ｗ／ｗ）以上であることをいう。メタノールを炭素源として用いる場合の濃度は、通常は０．００１％から４％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％から２％（ｗ／ｖ）である。また、グルコース等を添加する場合の濃度は、通常、０．１％から３％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％から１％（ｗ／ｖ）である。
【００５４】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素源、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００５５】
無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。これらの他に、有機微量栄養源として、ビタミンＢ１、または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい場合もある。
【００５６】
培養は、好気的条件下で１６〜７２時間程度実施するのがよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、あるいはアンモニアガス等を使用することができる。
【００５７】
培養終了後、発酵液からのＬ−リジンの採取は、通常のイオン交換樹脂法、沈澱法、その他の公知の方法を組み合わせることにより適宜実施できる。
【００５８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
【００５９】
【実施例１】メチロフィラス・メチロトロファスのリジンデカルボキシラーゼ遺伝子（ｌｄｃ）のクローニング
メチロフィラス・メチロトロファスの野生株ＡＳ１株から染色体ＤＮＡを取得することを目的に、ＡＳ１株を５０ｍＬのＳＥＩＩ培地（組成：（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５ｇ／Ｌ， Ｋ２ＨＰＯ４ １．９ｇ／Ｌ， ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ １．５６ｇ／Ｌ， ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２００ｍｇ／Ｌ， ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ７２ｍｇ／Ｌ， ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ５μｇ／Ｌ， ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ２５μｇ／Ｌ， ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２３μｇ／Ｌ， ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ９．７ｍｇ／Ｌ， メタノール ０．５％（Ｗ／Ｖ））に植菌し、培養温度３７℃で一晩振とう培養した。その後、培養液を遠心し、菌体を回収後、市販のキット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製 Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用いて、添付の操作マニュアルに従い染色体ＤＮＡを調製した。
【００６０】
この染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号１及び２に記載のＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ（反応条件：宝酒造社製 Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、変性工程９８℃−１０秒間、アニーリング５５℃−３０秒間、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃−３分間の反応を２５サイクル）を行い、約３．０キロベースペア（以下、「ｋｂｐ」と記載）の大きさのＤＮＡ断片を得た。
【００６１】
そして、この取得した断片のＤＮＡ塩基配列を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２００１）に記載の方法に従って決定した。そのＤＮＡ断片上の制限酵素ＥｃｏＲＶ部位から制限酵素ＤｄｅＩ部位までの領域の塩基配列は、配列番号３に示す塩基配列であることが明らかになった。このＤＮＡ配列中には、配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム（以下、「ｏｒｆ」と略する場合がある）が含まれていた。また、このｏｒｆをｏｒｆ＃３０９８と命名した。また、前記配列番号４に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子をｌｄｃ遺伝子と命名した。
【００６２】
【実施例２】ｌｄｃ遺伝子を破壊したメチロフィラス・メチロトロファス株の作製
（１）ｌｄｃ遺伝子破壊用断片の作製
実施例１で調製した染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号５及び６に記載のＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ（反応条件：宝酒造社製 ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを用い、変性工程９４℃−３０秒間、アニーリング６０℃−３０秒間、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃−２分間の反応を２５サイクル）を行い、約１．３ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を得た。また同様の条件で、配列番号７及び８に記載のプライマーを用いたＰＣＲを行い、約２．０ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を得た。
【００６３】
一方、プラスミドｐＫＤ４（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＹ０４８７４３， Ｄａｔｓｅｎｋｏ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９７ （１２）， ６６４０−６６４５， ２０００）を鋳型にして、配列番号９及び１０に記載のプライマーを用いて、上記と同じ条件でＰＣＲを行い、カナマイシン耐性（Ｋｍｒ）遺伝子を含むＤＮＡ断片（約１．５ｋｂ）を調製した。
【００６４】
以上の３種のＤＮＡ断片を混ぜ合わせ、これを鋳型にして、配列番号１１及び１２に記載したプライマーを用いてＰＣＲ（反応条件：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを用い、変性工程９４℃−３０秒間、アニーリング６０℃−３０秒間、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃−４分３０秒間の反応を２５サイクル）を行い、約４．７ｋｂの断片を取得した。この断片は、カナマイシン耐性遺伝子で分断されたｌｄｃ遺伝子を含んでいる。この断片を市販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製 Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて精製後、エタノール沈殿操作を行い、ＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）， １ｍＭ ＥＤＴＡ溶液）に溶解した。このＤＮＡ溶液を遺伝子破壊用断片として以下の操作に用いた。
【００６５】
（２）メチロフィラス・メチロトロファスのｌｄｃ遺伝子欠損株の取得
次に、メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株へ、上述した遺伝子破壊用断片を導入した。形質転換は、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ４３． １９７ （１９９７））を用いた。具体的には、以下のようにして行った。
【００６６】
メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株をＳＥＩＩ液体培地（但しメタノール濃度は０．５％（ｖ／ｖ））で、３７℃で１６時間振とう培養し、その培養液２０ ｍｌを１０，０００ｒｐｍ×１０分間の遠心にかけ、菌体を集菌した。これに１ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）緩衝液（２０ ｍｌ）を加えて懸濁した後、遠心するという操作を２回行い、最後に菌体に１ｍｌの同溶液を加え、菌体懸濁液を調製し、エレクトロポレーション用のエレクトロセルとした。そして、上記のカナマイシン耐性遺伝子で分断されたｌｄｃ遺伝子（ｌｄｃ：：ＫｍＲ）を含むＤＮＡ断片の約１μｇ分を、エレクトロセル１００μｌに加え、１８．５ｋＶ／ｃｍ， ２５μＦ， ２００Ωの条件で電気パルスを与え、エレクトロポレーション処理を行い、ＤＮＡ断片を細胞内へ導入した。この菌懸濁液に直ちにＳＥＩＩ液体培地を加え、３７℃で３時間培養した。
【００６７】
前記培養液を、カナマイシン２０μｇ／ｍｌを含むＳＥＩＩ寒天培地に塗布後、３７℃で培養した。培養を４８時間行ったところ、プレート上に数十個のコロニーが出現した。そのうち２０株を無作為に選択し、それらの株では目的どおりの遺伝子が破壊されているか否かを、ＰＣＲ法による検出方法により確認した。即ち、出現したコロニーを滅菌水２０μｌに懸濁し、１ｍｇ／ｍｌの濃度の Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を５μｌ、更に２５μＬのＰ溶液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＨＣｌにてｐＨ８．０に調整）からなる溶液）を添加した後、攪拌し、６０℃で２０分、次いで９５℃で５分間、保温した。そして、この反応液を鋳型とし、配列番号１１及び１２に示すプライマーを用いたＰＣＲ（反応条件：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを用い、変性過程９４℃−３０秒間、アニーリング過程６０℃−３０秒間、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃−４分３０秒間の反応を２５サイクル）を行うことによって、目的遺伝子の破壊を確認したところ、１０株が目的通りの破壊株であった。そこで、このうちの一株をＤＬＣ１０株（ＭＬＤＣ株）と命名し、以後の実験に使用した。
【００６８】
（３）ｌｄｃ遺伝子欠損株の表現型
上記（２）で作製したＤＬＣ１０株は、カナマイシンを含むＳＥＩＩ寒天培地で生育する株として選択された株であるが、同様の寒天培地で植え継ぐと、生育しなくなることが判明した。そこで、リジンデカルボキシラーゼ（ＬＤＣ）及びアルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）の、それぞれの反応生成物である、カダベリン（ＣＡＤ）及びアグマチン（ＡＧＭ）を、培地へ添加することで、それらの生育阻害を相補出来るかどうか検討した。
【００６９】
カナマイシン２０μｇ／ｍｌ（μｇ／ｍｌ）を含む液体ＳＥＩＩ培地４ｍｌに、カダベリン又はアグマチンを１ｇ／ｌの濃度で添加した培地を作製した。そして、そこへ上記ＤＬＣ１０株を植菌し、３７℃、１１６ｒｐｍで振とう培養し、その生育を調べた。その結果、ＤＬＣ１０株は、カダベリンあるいはアグマチンの無添加培地では生育出来ないが、どちらか一方の物質の培地への添加によって生育可能となることが判明した。また、カダベリン添加の方が、アグマチン添加時と比べ、より良い生育回復効果が認められた。
【００７０】
（４）ｏｒｆ＃３０９８導入によるｌｄｃ欠損株の相補性確認
上記のｌｄｃ欠損株の生育のためのカダベリン要求性が、実施例１で取得したｏｒｆ＃３０９８の導入で相補できるのかどうかを検証した。まず、ｏｒｆ＃３０９８のみを含むＤＮＡを、ｌｄｃ欠損株へ導入するためのプラスミドを作製した。実施例１に記載した染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号１３及び１４に記載した配列をもつＤＮＡプライマー（５’末端側にＳｓｅ８３８７Ｉサイトを連結）を用いてＰＣＲを行った（増幅反応条件は、宝酒造社製Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、変性工程９８℃−１０秒間、アニーリング５５℃−３０秒間、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃−３分間の反応を２５サイクル）。得られた約３ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を、制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ（宝酒造）で消化した。一方、同じくＳｓｅ８３８７Ｉで分解後、脱リン酸化処理を行ったベクターｐＲＳｔａｃと、このＤＮＡ断片を連結した（宝酒造社製、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２を使用）。このようにして作製したｏｒｆ＃３０９８の搭載プラスミド（ｔａｃプロモーターに対して順向き）をｐＲＳ−ｏｒｆ＃３０９８と命名した。
