KR100943834B1

KR100943834B1 - Ｌ-리신을 생산하는 코리네형 세균 및 코리네형 세균을 사용하여 l-리신을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR100943834B1
Application number: KR1020047001926A
Authority: KR
Inventors: 바테브리지테; 라이넨카롤리네; 뫼켈베티나; 티르바흐게오르크
Original assignee: 에보니크 데구사 게엠베하
Priority date: 2001-08-06
Filing date: 2002-07-30
Publication date: 2010-02-24
Also published as: ES2314076T3; CN1541274A; CN101126075B; EP1414986B1; KR20040041576A; CN101126075A; EP1414986A2; WO2003014330A3; AU2002355462A1; DE60229139D1; CN100336901C; US20040043458A1; US20100255544A1; DK1414986T3; BR0211745A; ATE409752T1; WO2003014330A2; CA2456416A1

Abstract

본 발명은 특정한 목적하는 위치(좌)에 자연적으로 존재하는 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 단일 복사체 대신, 본 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 2개 이상의 복사체를, 바람직하게는 탠덤 배열로 갖고, 임의로 본 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3의 복사체 1개 이상을 추가의 유전자 위치에 갖는 코리네형 세균 및 이러한 세균의 발효에 의한 화학적 화합물의 제조방법에 관한 것이다.

코리네형 세균, 개방형 판독 프레임, 유전자, 대립형질유전자, 복제, 벡터, 프로파아지, 결손파아지, 복사체, 플라스미드

Description

Ｌ-리신을 생산하는 코리네형 세균 및 코리네형 세균을 사용하여 L-리신을 생산하는 방법{Coryneform bacteria which produce L-lysine and a process for the preparation of L-lysine by using the coryneform bacteria}

선행 분야

특히, L-아미노산, 비타민, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 및 D-아미노산을 의미하는 화학적 화합물은 사람의 의약, 약제 산업, 화장품, 식료품 산업 및 동물의 사료에 사용된다.

다수의 이들 화합물이 코리네형 세균의 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로부터 발효에 의해 생산된다. 이들의 특별한 중요성 때문에, 생산 방법을 개선시키고자 하는 작업이 계속되어 왔다. 상기 방법에 대한 개선은, 발효 공정에 관한 수단, 예를 들면 교반 및 산소 공급, 또는 영양 배지의 조성, 예를 들면 발효중의 당 농도, 또는 예컨대 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물 형태로의 후처리, 또는 미생물 자체의 고유 수행 특성에 관한 것이다.

이들 미생물의 수행 특성을 개선하기 위하여, 돌연변이유발 방법, 선별법 및 돌연변이체 선별법이 사용된다. 이러한 방법에서, 항대사물에 내성을 갖거나 또는 조절에 있어서 중요한 대사물에 대해 자가영양성이고 특정 화합물을 생산하는 균주가 수득된다.

수년간 재조합 DNA 기술의 방법을 사용하여 각 개체의 생합성 유전자를 증폭시키고 L-아미노산의 생산에 미치는 효과를 연구함으로써, 코리네박테리움 균주를 개량하였다.

공통의 방법은 특히 미생물에서 에피좀 상태로 복제하는 플라스미드에 의한 특정 생합성 유전자의 증폭을 포함한다. 이러한 공정은 산업 공정에서 일반적으로 다수의 세대를 거치면서 발효가 일어나는 동안, 플라스미드가 자발적으로 소실된다는 단점이 있다(분리적 불안전성).

다른 방법은 특정 미생물에서 복제하지 않는 플라스미드로 특정 생합성 유전자를 중복시킴을 포함한다. 이러한 방법에서, 클론화된 생합성 유전자를 포함하는 플라스미드는 미생물의 염색체 생합성 유전자로 통합된다 [참조: Reinscheild et al., Applied and Environmental Microbiology 60(1), 126-132 (1994); Jetten et al., Applied Microbiology and Biotechnology 43(1): 76-82 (1995)]. 본 방법의 단점은 플라스미드 및 선별에 필요한 항생제 내성 유전자의 뉴클레오티드 서열이 미생물에 잔존한다는 것이다. 이는 예를 들어, 바이오매스의 처리 및 이용에 대한 단점이다. 더욱이, 전문가는 이러한 균주가 보통 산업 발효에 통상적인 상응하는 수의 세대에서 "캠벨형 교차(Campbell type cross over)"에 의해 붕괴된 결과로 불안정해질 것이라고 예상한다.

발명의 목적

본 발명은 코리네형 세균을 사용하는 화학적 화합물의 개선된 발효 제조에 관한 신규한 방법을 제공함을 목적으로 한다.

발명의 요약

본 발명은

a) 특정한 목적하는 위치(좌(locus))에 자연적으로 존재하는 개방형 판독 프레임(open reading frame(ORF)), 유전자 또는 대립형질유전자의 단일 복사체 대신, 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 2개 이상의 복사체를 특히 탠덤 배열로 가지고, 특정 위치에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없으며, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없으며,

b) 임의로 추가의 유전자 위치에 목적하는 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3의 복사체를 하나 이상 가지며, 추가의 유전자 위치에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없으며 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없음을 특징으로 하는, 하나 이상의 목적하는 화학적 화합물을 생산하는 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속을 제공한다.

본 발명은 또한

a) 개방형 판독 프레임(ORF) 유전자 또는 대립형질유전자의 발현이 가능한 조건 하에,

ⅰ) 특정한 목적하는 위치(좌)에 자연적으로 존재하는 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 단일 복사체 대신 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 2개 이상의 복사체를 바람직하게 탠덤 배열로 가지고, 특정 위치에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없으며, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없으며,

ⅱ) 임의로 추가의 유전자 위치에 목적하는 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3의 복사체를 하나 이상 가지며, 추가의 유전자 위치에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없으며 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없는 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속의 발효 단계,

b) 발효 브로쓰 및/또는 세균의 세포속의 화학적 화합물을 농축시키는 단계,

c) 화학적 화합물을 분리하는 단계, 임의로

d) 발효 브로쓰 및/또는 바이오매스로부터의 구성물질이 0 초과 내지 100%인 정도로 수행되는 단계를 포함하는, 하나 이상의 화학적 화합물의 생산방법을 제공한다.

화학적 화합물은 특히, 아미노산, 비타민, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드를 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 이들 화합물의 생합성 경로가 선행 분야에 공지되어 있으며 사용가능하다.

아미노산은 바람직하게는 L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-트레오닌, L-세린, L-글루탐산, L-글루타민, 글라이신, L-알라닌, L-시스테인, L-발린, L-메티오닌, L-이소루이신, L-루이신, L-타이로신, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-리신, L-트립토판, L-프롤린 및 L-아르기닌 및 이의 염, 특히 L-리신, L-메티오닌 및 L-트레오닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 L-아미노산, 특히 단백원 L-아미노산을 의미한다. L-리신이 매우 특히 바람직하다.

단백원 아미노산은 천연 단백질, 즉 미생물, 식물, 동물 및 사람의 단백질에서 발견되는 아미노산을 의미하는 것으로 이해된다.

비타민은, 특히 비타민 B1 (티아민), 비타민 B2 (리보플라빈), 비타민 B5 (판토텐산), 비타민 B6 (피리독신), 비타민 B12 (시아노코발라민), 니코틴산/니코틴아미드, 비타민 M (엽산) 및 비타민 E (토코페롤) 및 이의 염을 의미하며, 판토텐산이 바람직하다.

뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는, 특히, S-아데노실메티오닌, 이노신-5'-모노포스포르산 및 구아노신-5'-모노포스포르산 및 이의 염을 의미한다.

코리네형 세균는 특히, 코리네박테리움 속을 의미한다. 코리네박테리움 속의, 코리테박테리움 글루타미쿰 종, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 종 및 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes) 종이 바람직하다. 세균의 이러한 그룹의 균주의 분류에 대한 정보는 특히, 문헌[참조: Kampfer and Kroppenstedt (Canadian Jounal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)] 및 [참조: US-A-5, 250, 434]에서 발견된다.

특히, 코리네박테리움 글루타미쿰 종(씨. 글루타미쿰)의 적합한 균주는 공지된 야생형 균주, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806, 코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium) ATCC15990, 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola) ATCC17965, 코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis) ATCC13868, 아르트로박터 에스피(Arthrobacter sp) ATCC243, 브레비박테리움 창-푸아(Brevibacterium chang-fua) ATCC14017, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067, 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869, 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020, 브레비박테리움 타이페이(Brevibacterium taipei) ATCC13744 및 마이크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum) ATCC21645이며 선행 분야에 공지된 바와 같이, 화학적 화합물을 생산하는 돌연변이 또는 균주가 제조된다.

코리네박테리움 암모니아게네스 종(씨. 암모니아게네스)의 적합한 균주는, 특히, 공지된 야생형 균주, 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC6871, 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC15137 및 코리네박테리움 에스피. ATCC21084이며 선행 분야에 공지된 바와 같이, 화학적 화합물을 생산하는 돌연변이 또는 균주가 제조된다.

코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes) 종 (씨. 써모아미노게네스)의 적합한 균주는, 특히, 공지된 야생형 균주, 코리네박테리움 써모아미노게네스 FERM BP-1539, 코리네박테리움 써모아미노게네스 FERM BP-1540, 코리네박테리움 써모아미노게네스 FERM BP-1541 및 코리네박테리움 써모아미노게네스 FERM BP-1542이며 선행 분야에 공지된 바와 같이, 화학적 화합물을 생산하는 돌연변이 또는 균주가 제조된다.

명칭 "ATCC"를 갖는 균주는 국제기탁기관[American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)]으로부터 입수할 수 있다. 명칭 "FERM"을 갖는 균주는 국제기탁기관[National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan)]으로부터 입수할 수 있다. 언급한 코리네박테리움 써모아미노게네스 균주 (FERM BP-1539, FERM BP-1540, FERM BP-1541 및 FERM BP-1542)는 문헌[참조: US-A 5, 250, 434]에 기술되어 있다.

개방형 판독 프레임(ORF)은 선행 분야에 따른 어떠한 기능도 할당될 수 없는 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 리보뉴클레산을 암호화하거나 암호화할 수 있는 뉴클레오티드 서열의 부분을 나타낸다.

목적하는 뉴클레오티드 서열 부분에 기능을 할당한 후, 일반적으로 이를 유전자로 지칭한다.

대립형질유전자는 일반적으로 주어진 유전자의 또 다른 형태를 의미하는 것으로 이해된다. 본 형태는 뉴클레오티드 서열내의 차이에 의해 구별된다.

본 발명의 문맥에서, 종-특이적임을 의미하는 내인성 개방형 판독 프레임, 유전자 또는 대립형질유전자가 바람직하게 사용된다. 이들은 개방형 판독 프레임, 유전자 또는 대립형질유전자 또는 이의 뉴클레오티드 서열이 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 종의 집단에 존재한다는 것을 의미하는 것으로 이해된다.

"특정한 목적하는 위치(좌)에 자연적으로 존재하는 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 단일 복사체"는 일반적으로 유전자가 상응하는 야생형 또는 상응하는 모유기체 또는 시작 유기체내의 이의 위치 또는 유전자 위치에 이의 뉴클레오티드 서열의 형태로 1개(1)의 복사체로 자연 존재한다는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 이 위치는 바람직하게는 염색체내에 있다.

그러므로, 예를 들어, 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자 또는 "피드백(feed back)" 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC^FBR 대림유전자는 lysC 위치 또는 lysC 좌 또는 lysC 유전자 위치에 한개의 복사체로 존재하고 한 쪽에서는 개방형 판독 프레임 orfX 및 leuA 유전자와 측면을 접하고 있고 다른 한 쪽에서는 asd 유전자와 측면을 접하고 있다.

"피드백" 내성 아스파르토키나제는 야생형 형태와 비교하여, 리신 및 트레오닌의 혼합물 또는 AEC(아미노에틸시스테인) 및 트레오닌의 혼합물 또는 리신 단독 또는 AEC 단독에 의한 억제에 대하여 낮은 민감성을 갖는 아스파르토키나제를 의미하는 것으로 이해된다. L-리신을 생산하는 균주는 전형적으로 이러한 "피드백" 내성 또는 탈감작된 아스파르토키나제를 함유한다.

코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체의 뉴클레오티드 서열은 특허 출원 EP- A-1108790에 공지되어있고, 국제기탁기관[European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Germany and Cambridge, UK)]의 뉴클레오티드 서열 데이타뱅크의 수탁 번호(Accession No.) 제AX114121호에서 찾을 수 있다. orfX, leuA 유전자 및 asd 유전자의 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 제AX120364호 (orfX), AX123517 (leuA) 및 AX123519 (asd)를 갖는다.

또한 예를 들어, 국제기탁기관[National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)] 또는 국제기탁기관[Swiss Institute of Bioinformatics (Swissprot, Geneva, Switzerland)] 또는 국제기탁기관[Protein Information Resource Database (PIR, Washington, DC, USA)]와 같은 추가의 데이타뱅크를 사용할 수 있다.

개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 2개 이상의 복사체의 "탠덤 배열"은 이들이 같은 방향으로 일직선으로 인접한 줄에 배열되어있을 경우를 나타낸다.

"추가의 유전자 위치"는 제2 유전자 위치, 자연적 위치에서 적어도 중복된 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 서열과 다른 뉴클레오티드 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 추가의 유전자 위치에 존재하는 이러한 추가의 유전자 위치, 또는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 염색체상에 있으며 일반적으로 성장 및 목적한 화합물의 생산에 필수적이지는 않다.

물론, 언급한 "추가의 유전자 위치"는 언급한 개방형 판독 프레임 또는 유전자의 암호 영역뿐 아니라, 예를 들어, 리보솜 결합 위치, 프로모터, 조절 단백질에 대한 결합 위치, 조절 리보뉴클레산에 대한 결합 위치 및 감쇠자와 같은, 발현 및 조절을 담당하는 업스트림에 위치하는 영역 또는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일반적으로 이들 부분은 암호 영역의 1 내지 800, 1 내지 600, 1 내지 400, 1 내지 200, 1 내지 100 또는 1 내지 50 뉴클레오티드 업스트림의 범위에 위치한다. 마찬가지로, 예를 들어, 전사 종결영역와 같은 다운스트림에 위치하는 영역 또한 포함된다. 일반적으로 이들 영역은 암호 영역의 1 내지 400, 1 내지 200, 1 내지 100, 1 내지 50 또는 1 내지 25 뉴클레오티드 다운스트림의 범위에 위치한다.

염색체상의 유전자간 영역, 즉 암호화 기능이 없는 뉴클레오티드 서열이 추가로 사용될 수 있다. 최종적으로, 염색체내에 포함된 프로파아지 또는 결손 파아지를 이를 위하여 사용할 수 있다.

프로파아지는 숙주의 게놈과 함께 복제되며 감염성 입자를 형성하지 않는 박테리오파아지, 특히 이의 게놈을 의미하는 것으로 이해된다. 결손 파아지는 특히 각종 돌연변이의 결과로 소위 감엽성 입자를 형성하는 능력을 잃은 프로파아지, 특히 이의 게놈을 의미하는 것으로 이해된다. 결손 파아지는 또한 잠적으로 호칭한다. 프로파아지 및 결손 파아지는 흔히 이들 숙주의 염색체에 통합된 형태로 존재한다. 더 자세한 것은 선행 분야, 예를 들어 교과서 [Edward A. Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 3^rd ed., Springer-Verlag, New York, USA, 1994)] 또는 교과서 [S. Klaus et al. (Bakterienviren, Gustav Fischer Verlag, Jena, Germany, 1992)]에 공지되어 있다.

본 발명에 따라 코리네형 세균을 생산하기 위해, 바람직하게는 발현 및/또는 조절 시그날을 포함하며, 2개 이상의 복사체가 한 줄로, 바람직하게는 탠덤 배열로 배열되어있는 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 뉴클레오티드 서열을 분리하고, 이어서 이들을 바람직하게는 코리네형 세균에서 복제하지 않거나 제한된 양만큼만 복제하는 벡터를 사용하여 목적하는 코리네형 박테리움속으로 전이시키고, 본래 존재하는 단일 복사체 대신 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 2개의 복사체가 통합되고, 특정한 자연적 위치(좌)에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없는 이들 세균을 분리한다.