【００７１】
なお、ｐＲＳｔａｃは公知のプラスミドｐＲＳ（特表平３−５０１６８２号公報参照）を用いて、そこへｔａｃプロモーターを導入することにより構築した。ｐＲＳは、ＲＳＦ１０１０の誘導体である広宿主域ベクタープラスミドｐＡＹＣ３２（Ｃｈｉｓｔｏｒｅｒｄｏｖ， Ａ．Ｙ．， Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ， Ｙ．Ｄ． Ｐｌａｓｍｉｄ， １９８６， １６， １６１−１６７）に由来するｐＶＩＣ４０プラスミド（ＷＯ９０／０４６３６国際公開パンフレット、特表平３−５０１６８２号公報）より、同プラスミドが持つスレオニンオペロンをコードするＤＮＡ領域を削除してベクター部分のみを持つプラスミドである。
【００７２】
まず、ｐＲＳより、ｔａｃプロモーターを持つプラスミドｐＲＳｔａｃを構築した。ｐＲＳベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルにて分離し、約８キロベースペアのＤＮＡ断片をＥＡＳＹ ＴＲＡＰ Ｖｅｒ．２（ＤＮＡ回収キット、宝酒造社製）を用いて回収した。一方、ｔａｃプロモーター領域を、ｐＲＫ２２３−３プラスミド（発現用ベクター、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を鋳型とし、配列番号１７および１８に示すプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した（変性９４℃−２０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−６０秒のサイクルを３０サイクル行った）。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。増幅されたｔａｃプロモーターを含むＤＮＡ断片をＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した後、あらかじプライマー中にデザインしておいた制限酵素サイト、すなわちＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＴ２２Ｉで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した後、０．８％アガロースゲルで分離し、約０．１５ｋｂｐのＤＮＡ断片をＥＡＳＹ ＴＲＡＰ Ｖｅｒ．２を用いて回収した。
【００７３】
上記のようにして調製したｐＲＳベクター消化物と、ｔａｃプロモーター領域断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、宝酒造製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法で各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で消化して構造を確認し、ｐＲＳｔａｃを得た。ｐＲＳベクター上のストレプトマイシン耐性遺伝子の転写方向とｔａｃプロモーターの転写方向が同じ向きになっているものを、ｐＲＳｔａｃとして選択した。
【００７４】
以上のようにして作製したプラスミドｐＲＳ−ｏｒｆ＃３０９８、又は対照プラスミドであるｐＲＳｔａｃを用いて、エレクトロポレーション法でＤＬＣ１０株をそれぞれ形質転換し、ＳＥＩＩ寒天培地（但し、カナマイシン２０μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、カダベリン１ｇ／ｌを含む）で選択した。
【００７５】
選択されたＤＬＣ１０／ｐＲＳ−ｏｒｆ＃３０９８株を、カダベリン無添加のＳＥＩＩ寒天培地（カナマイシン２０μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを含む）に接種したところ、対照株のＤＬＣ１０／ｐＲＳｔａｃ株が生育出来なかったのに対し、ｐＲＳｔａｃ−ｏｒｆ＃３０９８導入株では生育が可能となった。また、ＤＬＣ１０／ｐＲＳ−ｏｒｆ＃３０９８株から、Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｗｉｚａｒｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓを用いてプラスミドを抽出し、電気泳動によって確認したところ、目的通りのプラスミドを保持していることが確認されたため、この相補性は、プラスミド上のｏｒｆ＃３０９８がコードするタンパク質がトランスに作用して、発揮されたことが判明した。このことは、このｏｒｆ＃３０９８自身の欠損が、本菌の生育にカダベリン要求性を付与したといえる。
【００７６】
【実施例３】Ｅ． ｃｏｌｉ由来のｌｄｃＣ遺伝子導入による、メチロフィラス・メチロトロファスｏｒｆ＃３０９８欠損の相補
（１）Ｅ． ｃｏｌｉ由来のｌｄｃＣ遺伝子を搭載したプラスミドの作製
Ｅ． ｃｏｌｉに由来するｌｄｃＣ遺伝子が、ＤＬＣ１０株の生育へのカダベリン要求性を相補出来るのかを調べるために、まずＥ． ｃｏｌｉ由来のｌｄｃＣ搭載プラスミドを作製した。Ｅ． ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株をＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）でて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からＥｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社製 Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆ．Ｋｉｔを用いて染色体ＤＮＡを調製した。この染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号１５及び１６（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９７， １７９（１４）， ４４８６−４４９２）に記載した配列をもつＤＮＡプライマー（５’末端側にＰｓｔＩサイトを連結）を用いてＰＣＲを行った（増幅反応条件は、宝酒造社製Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、変性工程９８℃−１０秒間、アニーリング６０℃−３０秒間、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃−２分間の反応を２５サイクル）。得られた約２．３ｋｂのＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩ（宝酒造）で分解した。一方、ベクターｐＲＳｔａｃを制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉで分解後、脱リン酸化処理を行い、上記のＰＣＲ断片と連結した（宝酒造社製、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２を使用）。このようにして作製したＥ． ｃｏｌｉのｌｄｃＣを搭載したプラスミドをｐＲＳ−ｌｄｃＣ−Ｆ（ｔａｃプロモーターに対して順向き）及びｐＲＳ−ｌｄｃＣ−Ｒ（ｔａｃプロモーターに対して逆向き）と命名した。
【００７７】
（２）Ｅ． ｃｏｌｉ由来ＬＤＣによるＤＬＣ１０株のｏｒｆ＃３０９８欠損の相補性確認
上記のようにして作製した両プラスミドで、エレクトロポレーション法によりＤＬＣ１０株を形質転換し、ＳＥＩＩ寒天培地（カナマイシン２０μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、カダベリン１ｇ／ｌを含む）で形質転換体を選択したところ、ｐＲＳｔａｃ−ｌｄｃＣ−Ｆでは形質転換体は取得できず、ｐＲＳｔａｃ−ｌｄｃＣ−Ｒによる形質転換体のみが得られた。
【００７８】
このＤＬＣ１０／ｐＲＳｔａｃ−ｌｄｃＣ−Ｒ株を、カダベリンを含まない寒天培地ＳＥＩＩ（カナマイシン２０μｇ／ｍｌとストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを含む）に塗布したところ、対照株であるＤＬＣ１０／ｐＲＳ−ｔａｃ株は生育出来ないのに対し、ＤＬＣ１０／ｐＲＳｔａｃ−ｌｄｃＣ−Ｒ株では生育可能となることを確認した。このことは、Ｅ． ｃｏｌｉのＬＤＣ（リジンデカルボキシラーゼ）が、メチロフィラス・メチロトロファスのｏｒｆ＃３０９８欠損株のカダベリン要求性を相補できたことを示すものである。
【００７９】
【実施例４】ｏｒｆ＃３０９８（ｌｄｃ遺伝子）を破壊したメチロフィラス・メチロトロファス株によるＬ−リジンの生産
（１）Ｌ−リジン生産プラスミドｐＲＳｌｙｓＥ２４の構築
まず、メチロフィラス属細菌に、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてリジンの排出活性を発揮する蛋白質をコードするｌｙｓＥ遺伝子を導入するために、前記ｐＲＳｔａｃを用いて、ｌｙｓＥ発現用プラスミドｐＲＳｌｙｓＥを構築した。
実施例２の（４）のようにして作製したｐＲＳｔａｃを、Ｓｓｅ８３８７Ｉ（宝酒造製）およびＳａｐＩ（ニューイングランドバイオラボ社製）で消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルで分離し、約９．０ｋｂｐのＤＡＮ断片を回収した。
【００８０】
また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株（ＡＴＣＣ１３８６９）より抽出した染色体を鋳型として、配列番号１９および２０に示すプライマーを用いたＰＣＲ法（変性９４℃−２０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−９０秒）によりｌｙｓＥ遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ反応には、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。得られた断片をＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した後、制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＳａｐＩで消化した。フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、０．８％アガロースゲルで精製し、回収した。
【００８１】
上記のようにして調製したｐＲＳｔａｃベクター消化物と、ｌｙｓＥ遺伝子領域断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、宝酒造製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、ｐＲＳｌｙｓＥを得た。ｐＲＳｌｙｓＥは、ｔａｃプロモーターの転写方向に対して、ｌｙｓＥ遺伝子の転写方向が同じ向きになるように配置されている。
【００８２】
上記のようにして得られたｐＲＳｌｙｓＥを、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ４３． １９７ （１９９７））によりメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ１０５１５）に導入した。その結果、ほとんど形質転換体が取得できなかった。また、コロニー形成ができた数個の株から、導入したプラスミドを抽出して塩基配列を調べたところ、ｌｙｓＥ遺伝子に変異が導入されており、それらのコロニーを培養しても、それらの培養上清中にＬ−リジンが蓄積することもなかった。しかしながら、更に多数のコロニーを調べたところ、変異が導入されたｐＲＳｌｙｓＥの解析を行ううちに、メチロフィラス属細菌にＬ−リジン生産能を付与し得る、即ち、機能する変異型ｌｙｓＥ遺伝子を取得することができた。
【００８３】
この変異型ｌｙｓＥ遺伝子をｌｙｓＥ２４遺伝子と命名した。ｌｙｓＥ２４遺伝子の塩基配列を解析したところ、この変異はアミノ酸置換が起こる変異ではなく、ｌｙｓＥの翻訳領域内のほぼ中央に終止コドンが導入されるナンセンス変異であることがわかった。野生型ｌｙｓＥ遺伝子の塩基配列及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示す。ｌｙｓＥ２４では、配列番号２１の３５５位のＧ（グアニン）のあとにＴ（チミン）が挿入されていた。ｌｙｓＥ２４の塩基配列及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示す。このｌｙｓＥ２４を持つプラスミドをｐＲＳｌｙｓＥ２４と命名した。
【００８４】
（２）ｄａｐＡ＊遺伝子を持つプラスミドｐＲＳｄａｐＡの作製
Ｌ−リジン生合成系酵素遺伝子として、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子（ｄａｐＡ＊）を持つプラスミドを作製した。
【００８５】
実施例２の（４）で作製したｐＲＳｔａｃをＳｓｅ８３８７ＩおよびＸｂａＩで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルで分離し、約９ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【００８６】
ｄａｐＡ＊遺伝子断片は、同遺伝子を含む公知のプラスミドＲＳＦＤ８０（ＷＯ９０／１６０４２号参照）を鋳型として、配列番号２５および２６に示すプライマーを用いたＰＣＲ法（変性９４℃−２０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−６０秒）により増幅した。ＰＣＲ反応には、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。得られたｄａｐＡ遺伝子断片をＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にて精製した後、制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＸｂａＩで消化した。フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収し、０．８％アガロースゲルで分離後、約０．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【００８７】
上記のように調製したｐＲＳｔａｃベクター消化物と、ｄａｐＡ＊遺伝子領域断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、宝酒造社）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、ｐＲＳｄａｐＡプラスミドを得た。ｐＲＳｄａｐＡプラスミドは、ｔａｃプロモーターの転写方向に対して、ｄａｐＡ遺伝子の転写方向が同じ向きになるように配置されている。
【００８８】
（３）ｌｙｓＥ２４遺伝子及びｄａｐＡ＊遺伝子を持つプラスミドｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡの構築
ｐＲＳｌｙｓＥプラスミドにｄａｐＡ＊遺伝子を挿入したプラスミドを構築した。実施例４の（１）で作製したｐＲＳｌｙｓＥ２４を制限酵素ＳａｐＩで消化し、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化した。また、実施例４の（２）で作製したｐＲＳｄａｐＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｐＩで消化し、０．８％アガロースゲルにより約１ｋｂｐのｔａｃプロモーターおよびｄａｐＡ＊領域を含む断片を分離し、同断片をＥＡＳＹ ＴＲＡＰ Ｖｅｒ２（宝酒造製）を用いて回収した。この断片を前記と同様にして平滑化し、前記のｐＲＳｌｙｓＥ２４の消化物と、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２（宝酒造製）を用いて連結した。
【００８９】
上記の連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、宝酒造社製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し３７℃で８時間振盪培養した。各培養液から、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡプラスミドを得た。このプラスミドは、ｌｙｓＥ２４遺伝子とｄａｐＡ＊遺伝子の各遺伝子の転写の向きが同一になるように配置されている。
【００９０】
ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡプラスミドで形質転換されたＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株はＡＪ１３８３２と命名され、同株は２００１年６月４日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３７１として寄託され、平成１４年５月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−８０４２の受託番号のもとで寄託されている。
【００９１】
（４）メチロフィラス・メチロトロファスのｏｒｆ＃３０９８（ｌｄｃ）欠損株へのＬ−リジン生産プラスミドの導入とＬ−リジン生産
メチロフィラス・メチロトロファスのＬ−リジン生産に及ぼす、ｌｄｃ遺伝子欠損の影響を調べた。まず、実施例２で作製したＤＬＣ１０株は、野生株から作製していることから、Ｌ−リジンを生産する性質は改変されていない。そこで、ｌｄｃ欠損によるＬ−リジン生産への影響を効果的に検証するために、メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株にｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡが導入された株から、実施例２（２）と同様の操作によって、ｌｄｃ破壊株を作製した。ここで得られた株をＤＬＣ１２／ ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡ株と命名した。
【００９２】
対照株であるＡＳ１／ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡ株をＳＥＩＩ（ストレプトマイシン ５０μｇ／ｍｌを含む）寒天培地に、ＤＬＣ１２／ ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡ株をＳＥＩＩ（ストレプトマイシン ５０μｇ／ｍｌおよびカダベリン１ｇ／ｌを含む）寒天培地に塗り広げ、３７℃で１晩培養した後、培地表面の約３ｃｍ２（平方センチメートル）の菌体をかきとって、カダベリン１ｇ／Ｌを含むＳＥＩＩ生産培地（ストレプトマイシン ５０μｇ／ｍｌを含む）２０ｍｌに植菌し、３７℃で６７時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−リジン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。その結果、ＡＳ１／ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡ株は培地中へのＬ−リジン蓄積が１．２６ｇ／Ｌであったが、ＤＬＣ１２／ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡ株は培地中にＬ−リジンを１．７９ｇ／Ｌ蓄積しており、ｌｄｃを欠損させることにより、Ｌ−リジンの生産性を向上し得ることが確認できた。
【００９３】
【発明の効果】
本発明により、新規なリジンデカルボキシラーゼ及び同酵素をコードする遺伝子が提供可能となる。一方、Ｌ−リジン生産能を有し、当該遺伝子の発現が抑えられているメチロフィラス属細菌を培養することにより、効率的にＬ−リジンを製造することができる。
【００９４】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−リジンの分解に関与するメチロフィラス属細菌の新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子、当該遺伝子の発現が抑えられたメチロフィラス属細菌及び当該細菌を用いたＬ−リジンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−リジンの分解酵素として、Ｌ−リジンの脱炭酸によりカダベリンを生成する反応を触媒するリジンデカルボキシラーゼ（リジン脱炭酸酵素）が知られている。例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）では、ＣａｄＡとＬｄｃと名づけられた２つの酵素がある（特許文献１）。更には、バチラス・ハロジュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｌａｎｓ）、バチラス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セレノモナス・ルミナンチウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、ニコチアナ・グルチノーサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）などの細菌において、ゲノム上の遺伝子配列情報からや、あるいは実験的結果に基づき、その酵素があることが示唆されている（非特許文献１〜３）。しかしながら、メタノール資化性菌において、そのような酵素の存在は定かではない。
【０００３】
一方、メチロフィラス属細菌を用いたＬ−リジンの製造方法として、リジンアナログ、例えば、ＡＥＣ（Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン）に耐性な変異株、またはＬ−リジンの生合成に関与する遺伝情報を担うデオキシリボ核酸を組み込んだベクターを保有する組換え体を培養する方法が知られている（特許文献２）。しかしながら、メチロフィラス属細菌ではリジンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は知られておらず、同遺伝子の発現が抑えられた、あるいは欠損させたメチロフィラス属細菌を用いたＬ−リジン生産についての報告もない。
【０００４】
【特許文献１】
国際公開第９６／１７９３０号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第００／６１７２３号パンフレット
【非特許文献１】
ＫＥＧＧ データベース （Ｒｅｌｅａｓｅ ２５．０， Ｊａｎｕａｒｙ ２００３）
【非特許文献２】
Ｙ． Ｔａｋａｔｓｕｋａ， ｅｔ ａｌ．， ”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”， （２０００） ｖｏｌ．１８２， ｐ．６７３２−６７４１
【非特許文献３】
Ｙ．−Ｓ．Ｌｅｅ ａｎｄ Ｙ．−Ｄ． Ｃｈｏ， ”Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｐｏｕｒｎａｌ”， （２００１） ｖｏｌ．３６０， ｐ．６５７−６６５
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、メタノール資化性細菌であるメチロフィラス・メチロトロファスのリジンデカルボキシラーゼ遺伝子を取得し、この遺伝子を利用して、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現が抑えられたメチロフィラス属に属するＬ−リジン生産菌を造成し、また、これらメチロフィラス属細菌を培養することによるＬ−リジン製造法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、メチロフィラス属細菌にリジンデカルボキシラーゼが存在しているか否かにつき鋭意研究を行った結果、メチロフィラス・メチロトロファスのゲノム上のＤＮＡ配列から、他の微生物由来である既知のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子とやや相同性のあるオープンリーディングフレーム（以下、「ｏｒｆ」と略する）を発見した。そのアミノ酸配列の相同性としては、例えば、エシェリヒア・コリのｃａｄＡ産物（Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＮＣＢＩ：ＡＣＣ７７０９２）との相同性（同一アミノ酸となる割合）は３８．１８％、またｌｄｃＣ産物（Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＮＣＢＩ：ＡＣＣ７３２９７）との相同性は３７．８５％であった。また、このｏｒｆのアミノ酸配列は、エシェリヒア・コリのａｄｉＡの遺伝子産物（Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＮＣＢＩ：ＡＣＣ７７０７８）であるアルギニンデカルボキシラーゼにも約３８．１１％の相同性を有しており、その実体は不明であった。
【０００７】
そこで、メチロフィラス・メチロトロファスの当該ｏｒｆを破壊したところ、通常、メチロフィラス・メチロトロファスの野生株が生育するＳＥＩＩ培地には生育しなくなった。これは意外なことで、エシェリヒア・コリなどでは、ｃａｄＡ及びｌｄｃＣを欠損させても、特別な栄養要求性を示さない。
【０００８】
メチロフィラス・メチロトロファスの場合は、当該ｏｒｆの欠損により、ＳＥＩＩ培地成分では不足している栄養分があると考えられたため、培地へＬ−リジンの分解産物であるカダベリン又はＬ−アルギニンの分解産物であるアグマチンを適量添加したところ、その欠損株は生育可能となった。
【０００９】
従って、メチロフィラス・メチロトロファスでは当該ｏｒｆにコードされるタンパク質は、通常の最少培地に生育するためには必須であること、そして、そのｏｒｆの欠損株の生育にはカダベリン又はアグマチンが必要であることが判明した。このことから、このｏｒｆを含む遺伝子を、ｌｄｃ遺伝子と命名した。
【００１０】
そして、メチロフィラス・メチロトロファスから育種したＬ−リジン生産菌において、ｌｄｃ遺伝子の発現を抑えたところ、生成されるＬ−リジンの生産量が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下のとおりである。
【００１１】
（１）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
（２）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