예를 들어, ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 암호 영역의 업스트림에 위치하는 리보솜 결합 위치, 프로모터, 조절 단백질에 대한 결합 위치, 조절 리보뉴클레산에 대한 결합 위치 및 감쇠자와 같은 발현 및/또는 조절 시그날은 일반적으로 암호 영역의 1 내지 800, 1 내지 600, 1 내지 400, 1 내지 200, 1 내지 100 또는 1 내지 50 뉴클레오티드 업스트림의 범위에 위치한다. 예를 들어, ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 암호 영역의 다운스트림에 위치하는 전사 종결영역와 같은 발현 및/또는 조절 시그날은 일반적으로 암호 영역의 1 내지 400, 1 내지 200, 1 내지 100, 1 내지 50 또는 1 내지 25 뉴클레오티드 다운스트림의 범위에 위치한다.

또한, 바람직하게는, 사용된 벡터 또는 종-외래 DNA의 서열, 예를 들어, 제한 절단 위치의 어떠한 잔기도 본 발명에 따라 증폭된 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 측면에 잔존하지 않는다. 각각의 경우에 임의로 이러한 DNA의 최대 24개, 바람직하게는 최대 12개, 특히 바람직하게는 최대 6개의 뉴클레오티드가 측면에 잔존한다. 목적하는 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3의 복사체 1개 이상을 추가의 유전자 위치, 또는 여러개의 추가의 유전자 위치에 임의로 삽입하고, 추가의 유전자 위치에는 미생물에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열 및 항생제에 대한 내성을 부여할 수 있는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 존재하지 않는다.

또한, 바람직하게는, 예를 들어, 제한 절단위치와 같은 사용한 벡터 또는 종-외부 DNA의 서열의 어떠한 잔기도 추가의 유전자 위치에 잔존하지 않는다. 임의로 통합된 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 이러한 DNA 업스트림 또는 다운스트림의 최대 24개, 바람직하게는 최대 12개, 특히 바람직하게는 최대 6개의 뉴클레오티드가 추가의 유전자 위치에 잔존한다.

따라서 본 발명은 또한

a) 바람직하게는 발현 및/또는 조절 시그날을 포함하는 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 뉴클레오티드 서열을 분리하는 단계,

b) ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 뉴클레오티드 서열의 2개 이상의 복사체를 한 줄에, 바람직하게는 탠덤 배열로 배열하는 단계,

c) 단계 b)에 따라 수득한 뉴클레오티드 서열을 코리네형 세균내에서 복제하지 않거나 오직 제한된 양만큼만 복제하는 벡터내로 통합하는 단계,

d) 단계 b) 또는 단계 c)에 따른 뉴클레오티드 서열을 코리네형 세균내로 전이시키는 단계, 및

e) 자연적으로 존재하는 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 단일 복사체 대신 특정의 목적하는 자연적 위치에서 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 2개 이상의 복사체를 가지며, 특정한 자연적 위치(좌)에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고 항생제에 대한 내성을 부여할 수 있는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없는 코리네형 세균을 분리하는 단계, 및

f) 목적하는 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3 복사체 하나 이상을 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열 및 항생제에 대한 내성을 부여할 수 있는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 존재하지 않는 추가의 유전자 위치에 임의로 도입하는 단계를 특징으로 하는, 하나 이상의 화학적 화합물을 생산하는 코리네형 세균의 생산방법을 제공한다.

본 발명에 따른 방법에 의해, 코리네형 세균 또는 화학적 화합물을 제조하기 위한 발효 방법의 생산성은 농도(형성된 화학적 화합물, 부피 단위에 근거), 수율(형성된 화학적 화합물, 소비된 탄소원에 근거) 및 생성물 형성률(형성된 화학적 화합물, 시간에 근거)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 특성의 관점에서 최소 0.5 내지 1.0% 또는 최소 1.0 내지 1.5% 또는 최소 1.5 내지 2.0% 개선된다.

예를 들어, 염색체 DNA, 플라스미드 DNA, 제한 효소 조작 등과 같은 통상적인 유전 공학 방법에 대한 지침은 문헌[참조: Sambrook et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press)]에 교시되어있다. 코리네형 세균내에서의 형질전환 및 접합에 대한 지침은 특히, 문헌[참조: Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362(1998)], [참조: Schafer et al. (Jounal of Bacteriology 172, 1663-1666(1990) and Gene 145, 69-73 (1994)] 및 [참조: Schwarzer and Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991))]에 교시되어 있다.

오직 제한된 양만큼만 복제할 수 있는 벡터는 숙주 또는 캐리어가 배양되는 조건하에서 , 복제하거나 복제하지 않는 플라스미드 벡터를 의미하는 것으로 이해된다. 이러한, 오직 31℃ 이하의 온도에서 복제할 수 있는 코리네형 세균에 대한 온도-민감성 플라스미드는 문헌[참조: Nakamura et al. (US-A-6, 303, 383)에 기술되어 있다.

본 발명은 또한

a) 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없는 특정한 목적하는 위치(좌)에 자연적으로 존재하는 리신 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 단일 복사체 대신, 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 2개 이상의 복사체를, 바람직하게는 탠덤 배열로 가지며,

b) 임의로 추가의 유전자 위치에 L-리신 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3의 복사체를 하나 이상 가지며, 특정 위치에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없음을 특징으로 하는, L-리신을 생산하는 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속을 제공한다.

본 발명은 또한 추가로

a) 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 발현이 가능한 조건하에,

ⅰ) 특정한 목적하는 위치(좌)에 존재하는 리신 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 단일 복사체 대신 목적하는 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 2개 이상의 복사체를, 바람직하게는 탠덤 배열로 가지고, 특정 위치에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없으며,

ⅱ) 임의로 추가의 유전자 위치에 목적하는 L-리신 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3의 복사체를 하나 이상 가지며, 추가의 유전자 위치에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없는 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속을 발효시키는 단계,

b) 발효 브로쓰에서 L-리신을 농축시키는 단계,

c) 발효 브로쓰로부터 L-리신을 분리시키는 단계, 임의로

d) 발효 브로쓰 및/또는 바이오매스로부터의 구성물질이 0 초과 내지 100%인 정도로 수행되는 단계를 포함하는, L-리신의 제조방법을 제공한다.

"리신 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 복사체"는 증강/과발현이 리신 생산을 개선시키는 효과를 가질 수 있는 모든, 바람직하게는 내인성의, 개방형 판독 프레임, 유전자 또는 대립형질유전자를 의미하는 것으로 이해되어진다. 증강은 특정 유전자 생성물, 단백질 또는 효소의 세포내의 농도 또는 활성의 증가를 의미하는 것으로 이해되어진다.

이들은 특히, 다음의 개방형 판독 프레임, 유전자 또는 대립형질유전자를 포함한다: accBC, accDA, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dapA, dapB, dapC, dapD, dapE, dapF, ddh, dps, enp, gap, gap2, gdh, gnd, lysC, lysC^FBR, lysE, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppc^FBR, pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsI, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, zwa1, zwf 및 zwf A213T. 이들은 표 1에 요약 및 설명되어 있다.

이들은 특히, "피드백" 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC^FBR 대 립형질유전자를 포함한다. 각종 lysC^FBR대립형질유전자는 표 2에 요약 및 설명되어 있다.

다음의 lysC^FBR대립형질유전자가 바람직하다: lysC A279T (서열번호 2에 따라 암호화된 아스파르테이트 키나제 단백질의 위치 279에서 알라닌이 트레오닌으로 치환), lysC A279V (서열번호 2에 따라 암호화된 아스파르테이트 키나제 단백질의 위치 279에서 알라닌이 발린으로 치환), lysC S301F (서열번호 2에 따라 암호화된 아스파르테이트 키나제 단백질의 위치 301에서 세린이 페닐알라닌으로 치환), lysC T308I (서열번호 2에 따라 암호화된 아스파르테이트 키나제 단백질의 위치 308에서 트레오닌이 이소루이신으로 치환), lysC S301Y (서열번호 2에 따라 암호화된 아스파르테이트 키나제 단백질의 위치 301에서 세린이 타이로신으로 치환), lysC G345D (서열번호 2에 따라 암호화된 아스파르테이트 키나제 단백질의 위치 345에서 글라이신이 아스파르트산으로 치환), lysC R320G (서열번호 2에 따라 암호화된 아스파르테이트 키나제 단백질의 위치 320에서 아르기닌이 글라이신으로 치환), lysC T311I (서열번호 2에따라 암호화된 아스파르테이트 키나제 단백질의 위치 311에서 트레오닌이 이소루이신으로 치환), lysC S381F (서열번호 2에 다라 암호화된 아스파르테이트 키나제 단백질의 위치 381에서 세린이 페닐알라닌으로 치환).

서열번호 3으로 나타낸 lysC^FBR대립형질유전자 lysC T311I (서열번호 2에 따라 암호화된 아스파르테이트 키나제 단백질의 위치 311에서 트레오닌이 이소루이신으로 치환)의 뉴클레오티드 서열이 특히 바람직하다; 암호화된 아스파르테이트 키나제 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 4로 나타내었다.

특히, 다음의 개방형 판독 프레임, 유전자 또는 뉴클레오티드가 성장 또는 리신 생산에 필수적이지 않은 "추가의 유전자 위치"로 사용될 수 있다: aecD, ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, fda, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysR1, lysR2, lysR3, menE, mqo, pck, pgi, poxB 및 zwa2, 특히 유전자 aecD, gluA, gluB, gluC, gluD 및 pck. 이들은 표 3에 요약 및 설명되어 있다. 염색체내의 유전자간 영역, 즉 암호화 기능이 없는 뉴클레오티드 서열을 추가로 사용할 수 있다. 최종적으로, 염색체에 포함된 프로파아지 또는 결손 파아지를 사용할 수 있다.

리신 생산의 개방형 판독 프레임, 유전자 및 대립형질유전자

명칭	암호화된 효소 또는 단백질의 기술	참조 문헌	수탁 번호
accBC	아실-CoA 카복실라제 EC 6.3.4.14 (아실-CoA 카복실라제)	Jager et al. Archives of Microbiology (1996) 166:76-82 EP1108790; WO0100805	U35023 AX123524 AX066441
accDA	아세틸-CoA 카복실라제 EC 6.4.1.2 (아세틸-CoA 카복실라제)	EP1055725 EP1108790 WO0100805	AX121013 AX066443
cstA	탄소 결핍 단백질 A (탄소 결핍 단백질 A)	EP1108790 WO0100804	AX120811 AX066109
cysD	설페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 아단위 II EC 2.7.7.4 (설페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 소형 쇄)	EP1108790	AX123177
cysE	세린 아세틸트랜스퍼라제 EC 2.3.1.30 (세린 아세틸트랜스퍼라제)	EP1108790 WO0100843	AX122902 AX063961
cysH	3'-포스포아데닐 설페이트 리덕타제 EC 1.8.99.4 (3'-포스포아데노신 5'-포스포설페이트 리덕타제)	EP1108790 WO0100842	AX123178 AX066001
cysK	시스테인 신타제 EC 4.2.99.8 (시스테인 신타제)	EP1108790 WO0100843	AX122901 AX063963
cysN	설페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 아단위 I EC 2.7.7.4 (설페이트 아데닐릴트랜스퍼라제)	EP1108790	AX123176 AX127152
cysQ	운송 단백질 CysQ (운송체 cysQ)	EP1108790 WO0100805	AX127145 AX066423

dapA	디하이드로디피콜리네이트 신타제 EC 4.2.1.52 (디하이드로디피콜리네이트 신타제)	Bonnassie et al. Nucleic Acids Research 18:6421 (1990) Pisabarro et al., Journal of Bacteriology 175:2743-2749(1993) EP1108790 WO0100805 EP0435132 EP1067192 EP1067193	X53993 Z21502 AX123560 AX063773
dapB	디하이드로디피콜리네이트 리덕타제 EC 1.3.1.26 (디하이드로디피콜리네이트 리덕타제)	EP1108790 WO0100843 EP1067192 EP1067193 Pisabarro et al., Journal of Bacteriology 175:2743-2749(1993) JP1998215883 JP1997322774 JP1997070291 JP1995075578	AX127149 AX063753 AX137723 AX137602 X67737 Z21502 E16749 E14520 E12773 E08900
dapC	N-석시닐 아미노케토피멜레이트 트랜스아미나제 EC 2.6.1.17 (N-석시닐 디아미노피멜레이트 트랜스아미나제)	EP1108790 WO0100843 EP1136559	AX127146 AX064219
dapD	테트라하이드로디피콜리네이트 석시닐라제 EC 2.3.1.117 (테트라하이드로디피콜리네이트 석시닐라제)	EP1108790 WO0100843 Wehrmann et al. Journal of Bacteriology 180:3159-3165(1998)	AX127146 AX063757 AJ004934

dapE	N-석시닐 디아미노피멜레이트 De석시닐라제 EC 3.5.1.18 (N-석시닐 디아미노피멜레이트 데석시닐라제)	EP1108790 WO0100843 Wehrmann et al. Microbiology 140:3349-3356 (1994)	AX127146 AX063749 X81379
dapF	디아미노피멜레이트 에피머라제 EC 5.1.1.7 (디아미노피멜레이트 에피머라제)	EP1108790 WO0100843 EP1085094	AX127149 AX063719 AX137620
ddh	디아미노피멜레이트 데하이드로게나제 EC 1.4.1.16 (디아미노피멜레이트 데하이드로게나제)	EP1108790 WO0100843 Ishino et al., Nucleic Acids Research 15:3917-3917(1987) JP1997322774 JP1993284970 Kim et al., Journal of Microbiology and Biotechnology 5:250-256(1995)	AX127152 AX063759 Y00151 E14511 E05776 D87976
dps	DNA 보호 단백질 (결핍 단백질 동안의 보호)	EP1108790	AX127153
eno	엔올라제 EC 4.2.1.11 (엔올라제)	EP1108790 WO0100844 EP1090998 Hermann et al., Electrophoresis 19:3217-3221 (1998)	AX127146 AX064945 AX136862
gap	글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제 EC 1.2.1.12 (글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제)	EP1108790 WO0100844 Eikmanns et al., Journal of Bacteriology 174:6076-6086(1992)	AX127148 AX064941 X59403

gap2	글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제 EC 1.2.1.12 (글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제 2)	EP1108790 WO0100844	AX127146 AX064939
gdh	글루타메이트 데하이드로게나제 EC 1.4.1.4 (글루타메이트 데하이드로게나제)	EP1108790 WO0100844 Boermann et al., Molecular Microbiology 6:317-326 (1992). Guyonvarch et al., NCBI	AX127150 AX063811 X59404 X72855
gnd	6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제 EC 1.1.1.44 (6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제)	EP1108790 WO0100844	AX127147 AX121689 AX065125
lysC	아스파르테이트 키나제 EC 2.7.2.4 (아스파르테이트 키나제)	EP1108790 WO0100844 Kalinowski et al., Molecular Microbiology 5:1197-204 (1991)	AX120365 AX063743 X57226
lysC^FBR	아스파르테이트 키나제 피이드백 내성 (fbr) EC 2.7.2.4 (아스파르테이트 키나제 fbr)	see table　2
lysE	리신 이출제 (리신 이출제 단백질)	EP1108790 WO0100843 Vrljic et al., Molecular Microbiology 22:815-826 (1996)	AX123539 AX123539 X96471
msiK	당 이입체 (다중 당 이입 단백질)	EP1108790	AX120892
opcA	글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제 (글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제의 아단위)	WO0104325	AX076272
oxyR	전사 조절제 (전사 조절제)	EP1108790	AX122198 AX127149