（３）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（２）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列の塩基番号６８４〜２９３０からなる塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列の塩基番号６８４〜２９３０からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）メチロフィラス属細菌の染色体に由来することを特徴とする（２）又は（３）に記載のＤＮＡ。
（５）Ｌ−リジン生産能を有し、かつ、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下または消失するように改変されたメチロフィラス属細菌。
（６）染色体上の遺伝子であって、かつ、（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡと同一の塩基配列を有する遺伝子、又は同ＤＮＡと相同組換えが起こり得る程度の相同性を有する遺伝子が破壊されたことにより、該遺伝子の発現が抑えられ、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下または消失した（５）に記載のメチロフィラス属細菌。
（７）（６）に記載のメチロフィラス属細菌を、メタノールを主要炭素源とする液体培地に培養し、培養物中にＬ−リジンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明のリジンデカルボキシラーゼ及びそれをコードするＤＮＡ
本発明のリジンデカルボキシラーゼは、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質である。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【００１３】
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１４】
また、本発明のＤＮＡは、上記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである。
【００１５】
本発明のＤＮＡ（以下、「ｌｄｃ遺伝子」ということがある）は、メチロフィラス属細菌、例えば、メチロフィラス・メチロトロファスの染色体ＤＮＡから単離、取得することができる。メチロフィラス・メチロトロファスの野生株ＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ Ｎｏ．１０５１５）は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ、住所ＮＣＩＭＢ Ｌｔｓ．， Ｔｏｒｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔａｔｉｏｎ １３５， Ａｂｂｅｙ Ｒｏａｄ， Ａｂｅｒｄｅｅｎ ＡＢ９ ８ＤＧ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）から入手可能である。そしてこの株の一般的な培養方法は、ＮＣＩＭＢのカタログに記載されているが、また実施例に記載したＳＥＩＩ培地でも生育させることができる。
【００１６】
そしてこの株の一般的な培養方法は、ＮＣＩＭＢのカタログに記載されているが、また実施例に記載したＳＥＩＩ培地でも生育させることができる。
ＡＳ１株のゲノムＤＮＡは公知の方法により調製できるが、市販のゲノム調製用キットを使用してもよい。
【００１７】
本発明のＤＮＡは、本発明によってそれらの塩基配列が明らかになったので、それらの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、メチロフィラス属細菌等の細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）により増幅することによって、取得することができる。また、前記塩基配列に基づいて調製したプローブ、又はＰＣＲにより増幅した部分断片をプローブに用いたコロニーハイブリダイゼーションによっても、本発明のＤＮＡは取得され得る。
【００１８】
本発明のＤＮＡのクローニングに用いるゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換等の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２００１）に記載されている。
【００１９】
上記ＰＣＲに用いるプライマーとしては、配列番号１と及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
上記のようにして取得されたメチロフィラス・メチロトロファスのゲノムから単離されたｌｄｃ遺伝子の塩基配列を配列番号３に示す。また、それによってコードされるリジンデカルボキシラーゼのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００２０】
上記アミノ酸配列を、既知のアミノ酸配列のデータベースを用いて、相同性のある配列を検索したところ、エシェリヒア・コリの２種のリジンデカルボキシラーゼ（遺伝子はそれぞれ、ｃａｄＡとｌｄｃＣ）およびアルギニンデカルボキシラーゼ（遺伝子はａｄｉＡ）と、それぞれ３８．１８％、３７．８５％、及び３８．１１％の相同性が認められた。相同性は、比較に用いた領域の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の個数の割合として算出した。
【００２１】
本発明のＤＮＡは、コードされるリジンデカルボキシラーゼの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含んでいてもよい。ここで、数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、リジンデカルボキシラーゼを構成するアミノ酸配列全体に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、リジンデカルボキシラーゼの活性を有するものであってもよい。具体的には、前記「数個」は、好ましくは２〜２０個、より好ましくは ２〜１０個である。前記リジンデカルボキシラーゼの活性とは、Ｌ−リジンを脱炭酸してカダベリンを生成する反応を触媒する活性をいう。
【００２２】
上記のようなリジンデカルボキシラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号３に示す塩基配列を改変することによって取得することができる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、ｌｄｃ遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、およびｌｄｃ遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００２３】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、ｌｄｃ遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【００２４】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現されたリジンデカルボキシラーゼの活性を調べることにより、リジンデカルボキシラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するｌｄｃ遺伝子を保持する細胞から、配列番号３の塩基番号６８４〜２９３０からなる塩基配列を有するＤＮＡ、または同塩基配列から調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、リジンデカルボキシラーゼと実質的に同一のタンパク質を、それぞれコードするＤＮＡが得られる。
【００２５】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましく９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ， ０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ， ０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２６】
プローブとしては、ｌｄｃ遺伝子の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、当業者によく知られた方法により、各遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、各遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲ反応により作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は５０℃、２×ＳＳＣ， ０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００２７】
なお、リジンデカルボキシラーゼ活性は、例えばＹ．−Ｓ．Ｌｅｅ ａｎｄ Ｙ．−Ｄ． Ｃｈｏ， ”Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｐｏｕｒｎａｌ”， （２００１） ｖｏｌ．３６０， ｐ．６５７−６６５の方法により測定することができる。
本発明のｌｄｃ遺伝子は、後述するようにｌｄｃ遺伝子破壊株の構築に利用することができることに加えて、例えば、本発明のリジンデカルボキシラーゼの製造に利用することができる。すなわち、ｌｄｃ遺伝子を適当な宿主微生物に導入し、同遺伝子を発現させることにより、リジンデカルボキシラーゼを製造することができる。これは、遺伝子組換え技術を利用した有用タンパク質の製造に用いられる通常の方法と同様にして行うことができる。すなわち、リジンデカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを、適当なプロモーターを含むベクターに挿入し、得られる組換えベクターで大腸菌等の宿主を形質転換し、形質転換体を培養して前記遺伝子を発現させればよい。宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌、酵母等が挙げられる。また、プロモーターは、用いる宿主で機能するものであればよく、一例としはｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｒｅｃＡ、Ｔ７（新生化学実験講座１、タンパク質、ＶＩ合成及び発現、日本生化学会編、ｐ１６６、安枝、松井、１９９２年、東京化学同人刊）、ＰＧＫ、ＡＤＨ１、ＧＰＤ、ＭＦα１、ＳＵＣ２、ＰＨＯ５、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４（新生化学実験講座１、タンパク質、ＶＩ合成及び発現、日本生化学会編、ｐ２１５、酒井ら、１９９２年、東京化学同人刊）等が挙げられる。
【００２８】
宿主微生物からのリジンデカルボキシラーゼの採取は、通常の組換えタンパク質の製造と同様にして行うことができる。
【００２９】
＜２＞本発明のメチロフィラス属細菌
本発明の細菌は、Ｌ−リジン生産能を有し、かつ、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下または消失するように改変されたメチロフィラス属細菌である。
【００３０】
メチロフィラス属細菌としては、メチロフィラス・メチロトロファスが挙げられる。また、本発明において「Ｌ−リジン生産能」とは、本発明の細菌を培地で培養したときに、培地中に有意な量のＬ−リジンを蓄積する能力をいう。
【００３１】
細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性の低下又は消失は、例えば、ｌｄｃ遺伝子の発現を抑えることによって行われる。また、この遺伝子によりコードされるリジンデカルボキシラーゼ酵素の構造を改変して、比活性を低下又は消失させることによっても、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性を低下又は消失させることができる。上記のような細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下又は消失したメチロフィラス属細菌は、例えば、メチロフィラス属細菌を紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、リジンデカルボキシラーゼ活性が低下した変異株を選択する方法が挙げられる。
【００３２】
また、本発明の細菌の好ましい態様として、染色体上のｌｄｃ遺伝子が破壊されたことにより、該遺伝子の発現が抑えられ、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下または消失したメチロフィラス属細菌が挙げられる。ここでいうｌｄｃ遺伝子とは、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するリジンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子、又は同遺伝子と相同組換えが起こり得る程度の相同性を有する遺伝子を含む。前記相同組換えが起こり得る程度の相同性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【００３３】
染色体上のｌｄｃ遺伝子の破壊は、実施例に示したように、相同性組換えを利用した遺伝子置換による方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ１ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ（１９７２）； Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．ａｎｄ Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６２，１１９６（１９８５））によって、行うことができる。相同性組換えは、細菌が一般的に持つ能力であり、メチロフィラス属細菌も、相同組換えによる遺伝子置換が可能なことを、本発明者らは見出している。具体的には、正常な機能を有するリジンデカルボキシラーゼを産生しないように改変したｌｄｃ遺伝子（欠失型ｌｄｃ遺伝子）を含むＤＮＡでメチロフィラス属細菌を形質転換し、欠失型ｌｄｃ遺伝子と染色体上のｌｄｃ遺伝子との間で組換えを起こさせる。この後、染色体上のプラスミドが組み込まれた部位で再び組換えが起こると、プラスミドが染色体上から抜け落ちる。その際、組換えが起きる位置によって、欠失型遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちる場合と、正常な遺伝子が染色体上に固定され、欠失型遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちる場合がある。前者のような菌株を選択することにより、染色体上の正常な遺伝子が欠失型遺伝子で置換された菌株を取得することができる。
【００３４】
また、メチロフィラス・メチロトロファスにおいては、染色体上の目的遺伝子と相同な遺伝子を、直鎖状ＤＮＡ断片の形態で導入することにより、細胞内で染色体上の目的遺伝子と導入した直鎖状ＤＮＡ断片上の相同な遺伝子との間で相同組換えが起こり、遺伝子置換ができることを本発明者らは見い出しており、このような手法も適用可能である。なお、この手法により遺伝子の置換を行った例を、後記実施例に記載している。
【００３５】
前記欠失型ｌｄｃ遺伝子としては、同遺伝子のコーディング領域の中の塩基配列中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることによってコードされるタンパク質の比活性が低下又は消失した遺伝子が挙げられる。また、コーディング領域の内部又は末端を欠失させた遺伝子、あるいは、コード領域に、他の配列を挿入した遺伝子等が挙げられる。他の配列としては、カナマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子が挙げられる。
【００３６】
染色体上のｌｄｃ遺伝子の発現を低下又は消失させることは、同遺伝子のプロモーター配列中に、１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせ、プロモーター活性を低下させることによって、転写レベルで遺伝子の発現を抑えること（Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｄ． Ｃｏｕｒｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３（１９７９）ｐ．３１９、Ｐ．Ｙｏｕｄｅｒｉａｎ，Ｓ．Ｂｏｕｖｉｅｒ ａｎｄ Ｍ． Ｓｕｓｓｋｉｎｄ，Ｃｅｌｌ ３０（１９８２）Ｐ．８４３−８５３参照）によっても行うことができる。
【００３７】
また、ｌｄｃ遺伝子の発現は、同遺伝子のＳＤ配列と開始コドンとの間の領域中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることによって、翻訳レベルで抑えることができる（Ｊ．Ｊ．Ｄｕｎｎ，Ｅ．Ｂｕｚａｓｈ−Ｐｏｌｌｅｒｔ ａｎｄ Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７５（１９７８）ｐ．２７４３参照）。
【００３８】
上記のようなプロモーターやＳＤ配列と開始コドンとの間の領域の改変は、前記の遺伝子置換と同様にして行うことができる。
遺伝子中に塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせるには、具体的には、部位特異的変異法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ Ｆｒｉｔｓ，Ｈ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １５４， ３５０（１９８７））や、次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤により処理する方法（Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｄ．ａｎｄ Ｎａｔｈａｎｓ，Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５，２７０（１９７８））が挙げられる。
【００３９】
部位特異的変異法は、合成オリゴヌクレオチドを用いる方法であり、任意の限定された塩基対だけに、任意の置換、欠失、挿入、付加または逆位を導入できる手法である。この方法を利用するには、まず、クローン化され、ＤＮＡ塩基配列が決定されている目的遺伝子を持つプラスミドを変性させて１本鎖を調製する。次に、変異を起こさせたい部分に相補的な合成オリゴヌクレオチドを合成するが、この時合成オリゴヌクレオチドを完全に相補的な配列にせず、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つようにしておく。この後１本鎖ＤＮＡと任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つ合成オリゴヌクレオチドをアニールさせ、さらにＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントとＴ４リガーゼを用いて完全な２本鎖プラスミドを合成し、これをエシェリヒア・コリのコンピテントセルに導入する。このようにして得られた形質転換体の幾つかは、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位が固定された遺伝子を含むプラスミドを持っている。遺伝子に変異を導入し、改変または破壊することができる同様な手法には、リコンビナントＰＣＲ法（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ ｐｒｅｓｓ（１９８９））がある。
【００４０】
以上のようにして取得した変異が導入されて改変または破壊された遺伝子を、メチロフィラス属細菌の染色体上の正常な遺伝子と置換することにより、細胞中のｌｄｃ遺伝子の発現を抑えることができる。
【００４１】
リジンデカルボキシラーゼ活性を低下または消失させるメチロフィラス属細菌は、Ｌ−リジン生産能を有する細菌である。Ｌ−リジン生産能を有するメチロフィラス属細菌、例えばメチロフィラス・メチロトロファス菌株は、Ｌ−リジン生産能を有しない株に変異処理を施し、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（以下、ＡＥＣと記す）等のリジンアナログに対する耐性を付与することにより取得することができる。変異処理の方法としては、エシェリヒア・コリの菌体にＮＴＧやＥＭＳ等の化学薬剤による処理、あるいは紫外線、放射線照射等の処理を施す方法がある。このような菌株の具体例としては、メチロフィラス・メチロトロファスＡＪ１３６０８が挙げられる。本菌株は、メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株にＡＥＣ耐性を付与することによって育種されたものである。尚、メチロフィラス・メチロトロファスＡＪ１３６０８は、１９９９年６月１０日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター：郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７４１６として寄託され、２０００年３月３１日付にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１２が付与されている。
【００４２】
また、Ｌ−リジン生産能を有するメチロフィラス・メチロトロファス菌株は、Ｌ−リジンの生合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを遺伝子組換え技術により導入、増強することによっても育種することができる。導入される遺伝子は、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、スクシニルジアミノピメリン酸トランスアミナーゼ等、Ｌ−リジンの生合成経路上の酵素をコードする遺伝子であり、ジヒドロジピコリン酸合成酵素のようにＬ−リジンによるフィードバック阻害を受ける酵素遺伝子の場合には、かかる阻害が解除された酵素をコードする変異型遺伝子を用いることが望ましい。
【００４３】
また、Ｌ−リジンの菌体外への排出に関与するタンパク質の活性を強化することによっても、Ｌ−リジン生産能を向上させることができる。Ｌ−リジンの細胞外への排出に関与するタンパク質としては、ｌｙｓＥ遺伝子によってコードされるＬｙｓＥタンパク質が知られている。尚、本発明者らは、ブレビバクテリウム属細菌に由来する野生型ｌｙｓＥ遺伝子は、メチロフィラス属細菌中では全く機能しないが、同細菌で機能するような改変が可能であることを確認している。このようなｌｙｓＥタンパク質の改変体としては、後記実施例に示すｌｙｓＥ２４が挙げられる。
【００４４】
ｌｙｓＥ遺伝子がコードするＬｙｓＥタンパク質は、６個の疎水性へリックス領域を有している。それらの疎水性へリックス領域のいくつかは膜貫通領域であると推定される。また、Ｎ末端から３番目と４番目の疎水性へリックス領域の間の領域は親水性であり、ループ構造をとると推定される。この親水性領域を本願発明においてはループ領域と呼ぶ。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生型ｌｙｓＥの塩基配列及びＬｙｓＥタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２１及び２２に示す。同アミノ酸配列において、疎水性へリックス領域は、５〜２０、３７〜５８、６７〜９３、１４６〜１６８、１８１〜２０３、２１１〜２３２に相当する。また、ループ領域は９４〜１４５に相当する。
【００４５】
本発明者らは、ｌｙｓＥ遺伝子はメチロフィラス属細菌においては致死的に働くが、ループ領域を持たない、あるいは実質的に疎水性ヘリックスのみからなるＬｙｓＥタンパク質の改変体をコードするＤＮＡは、メタノール資化性菌のＬ−リジンの細胞外への排出を促進することを見い出した。ｌｙｓＥ２４は、このような野生型ＬｙｓＥタンパク質が持つループ領域を持たない変異型ＬｙｓＥタンパク質、又は実質的に疎水性ヘリックスのみからなる変異型ＬｙｓＥタンパク質をコードする。
【００４６】
上記のような変異型ｌｙｓＥとしては、少なくとも一つ又は二つ以上の疎水性ヘリックスを有し、メチロフィラス属細菌に導入したときにＬ−リジンもしくはＬ−アルギニン又はこれらの両方のＬ−アミノ酸の細胞外への排出を促進するものであれば特に制限されないが、具体的にはＮ末端から１番目〜６番目の疎水性ヘリックスのすべてを有する変異型ＬｙｓＥをコードするＤＮＡが挙げられる。より具体的には、Ｎ末端から１番目〜３番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドと、４番目〜６番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドとをコードするＤＮＡが挙げられる。前記ｌｙｓＥ２４は、このような１番目〜３番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドと、４番目〜６番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドとをコードする変異型ｌｙｓＥの一例である。ｌｙｓＥ２４遺伝子には、３番目の疎水性ヘリックスをコードする領域の下流に終止コドンが変異により導入されているが、この終止コドンよりも下流の領域を欠失させると、ｌｙｓＥ２４遺伝子を導入したメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株はＬ−リジンを培地中に蓄積しないことを、発明者らは確認している。このことから、１番目〜３番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドと、４番目〜６番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドがそれぞれ別個に翻訳され、メチロフィラス属細菌中で機能しているものと推定される。いずれにしても、ｌｙｓＥ２４遺伝子を メチロフィラス属細菌に導入すれば、Ｌ−リジンの生産量が向上する。
【００４７】