ppc^FBR	포스포엔올 피루베이트 카복실라제 피이드백 내성 EC 4.1.1.31 (포스포엔올 피루베이트 카복실라제 피이드백 내성)	EP0723011 WO0100852
ppc	포스포엔올 피루베이트 카복실라제 EC 4.1.1.31 (포스포엔올 피루베이트 카복실라제)	EP1108790 O'Reagan et al., Gene 77(2):237-251(1989)	AX127148 AX123554 M25819
pgk	포스포글리서레이트 키나제 EC 2.7.2.3 (포스포글리서레이트 키나제)	EP1108790 WO0100844 Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	AX121838 AX127148 AX064943 X59403
pknA	단백질 키나제 A (단백질 키나제 A)	EP1108790	AX120131 AX120085
pknB	단백질 키나제 B (단백질 키나제 B)	EP1108790	AX120130 AX120085
pknD	단백질 키나제 D (단백질 키나제 D)	EP1108790	AX127150 AX122469 AX122468
pknG	단백질 키나제 G (단백질 키나제 G)	EP1108790	AX127152 AX123109
ppsA	포스포엔올 피루베이트 신타제 EC 2.7.9.2 (포스포엔올 피루베이트 신타제)	EP1108790	AX127144 AX120700 AX122469
ptsH	포스포트랜스퍼라제 시스템 단백질 H EC 2.7.1.69 (포스포트랜스퍼라제 시스템 성분 H)	EP1108790 WO0100844	AX122210 AX127149 AX069154
ptsI	포스포트랜스퍼라제 시스템 효소 I EC 2.7.3.9 (포스포트랜스퍼라제 시스템 효소 I)	EP1108790	AX122206 AX127149
ptsM	Glukose-specific 포스포트랜스퍼라제 시스템 효소 II EC 2.7.1.69 (글루코스 포스포트랜스퍼라제 시스템 효소 II)	Lee et al., FEMS Microbiology Letters 119 (1-2):137-145 (1994)	L18874
pyc	피루베이트 카복실라제 EC 6.4.1.1 (피루베이트 카복실라제)	WO9918228 Peters-Wendisch et al., Microbiology 144:915-927 (1998)	A97276 Y09548

pyc P458S	피루베이트 카복실라제 EC 6.4.1.1 (피루베이트 카복실라제) 아미노산 교환 P458S	EP1108790
sigC	시그마 인자 C EC 2.7.7.6 (세포질외 기능 대안적 시그마 인자 C)	EP1108790	AX120368 AX120085
sigD	RNA 폴리머라제 시그마 인자 D EC 2.7.7.6 (RNA 폴리머라제 시그마 인자)	EP1108790	AX120753 AX127144
sigE	시그마 인자 E EC 2.7.7.6 (세포질외 기능 대안적 시그마 인자 E)	EP1108790	AX127146 AX121325
sigH	시그마 인자 H EC 2.7.7.6 (시그마 인자 SigH)	EP1108790	AX127145 AX120939
sigM	시그마 인자 M EC 2.7.7.6 (시그마 인자 SigM)	EP1108790	AX123500 AX127145
tal	트랜스알돌라제 EC 2.2.1.2 (트랜스알돌라제)	WO0104325	AX076272
thyA	티미딜레이트 신타제 EC 2.1.1.45 (티미딜레이트 신타제)	EP1108790	AX121026 AX127145
tkt	트랜스케톨라제 EC 2.2.1.1 (트랜스케톨라제)	Ikeda et al., NCBI	AB023377
tpi	트리오스 포스페이트 이소머라제 EC 5.3.1.1 (트리오스 포스페이트 이소머라제)	Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	X59403
zwa1	세포 성장 인자 1 (성장 인자 1)	EP1111062	AX133781
zwf	글루코스 6-포스페이트 1-데하이드로게나제 EC 1.1.1.49 (글루코스 6-포스페이트 1-데하이드로게나제)	EP1108790 WO0104325	AX127148 AX121827 AX076272
zwf A213T	글루코스 6-포스페이트 1-데하이드로게나제 EC 1.1.1.49 (글루코스 6-포스페이트 1-데하이드로게나제) 아미노산 교환 A213T	EP1108790

피드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC^FBR대립형질유전자

대립형질유전자의 명칭	아미노산 치환체	참조 문헌	수탁 번호
lysC^FBR-E05108		JP 1993184366-A (서열번호 1)	E05108
lysC^FBR-E06825	lysC A279T	JP 1994062866-A (서열번호 1)	E06825
lysC^FBR-E06826	lysC A279T	JP 1994062866-A (서열번호 2)	E06826
lysC^FBR-E06827		JP 1994062866-A (서열번호 3)	E06827
lysC^FBR-E08177		JP 1994261766-A (서열번호 1)	E08177
lysC^FBR-E08178	lysC A279T	JP 1994261766-A (서열번호 2)	E08178
lysC^FBR-E08179	lysC A279V	JP 1994261766-A (서열번호 3)	E08179
lysC^FBR-E08180	lysC S301F	JP 1994261766-A (서열번호 4)	E08180
lysC^FBR-E08181	lysC T308I	JP 1994261766-A (서열번호 5)	E08181
lysC^FBR-E08182		JP 1994261766-A (서열번호 6)	E08182
lysC^FBR-E12770		JP 1997070291-A (서열번호 13)	E12770
lysC^FBR-E14514		JP 1997322774-A (서열번호 9)	E14514
lysC^FBR-E16352		JP 1998165180-A (서열번호 3)	E16352
lysC^FBR-E16745		JP 1998215883-A (서열번호 3)	E16745
lysC^FBR-E16746		JP 1998215883-A (서열번호 4)	E16746
lysC^FBR-I74588		US 5688671-A (서열번호 1)	I74588
lysC^FBR-I74589	lysC A279T	US 5688671-A (서열번호 2)	I74589
lysC^FBR-I74590		US 5688671-A (서열번호 7)	I74590
lysC^FBR-I74591	lysC A279T	US 5688671-A (서열번호 8)	I74591
lysC^FBR-I74592		US 5688671-A (서열번호 9)	I74592
lysC^FBR-I74593	lysC A279T	US 5688671-A (서열번호 10)	I74593
lysC^FBR-I74594		US 5688671-A (서열번호 11)	I74594
lysC^FBR-I74595	lysC A279T	US 5688671-A (서열번호 12)	I74595
lysC^FBR-I74596		US 5688671-A (서열번호 13)	I74596

lysC^FBR-I74597	lysC A279T	US 5688671-A (서열번호 14)	I74597
lysC^FBR-X57226	lysC S301Y	EP0387527 Kalinowski et al., Molecular and General Genetics 224:317-324 (1990)	X57226
lysC^FBR-L16848	lysC G345D	Follettie and Sinskey NCBI Nucleotide Database (1990)	L16848
lysC^FBR-L27125	lysC R320G lysC G345D	Jetten et al., Applied Microbiology Biotechnology 43:76-82 (1995)	L27125
lysC^FBR	lysC T311I	WO0063388 (서열번호 17)
lysC^FBR	lysC S301F	US3732144
lysC^FBR	lysC S381F
lysC^FBR		JP6261766 (서열번호 1)
lysC^FBR	lysC A279T	JP6261766 (서열번호 2)
lysC^FBR	lysC A279V	JP6261766 (서열번호 3)
lysC^FBR	lysC S301F	JP6261766 (서열번호 4)
lysC^FBR	lysC T308I	JP6261766 (서열번호 5)

리신 생산의 개방형 판독 프레임, 유전자 및 대립형질유전자의 통합을 위한 추가의 유전자 위치

유전자 명칭	암호화된 효소 또는 단백질의 기술	참조 문헌	수탁 번호
aecD	베타 C-S 리아제 EC 2.6.1.1 (베타 C-S 리아제)	Rossol et al., Journal of Bacteriology 174(9):2968-77 (1992)	M89931
ccpA1	이화산물 조절 단백질 (이화산물 조절 단백질 A1)	WO0100844 EP1108790	AX065267 AX127147
ccpA2	이화산물 조절 단백질 (이화산물 조절 단백질 A2)	WO0100844 EP1108790	AX065267 AX121594
citA	센서 키나제 CitA (센서 키나제 CitA)	EP1108790	AX120161
citB	전사 조절제 CitB (전사 조절제 CitB)	EP1108790	AX120163
citE	시트레이트 리아제 EC 4.1.3.6 (시트레이트 리아제)	WO0100844 EP1108790	AX065421 AX127146
fda	프럭토스 비스포스페이트 알돌라제 EC 4.1.2.13 (프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌라제)	von der Osten et al., Molecular Microbiology 3(11):1625-37 (1989)	X17313
gluA	글루타메이트 운송 ATP-결합 단백질 (글루타메이트 운송 ATP-결합 단백질)	Kronemeyer et al., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluB	글루타메이트-결합 단백질 (글루타메이트-결합 단백질)	Kronemeyer et al., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluC	글루타메이트 운송 퍼미아제 (글루타메이트 운송 시스템 퍼미아제)	Kronemeyer et al., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluD	글루타메이트 운송 퍼미아제 (글루타메이트 운송 시스템 퍼미아제)	Kronemeyer et al., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
luxR	전사 조절제 LuxR (전사 조절제 LuxR)	WO0100842 EP1108790	AX065953 AX123320
luxS	히스티딘 키나제 LuxS (히스티딘 키나제 LuxS)	EP1108790	AX123323 AX127145
lysR1	전사 조절제 LysR1 (전사 조절제 LysR1)	EP1108790	AX064673 AX127144
lysR2	전사 활성화제 LysR2 (전사 조절제 LysR2)	EP1108790	AX123312
lysR3	전사 조절제 LysR3 (전사 조절제 LysR3)	WO0100842 EP1108790	AX065957 AX127150
menE	O-석시닐벤조산 CoA 리가제 EC 6.2.1.26 (O-석시닐벤조에이트 CoA 리가제)	WO0100843 EP1108790	AX064599 AX064193 AX127144

mqo	말레이트-퀴논 옥시도리덕타제 (말레이트-퀴논-옥시도리덕타제)	Molenaar et al., Eur. Journal of Biochemistry 1;254(2):395-403 (1998)	AJ224946
pck	포스포엔올 피루베이트 카복시키나제 (포스포엔올 피루베이트 카복시키나제)	WO0100844	AJ269506 AX065053
pgi	글루코스 6-포스페이트 이소머라제 EC 5.3.1.9 (글루코스 6-포스페이트 이소머라제)	EP1087015 EP1108790	AX136015 AX127146
poxB	피루베이트 옥시다제 EC 1.2.3.3 (피루베이트 옥시다제)	WO0100844 EP1096013	AX064959 AX137665
zwa2	세포 성장 인자 2 (성장 인자 2)	EP1106693 EP1108790	AX113822 AX127146

따라서 본 발명은 또한

a) 임의로 발현 및/또는 조절 시그날을 포함하는, 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 뉴클레오티드 서열을 분리하는 단계,

b) 리신 생산의 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 뉴클레오티드 서열의 2개 이상의 복사체를 한 줄로, 바람직하게는 탠덤 배열로 배열하는 단계,

c) 단계 b)에 따라 수득한 뉴클레오티드 서열을 코리네형 세균에서 복제하지 않거나 오직 제한된 양만큼만 복제하는 벡터내로 통합시키는 단계,

e) 본래 존재하는 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 단일 복사체 대신 특정의 목적하는 본 위치에서 리신 생산의 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 2개 이상의 복사체를 갖고, 특정한 본 위치(좌)에는 미생물내에서 에피좀 상 태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없는 코리네형 세균을 분리하는 단계, 및 임의로

f) 목적하는 리신 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3의 복사체 1개 이상을 추가의 유전자 위치에 도입하는 단계를 특징으로 하는, L-리신을 생산하는 코리네형 세균의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한

a) 특정한 목적하는 위치(좌)에 자연적으로 존재하는 메티오닌 생산 또는 트레오닌 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 단일 복사체 대신, 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 2개 이상의 복사체를, 바람직하게는 탠덤 배열로 가지며, 특정 위치에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고,

b) 임의로 추가의 유전자 위치에 메티오닌 생산 또는 트레오닌 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3의 복사체를 하나 이상 가지며, 추가의 유전자 위치에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없음을 특징으로 하는, L-메티오닌 및/또는 L-트레오닌을 생산하는 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속을 제공한다.

본 발명은 또한 추가로

a) 개방형 판독 프레임(ORFs), 유전자 또는 대립형질유전자의 발현이 가능한 조건하에

ⅰ) 특정한 목적하는 위치(좌)에 존재하는 메티오닌 생산 또는 트레오닌 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 단일 복사체 대신, 목적하는 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 2개 이상의 복사체를, 바람직하게는 탠덤 배열로 가지며, 특정한 위치에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고,

ⅱ) 임의로 추가의 유전자 위치에 목적하는 메티오닌 생산 또는 트레오닌 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3의 복사체를 하나 이상 가지며, 추가의 유전자 위치에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없는 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속을 발효시키는 단계,

b) 발효 브로쓰속에서 L-메티오닌 및/또는 L-트레오닌을 농축시키는 단계,

c) 발효 브로쓰로부터 L-메티오닌 및/또는 L-트레오닌을 분리시키는 단계, 임의로

d) 발효 브로쓰 및/또는 바이오매스로부터의 구성물질이 0 초과 내지 100%인 정도로 수행되는 단계를 포함하는, L-메티오닌 및/또는 L-트레오닌의 제조방법을 제공한다.

"메티오닌 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 복사체"는 증강/과발현이 메티오닌 생산 개선 효과를 가질 수 있는 모든, 바람직하게는 내인성, 개방형 판독 프레임, 유전자 또는 대립형질유전자를 의미하는 것으로 이해된다.

이들은, 특히, 다음의 개방형 판독 프레임, 유전자 또는 대립형질유전자를 포함한다: accBC, accDA, aecD, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dps, eno, fda, gap, gap2, gdh, gnd, glyA, hom, hom^FBR, lysC, lysC^FBR, metA, metB, metE, metH, metY, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppc^FBR, pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsI, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, zwa1, zwf 및 zwf A213T. 이들은 표 4에 요약 및 설명되어 있다. 이들은 특히, "피드백" 내성 아스파르테이트 키나제 (표 2 참조)를 암호화하는 lysC^FBR대립형질유전자 및 "피드백" 내성 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom^FBR 대립형질유전자를 포함한다.

목적하는 메티오닌 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3, 바람직하게는 제4 또는 제5의 복사체 1개 이상을 추가의 위치에 통합할 수 있다. 다음의 개방형 판독 프레임, 유전자 또는 뉴클레오티드 서열이 특히, 이를 위하여 사용될 수 있다: brnE, brnF, brnQ, ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, ddh, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysR1, lysR2, lysR3, menE, metD, metK, pck, pgi, poxB 및 zwa2. 이들은 표 5에 요약 및 설명되어 있다. 염색체상의 유전자간 영역, 즉 암호화 기능이 없는 뉴클레오티드 서열을 추가로 사용할 수 있다. 최종적으로, 염색체에 포함된 프로파아지 또는 결손 파아지를 이를 위하여 사용할 수 있다.

메티오닌 생산의 개방형 판독 프레임, 유전자 및 대립형질유전자

명칭	암호화된 효소 또는 단백질의 기술	참조 문헌	수탁 번호
accBC	아실-CoA 카복실라제 EC 6.3.4.14 (아실-CoA 카복실라제)	Jager et al. Archives of Microbiology (1996) 166:76-82 EP1108790; WO0100805	U35023 AX123524 AX066441
accDA	아세틸-CoA 카복실라제 EC 6.4.1.2 (아세틸-CoA 카복실라제)	EP1055725 EP1108790 WO0100805	AX121013 AX066443
aecD	Cystathionine 베타-리아제 EC 4.4.1.8 (시스타티오닌 베타-리아제)	Rossol et al., Journal of Bacteriology 174:2968-2977 (1992)	M89931
cstA	탄소 결핍 단백질 A (탄소 결핍 단백질 A)	EP1108790 WO0100804	AX120811 AX066109
cysD	설페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 아단위 II EC 2.7.7.4 (설페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 소형 쇄)	EP1108790	AX123177
cysE	세린 아세틸트랜스퍼라제 EC 2.3.1.30 (세린 아세틸트랜스퍼라제)	EP1108790 WO0100843	AX122902 AX063961
cysH	3'-포스포아데닐 설페이트 리덕타제 EC 1.8.99.4 (3'-포스포아데노신 5'-포스포설페이트 리덕타제)	EP1108790 WO0100842	AX123178 AX066001
cysK	시스테인 신타제 EC 4.2.99.8 (시스테인 신타제)	EP1108790 WO0100843	AX122901 AX063963
cysN	설페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 아단위 I EC 2.7.7.4 (설페이트 아데닐릴트랜스퍼라제)	EP1108790	AX123176 AX127152
cysQ	운송 단백질 CysQ (운송체 cysQ)	EP1108790 WO0100805	AX127145 AX066423
dps	DNA 보호 단백질 (결핍 단백질 동안의 보호)	EP1108790	AX127153

eno	엔올라제 EC 4.2.1.11 (엔올라제)	EP1108790 WO0100844 EP1090998 Hermann et al., Electrophoresis 19:3217-3221 (1998)	AX127146 AX064945 AX136862
fda	프럭토스 비스포스페이트 알돌라제 EC 4.1.2.13 (프럭토스 비스포스페이트 알돌라제)	van der Osten et al., Molecular Microbiology 3:1625-1637 (1989)	X17313
gap	글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제 EC 1.2.1.12 (글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제)	EP1108790 WO0100844 Eikmanns et al., Journal of Bacteriology 174:6076-6086(1992)	AX127148 AX064941 X59403
gap2	글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제 EC 1.2.1.12 (글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제 2)	EP1108790 WO0100844	AX127146 AX064939
gdh	글루타메이트 데하이드로게나제 EC 1.4.1.4 (글루타메이트 데하이드로게나제)	EP1108790 WO0100844 Boermann et al., Molecular Microbiology 6:317-326 (1992); Guyonvarch et al., NCBI	AX127150 AX063811 X59404 X72855
glyA	글리세린/세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제 EC 2.1.2.1 (글리세린/세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제)	EP1108790	AX127146 AX121194
gnd	6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제 EC 1.1.1.44 (6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제)	EP1108790 WO0100844	AX127147 AX121689 AX065125
hom	호모세린 데하이드로게나제 EC 1.1.1.3 (호모세린 데하이드로게나제)	Peoples et al., Molecular Microbiology 2:63-72 (1988)	Y00546
hom^FBR	호모세린 데하이드로게나제 피이드백 내성 (fbr) EC 1.1.1.3 (호모세린 데하이드로게나제 fbr)	Reinscheid et al., Journal of Bacteriology 173:3228-30 (1991)

lysC	아스파르테이트 키나제 EC 2.7.2.4 (아스파르테이트 키나제)	EP1108790 WO0100844 Kalinowski et al., Molecular Microbiology 5:1197-204 (1991)	AX120365 AX063743 X57226
lysC^FBR	아스파르테이트 키나제 피이드백 내성 (fbr) EC 2.7.2.4 (아스파르테이트 키나제 fbr)	see table 2
metA	호모세린 아세틸트랜스퍼라제 EC 2.3.1.31 (호모세린 아세틸트랜스퍼라제)	Park et al., Molecular Cells 8:286-94 (1998)	AF052652
metB	시스타티오닌 g-리아제 EC 4.4.1.1 (시스타티오닌 감마-신타제)	Hwang et al., Molecular Cells 9:300-308 (1999)	AF126953
metE	호모시스테인 메틸트랜스퍼라제 EC 2.1.1.14 (호모시스테인 메틸트랜스퍼라제)	EP1108790	AX127146 AX121345
metH	호모시스테인 메틸트랜스퍼라제 (비타민 B12-의존형) EC 2.1.1.14 (호모시스테인 메틸트랜스퍼라제)	EP1108790	AX127148 AX121747
metY	아세틸호모세린 설프하이드롤라제 (아세틸호모세린 설프하이드롤라제)	EP1108790	AX120810 AX127145
msiK	당 이입체 (다중 당 이입 단백질)	EP1108790	AX120892
opcA	글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제 (글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제의 아단위)	WO0104325	AX076272
oxyR	전사 조절제 (전사 조절제)	EP1108790	AX122198 AX127149
ppc^FBR	포스포엔올 피루베이트 카복실라제 피이드백 내성 EC 4.1.1.31 (포스포엔올 피루베이트 카복실라제 피이드백 내성)	EP0723011 WO0100852
ppc	포스포엔올 피루베이트 카복실라제 EC 4.1.1.31 (포스포엔올 피루베이트 카복실라제)	EP1108790 O'Reagan et al., Gene 77(2):237-251(1989)	AX127148 AX123554 M25819

pgk	포스포글리서레이트 키나제 EC 2.7.2.3 (포스포글리서레이트 키나제)	EP1108790 WO0100844 Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	AX121838 AX127148 AX064943 X59403
pknA	단백질 키나제 A (단백질 키나제 A)	EP1108790	AX120131 AX120085
pknB	단백질 키나제 B (단백질 키나제 B)	EP1108790	AX120130 AX120085
pknD	단백질 키나제 D (단백질 키나제 D)	EP1108790	AX127150 AX122469 AX122468
pknG	단백질 키나제 G (단백질 키나제 G)	EP1108790	AX127152 AX123109
ppsA	포스포엔올 피루베이트 신타제 EC 2.7.9.2 (포스포엔올 피루베이트 신타제)	EP1108790	AX127144 AX120700 AX122469
ptsH	포스포트랜스퍼라제 시스템 단백질 H EC 2.7.1.69 (포스포트랜스퍼라제 시스템 성분 H)	EP1108790 WO0100844	AX122210 AX127149 AX069154
ptsI	포스포트랜스퍼라제 시스템 효소 I EC 2.7.3.9 (포스포트랜스퍼라제 시스템 효소 I)	EP1108790	AX122206 AX127149
ptsM	글루코스-특이적 포스포트랜스퍼라제 시스템 효소 II EC 2.7.1.69 (글루코스 포스포트랜스퍼라제 시스템 효소 II)	Lee et al., FEMS Microbiology Letters 119 (1-2):137-145 (1994)	L18874
pyc	피루베이트 카복실라제 EC 6.4.1.1 (피루베이트 카복실라제)	WO9918228 Peters-Wendisch et al., Microbiology 144:915-927 (1998)	A97276 Y09548
pyc P458S	피루베이트 카복실라제 EC 6.4.1.1 (피루베이트 카복실라제) 아미노산 교환 P458S	EP1108790
sigC	시그마 인자 C EC 2.7.7.6 (세포질외 기능 대안적 시그마 인자 C)	EP1108790	AX120368 AX120085
sigD	RNA 폴리머라제 시그마 인자 D EC 2.7.7.6 (RNA 폴리머라제 시그마 인자)	EP1108790	AX120753 AX127144
sigE	시그마 인자 E EC 2.7.7.6 (세포질외 기능 대안적 시그마 인자 E)	EP1108790	AX127146 AX121325

sigH	시그마 인자 H EC 2.7.7.6 (시그마 인자 SigH)	EP1108790	AX127145 AX120939
sigM	시그마 인자 M EC 2.7.7.6 (시그마 인자 SigM)	EP1108790	AX123500 AX127153
tal	트랜스알돌라제 EC 2.2.1.2 (트랜스알돌라제)	WO0104325	AX076272
thyA	티미딜레이트 신타제 EC 2.1.1.45 (티미딜레이트 신타제)	EP1108790	AX121026 AX127145
tkt	트랜스케톨라제 EC 2.2.1.1 (트랜스케롤라제)	Ikeda et al., NCBI	AB023377
tpi	트리오스 포스페이트 이소머라제 EC 5.3.1.1 (트리오스 포스페이트 이소머라제)	Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	X59403
zwa1	세포 성장 인자 1 (성장 인자 1)	EP1111062	AX133781
zwf	글루코스 6-포스페이트 1-데하이드로게나제 EC 1.1.1.49 (글루코스 6-포스페이트 1-데하이드로게나제)	EP1108790 WO0104325	AX127148 AX121827 AX076272
zwf A213T	글루코스 6-포스페이트 1-데하이드로게나제 EC 1.1.1.49 (글루코스 6-포스페이트 1-데하이드로게나제) 아미노산 교환 A213T	EP1108790

메티오닌 생산의 개방형 판독 프레임, 유전자 및 대립형질유전자의 통합을 위한 추가의 유전자 위치

유전자 명칭	암호화된 효소 또는 단백질의 기술	참조 문헌	수탁 번호
brnE	측쇄 아미노산의 운송체 (측쇄 아미노산 운송체)	EP1096010	AX137709 AX137714
brnF	측쇄 아미노산의 운송체 (측쇄 아미노산 운송체)	EP1096010	AX137709 AX137714
brnQ	측쇄 아미노산의 운반 단백질 (측쇄 아미노산 운송 시스템 운반 단백질)	Tauch et al., Archives of Microbiology 169(4):303-12 (1998) WO0100805 EP1108790	M89931 AX066841 AX127150
ccpA1	이화산물 조절 단백질 (이화산물 조절 단백질 A1)	WO0100844 EP1108790	AX065267 AX127147
ccpA2	이화산물 조절 단백질 (이화산물 조절 단백질 A2)	WO0100844 EP1108790	AX065267 AX121594
citA	센서 키나제 CitA (센서 키나제 CitA)	EP1108790	AX120161
citB	전사 조절제 CitB (전사 조절제 CitB)	EP1108790	AX120163
citE	시트레이트 리아제 EC 4.1.3.6 (시트레이트 리아제)	WO0100844 EP1108790	AX065421 AX127146
ddh	디아미노피멜레이트 데하이드로게나제 EC 1.4.1.16 (디아미노피멜레이트 데하이드로게나제)	Ishino et al., Nucleic Acids Research 15: 3917 (1987) EP1108790	S07384 AX127152
gluA	글루타메이트 운송 ATP-결합 단백질 (글루타메이트 운송 ATP-결합 단백질)	Kronemeyer et al., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluB	글루타메이트-결합 단백질 (글루타메이트-결합 단백질)	Kronemeyer et al., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluC	글루타메이트 운송 퍼미아제 (글루타메이트 운송 시스템 퍼미아제)	Kronemeyer et al., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluD	글루타메이트 운송 퍼미아제 (글루타메이트 운송 시스템 퍼미아제)	Kronemeyer et al., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
luxR	전사 조절제 LuxR (전사 조절제 LuxR)	WO0100842 EP1108790	AX065953 AX123320
luxS	히스티딘 키나제 LuxS (히스티딘 키나제 LuxS)	EP1108790	AX123323 AX127145
lysR1	전사 조절제 LysR1 (전사 조절제 LysR1)	EP1108790	AX064673 AX127144
lysR2	전사 활성화제 LysR2 (전사 조절제 LysR2)	EP1108790	AX123312
lysR3	전사 조절제 LysR3 (전사 조절제 LysR3)	WO0100842 EP1108790	AX065957 AX127150

menE	O-석시닐벤조산 CoA 리가제 EC 6.2.1.26 (O-석시닐벤조에이트 CoA 리가제)	WO0100843 EP1108790	AX064599 AX064193 AX127144
metD	전사 조절제 MetD (전사 조절제 MetD)	EP1108790	AX123327 AX127153
metK	메티오닌 아데노실 트랜스퍼라제 EC 2.5.1.6 (S-아데노실메티오닌 신타제)	WO0100843 EP1108790	AX063959 AX127148
pck	포스포엔올 피루베이트 카복시키나제 (포스포엔올 피루베이트 카복시키나제)	WO0100844	AJ269506 AX065053
pgi	글루코스 6-포스페이트 이소머라제 EC 5.3.1.9 (글루코스-6-포스페이트 이소머라제)	EP1087015 EP1108790	AX136015 AX127146
poxB	피루베이트 옥시다제 EC 1.2.3.3 (피루베이트 옥시다제)	WO0100844 EP1096013	AX064959 AX137665
zwa2	세포 성장 인자 2 (성장 인자 2)	EP1106693 EP1108790	AX113822 AX127146

"트레오닌 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 복사체"는 증강/과발현이 트레오닌 생산 개선의 효과를 가질 수 있는 모든, 바람직하게는 내인성, 개방형 판독 프레임, 유전자 또는 대립형질유전자를 의미하는 것으로 이해된다.

이들은 특히, 다음의 개방형 판독 프레임, 유전자 또는 대립형질유전자를 포함한다: accBC, accDA, cstA, cysD, cysE, cysH, cysI, cysN, cysQ, dps, eno, fda, gap, gap2, gdh, gnd, hom, hom^FBR, lysC, lysC^FBR, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppc^FBR, pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsI, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, thrB, thrC, thrE, zwa1, zwf 및 zwf A213T. 이들은 표 6에 요약 및 설명되어 있다. 이들은 특히, "피드백" 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC^FBR대립형질유전자 및 "피드백" 내성 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom^FBR 대립형질유전자를 포함한다.

목적하는 트레오닌 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3, 임의로 제4 또는 제5의 복사체 1개 이상이 목적하는 위치에 통합된다. 특히, 다음의 개방형 판독 프레임, 유전자 또는 뉴클레오티드 서열이 이를 위하여 사용될 수 있다: ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, ddh, gluA, gluB, gluC, gluD, glyA, ilvA, ilvBN, ilvC, ilvD, luxR, luxS, lysR1, lysR2, lysR3, mdh, menE, metA, metD, pck, poxB, sigB 및 zwa2. 이들은 표 7에 요약 및 설명되어 있다. 염색체상의 유전자간 영역, 즉 암호화 기능이 없는 뉴클레오티드 서열을 추가로 사용할 수 있다. 최종적으로, 염색체에 포함된 프로파아지 또는 결손 파아지를 이를 위하여 사용할 수 있다.

트레오닌 생산의 개방형 판독 프레임, 유전자 및 대립형질유전자

명칭	암호화된 효소 또는 단백질의 기술	참조 문헌	수탁 번호
accBC	아실-CoA 카복실라제 EC 6.3.4.14 (아실-CoA 카복실라제)	Jager et al. Archives of Microbiology 166:76-82 (1996) EP1108790 WO0100805	U35023 AX123524 AX066441
accDA	아세틸-CoA 카복실라제 EC 6.4.1.2 (아세틸-CoA 카복실라제)	EP1055725 EP1108790 WO0100805	AX121013 AX066443
cstA	탄소 결핍 단백질 A (탄소 결핍 단백질 A)	EP1108790 WO0100804	AX120811 AX066109
cysD	설페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 아단위 II EC 2.7.7.4 (설페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 소형 쇄)	EP1108790	AX123177
cysE	세린 아세틸트랜스퍼라제 EC 2.3.1.30 (세린 아세틸트랜스퍼라제)	EP1108790 WO0100843	AX122902 AX063961
cysH	3'-포스포아데닐 설페이트 리덕타제 EC 1.8.99.4 (3'-포스포아데노신 5'-포스포설페이트 리덕타제)	EP1108790 WO0100842	AX123178 AX066001
cysK	시스테인 신타제 EC 4.2.99.8 (시스테인 신타제)	EP1108790 WO0100843	AX122901 AX063963
cysN	설페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 아단위 I EC 2.7.7.4 (설페이트 아데닐릴트랜스퍼라제)	EP1108790	AX123176 AX127152
cysQ	운송 단백질 CysQ (운송체 cysQ)	EP1108790 WO0100805	AX127145 AX066423
dps	DNA 보호 단백질 (결핍 단백질 동안의 보호)	EP1108790	AX127153
eno	엔올라제 EC 4.2.1.11 (엔올라제)	EP1108790 WO0100844 EP1090998 Hermann et al., Electrophoresis 19:3217-3221 (1998)	AX127146 AX064945 AX136862
fda	프럭토스 비스포스페이트 알돌라제 EC 4.1.2.13 (프럭토스 비스포스페이트 알돌라제)	van der Osten et al., Molecular Microbiology 3:1625-1637 (1989)	X17313

gap	글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제 EC 1.2.1.12 (글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제)	EP1108790 WO0100844 Eikmanns et al., Journal of Bacteriology 174:6076-6086(1992)	AX127148 AX064941 X59403
gap2	글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제 EC 1.2.1.12 (글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제 2)	EP1108790 WO0100844	AX127146 AX064939
gdh	글루타메이트 데하이드로게나제 EC 1.4.1.4 (글루타메이트 데하이드로게나제)	EP1108790 WO0100844 Boermann et al., Molecular Microbiology 6:317-326 (1992); Guyonvarch et al., NCBI	AX127150 AX063811 X59404 X72855
gnd	6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제 EC 1.1.1.44 (6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제)	EP1108790 WO0100844	AX127147 AX121689 AX065125
hom	호모세린 데하이드로게나제 EC 1.1.1.3 (호모세린 데하이드로게나제)	Peoples et al., Molecular Microbiology 2:63-72 (1988)	Y00546
hom^FBR	호모세린 데하이드로게나제 피이드백 내성 (fbr) EC 1.1.1.3 (호모세린 데하이드로게나제 fbr)	Reinscheid et al., Journal of Bacteriology 173:3228-30 (1991)
lysC	아스파르테이트 키나제 EC 2.7.2.4 (아스파르테이트 키나제)	EP1108790 WO0100844 Kalinowski et al., Molecular Microbiology 5:1197-204 (1991)	AX120365 AX063743 X57226
lysC^FBR	아스파르테이트 키나제 피이드백 내성 (fbr) EC 2.7.2.4 (아스파르테이트 키나제 fbr)	see table　2
msiK	당 이입체 (multiple 당 이입 단백질)	EP1108790	AX120892
opcA	글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제 (subunit of 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제)	WO0104325	AX076272