前記のようなＬ−リジンの細胞外への排出に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ、すなわちｌｙｓＥ遺伝子またはその相同遺伝子の供与微生物としては、それらの遺伝子の改変体がメタノール資化性菌中でＬ−リジン排出活性を発現することができるものを保持する微生物であれば、いかなる微生物でも利用できる。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等が挙げられる。
【００４８】
メチロフィラス属細菌菌においてＬ−リジンの排出遺伝子を増強する場合は、その遺伝子断片を、メチロフィラス属細菌菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して、組換えＤＮＡを作製し、これをメタノール資化性細菌の宿主に導入して形質転換すればよい。あるいは、トランスポゾンに搭載し、染色体への組み込みにより、また、メタノール資化性細菌内で強力転写を誘導するようなプロモーターを、その遺伝子の上流に連結させることも可能である。
【００４９】
上記のようなＬ−リジン生合成系遺伝子又はＬ−リジン排出遺伝子等の目的遺伝子をメチロフィラス属細菌に導入、増強するには、メチロフィラス属細菌細胞内で自律複製可能なベクターに遺伝子を連結して組換えＤＮＡを作製し、それでメチロフィラス・メチロトロファスを、例えばエレクトロポレーション法などにより形質転換する方法があり、その他にトランスダクション、トランスポゾン（Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｃ．Ｍ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１，４１７，（１９８３））、Ｍｕファージ、（特開平２−１０９９８５号）または相同組換え（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．（１９７２））を用いた方法で宿主染色体に組み込むこともできる。
【００５０】
前記メチロフィラス属細菌細胞内で自律複製可能なベクターとして具体的には、例えば、広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０及びその誘導体、例えば、ｐＡＹＣ３２（Ｃｈｉｓｔｏｓｅｒｄｏｖ，Ａ．Ｙ．， Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ，Ｙ．Ｄ．， Ｐｌａｓｍｉｄ， １９８６， １６， １６１−１６７）、あるいはｐＭＦＹ４２（Ｇｅｎｅ， ４４， ５３ （１９９０））や、ｐＢＢＲ１及びその誘導体に由来するもの（Ｋｏｖａｃｈ，Ｍ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １６６， １７５−１７６ （１９９５））、さらにはｐＲＫ３１０及びその誘導体に由来のもの（Ｅｄｔｓ． Ｍｕｒｒｅｌｌ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｄａｌｔｏｎ， Ｈ．， Ｍｅｔｈａｎｅ ａｎｄ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｕｔｉｌｉｚｅｒｓ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， １８３−２０６ （１９９２））等が利用できる。
【００５１】
リジン生産能を有し、かつ、リジンデカルボキシラーゼが低下又は消失したメチロフィラス属細菌は、リジンデカルボキシラーゼが低下又は消失したメチロフィラス属細菌にＬ−リジン生産能を付与することによって取得することができる。また、上記細菌は、Ｌ−リジン生産能を有するメチロフィラス属細菌のリジンデカルボキシラーゼが低下又は消失するように改変することによっても、取得することができる。
【００５２】
＜３＞本発明のＬ−リジンの製造法
上記のようにして取得したリジンデカルボキシラーゼ活性が低下又は消失したメチロフィラス属細菌を、メタノールを主要炭素源とする液体培地に培養することにより、培養物中にＬ−リジンを生成蓄積させることができる。Ｌ−リジン生産能を有するメチロフィラス属細菌のリジンデカルボキシラーゼ活性を低下又は消失させることにより、Ｌ−リジン生産能を向上させることができる。
【００５３】
Ｌ−リジン生産のために使用される培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養源を含有する通常の培地である。主要炭素源としては、メタノールであるが、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、でんぷん加水分解物などの糖類、グリセロール、ソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸、ピルビン酸等の有機酸類を併用して用いることができる。「メタノールを主要炭素源とする」とは、全炭素源のうち、メタノールを５０％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは８０％（ｗ／ｗ）以上であることをいう。メタノールを炭素源として用いる場合の濃度は、通常は０．００１％から４％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％から２％（ｗ／ｖ）である。また、グルコース等を添加する場合の濃度は、通常、０．１％から３％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％から１％（ｗ／ｖ）である。
【００５４】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素源、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００５５】
無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。これらの他に、有機微量栄養源として、ビタミンＢ１、または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい場合もある。
【００５６】
培養は、好気的条件下で１６〜７２時間程度実施するのがよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、あるいはアンモニアガス等を使用することができる。
【００５７】
培養終了後、発酵液からのＬ−リジンの採取は、通常のイオン交換樹脂法、沈澱法、その他の公知の方法を組み合わせることにより適宜実施できる。
【００５８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
【００５９】
【実施例１】メチロフィラス・メチロトロファスのリジンデカルボキシラーゼ遺伝子（ｌｄｃ）のクローニング
メチロフィラス・メチロトロファスの野生株ＡＳ１株から染色体ＤＮＡを取得することを目的に、ＡＳ１株を５０ｍＬのＳＥＩＩ培地（組成：（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５ｇ／Ｌ， Ｋ２ＨＰＯ４ １．９ｇ／Ｌ， ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ １．５６ｇ／Ｌ， ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２００ｍｇ／Ｌ， ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ７２ｍｇ／Ｌ， ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ５μｇ／Ｌ， ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ２５μｇ／Ｌ， ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２３μｇ／Ｌ， ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ９．７ｍｇ／Ｌ， メタノール ０．５％（Ｗ／Ｖ））に植菌し、培養温度３７℃で一晩振とう培養した。その後、培養液を遠心し、菌体を回収後、市販のキット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製 Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用いて、添付の操作マニュアルに従い染色体ＤＮＡを調製した。
【００６０】
この染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号１及び２に記載のＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ（反応条件：宝酒造社製 Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、変性工程９８℃−１０秒間、アニーリング５５℃−３０秒間、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃−３分間の反応を２５サイクル）を行い、約３．０キロベースペア（以下、「ｋｂｐ」と記載）の大きさのＤＮＡ断片を得た。
【００６１】
そして、この取得した断片のＤＮＡ塩基配列を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２００１）に記載の方法に従って決定した。そのＤＮＡ断片上の制限酵素ＥｃｏＲＶ部位から制限酵素ＤｄｅＩ部位までの領域の塩基配列は、配列番号３に示す塩基配列であることが明らかになった。このＤＮＡ配列中には、配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム（以下、「ｏｒｆ」と略する場合がある）が含まれていた。また、このｏｒｆをｏｒｆ＃３０９８と命名した。また、前記配列番号４に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子をｌｄｃ遺伝子と命名した。
【００６２】
【実施例２】ｌｄｃ遺伝子を破壊したメチロフィラス・メチロトロファス株の作製
（１）ｌｄｃ遺伝子破壊用断片の作製
実施例１で調製した染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号５及び６に記載のＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ（反応条件：宝酒造社製 ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを用い、変性工程９４℃−３０秒間、アニーリング６０℃−３０秒間、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃−２分間の反応を２５サイクル）を行い、約１．３ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を得た。また同様の条件で、配列番号７及び８に記載のプライマーを用いたＰＣＲを行い、約２．０ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を得た。
【００６３】
一方、プラスミドｐＫＤ４（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＹ０４８７４３， Ｄａｔｓｅｎｋｏ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９７ （１２）， ６６４０−６６４５， ２０００）を鋳型にして、配列番号９及び１０に記載のプライマーを用いて、上記と同じ条件でＰＣＲを行い、カナマイシン耐性（Ｋｍｒ）遺伝子を含むＤＮＡ断片（約１．５ｋｂ）を調製した。
【００６４】
以上の３種のＤＮＡ断片を混ぜ合わせ、これを鋳型にして、配列番号１１及び１２に記載したプライマーを用いてＰＣＲ（反応条件：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを用い、変性工程９４℃−３０秒間、アニーリング６０℃−３０秒間、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃−４分３０秒間の反応を２５サイクル）を行い、約４．７ｋｂの断片を取得した。この断片は、カナマイシン耐性遺伝子で分断されたｌｄｃ遺伝子を含んでいる。この断片を市販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製 Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて精製後、エタノール沈殿操作を行い、ＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）， １ｍＭ ＥＤＴＡ溶液）に溶解した。このＤＮＡ溶液を遺伝子破壊用断片として以下の操作に用いた。
【００６５】
（２）メチロフィラス・メチロトロファスのｌｄｃ遺伝子欠損株の取得
次に、メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株へ、上述した遺伝子破壊用断片を導入した。形質転換は、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ４３． １９７ （１９９７））を用いた。具体的には、以下のようにして行った。
【００６６】
メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株をＳＥＩＩ液体培地（但しメタノール濃度は０．５％（ｖ／ｖ））で、３７℃で１６時間振とう培養し、その培養液２０ ｍｌを１０，０００ｒｐｍ×１０分間の遠心にかけ、菌体を集菌した。これに１ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）緩衝液（２０ ｍｌ）を加えて懸濁した後、遠心するという操作を２回行い、最後に菌体に１ｍｌの同溶液を加え、菌体懸濁液を調製し、エレクトロポレーション用のエレクトロセルとした。そして、上記のカナマイシン耐性遺伝子で分断されたｌｄｃ遺伝子（ｌｄｃ：：ＫｍＲ）を含むＤＮＡ断片の約１μｇ分を、エレクトロセル１００μｌに加え、１８．５ｋＶ／ｃｍ， ２５μＦ， ２００Ωの条件で電気パルスを与え、エレクトロポレーション処理を行い、ＤＮＡ断片を細胞内へ導入した。この菌懸濁液に直ちにＳＥＩＩ液体培地を加え、３７℃で３時間培養した。
【００６７】
前記培養液を、カナマイシン２０μｇ／ｍｌを含むＳＥＩＩ寒天培地に塗布後、３７℃で培養した。培養を４８時間行ったところ、プレート上に数十個のコロニーが出現した。そのうち２０株を無作為に選択し、それらの株では目的どおりの遺伝子が破壊されているか否かを、ＰＣＲ法による検出方法により確認した。即ち、出現したコロニーを滅菌水２０μｌに懸濁し、１ｍｇ／ｍｌの濃度の Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を５μｌ、更に２５μＬのＰ溶液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＨＣｌにてｐＨ８．０に調整）からなる溶液）を添加した後、攪拌し、６０℃で２０分、次いで９５℃で５分間、保温した。そして、この反応液を鋳型とし、配列番号１１及び１２に示すプライマーを用いたＰＣＲ（反応条件：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを用い、変性過程９４℃−３０秒間、アニーリング過程６０℃−３０秒間、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃−４分３０秒間の反応を２５サイクル）を行うことによって、目的遺伝子の破壊を確認したところ、１０株が目的通りの破壊株であった。そこで、このうちの一株をＤＬＣ１０株（ＭＬＤＣ株）と命名し、以後の実験に使用した。
【００６８】
（３）ｌｄｃ遺伝子欠損株の表現型
上記（２）で作製したＤＬＣ１０株は、カナマイシンを含むＳＥＩＩ寒天培地で生育する株として選択された株であるが、同様の寒天培地で植え継ぐと、生育しなくなることが判明した。そこで、リジンデカルボキシラーゼ（ＬＤＣ）及びアルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）の、それぞれの反応生成物である、カダベリン（ＣＡＤ）及びアグマチン（ＡＧＭ）を、培地へ添加することで、それらの生育阻害を相補出来るかどうか検討した。
【００６９】
カナマイシン２０μｇ／ｍｌ（μｇ／ｍｌ）を含む液体ＳＥＩＩ培地４ｍｌに、カダベリン又はアグマチンを１ｇ／ｌの濃度で添加した培地を作製した。そして、そこへ上記ＤＬＣ１０株を植菌し、３７℃、１１６ｒｐｍで振とう培養し、その生育を調べた。その結果、ＤＬＣ１０株は、カダベリンあるいはアグマチンの無添加培地では生育出来ないが、どちらか一方の物質の培地への添加によって生育可能となることが判明した。また、カダベリン添加の方が、アグマチン添加時と比べ、より良い生育回復効果が認められた。
【００７０】
（４）ｏｒｆ＃３０９８導入によるｌｄｃ欠損株の相補性確認
上記のｌｄｃ欠損株の生育のためのカダベリン要求性が、実施例１で取得したｏｒｆ＃３０９８の導入で相補できるのかどうかを検証した。まず、ｏｒｆ＃３０９８のみを含むＤＮＡを、ｌｄｃ欠損株へ導入するためのプラスミドを作製した。実施例１に記載した染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号１３及び１４に記載した配列をもつＤＮＡプライマー（５’末端側にＳｓｅ８３８７Ｉサイトを連結）を用いてＰＣＲを行った（増幅反応条件は、宝酒造社製Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、変性工程９８℃−１０秒間、アニーリング５５℃−３０秒間、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃−３分間の反応を２５サイクル）。得られた約３ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を、制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ（宝酒造）で消化した。一方、同じくＳｓｅ８３８７Ｉで分解後、脱リン酸化処理を行ったベクターｐＲＳｔａｃと、このＤＮＡ断片を連結した（宝酒造社製、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２を使用）。このようにして作製したｏｒｆ＃３０９８の搭載プラスミド（ｔａｃプロモーターに対して順向き）をｐＲＳ−ｏｒｆ＃３０９８と命名した。
【００７１】
なお、ｐＲＳｔａｃは公知のプラスミドｐＲＳ（特表平３−５０１６８２号公報参照）を用いて、そこへｔａｃプロモーターを導入することにより構築した。ｐＲＳは、ＲＳＦ１０１０の誘導体である広宿主域ベクタープラスミドｐＡＹＣ３２（Ｃｈｉｓｔｏｒｅｒｄｏｖ， Ａ．Ｙ．， Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ， Ｙ．Ｄ． Ｐｌａｓｍｉｄ， １９８６， １６， １６１−１６７）に由来するｐＶＩＣ４０プラスミド（ＷＯ９０／０４６３６国際公開パンフレット、特表平３−５０１６８２号公報）より、同プラスミドが持つスレオニンオペロンをコードするＤＮＡ領域を削除してベクター部分のみを持つプラスミドである。
【００７２】
まず、ｐＲＳより、ｔａｃプロモーターを持つプラスミドｐＲＳｔａｃを構築した。ｐＲＳベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルにて分離し、約８キロベースペアのＤＮＡ断片をＥＡＳＹ ＴＲＡＰ Ｖｅｒ．２（ＤＮＡ回収キット、宝酒造社製）を用いて回収した。一方、ｔａｃプロモーター領域を、ｐＲＫ２２３−３プラスミド（発現用ベクター、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を鋳型とし、配列番号１７および１８に示すプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した（変性９４℃−２０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−６０秒のサイクルを３０サイクル行った）。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。増幅されたｔａｃプロモーターを含むＤＮＡ断片をＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した後、あらかじプライマー中にデザインしておいた制限酵素サイト、すなわちＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＴ２２Ｉで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した後、０．８％アガロースゲルで分離し、約０．１５ｋｂｐのＤＮＡ断片をＥＡＳＹ ＴＲＡＰ Ｖｅｒ．２を用いて回収した。
【００７３】
上記のようにして調製したｐＲＳベクター消化物と、ｔａｃプロモーター領域断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、宝酒造製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法で各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で消化して構造を確認し、ｐＲＳｔａｃを得た。ｐＲＳベクター上のストレプトマイシン耐性遺伝子の転写方向とｔａｃプロモーターの転写方向が同じ向きになっているものを、ｐＲＳｔａｃとして選択した。
【００７４】
以上のようにして作製したプラスミドｐＲＳ−ｏｒｆ＃３０９８、又は対照プラスミドであるｐＲＳｔａｃを用いて、エレクトロポレーション法でＤＬＣ１０株をそれぞれ形質転換し、ＳＥＩＩ寒天培地（但し、カナマイシン２０μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、カダベリン１ｇ／ｌを含む）で選択した。
【００７５】
選択されたＤＬＣ１０／ｐＲＳ−ｏｒｆ＃３０９８株を、カダベリン無添加のＳＥＩＩ寒天培地（カナマイシン２０μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを含む）に接種したところ、対照株のＤＬＣ１０／ｐＲＳｔａｃ株が生育出来なかったのに対し、ｐＲＳｔａｃ−ｏｒｆ＃３０９８導入株では生育が可能となった。また、ＤＬＣ１０／ｐＲＳ−ｏｒｆ＃３０９８株から、Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｗｉｚａｒｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓを用いてプラスミドを抽出し、電気泳動によって確認したところ、目的通りのプラスミドを保持していることが確認されたため、この相補性は、プラスミド上のｏｒｆ＃３０９８がコードするタンパク質がトランスに作用して、発揮されたことが判明した。このことは、このｏｒｆ＃３０９８自身の欠損が、本菌の生育にカダベリン要求性を付与したといえる。
【００７６】
【実施例３】Ｅ． ｃｏｌｉ由来のｌｄｃＣ遺伝子導入による、メチロフィラス・メチロトロファスｏｒｆ＃３０９８欠損の相補
（１）Ｅ． ｃｏｌｉ由来のｌｄｃＣ遺伝子を搭載したプラスミドの作製
Ｅ． ｃｏｌｉに由来するｌｄｃＣ遺伝子が、ＤＬＣ１０株の生育へのカダベリン要求性を相補出来るのかを調べるために、まずＥ． ｃｏｌｉ由来のｌｄｃＣ搭載プラスミドを作製した。Ｅ． ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株をＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）でて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からＥｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社製 Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆ．Ｋｉｔを用いて染色体ＤＮＡを調製した。この染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号１５及び１６（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９７， １７９（１４）， ４４８６−４４９２）に記載した配列をもつＤＮＡプライマー（５’末端側にＰｓｔＩサイトを連結）を用いてＰＣＲを行った（増幅反応条件は、宝酒造社製Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、変性工程９８℃−１０秒間、アニーリング６０℃−３０秒間、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃−２分間の反応を２５サイクル）。得られた約２．３ｋｂのＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩ（宝酒造）で分解した。一方、ベクターｐＲＳｔａｃを制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉで分解後、脱リン酸化処理を行い、上記のＰＣＲ断片と連結した（宝酒造社製、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２を使用）。このようにして作製したＥ． ｃｏｌｉのｌｄｃＣを搭載したプラスミドをｐＲＳ−ｌｄｃＣ−Ｆ（ｔａｃプロモーターに対して順向き）及びｐＲＳ−ｌｄｃＣ−Ｒ（ｔａｃプロモーターに対して逆向き）と命名した。
【００７７】
（２）Ｅ． ｃｏｌｉ由来ＬＤＣによるＤＬＣ１０株のｏｒｆ＃３０９８欠損の相補性確認
上記のようにして作製した両プラスミドで、エレクトロポレーション法によりＤＬＣ１０株を形質転換し、ＳＥＩＩ寒天培地（カナマイシン２０μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、カダベリン１ｇ／ｌを含む）で形質転換体を選択したところ、ｐＲＳｔａｃ−ｌｄｃＣ−Ｆでは形質転換体は取得できず、ｐＲＳｔａｃ−ｌｄｃＣ−Ｒによる形質転換体のみが得られた。
【００７８】
このＤＬＣ１０／ｐＲＳｔａｃ−ｌｄｃＣ−Ｒ株を、カダベリンを含まない寒天培地ＳＥＩＩ（カナマイシン２０μｇ／ｍｌとストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを含む）に塗布したところ、対照株であるＤＬＣ１０／ｐＲＳ−ｔａｃ株は生育出来ないのに対し、ＤＬＣ１０／ｐＲＳｔａｃ−ｌｄｃＣ−Ｒ株では生育可能となることを確認した。このことは、Ｅ． ｃｏｌｉのＬＤＣ（リジンデカルボキシラーゼ）が、メチロフィラス・メチロトロファスのｏｒｆ＃３０９８欠損株のカダベリン要求性を相補できたことを示すものである。