oxyR	전사 조절제 (전사 조절제)	EP1108790	AX122198 AX127149
ppc^FBR	포스포엔올 피루베이트 카복실라제 피이드백 내성 EC 4.1.1.31 (포스포엔올 피루베이트 카복실라제 피이드백 내성)	EP0723011 WO0100852
ppc	포스포엔올 피루베이트 카복실라제 EC 4.1.1.31 (포스포엔올 피루베이트 카복실라제)	EP1108790 O'Reagan et al., Gene 77(2):237-251(1989)	AX127148 AX123554 M25819
pgk	포스포글리서레이트 키나제 EC 2.7.2.3 (포스포글리서레이트 키나제)	EP1108790 WO0100844 Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	AX121838 AX127148 AX064943 X59403
pknA	단백질 키나제 A (단백질 키나제 A)	EP1108790	AX120131 AX120085
pknB	단백질 키나제 B (단백질 키나제 B)	EP1108790	AX120130 AX120085
pknD	단백질 키나제 D (단백질 키나제 D)	EP1108790	AX127150 AX122469 AX122468
pknG	단백질 키나제 G (단백질 키나제 G)	EP1108790	AX127152 AX123109
ppsA	포스포엔올 피루베이트 신타제 EC 2.7.9.2 (포스포엔올 피루베이트 신타제)	EP1108790	AX127144 AX120700 AX122469
ptsH	포스포트랜스퍼라제 시스템 단백질 H EC 2.7.1.69 (포스포트랜스퍼라제 시스템 성분 H)	EP1108790 WO0100844	AX122210 AX127149 AX069154
ptsI	포스포트랜스퍼라제 시스템 효소 I EC 2.7.3.9 (포스포트랜스퍼라제 시스템 효소 I)	EP1108790	AX122206 AX127149
ptsM	글루코스-특이적 포스포트랜스퍼라제 시스템 효소 II EC 2.7.1.69 (글루코스 포스포트랜스퍼라제-시스템 효소 II)	Lee et al., FEMS Microbiology Letters 119 (1-2):137-145 (1994)	L18874
pyc	피루베이트 카복실라제 EC 6.4.1.1 (피루베이트 카복실라제)	WO9918228 Peters-Wendisch et al., Microbiology 144:915-927 (1998)	A97276 Y09548

pyc P458S	피루베이트 카복실라제 EC 6.4.1.1 (피루베이트 카복실라제) 아미노산 교환 P458S	EP1108790
sigC	시그마 인자 C EC 2.7.7.6 (세포질외 기능 대안적 시그마 인자 C)	EP1108790	AX120368 AX120085
sigD	RNA 폴리머라제 시그마 인자 D EC 2.7.7.6 (RNA 폴리머라제 시그마 인자)	EP1108790	AX120753 AX127144
sigE	시그마 인자 E EC 2.7.7.6 (세포질외 기능 대안적 시그마 인자 E)	EP1108790	AX127146 AX121325
sigH	시그마 인자 H EC 2.7.7.6 (시그마 인자 SigH)	EP1108790	AX127145 AX120939
sigM	시그마 인자 M EC 2.7.7.6 (시그마 인자 SigM)	EP1108790	AX123500 AX127153
tal	트랜스알돌라제 EC 2.2.1.2 (트랜스알돌라제)	WO0104325	AX076272
thrB	호모세린 키나제 EC 2.7.1.39 (호모세린 키나제)	Peoples et al., Molecular Microbiology 2:63-72 (1988)	Y00546
thrC	트레오닌 신타제 EC 4.2.99.2 (트레오닌 신타제)	Han et al., Molecular Microbiology 4:1693-1702 (1990)	X56037
thrE	트레오닌 이출체 (트레오닌 이출 운반체)	EP1085091	AX137526
thyA	티미딜레이트 신타제 EC 2.1.1.45 (티미딜레이트 신타제)	EP1108790	AX121026 AX127145
tkt	트랜스케톨라제 EC 2.2.1.1 (트랜스케톨라제)	Ikeda et al., NCBI	AB023377
tpi	트리오스 포스페이트 이소머라제 EC 5.3.1.1 (트리오스 포스페이트 이소머라제)	Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	X59403
zwa1	세포 성장 인자 1 (성장 인자 1)	EP1111062	AX133781

zwf	글루코스 6-포스페이트 1-데하이드로게나제 EC 1.1.1.49 (글루코스 6-포스페이트 1-데하이드로게나제)	EP1108790 WO0104325	AX127148 AX121827 AX076272
zwf A213T	글루코스 6-포스페이트 1-데하이드로게나제 EC 1.1.1.49 (글루코스 6-포스페이트 1-데하이드로게나제) 아미노산 교환 A213T	EP1108790

트레오닌 생산의 개방형 판독 프레임, 유전자 및 대립형질유전자의 통합을 위한 추가의 유전자 위치

유전자 명칭	암호화된 효소 또는 단백질의 기술	참조 문헌	수탁 번호
ccpA1	이화산물 조절 단백질 (이화산물 조절 단백질 A1)	WO0100844 EP1108790	AX065267 AX127147
ccpA2	이화산물 조절 단백질 (이화산물 조절 단백질 A2)	WO0100844 EP1108790	AX065267 AX121594
citA	센서 키나제 CitA (센서 키나제 CitA)	EP1108790	AX120161
citB	전사 조절제 CitB (전사 조절제 CitB)	EP1108790	AX120163
citE	시트레이트 리아제 EC 4.1.3.6 (시트레이트 리아제)	WO0100844 EP1108790	AX065421 AX127146
ddh	디아미노피멜레이트 데하이드로게나제 EC 1.4.1.16 (디아미노피멜레이트 데하이드로게나제)	Ishino et al., Nucleic Acids Research 15: 3917 (1987) EP1108790	S07384 AX127152
gluA	글루타메이트 운송 ATP-결합 단백질 (글루타메이트 운송 ATP-결합 단백질)	Kronemeyer et al., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluB	글루타메이트-결합 단백질 (글루타메이트-결합 단백질)	Kronemeyer et al., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluC	글루타메이트 운송 퍼미아제 (글루타메이트 운송 시스템 퍼미아제)	Kronemeyer et al., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191

gluD	글루타메이트 운송 퍼미아제 (글루타메이트 운송 시스템 퍼미아제)	Kronemeyer et al., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
glyA	글리세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제 EC 2.1.2.1 (글리세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제)	WO0100843	AX063861 AF327063
ilvA	트레오닌 데하이드라타제 EC 4.2.1.16 (트레오닌 데하이드라타제)	M kel et al., Journal of Bacteriology 174 (24), 8065-8072 (1992) EP1108790	A47044 L01508 AX127150
ilvBN	아세톨락테이트 신타제 EC 4.1.3.18 (아세톨락테이트 신타제)	Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175(17):5595-603 (1993) EP1108790	L09232 AX127147
ilvC	리덕토이소머라제 EC 1.1.1.86 (케톨산 리덕토이소머라제)	Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175(17):5595-603 (1993) EP1108790	C48648 AX127147
ilvD	디하이드록시산 데하이드라타제 EC 4.2.1.9 (디하이드록시산 데하이드라타제)	EP1006189	AX136925
luxR	전사 조절제 LuxR (전사 조절제 LuxR)	WO0100842 EP1108790	AX065953 AX123320
luxS	히스티딘 키나제 LuxS (히스티딘 키나제 LuxS)	EP1108790	AX123323 AX127153
lysR1	전사 조절제 LysR1 (전사 조절제 LysR1)	EP1108790	AX064673 AX127144
lysR2	전사 활성화제 LysR2 (전사 조절제 LysR2)	EP1108790	AX123312
lysR3	전사 조절제 LysR3 (전사 조절제 LysR3)	WO0100842 EP1108790	AX065957 AX127150
mdh	말레이트 데하이드로게나제 EC 1.1.1.37 (말레이트 데하이드로게나제)	WO0100844	AX064895
menE	O-석시닐벤조산 CoA 리가제 EC 6.2.1.26 (O-석시닐벤조에이트 CoA 리가제)	WO0100843 EP1108790	AX064599 AX064193 AX127144
metA	호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 EC 2.3.1.31 (호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제)	Park et al., Molecular Cells 30;8(3):286-94 (1998) WO0100843 EP1108790	AX063895 AX127145
metD	전사 조절제 MetD (전사 조절제 MetD)	EP1108790	AX123327 AX127153

pck	포스포엔올 피루베이트 카복시키나제 (포스포엔올 피루베이트 카복시키나제)	WO0100844	AJ269506 AX065053
poxB	피루베이트 옥시다제 EC 1.2.3.3 (피루베이트 옥시다제)	WO0100844 EP1096013	AX064959 AX137665
sigB	RNA 폴리머라제 전사 인자 (RNA 폴리머라제 전사 인자)	EP1108790	AX127149
zwa2	세포 성장 인자 2 (성장 인자 2)	EP1106693 EP1108790	AX113822 AX127146

따라서 본 발명은

a) 임의로 발현 및/또는 조절 시그날을 포함하는 메티오닌 생산 또는 트레오닌 생산의 목적하는 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자를 분리하는 단계,

b) 메티오닌 생산 또는 트레오닌 생산의 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 뉴클레오티드 서열의 2개 이상의 복사체를 한 줄로, 바람직하게는 탠덤 배열로 배열하는 단계,

c) 단계 b)에 따라 수득한 뉴클레오티드 서열을 코리네형 세균에서 복제하지 않거나 오직 제한된 양만큼만 복제하는 벡터내로 통합하는 단계,

e) 본래 존재하는 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 단일 복사체 대신 특정한 목적하는 본 위치에서 목적한 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 2개 이상의 복사체를 지니며, 특정한 본 위치(좌)에 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하 게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없는, 코리네형 세균을 분리하는 단계, 및 임의로

f) 목적하는 메티오닌 생산 또는 트레오닌 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3의 복사체 1개 이상을 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없는, 추가의 유전자 위치에 도입하는 단계를 특징으로 하는, L-메티오닌 및/또는 L-트레오닌을 생산하는 코리네형 세균의 생산방법을 제공한다.

본 발명은 또한

a) 특정한 목적하는 위치(좌)에 자연적으로 존재하는 발린 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 단일 복사체 대신, 개방형 판독 프레임(ORF) 유전자 또는 대립형질유전자의 2개 이상의 복사체를, 바람직하게는 탠덤 배열로 갖고, 특정 위치에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없으며,

b) 임의로 추가의 유전자 위치에 발린 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3의 복사체를 하나 이상 갖고, 추가의 유전자 위치에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없음을 특징으로 하는, L-발린을 생산하는 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속을 제공한다.

본 발명은 또한 추가로

a) 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 발현이 가능한 조건하에

ⅰ) 특정한 목적하는 위치(좌)에 존재하는 발린 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 단일 복사체 대신, 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 2개 이상의 복사체를, 바람직하게는 탠덤 배열로 갖고, 특정한 위치에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없으며,

ⅱ) 임의로 추가의 유전자 위치에 목적하는 발린 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3의 복사체를 하나 이상 가지며, 추가의 유전자 위치에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없는 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속을 발효시키는 단계,

b) 발효 브로쓰에서 L-발린을 농축시키는 단계,

c) 발효 브로쓰로부터 L-발린을 분리하는 단계, 임의로

d) 발효 브로쓰 및/또는 바이오매스로부터의 구성물질이 0 초과 내지 100%인 정도로 수행되는 단계를 포함하는, L-발린의 생산방법을 제공한다.

"발린 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 복사체"는 증강/과발현이 발린 생산 개선의 효과를 가질 수 있는 모든, 바람직하게는 내인성, 개방형 판독 프레임, 유전자 또는 대립형질유전자를 의미하는 것으로 이해된다.

이들은 특히, 다음의 개방형 판독 프레임, 유전자 또는 대립형질유전자를 포함한다: brnE, brnF, brnEF, cstA, cysD, dps, eno, fda, gap, gap2, gdh, ilvB, ilvN, ilvBN, ilvC, ilvD, ilvE, msik, pgk, ptsH, ptsI, ptsM, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tpi 및 zwa1. 이들은 표 8에 요약 및 설명되어 있다. 이들은 특히 발린-내성을 암호화하는 아세토락테이트 신타제 ilvBN 대립형질유전자를 포함한다.

목적하는 발린 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3, 임의로 제4 또는 제5의 복사체 1개 이상이 추가의 위치에 통합될 수 있다. 특히, 다음의 개방형 판독 프레임, 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 이를 위하여 사용할 수 있다: aecD, ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, ddh, gluA, gluB, gluC, gluD, glyA, ilvA, luxR, lysR1, lysR2, lysR3, panB, panC, poxB 및 zwa2. 이들은 표 9에 설명 및 요약되어 있다. 염색체내의 유전자간 영역, 즉 암호화 기능이 없는 뉴클레오티드 서열을 추가로 사용할 수 있다. 최종적으로, 염색체에 포함된 프로파아지 또는 결손 파아지를 이를 위하여 사용할 수 있다.

발린 생산의 개방형 판독 프레임, 유전자 및 대립형질유전자

명칭	암호화된 효소 또는 단백질의 기술	참조 문헌	수탁 번호
brnEF	측쇄 아미노산의 이출 (측쇄 아미노산 이출)	EP1096010 Kennerknecht et al., NCBI	AF454053
cstA	탄소 결핍 단백질 A (탄소 결핍 단백질 A)	EP1108790 WO0100804	AX120811 AX066109
dps	DNA 보호 단백질 (결핍 단백질 동안의 보호)	EP1108790	AX127153
eno	엔올라제 EC 4.2.1.11 (엔올라제)	EP1108790 WO0100844 EP1090998 Hermann et al., Electrophoresis 19:3217-3221 (1998)	AX127146 AX064945 AX136862
fda	프럭토스 비스포스페이트 알돌라제 EC 4.1.2.13 (프럭토스 비스포스페이트 알돌라제)	van der Osten et al., Molecular Microbiology 3:1625-1637 (1989)	X17313
gap	글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제 EC 1.2.1.12 (글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제)	EP1108790 WO0100844 Eikmanns et al., Journal of Bacteriology 174:6076-6086(1992)	AX127148 AX064941 X59403
gap2	글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제 EC 1.2.1.12 (글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제 2)	EP1108790 WO0100844	AX127146 AX064939

gdh	글루타메이트 데하이드로게나제 EC 1.4.1.4 (글루타메이트 데하이드로게나제)	EP1108790 WO0100844 Boermann et al., Molecular Microbiology 6:317-326 (1992); Guyonvarch et al., NCBI	AX127150 AX063811 X59404 X72855
ilvBN	아세톨락테이트 신타제 EC 4.1.3.18 (아세톨락테이트 신타제)	Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175(17):5595-603 (1993) EP1108790	L09232 AX127147
ilvC	이소메로리덕타제 EC 1.1.1.86 (아세토하이드록시산 이소메로리덕타제)	Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175(17):5595-603 (1993) EP1108790	C48648 AX127147
ilvD	디하이드록시산 데하이드라타제 EC 4.2.1.9 (디하이드록시산 데하이드라타제)	EP1006189	AX136925
ilvE	트랜스아미나제 B EC 2.6.1.42 (트랜스아미나제 B)	EP1108790	AX127150 AX122498
msiK	당 이입체 (다중 당 이입 단백질)	EP1108790	AX120892
pgk	포스포글리서레이트 키나제 EC 2.7.2.3 (포스포글리서레이트 키나제)	EP1108790 WO0100844 Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	AX121838 AX127148 AX064943 X59403
ptsH	포스포트랜스퍼라제 시스템 단백질 H EC 2.7.1.69 (포스포트랜스퍼라제 시스템 성분 H)	EP1108790 WO0100844	AX122210 AX127149 AX069154
ptsI	포스포트랜스퍼라제 시스템 효소 I EC 2.7.3.9 (포스포트랜스퍼라제 시스템 효소 I)	EP1108790	AX122206 AX127149
ptsM	글루코스-특이적 포스포트랜스퍼라제 시스템 효소 II EC 2.7.1.69 (글루코스 포스포트랜스퍼라제-시스템 효소 II)	Lee et al., FEMS Microbiology Letters 119 (1-2):137-145 (1994)	L18874
sigC	시그마 인자 C EC 2.7.7.6 (세포질외 기능 대안적 시그마 인자 C)	EP1108790	AX120368 AX120085

sigD	RNA 폴리머라제 시그마 인자 D EC 2.7.7.6 (RNA 폴리머라제 시그마 인자)	EP1108790	AX120753 AX127144
sigE	시그마 인자 E EC 2.7.7.6 (세포질외 기능 대안적 시그마 인자 E)	EP1108790	AX127146 AX121325
sigH	시그마 인자 H EC 2.7.7.6 (시그마 인자 SigH)	EP1108790	AX127145 AX120939
sigM	시그마 인자 M EC 2.7.7.6 (시그마 인자 SigM)	EP1108790	AX123500 AX127153
tpi	트리오스 포스페이트 이소머라제 EC 5.3.1.1 (트리오스 포스페이트 이소머라제)	Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992)	X59403
zwa1	세포 성장 인자 1 (성장 인자 1)	EP1111062	AX133781

발린 생산의 개방형 판독 프레임, 유전자 및 대립형질유전자의 통합을 위한 추가의 유전자 위치

유전자 명칭	암호화된 효소 또는 단백질의 기술	참조 문헌	수탁 번호
aecD	베타 C-S 리아제 EC 2.6.1.1 (베타 C-S 리아제)	Rossol et al., Journal of Bacteriology 174(9):2968-77 (1992)	M89931
ccpA1	이화산물 조절 단백질 (이화산물 조절 단백질 A1)	WO0100844 EP1108790	AX065267 AX127147
ccpA2	이화산물 조절 단백질 (이화산물 조절 단백질 A2)	WO0100844 EP1108790	AX065267 AX121594
citA	센서 키나제 CitA (센서 키나제 CitA)	EP1108790	AX120161
citB	전사 조절제 CitB (전사 조절제 CitB)	EP1108790	AX120163
citE	시트레이트 리아제 EC 4.1.3.6 (시트레이트 리아제)	WO0100844 EP1108790	AX065421 AX127146
ddh	디아미노피멜레이트 데하이드로게나제 EC 1.4.1.16 (디아미노피멜레이트 데하이드로게나제)	Ishino et al., Nucleic Acids Research 15: 3917 (1987) EP1108790	S07384 AX127152
gluA	글루타메이트 운송 ATP-결합 단백질 (글루타메이트 운송 ATP-결합 단백질)	Kronemeyer et al., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluB	글루타메이트-결합 단백질 (글루타메이트-결합 단백질)	Kronemeyer et al., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluC	글루타메이트 운송 퍼미아제 (글루타메이트 운송 시스템 퍼미아제)	Kronemeyer et al., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
gluD	글루타메이트 운송 퍼미아제 (글루타메이트 운송 시스템 퍼미아제)	Kronemeyer et al., Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995)	X81191
glyA	글리세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제 EC 2.1.2.1 (글리세린 하이드록시메틸트랜스퍼라제)	WO0100843	AX063861 AF327063
ilvA	트레오닌 데하이드라타제 EC 4.2.1.16 (트레오닌 데하이드라타제)	M kel et al., Journal of Bacteriology 174 (24), 8065-8072 (1992) EP1108790	A47044 L01508 AX127150

luxR	전사 조절제 LuxR (전사 조절제 LuxR)	WO0100842 EP1108790	AX065953 AX123320
lysR1	전사 조절제 LysR1 (전사 조절제 LysR1)	EP1108790	AX064673 AX127144
lysR2	전사 활성화제 LysR2 (전사 조절제 LysR2)	EP1108790	AX123312
lysR3	전사 조절제 LysR3 (전사 조절제 LysR3)	WO0100842 EP1108790	AX065957 AX127150
panB	케토판토에이트 하이드록시메틸트랜스퍼라제 EC 2. 1. 2. 11 (케토판토에이트 하이드록시메틸트랜스퍼라제)	US6177264	X96580
panC	판토테네이트 신테타제 EC 6.3.2.1 (판토테네이트 신테타제)	US6177264	X96580
poxB	피루베이트 옥시다제 EC 1.2.3.3 (피루베이트 옥시다제)	WO0100844 EP1096013	AX064959 AX137665
zwa2	세포 성장 인자 2 (성장 인자 2)	EP1106693 EP1108790	AX113822 AX127146

따라서 본 발명은 또한

b) 발린 생산의 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 뉴클레오티드 서열의 2개 이상의 복사체를 한 줄로, 바람직하게는 탠덤 배열로 배열하는 단계,

c) 단계 b)에 따라 수득한 뉴클레오티드 서열을 코리네형 세균에서 복제하지 않거나 오직 제한된 양만큼만 복제하는 벡터로 통합시키는 단계,

e) 본래 존재하는 ORF, 유전자 및 대립형질유전자의 단일 복사체 대신 특정의 목적하는 본 위치에서 목적한 ORF, 유전자 또는 대립형질유전자의 2개 이상의 복사체를 지니며, 특정의 본 위치(좌)에 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없는, 코리네형 세균을 분리하는 단계, 및 임의로

f) 목적하는 발린 생산의 개방형 판독 프레임(ORF), 유전자 또는 대립형질유전자의 제3의 복사체 하나 이상을 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없는 추가의 유전자 위치에 도입하는 단계를 특징으로 하는, L-발린을 생산하는 코리네형 세균의 생산방법을 제공한다.

본 발명을 수행하는 동안, lysC^FBR 대립형질유전자의, 일렬로 배열된 2개의 복사체를 lysC 유전자 위치에는 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없는 코리네박테리움 글루타미쿰의 lysC 유전자 위치에 통합시키는 것이 가능하다. 이러한 균주는 예를 들어, 균주 DSM13992lysC^FBR::lysC^FBR이다.

lysC^FBR대립형질유전자의 2개의 복사체가 코리네박테리움 글루타미쿰의 lysC 유전자 위치로 통합될 수 있도록 돕는 플라스미드 pK18mobsacB2xlysCSma2/1을 도 1에 나타내었다.

본 발명을 수행하는 동안, 추가로 lysE 유전자 위치에 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없는 코리네박테리움 글루타미쿰의 lysE 유전자 위치에 lysE 유전자의, 일렬로 배열된 2개의 복사체를 통합시키는 것이 가능하다. 이러한 균주는 예를 들어, 균주 ATCC21513_17lysE::lysE이다.

lysE 유전자의 2개의 복사체라 코리네박테리움 글루타미쿰의 lysE 유전자 위치로 통합될 수 있도록 돕는 플라스미드를 도 2에 나타내었다. 이것은 명칭 pK18mobsacB2xlysESma1/1을 가진다.

최종적으로, 본 발명을 수행하는 동안, zwa1 유전자 위치에 미생물내에서 에피좀 상태로 복제를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 전위를 할 수 있는/가능하게 하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없고, 항생제에 대한 내성을 부여하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 없는 코리네박테리움 글루타미쿰의 zwa1 유전자 위치에서 zwa1 유전자의, 일렬로 배열된 2개의 복사체를 통합시키는 것이 가능하다. 이러한 균주는 예를 들어, 균주 ATCC21513_17zwa1::zwa1이다.

zwa1 유전자의 2개의 복사체가 코리네박테리움 글루타미쿰의 zwa1 유전자 위치로 통합될 수 있게 돕는 플라스미드를 도 3에 나타내었다. 이것은 명칭 pK18mobsacBzwa1zwa1을 가진다.

화학적 화합물을 생성하기 위하여, 본 발명에 따라 생산된 코리네형 세균을 배취 공정(배취 배양), 또는 유가 배양(유가 공정)이나 반복적 유가 공정(반복 공급 공정)으로 연속적 또는 불연속적으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법의 개요가 교과서[참조: Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 또는 교과서[참조: Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에 기술되어 있다.

사용되는 배양 배지는 적합한 방식으로 특정 균주의 요구를 충족시켜야 한다. 각종 미생물에 대한 배양 배지에 관한 내용은 문헌[참조: "Manual of Methods for General Bacteriology" The American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 기재되어 있다.

당류와 탄수화물(예: 글루코스, 수크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분 및 셀룰로스), 오일 및 유지(예: 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코낫유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올), 및 유기산(예: 아세트산 또는 락트산)이 탄소원으로서 사용될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

질소를 함유하는 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침적액, 대두분 및 요소), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)이 질소원으로서 사용될 수 있다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

인산, 이수소인산칼륨, 수소인산이칼륨, 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 인 공급원으로서 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속 염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 포함해야 한다. 최종적으로, 필수 성장 물질, 예를 들면, 아미노산 및 비타민이 위에서 언급된 물질에 추가하여 사용될 수 있다. 게다가, 적절한 전구체가 배양 배지에 가해질 수 있다. 언급된 출발 물질은 상기 배지에 단일 배취 형태로 가해지거나, 또는 배양 중에 적당한 방식으로 공급될 수 있다.

배지의 pH를 조절하기 위하여, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수), 또는 산 화합물(예: 인산 또는 황산)을 적절하게 사용할 수 있다. 소포제, 예를 들면, 지방산 폴리글리콜 에스테르를 사용하여 발포 형성을 조절할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위하여, 선택적으로 작용하는 적합한 물질, 예를 들면 항생제를 배지에 가할 수 있다. 호기성 상태를 유지하기 위하여, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물(예: 공기)를 배지에 유입할 수 있다. 배지의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 목적하는 화학적 화합물이 최대로 생성될 때까지, 배양을 계속한다. 이러한 목표는 통상적으로 10시간 내지 160시간내에 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 코리네형 세균, 특히 L-리신을 생산하는 코리네형 세균이 예기치 않게도 고도의 안정성을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 이들은 10 내지 20회, 20 내지 30회, 30 내지 40회, 40 내지 50회 이상, 바람직하게는 50 내지 60회, 60 내지 70회, 70 내지 80회 및 80 내지 90회 이상의 세대 또는 세포 분열 주기 동안 안정하였다.

다음의 미생물이 기탁되었다:

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM13992lysC^FBR::lysC^FBR이 부다페스트 조약에 따라 국제기탁기관[Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 수탁 번호 제DSM15036호하에 2002년 6월 5일에 순수 배양액의 형태로 기탁되었다.

플라스미드 pK18mobsacB2xlysCSma2/1는 부다페스트 조약에 따라 국제기탁기관 [Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 수탁 번호 제DSM14244호하에 2001년 4월 20일에 이. 콜라이 DH5αmcr/pK18mobsacB2xlysCSma2/1 (= DH5alphamcr/pK18mobsacB2xlysCSma2/1)의 순수 배양액의 형태로 기탁되었다.

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC21513_17lysE::lysE는 부다페스트 조약에 따라 국제기탁기관[Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 수탁 번호 제DSM15037호하에 2002년 6월 5일에 순수 배양액의 형태로 기탁되었다.

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC21513_17zwa1::zwa1은 부다페스트 조약에 따라 국제기탁기관[Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 수탁 번호 제DSM15038호하에 2002년 6월 5일에 순수 배양액의 형태로 기탁되었다.

실시예 1

코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체상에서 lysC^FBR 대립형질유전자 lysC T311I의 탠덤 중복의 생성

1. 1. 탠덤 벡터 pK18mobsacB2xlysCSma2/1의 작제

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM13994로부터, 염색체 DNA를 통상적인 방법으로 분리한다(Eikmanns et al., Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)).

균주 DSM13994를 씨. 글루타미쿰 ATCC13032로부터 다중의, 간접적 돌연변이유발방법, 선택법 및 돌연변이 선별법으로 생산한다. 균주는 리신 유사체 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 내성을 가지며 리신 및 트레오닌(각각 25mM)의 혼합물에 의한 억제에 비민감성인 피드백 내성 아스파르테이트 키나제를 갖는다. lysC^FBR 대립형질유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3으로 나타내었다. 이는 또한 다음에서 lysC T311I로 칭한다. 암호화된 아스파르테이트 키나제 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 4로 나타내었다. 이 균주의 순수 배양액은 부다페스트 조약에 따라 국제기탁기관[Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 2001년 1월 16일에 기탁되었다.

폴리머라제 연쇄반응으로, lysC 유전자 또는 대립형질유전자를 보유하는 DNA 부분을 증폭시킨다. 씨. 글루타미쿰에 대해 공지된 lysC 유전자의 서열에 기초하여[참조: Kalinowski et al., Molecular Microbiology, 5(5), 1197-1204(1991); 수탁 번호 제X57226호], 다음의 프라이머 올리고뉴클레오티드를 PCR을 위해 선택한다:

lysC1beg (서열번호 15):

5' TA(G GAT CC)T CCG GTG TCT GAC CAC GGT G 3'

lysC2end: (서열번호 16):

5' AC(G GAT CC)G CTG GGA AAT TGC GCT CTT CC 3'

제시된 프라이머를, MWG 바이오테크(Biotech)에 의해 합성하고, PCR 반응을 문헌[참조: Innis et al., PCR protocol. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press]의 표준 PCR 방법에 의해 수행하였다. 당해 프라이머를 사용하여, lysC 유전자 또는 대립형질유전자를 보유하는 약 1.7kb길이의 DNA 절편을 증폭시킬 수 있다. 또한, 당해 프라이머는 제한 엔도뉴클리아제 BamHI의 절단 영역(이는 위에서 제시된 뉴클레오티드 서열에서 괄호로 표시된다)의 서열을 함유한다.

균주 DSM13994의 lysC^FBR 대립형질유전자 lysC T311I를 보유하는 약 1.7kb 길이의 증폭된 DNA 단편을 0.8% 아가로즈 겔에서의 전기영동에 의해 식별하고, 겔로 부터 분리하여, 통상의 방법(QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden)에 의해 정제한다.

이어서, 당해 단편을 Topo TA 클로닝 키트(Invitrogen, Leek, The Netherlands, Cat. Number K4600-01)을 사용하여 벡터 pCRII-TOPO내에 연결시킨다. 당해 연결 배취를 이. 콜라이 균주 TOP10(Invitrogen, Leek, The Netherlands)에 형질전환시킨다. X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-갈락토피라노사이드, 64　mg/l)와 함께 카나마이신(50 mg/l)-함유하는 LB 아가상에 형질전환 배취를 플레이팅하여, 플라스미드-보유 세포를 선별한다.

DNA의 분리 후, 수득된 플라스미드를 제한 절단으로 확인하고, 아가로스 겔에서 동정한다. 생성된 플라스미드는 pCRIITOPOlysC로 호칭된다.

증폭된 DNA 단편 또는 PCR 산물의 뉴클레오티드 서열을, PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Germany)의 "ABI Prism 377" 서열분석 장치를 사용하여 디데옥시 쇄 종결법[참조 문헌: Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 74:5463-5467 (1977)]으로 결정한다. PCR 산물의 암호화 영역의 서열은 서열번호 3에 제시된다. 관련 아스파르테이트 키나제 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 4에 제시된다.

염기 티민이 균주 DSM13994의 lysC^FBR 대립형질유전자의 암호화 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 3)의 위치 932에서 발견된다. 염기 시토신은 야생형 유전자(서열번호 1)의 상응하는 위치에서 발견된다.

아미노산 이소루이신은 균주 DSM13994의 아스파르테이트 키나제 단백질의 아미노산 서열(서열번호 4)의 위치 311에서 발견된다. 아미노산 트레오닌은 야생형 단백질(서열번호 2)의 상응하는 위치에서 발견된다.