【００７９】
【実施例４】ｏｒｆ＃３０９８（ｌｄｃ遺伝子）を破壊したメチロフィラス・メチロトロファス株によるＬ−リジンの生産
（１）Ｌ−リジン生産プラスミドｐＲＳｌｙｓＥ２４の構築
まず、メチロフィラス属細菌に、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてリジンの排出活性を発揮する蛋白質をコードするｌｙｓＥ遺伝子を導入するために、前記ｐＲＳｔａｃを用いて、ｌｙｓＥ発現用プラスミドｐＲＳｌｙｓＥを構築した。
実施例２の（４）のようにして作製したｐＲＳｔａｃを、Ｓｓｅ８３８７Ｉ（宝酒造製）およびＳａｐＩ（ニューイングランドバイオラボ社製）で消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルで分離し、約９．０ｋｂｐのＤＡＮ断片を回収した。
【００８０】
また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株（ＡＴＣＣ１３８６９）より抽出した染色体を鋳型として、配列番号１９および２０に示すプライマーを用いたＰＣＲ法（変性９４℃−２０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−９０秒）によりｌｙｓＥ遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ反応には、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。得られた断片をＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した後、制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＳａｐＩで消化した。フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、０．８％アガロースゲルで精製し、回収した。
【００８１】
上記のようにして調製したｐＲＳｔａｃベクター消化物と、ｌｙｓＥ遺伝子領域断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、宝酒造製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、ｐＲＳｌｙｓＥを得た。ｐＲＳｌｙｓＥは、ｔａｃプロモーターの転写方向に対して、ｌｙｓＥ遺伝子の転写方向が同じ向きになるように配置されている。
【００８２】
上記のようにして得られたｐＲＳｌｙｓＥを、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ４３． １９７ （１９９７））によりメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ１０５１５）に導入した。その結果、ほとんど形質転換体が取得できなかった。また、コロニー形成ができた数個の株から、導入したプラスミドを抽出して塩基配列を調べたところ、ｌｙｓＥ遺伝子に変異が導入されており、それらのコロニーを培養しても、それらの培養上清中にＬ−リジンが蓄積することもなかった。しかしながら、更に多数のコロニーを調べたところ、変異が導入されたｐＲＳｌｙｓＥの解析を行ううちに、メチロフィラス属細菌にＬ−リジン生産能を付与し得る、即ち、機能する変異型ｌｙｓＥ遺伝子を取得することができた。
【００８３】
この変異型ｌｙｓＥ遺伝子をｌｙｓＥ２４遺伝子と命名した。ｌｙｓＥ２４遺伝子の塩基配列を解析したところ、この変異はアミノ酸置換が起こる変異ではなく、ｌｙｓＥの翻訳領域内のほぼ中央に終止コドンが導入されるナンセンス変異であることがわかった。野生型ｌｙｓＥ遺伝子の塩基配列及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示す。ｌｙｓＥ２４では、配列番号２１の３５５位のＧ（グアニン）のあとにＴ（チミン）が挿入されていた。ｌｙｓＥ２４の塩基配列及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示す。このｌｙｓＥ２４を持つプラスミドをｐＲＳｌｙｓＥ２４と命名した。
【００８４】
（２）ｄａｐＡ＊遺伝子を持つプラスミドｐＲＳｄａｐＡの作製
Ｌ−リジン生合成系酵素遺伝子として、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子（ｄａｐＡ＊）を持つプラスミドを作製した。
【００８５】
実施例２の（４）で作製したｐＲＳｔａｃをＳｓｅ８３８７ＩおよびＸｂａＩで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルで分離し、約９ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【００８６】
ｄａｐＡ＊遺伝子断片は、同遺伝子を含む公知のプラスミドＲＳＦＤ８０（ＷＯ９０／１６０４２号参照）を鋳型として、配列番号２５および２６に示すプライマーを用いたＰＣＲ法（変性９４℃−２０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−６０秒）により増幅した。ＰＣＲ反応には、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。得られたｄａｐＡ遺伝子断片をＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にて精製した後、制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＸｂａＩで消化した。フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収し、０．８％アガロースゲルで分離後、約０．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【００８７】
上記のように調製したｐＲＳｔａｃベクター消化物と、ｄａｐＡ＊遺伝子領域断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、宝酒造社）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、ｐＲＳｄａｐＡプラスミドを得た。ｐＲＳｄａｐＡプラスミドは、ｔａｃプロモーターの転写方向に対して、ｄａｐＡ遺伝子の転写方向が同じ向きになるように配置されている。
【００８８】
（３）ｌｙｓＥ２４遺伝子及びｄａｐＡ＊遺伝子を持つプラスミドｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡの構築
ｐＲＳｌｙｓＥプラスミドにｄａｐＡ＊遺伝子を挿入したプラスミドを構築した。実施例４の（１）で作製したｐＲＳｌｙｓＥ２４を制限酵素ＳａｐＩで消化し、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化した。また、実施例４の（２）で作製したｐＲＳｄａｐＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｐＩで消化し、０．８％アガロースゲルにより約１ｋｂｐのｔａｃプロモーターおよびｄａｐＡ＊領域を含む断片を分離し、同断片をＥＡＳＹ ＴＲＡＰ Ｖｅｒ２（宝酒造製）を用いて回収した。この断片を前記と同様にして平滑化し、前記のｐＲＳｌｙｓＥ２４の消化物と、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２（宝酒造製）を用いて連結した。
【００８９】
上記の連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、宝酒造社製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し３７℃で８時間振盪培養した。各培養液から、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡプラスミドを得た。このプラスミドは、ｌｙｓＥ２４遺伝子とｄａｐＡ＊遺伝子の各遺伝子の転写の向きが同一になるように配置されている。
【００９０】
ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡプラスミドで形質転換されたＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株はＡＪ１３８３２と命名され、同株は２００１年６月４日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３７１として寄託され、平成１４年５月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−８０４２の受託番号のもとで寄託されている。
【００９１】
（４）メチロフィラス・メチロトロファスのｏｒｆ＃３０９８（ｌｄｃ）欠損株へのＬ−リジン生産プラスミドの導入とＬ−リジン生産
メチロフィラス・メチロトロファスのＬ−リジン生産に及ぼす、ｌｄｃ遺伝子欠損の影響を調べた。まず、実施例２で作製したＤＬＣ１０株は、野生株から作製していることから、Ｌ−リジンを生産する性質は改変されていない。そこで、ｌｄｃ欠損によるＬ−リジン生産への影響を効果的に検証するために、メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株にｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡが導入された株から、実施例２（２）と同様の操作によって、ｌｄｃ破壊株を作製した。ここで得られた株をＤＬＣ１２／ ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡ株と命名した。
【００９２】
対照株であるＡＳ１／ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡ株をＳＥＩＩ（ストレプトマイシン ５０μｇ／ｍｌを含む）寒天培地に、ＤＬＣ１２／ ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡ株をＳＥＩＩ（ストレプトマイシン ５０μｇ／ｍｌおよびカダベリン１ｇ／ｌを含む）寒天培地に塗り広げ、３７℃で１晩培養した後、培地表面の約３ｃｍ２（平方センチメートル）の菌体をかきとって、カダベリン１ｇ／Ｌを含むＳＥＩＩ生産培地（ストレプトマイシン ５０μｇ／ｍｌを含む）２０ｍｌに植菌し、３７℃で６７時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−リジン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。その結果、ＡＳ１／ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡ株は培地中へのＬ−リジン蓄積が１．２６ｇ／Ｌであったが、ＤＬＣ１２／ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡ株は培地中にＬ−リジンを１．７９ｇ／Ｌ蓄積しており、ｌｄｃを欠損させることにより、Ｌ−リジンの生産性を向上し得ることが確認できた。
【００９３】
【発明の効果】
本発明により、新規なリジンデカルボキシラーゼ及び同酵素をコードする遺伝子が提供可能となる。一方、Ｌ−リジン生産能を有し、当該遺伝子の発現が抑えられているメチロフィラス属細菌を培養することにより、効率的にＬ−リジンを製造することができる。
【００９４】
【配列表】
Claims (7)
- 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。 - 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。 - 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列の塩基番号６８４〜２９３０からなる塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号３に記載の塩基配列の塩基番号６８４〜２９３０からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 - メチロフィラス属細菌の染色体に由来することを特徴とする請求項２又は３に記載のＤＮＡ。
- Ｌ−リジン生産能を有し、かつ、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下または消失するように改変されたメチロフィラス属細菌。
- 染色体上の遺伝子であって、かつ、請求項２〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡと同一の塩基配列を有する遺伝子、又は同ＤＮＡと相同組換えが起こり得る程度の相同性を有する遺伝子が破壊されたことにより、該遺伝子の発現が抑えられ、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下または消失した請求項５に記載のメチロフィラス属細菌。
- 請求項６に記載のメチロフィラス属細菌を、メタノールを主要炭素源とする液体培地に培養し、培養物中にＬ−リジンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造方法。
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