암호화 영역의 위치 932에 염기 티민을 함유하므로, 이에 따라 아미노산 서열의 위치 311에 아미노산 이소루이신을 함유하는 아스파르테이트 키나제 단백질을 암호화하는 lysC 대립형질 유전자는 이후 lysC^FBR 대립형질유전자 또는 lysC T311I로 호칭된다.

lysC^FBR 대립형질유전자 lysC T311I을 보유하는 플라스미드 pCRIITOPOlysC는 부타페스트 조약에 따라 국제기탁국제기탁기관[Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 2001년 4월 20일에 수탁 번호 제DSM14242호하에 균주 이.콜라이 TOP 10/pCRIITOPOlysC의 순수한 배양물의 형태로 기탁되었다.

플라스미드 DNA 를 플라스미드 pCRIITOPOlysC를 보유하는 균주 DCM14242로부터 분리하고, 제한 효소 BamHI(Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 절단하고, 아가로스 겔에서 분류한 후 대략 1.7 kb 길이의 lysC^FBR-포함 DNA 단편을 퀴아퀵크 겔 익스트랙션 키트(QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany))을 이용하여 아가로스 겔로부터 분리하고, 돌출말단을 클레노우(Klenow) 폴리머라제 (Boehringer Mannheim)로 완성하고 문헌[참조: Schafer et al., Gene, 14, 69-73 (1994)]에 기술된 이동성 클로닝 벡터 pK18mobsacB과 함께 연결에 사용한다. 이를 제한효소 SmaI으로 미리 절단하고 알칼라인 포스파타제(Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim)로 탈인산화하고, 대략 1.7kb의 lysC^FBR-포함 DNA 단편과 혼합하여 혼합물을 T4 DNA 리가제(Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 처리한다.

이어서 이. 콜라이 균주 DH5α(Grant et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)를 연결 배취와 함께 형질전환시킨다[참조: Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach, Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New york, 1989]. 플라스미드-보유 세포의 선별은 카나마이 신 25 mg/l을 첨가한, LB 아가위에서 형질전환 배취를 플레이팅함으로써 수행한다 [참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual. 2^ndEd., Cold Spring Harbor, New York, 1989].

플라스미드 DNA를 퀴아겐(Qiagen)의 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit)를 사용하여 형질전환체로부터 분리하고 효소 HindⅢ를 사용한 제한 절단 및 연속한 아가로스 겔 전기 영동으로 확인한다. 본 플라스미드는 pK18mobsacB1xlysCSma2로 호칭된다.

제2 단계에서, 플라스미드 pCRII-TOPOlysC를 차례로 제한효소 BamHI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)으로 절단하고, 아가로스 겔(0.8%)에서 분류한 후 대략 1.7kb의 lysC^FBR-포함 단편을 퀴아퀵크 겔 익스트랙션 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 아가로스 겔로부터 분리하고 본 실시예에 기술한 pK18mobsacB1xlysCSma2 벡터와 함께 연결에 사용한다. 이를 제한효소 BamHI으로 미리 절단하고 알칼라인 포스파타제(Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim)로 탈인산화하고, 대략 1.7kb의 lysC^FBR-포함 DNA 단편과 혼합하여 혼합물을 T4 DNA 리가제(Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 처리한다.

이어서 이. 콜라이 균주 DH5α[참조: Grant et al.; Proceedings of the National Acaedmy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649]를 연결 배취로 형질전환시킨다[참조: Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach, Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]. 플라스미드-보유 세포의 선별은 카나마이신 25 mg/l을 첨가한, LB 아가상에 형질전환 배취를 플레이팅함으로써 수행한다 [참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual. 2^ndEd., Cold Spring Harbor, New York, 1989].

플라스미드 DNA를 퀴아겐(Qiagen)의 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit)를 사용하여 형질전환체로부터 분리하고 효소 HindⅢ를 사용한 제한 절단 및 연속한 아가로스 겔 전기 영동으로 확인한다. 본 플라스미드는 pK18mobsacB2xlysCSma2/1으로 호칭된다. 본 플라스미드의 지도는 도 1에 나타내었다.

플라스미드 pK18mobsacB2xlysCSma2/1은 부다페스트 조약에 따라 국제기탁기관 [Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 수탁 번호 제DSM14244호하에 2001년 4월 20일에 균주 이. 콜라이 DH5αmcr/pK18mobsacB2xlysCSma2/1 (= DH5alphamcr/pK18mobsacB2xlysCSma2/1)의 순수 배양액의 형태로 기탁되었다.

1. 2. 씨. 글루타미쿰 균주 DSM13992내의 lysC^FBR대립형질유전자 lysC T311I의 탠덤 중복의 생성

실시예 1. 1에 언급한 벡터 pK18mobsacB2xlysCSma2/1를 [참조: Schafer et al. (1990 Journal of Microbiology 172: 1663-1666)]의 변형된 프로토콜에 따라 씨. 글루타미쿰 균주 DSM13992로 전이시킨다.

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM13992를 다중의, 간접적 돌연변이유발법, 선택법 및 돌연변이 선별법에 의해 씨. 글루타미쿰 ATCC13032로부터 생산한다. 본 균주는 항생제 스트렙토마이신에 대해 내성을 가지며 표현형질적으로 리신 유사체 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대해 내성을 가진다. 그러나, 본 균주는 리신 및 트레오닌(각각 25mM)의 혼합물에 의한 억제에 민감한, 야생형 아스파르테이트 키나제(서열번호 1 및 서열번호 2 참조)를 갖는다. 본 균주의 순수 배양액은 부다페스트 조약에 따라 국제기탁기관[Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 2001년 1월 16일에 기탁되었다.

벡터 pK18mobsacB2xlysCSma2/1은 DSM13992내에서 독립적으로 복제할 수 없으며 오직 염색체내로 통합되었을 시에만 세포내에 잔존할 수 있다.

통합된 pK18mobsacB2xlysCSma2/1을 갖는 클론의 선별은 카나마이신 15 mg/l 및 날리딕스산 50 mg/l을 첨가한, LB 아가상에 접합 배취를 플레이팅함으로써 수행한다 [참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual. 2^ndEd., Cold Spring Harbor, New York, 1989]. 성장한 클론을 카나마이신 25 mg/l과 함께 LB 아가 위에 플레이팅하고 33℃에서 16시간 동안 배양한다. lysC유전자의 단 하나의 복사체를 갖는 플라스미드를 제거하기 위하여, LB 액체 배지에서 16시간 동안 배양한 후 클론을 10% 수크로스를 갖는 LB 아가위에 배양시킨다. 플라스미드 pK18mobsacB는 수크로스를 씨. 글루타미쿰에 유해한 레반 수크라제로 전환시키는 sacB 유전자의 복사체를 포함한다.

그러므로 오직 통합된 pK18mobsacB2xlysCSma2/1이 제거된 클론만 수크로스를 갖는 LB 아가위에서 성장한다. 대략 40 내지 50개의 콜로니를 표현형질 "수크로스의 존재시 성장" 및 "카나마이신의 존재시 비성장"에 대해 검사했다. 제거하는 동안, lysC 유전자의 2개의 복사체 또는 오직 1개의 복사체가 플라스미드와 함께 제거될 수 있다.

lysC의 2개의 복사체가 염색체내에 잔존한다는 것을 증명하기 위해, 표현형질 "수크로스의 존재시 성장" 및 "카나마이신의 존재시 비성장"을 나타내는 대략 20개의 콜로니를 문헌[참조: Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)]의 표준 PCR 방법에 의한 폴리머라제 연쇄반응을 사용하여 조사한다. lysC 유전자를 보유하는 DNA 절편 및 주변 영역를 콜로니의 염색체 DNA로부터 증폭시킨다. 다음의 프라이머 올리고뉴클레오티드를 PCR을 위해 선택한다.

lysCK1 (서열번호 5):

5' TCG GTG TCA TCA GAG CAT TG 3'

lysCK2 (서열번호 6):

5' TCG GTT GCC TGA GTA ATG TC 3'

프라이머는 본래 lysC 좌를 갖는 대조 클론내의 크기에서 대략 1.9 kb의 DNA 단편의 증폭을 허락한다. lysC 좌에서 염색체상의 lysC 유전자의 제2 복사체를 갖는 클론에서, 대략 3.6 kb의 크기를 갖는 DNA 단편을 증폭시킨다.

증폭된 DNA 단편은 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동의 방법으로 동정한다. 증폭된 단편 길이에 기초하여, 1개의 염색체 lysC 유전자 복사체를 갖는 클론과 2 개의 염색체 lysC 유전자 복사체를 갖는 클론을 구별한다.

염색체상의 lysC 유전자의 2개의 완벽한 복사체를 갖는 10개의 클론을 2개의 복사체가 돌연변이 lysC T311I를 갖는 lysC^FBR 대립형질유전자인지 아닌지 또는 본래의 야생형 lysC가 lysC^FBR 대립형질유전자 lysC T311I와 함께 존재하는지 아닌지를 증명하기 위하여 로체 디아그노스틱스의 라이트사이클러(LightCycler of Roche Diagnostics (Mannheim, Germany))를 사용하여 조사한다. 라이트사이클러는 유전자증폭기 및 형광광도계의 합한 장치이다.

돌연변이 위치를 포함하는 대략 500bp 길이의 DNA 부분을 다음의 프라이머 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR[참조: Innis et al., PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press]로 제1 단계에서 증폭시킨다.

LC-lysC1-fbr (서열번호 7):

5' aaccgttctgggtatttccg 3'

LC-lysC2-fbr (서열번호 8):

5' tccatgaactctgcggtaac 3'

제2 단계에서, 돌연변이 위치의 영역에 부합화한, 상이한 길이의 2개의 추가의 올리고뉴클레오티드 및 상이한 형광 염료로 표지하고, 돌연변이의 존재를 융점 곡선 분석을 사용한 "형광공명에너지전이" 방법(Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET))으로 검출한다 [참조: Lay et al., Clinical Chemistry, 43 : 2262-2267 (1997)].

lysC311-C (서열번호 9):

5' LC-Red640 - gcaggtgaagatgatgtcggt - (P) 3'

lysC311-A (서열번호 10):

5' tcaagatctccatcgcgcggcggccgtcggaacga - 플루오레세인 3'

나타낸 프라이머는 MWG 바이오테크(Biotech)에 의해 PCR용으로 합성되었고 부합화를 위해 나타낸 올리고뉴클레오티드는 팁 몰비올(TIB MOLBIOL, 독일 베를린 소재)에 의해 합성된다.

그러므로 2개의 lysC 복사체의 암호화 영역의 위치 932에 염기 티민을 포함하고 2개의 lysC^FBR 대립형질유전자 lysC T311I를 갖는 클론을 이러한 방법으로 동정한다.

본 균주를 씨. 글루타미쿰 DSM13992lysC^FBR::lysC^FBR이라 호칭한다.

본 균주는 부다페스트 조약에 따라 국제기탁기관 [Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 수탁 번호 제DSM15036호하에 씨. 글루타미쿰 DSM13992lysC^FBR::lysC^FBR2002년 6월 5일에 기탁되었다.

실시예 2

코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체내의 lysE 유전자의 탠덤 중복의 생성

2. 1. 탠덤 벡터 pK18mobsacB2xlysESma1/1의 작제

플라스미드 DNA를 플라스미드 pEC7lysE를 보유하는 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주 DSM12871 (EP-A-1067193)로부터 분리한다.

당해 플라스미드는 리신 방출을 암호화하는 lysE 유전자를 포함한다. 당해 균주의 순수 배양액은 부다페스트 조약에 따라 국제기탁기관 [Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 1999년 6월 10일에 기탁되었다.

플라스미드 pEC71lysE를 제한효소 BamHI(Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 절단하고, 아가로스 겔(0.8%)에서 분류한 후 대략 1.1kb의 lysE 단편을 퀴아퀵크 겔 익스트랙션 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 아가로스 겔로부터 분리하고, 돌출 말단은 클레노우 폴리머라제(Boehringer Mannheim)로 완성하고 문헌[참조: Schafer et al., Gene, 14, 69-73 (1994)]에 기술한 이동성 클로닝 벡터 pK18mobsacB와 함께 연결에 사용한다. 이것을 제한효소 SmaI으로 미리 절단하고 알칼라인 포스파타제(Alkaline Phophatase, Boehringer Mannheim)으로 탈인산화하고, 대략 1.1kb의 lysE 단편과 혼합하여 혼합물을 T4 DNA 리가제(Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 처리한다.

이어서 이. 콜라이 균주 DH5α[참조: Grant et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649]를 연결 배취로 형질전환시킨다 [참조: Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]. 플라스미드-보유 세포의 선별은 형질전환 배취를 카나마이신 25 mg/l을 첨가한 LB 아가 위에 플레이팅함으로써 수행 한다 [참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989].

플라스미드 DNA를 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit)를 사용하여 형질전환체로부터 분리하고 효소 BamHI 및 EcoRI을 사용한 제한 절단 및 연속한 아가로스 겔 전기 영동으로 확인한다. 본 플라스미드는 pK18mobsacB1xlysESma1으로 호칭된다.

제2 단계에서, 플라스미드 pEC7lysE를 차례로 제한효소 BamHI (Amercham-Pharmacia, Freibufg, Germany)로 절단하고, 아가로스 겔(0.8%)에서 분류한 후 대략 1.1kb의 lysE 단편을 퀴아퀵크 겔 익스트랙션 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 아가로스 겔로부터 분리하고 본 실시예에 기술한 벡터 pK18mobsacB1xlysESma1과 함께 연결에 사용한다. 이를 제한효소 BamHI으로 미리 절단하고 알칼라인 포스파타제(Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim)로 탈인산화시키며, 대략 1.1kb의 lysE 단편과 혼합하고 혼합물은 T4 DNA 리가제(Amercham-Pharmacia, Freibufg, Germany)로 처리한다.

플라스미드 DNA를 퀴아젠의 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit)를 사용하여 형질전환체로부터 분리하고 효소 EcoRI 및 SalI 또는 ScaI을 사용한 제한 절단 및 연속한 아가로스 겔 전기 영동으로 확인한다. 본 플라스미드는 pK18mobsacB2xlysESma1/1으로 호칭된다. 본 플라스미드의 지도는 도 2에 나타내었다.

2. 2. 씨. 글루타미쿰 균주 ATCC21513_17내의 lysE 유전자의 탠덤 중복의 생성

실시예 2. 1에 언급한 벡터 pK18mobsacB2xlysESma1/1을 [참조: Schafer et al. (1990 Journal of Microbiology 172: 1663-1666)]의 변형된 프로토콜에 의해 씨. 글루타미쿰 균주 ATCC21513_17로 전이시킨다.

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC21513_17을 다중의, 간접적 돌연변이유발방법, 선택법 및 돌연변이 선별법으로 씨, 글루타미쿰 ATCC21513으로부터 생산한다. 당해 균주는 리신 유사체 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대해 내성을 가지며 루이신 및 호모세린에 대해 자가영양성이다.

당해 벡터는 ATCC21513_17에서 독립적으로 복제할 수 없으며 염색체내로 통합되었을 시에만 세포내에 잔존한다.

통합된 pK18mobsacB2xlysESma1/1을 갖는 클론의 선별은 카나마이신 15mg/l 및 날리딕스산 50mg/l을 첨가한 LB 아가위에 접합 배취를 플레이팅함으로써 수행한다 [참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989]. 성장한 클론을 카나마이신 25 mg/l과 함께 LB 아가 플레이트 위에 플레이팅하고 33℃에서 16시간동안 항온처리한다. lysE 유전자의 단 1개의 복사체를 갖는 플라스미드를 제거하기 위하여, 클론을 LB 액체 배지에서 16시간 동안 항온처리한 후, 10% 수크로스를 갖는 LB 아가위에서 배양한다. 플라스미드 pK18mobsacB는 수크로스를 씨. 글루타미쿰에 유해한 레반 수크라제로 전환시키는 sacB 유전자를 포함한다.

그러므로 통합된 pK18mobsacB2xlysESma1/1이 다시 제거된 클론만이 수크로스를 갖는 LB 아가위에서 성장할 수 있다. 대략 40 내지 50개의 콜로니를 표현형질 "수크로스의 존재시 성장" 및 "카나마이신의 존재시 비성장"에 대하여 시험하였다. 제거하는 동안, lysE 유전자의 2개의 복사체 또는 단 1개가 플라스미드와 함께 제거된다.

lysE의 2개의 복사체가 염색체내에 잔존한다는 것을 증명하기 위해, 표현형질 "수크로스의 존재시 성장" 및 "카나마이신의 존재시 비성장"을 나타내는 대략 20개의 콜로니를 [참조: Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, 1990, Academic Press)]의 표준 PCR 방법에 의한 폴리머라제 연쇄반응을 이용하여 조사한다. lysE 유전자를 보유하는 DNA 단편 및 주위 영역을 콜로니의 염색체 DNA로부터 증폭시킨다. 다음의 프라이머 올리고뉴클레오티드를 PCR을 위하여 선택한다.

lysEK-1 (서열번호 11):

5' TGC TTG CAC AAG GAC TTC AC 3'

lysEK-2 (서열번호 12):

5' TAT GGT CCG CAA GCT CAA TG 3'

당해 프라이머는 본래의 lysE 좌를 갖는 대조군 클론내에서 대략 1.2 kb의 DNA 단편을 증폭시킨다. lysE 좌에서 염색체의 lysC 유전자의 제2 복사체를 갖는 클론내에서, 대략 2.3 kb의 크기를 갖는 DNA 단편을 증폭시킨다.

증폭된 DNA 단편을 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동으로 동정한다. 증폭된 단편 길이에 근거하여, 1개의 염색체 lysE 유전자 복사체를 갖는 클론과 2개의 염색체 lysE 유전자 복사체를 갖는 클론을 구별한다. 이로써 균주 ATCC21513_17이 염색체상에 lysE 유전자의 2개의 완전한 복사체를 보유한다는 것이 증명된다.

당해 균주를 씨. 글루타미쿰 ATCC21513_17lysE::lysE로 호칭한다.

당해 균주는 부다페스트 조약에 따라 국제기탁기관 [Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 수탁 번호 제DSM15037호하에 2002년 6월 5일에 씨. 글루타미쿰 ATCC21513_17lysE::lysE로 기탁되었다.

실시예 3

코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체내의 zwa1 유전자의 탠덤 중복의 생성

3. 1. 탠덤 벡터 pK18mobsacBzwa1zwa1의 작제

플라스미드 DNA를 플라스미드 pCR2.1zwa1exp를 보유하는 에쉐리키아 콜라이 균주 DSM13115 (EP-A-1111062)로부터 분리한다. 당해 플라스미드는 세포 성장 인자 1을 암호화하는 zwa1 유전자를 포함한다. 이 균주의 순수한 배양액은 부다페스트 조약에 따라 국제기탁기관 [Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 1999년 10월 19일자로 기탁되었다.

플라스미드 pCR2.1zwa1exp를 제한 효소 EcoRI (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 절단하고, 아가로스 겔 (0.8%)에서 분류한 후 1kb의 zwa1 단편을 퀴아퀵크 겔 익스트랙션 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 아가로스 겔로부터 분리하고 문헌[참조: Schafer et al., Gene, 14, 69-73 (1994)]에 기술된 이동성 클로닝 벡터 pK18mobsacB와 함께 연결한다. 이를 제한 효소 EcoRI으로 미리 절단하고 알칼라인 포스파타제(Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim)으로 탈인산화시키고, 1kb의 zwa1 단편과 혼합시켜 혼합물을 T4 DNA 리가제(Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 처리한다.

이어서 이. 콜라이 균주 DH5α(Grant et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)를 연결 배취 (Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)로 형질전환시킨다. 플라스미드-보유 세포의 선별은 형질전환 배취를 카나마이신 25mg/l를 첨가한 LB 아가 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York. 1989)위에 플레이팅함으로서 수행한다.

플라스미드 DNA를 퀴아젠의 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트를 사용하여 형질전환체로부터 분리하고 효소 NheI을 사용한 제한 절단 및 연속한 아가로스 겔 전기 영동으로 확인한다. 플라스미드의 확인은 2개의 zwa1 단편이 클로닝 벡터 pK18mobsac내에 동시에 목적하는 방향으로 클론화되었음을 나타낸다. 당해 플라스미드를 pK18mobsacBzwa1zwa1으로 호칭한다. 플라스미드의 지도는 도 3에 나타내었다.

3. 2. 씨. 글루타미쿰 균주 ATCC21513_17내의 zwa1 유전자의 탠덤 중복의 생성

실시예 3. 1에 언급한 벡터 pk18mobsacBzwa1zwa1을 문헌[참조: Schafer et al. (1990 Journal of Microbiology 172: 1663-1666)]의 변형된 프로토콜에 의해 씨. 글루타미쿰 균주 ATCC21513_17로 전이시킨다.

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC21513_17을 다중의, 간접적 돌연변이유발법, 선택법 및 돌연변이 선별법으로 씨. 글루타미쿰 ATCC21513으로부터 생산한다. 당해 균주는 리신 유사체 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 내성을 가지며 루이신 및 호모세린에 대하여 자가영양성을 갖는다.

당해 벡터는 ATCC21513_17내에서 독립적으로 복제할 수 없고 오직 염색체내로 통합되었을 시에만 세포내에 잔존한다.

통합된 pK18mobsacBzwa1zwa1을 갖는 클론의 선별은 접합 배취를 카나마이신 15mg/l 및 날리딕스산 50mg/l을 첨가한 LB 아가[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989)]위에 플레이팅함으로써 수행한다. 성장한 클론을 카나마이신 25mg/l을 갖는 LB 아가위에 플레이팅하고 33℃에서 16시간동안 항온처리한다. zwa1 유전자의 단 1개의 복사체를 갖는 플라스미드를 제거하기 위하여, 클론을 LB 액체 배지에서 16시간 동안 항온처리한 후, 10% 수크로스를 갖는 LB 아가위에서 배양한다. 당해 플라스미드 pK18mobsacB는 수크로스를 씨. 글루타미쿰에 유해한 레반 수크라제로 전환시키는 sacB 유전자의 복사체를 포함한다.

그러므로 통합된 pK18mobsacBzwa1zwa1이 다시 제거된 클론만이 수크로스를 갖는 LB 아가위에서 성장할 수 있다. 대략 40 내지 50개의 콜로니를 표현형질 "수크로스의 존재시 성장" 및 "카나마이신의 존재시 비성장"에 대해 시험한다. 제거하는 동안, zwa1 유전자의 2개의 복사체 또는 단 1개의 복사체가 플라스미드와 함께 제거될 수 있다.

zwa1의 2개의 복사체가 염색체내에 잔존한다는 것을 증명하기 위해, 표현형질 "수크로스의 존재시 성장" 및 "카나마이신의 존재시 비성장"을 나타내는 대략 20개의 콜로니를 [참조: Innis et al. (PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)]의 표준 PCR 방법에 의한 폴리머라제 연쇄반응으로 조사한다. zwa1 유전자를 보유하는 DNA 단편 및 주위 영역을 콜로니의 염색체 DNA로부터 증폭시킨다. 다음의 프라이머 올리고뉴클레오티드를 PCR을 위해 선택한다.

zwa1-A2 (서열번호 13):

5' CAC TTG TCC TCA CCA CTT TC 3'

zwa1-E1 (서열번호 14):

5' TTC TAC TGG GCG TAC TTT CG 3'

당해 프라이머는 본래의 zwa1 좌를 갖는 대조군 클론내에서 대략 1.3kb의 DNA 단편을 증폭시킨다. zwa1 좌에서 염색체에 zwa1 유전자의 제2 복사체를 갖는 클론내에서, 대략 2.3 kb의 크기를 갖는 DNA 단편을 증폭시킨다.

증폭된 DNA 단편을 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동으로 동정한다. 증폭된 단편 길이에 근거하여, 1개의 염색체 zwa1 유전자 복사체를 갖는 클론과 2개의 염색체 zwa1 유전자 복사체를 갖는 클론을 구별한다. 이로써 균주 ATCC21513_17이 염색체상에 zwa1 유전자의 2개의 완전한 복사체를 보유한다는 것이 증명된다.

당해 균주를 씨. 글루타미쿰 ATCC21513_17zwa1::zwa1으로 호칭한다.

당해 균주는 부다페스트 조약에 따라 국제기탁기관 [Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 수탁 번호 제DSM15038호하에 2002년 6월 5일에 씨. 글루타미쿰 ATCC21513_17zwa1::zwa1으로 기탁되었다.

실시예 4

리신의 제조

실시예 1 내지 3에서 수득된 씨. 글루타미쿰 균주 DSM13992lysC^FBR::lysC^FBR, ATCC21513_17lysE::lysE 및 ATCC21513_17zwa1::zwa1을 L-리신 생산에 적합한 영양 배지에서 배양한 다음, 배양 상청액 중의 L-리신 함량을 측정하였다.

이를 위하여, 당해 배양물을 우선 아가 플레이트상에서 24시간 동안 33℃에서 항온처리하였다. 이러한 아가 플레이트 배양물로부터 출발하여, 예비배양물을 시딩하였다(100ml 원추형 플라스크당 10ml 배지). 배지 MM을 예비배양용 배지로서 사용한다. 당해 예비배양물을 진탕기에서 240rpm으로 24시간 동안 33℃에서 항온처리한다. 본배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1 OD가 되도록 상기 예비배양물로부터 본배양물을 시딩한다. 배지 MM을 또한 본배양에 사용한다.

배지 MM:

CSL 5g/ℓ

MOPS 20g/ℓ

글루코스(별도로 오토클레이빙시킴) 50g/ℓ

염:

(NH₄)₂SO₄25g/ℓ

KH₂PO₄0.1g/ℓ

MgSO₄ * 7H₂O 1.0g/ℓ

CaCl₂ * 2H₂O 10mg/ℓ

FeSO₄ * 7H₂O 10mg/ℓ

MnSO₄ * H₂O 5.0mg/ℓ

비오틴(멸균 여과) 0.3mg/ℓ

티아민 * HCl(멸균 여과) 0.2mg/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

CSL(옥수수 침지액), MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 및 염 용액을, 암모니아수를 사용하여 pH 7로 조정한 다음, 오토클레이빙시킨다. 이어서, 멸균 기질과 비타민 용액 뿐 아니라, 무수-상태로 오토클레이빙시킨 CaCO₃를 첨가한다.

배플이 장착된 100ml의 원추형 플라스크당 10ml 용량으로 배양을 수행한다. 33℃ 및 80% 대기 습도하에 배양을 수행한다.

48시간 후, Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용하여, 측정 파장 660nm에서 OD를 측정한다. 생성된 리신의 양을, 아미노산 분석기(제조원: Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Germany)를 사용하여, 이온 교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출을 이용한 컬럼 후(post-column) 유도체화에 의해 측정한다.

실험 결과는 표 10에 제시되어 있다.

균주	OD (660 nm)	리신 HCl g/l
DSM13992	12.8	18.9
DSM13992lysC^FBR::lysC^FBR	12.0	21.6
ATCC21513_17	10.4	14.0
ATCC21513_17lysE::lysE	10.0	14.3
ATCC21513_17zwa1::zwa1	9.9	14.6

기술된 염기쌍 수는 측정의 재현성의 관점에서 수득된 대략적인 값이다.

도 1은 플라스미드 pK18mobsacB2xlysCSma2/1의 지도이다.

사용된 약어 또는 기호는 아래의 의미를 갖는다:

KmR: 카나마이신 내성 유전자

HindIII: 제한 효소 HindIII의 절단 부위

BamHI: 제한 효소 BamHI의 절단 부위

lysC: lysC^FBR 대립형질유전자 lysC T311I

sacB: sacB 유전자

RP4mob: 전달용 복제원(oriT)을 가진 mob 영역

oriV: 복제원 V

도 2는 플라스미드 pK18mobsacB2xlysESma1/1의 지도이다.

사용된 약어 또는 기호는 아래의 의미를 갖는다:

KanR: 카나마이신 내성 유전자

SalI: 제한 효소 SalI의 절단 부위

BamHI: 제한 효소 BamHI의 절단 부위

EcoRI: 제한 효소 EcoRI의 절단 부위

ScaI: 제한 효소 ScaI의 절단 부위

lysE: lysE 유전자

sacB: sacB 유전자

RP4mob: 전달용 복제원(oriT)을 가진 mob 영역

oriV: 복제원 V

도 3은 플라스미스 pK18mobsacBzwa1zwa1의 지도이다.

사용된 약어 또는 기호는 아래의 의미를 갖는다:

KanR: 카나마이신 내성 유전자

EcoRI: 제한 효소 EcoRI의 절단 부위

NheI: 제한 효소 NheI의 절단 부위

zwa1: zwa1 유전자

sacB: sacB 유전자

RP4mob: 전달용 복제원(oriT)을 가진 mob 영역

oriV: 복제원 V

특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약

국 제 양 식

하기 국제 기탁기관에서 정한 규칙 7.1에 따라 발행된 원 기탁에 관한 수탁증

데구사 아게

독일 33790 할레(베슈트프) 칸트슈트라쎄 2

I.미생물의 동정
기탁자가 정한 동정 표시: DSM 13992lysCFBR::lysCFBR	국제기탁기관에 의한 수탁 번호 : DSM 15036
II. 과학적 성질 및/또는 분류학상의 위치
상기 I란의 미생물에는 하기의 사항을 기재한 문서가 첨부되어 있다. ( × ) 과학적 성질 ( × ) 분류학상의 위치 (해당되는 경우 ×로 표시)
III. 수령 및 수탁
본 국제기탁기관은 2002년 6월 5일(원기탁일)¹에 수령된 상기 I란의 미생물을 수탁한다.
IV. 전환 요구서의 수령
상기 I란의 미생물은 (원기탁일)에 본 국제기탁기관에 의해 수령되었고 원 기탁물의 부다페스트 조약하의 기탁물로의 전환 요구서는 본 기관에 의해 (전환요구서 수령일)에 수령되었다.
V. 국제기탁기관
명칭 : DSMZ-도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하 주소 : 독일 데-38124 브라운쉬바이크 마쉐로더 벡 1베	국제기탁기관을 대표하는 권한을 갖는 사람(들) 또는 증명관(들)의 서명(들) : 서 명 날짜 : 2002년 6월 6일

1. 규칙 6.4(d)가 적용되는 경우, 이 날짜는 국제기탁기관의 자격이 획득된 날짜이다.

양식 DSMZ : BP/4(단독 면) 12/2001

국 제 양 식

하기 국제 기탁기관에서 정한 규칙 10.2에 따라 발행된 생존 진술서

데구사 아게

독일 33790 할레(베슈트프) 칸트슈트라쎄 2

I. 기탁자	II. 미생물 동정
성명: 데구사 아게 주소: 독일 33790 할레(베슈트프) 칸트슈트라쎄 2	국제기탁 기관에 의한 수탁 번호: DSM 15036 기탁일 또는 이전일¹: 2002년 6월 5일
III. 생존 진술서
상기 II란의 미생물 생존성은 2002년 6월 5일자로 시험되었다.² 시험일에 이 미생물은 ( × )³ 생존가능한 상태. ( )³ 더 이상 생존불가능한 상태.
IV. 생존 시험시의 조건 ⁴

V. 국제기탁기관
명칭 : DSMZ-도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하 주소 : 독일 데-38124 브라운쉬바이크 마쉐로더 벡 1베	국제기탁기관을 대표하는 권한을 갖는 사람(들) 또는 증명관(들)의 서명(들) : 서 명 날짜 : 2002년 6월 6일

1.원 기탁일, 또는 신규기탁이나 이전이 이루어진 경우, 가장 최근일 (신규 기탁일 또는 이전일)을 가리킨다.

2. 규칙 10.2(a) (ii) 및 (iii)이 적용되는 경우, 가장 최근의 생존 시험을 의미한다.

3. 해당 칸에 크로스로 표시한다.

4. 정보가 요구되고 시험 결과가 음성인 경우 기입한다.

양식 DSMZ-BP/9(단독면) 12/2001

국 제 양 식

데구사 아게

독일 33790 할레(베슈트프) 칸트슈트라쎄 2

I. 기탁자	II. 미생물 동정
성명: 데구사 아게 주소: 독일 33790 할레(베슈트프) 칸트슈트라쎄 2	국제기탁 기관에 의한 수탁 번호: DSM 15037 기탁일 또는 이전일¹: 2002년 6월 5일
III. 생존 진술서
상기 II란의 미생물 생존성은 2002년 6월 5일자로 시험되었다.² 시험일에 이 미생물은 ( × )³ 생존가능한 상태. ( )³ 더 이상 생존불가능한 상태.
IV. 생존 시험시의 조건 ⁴

V. 국제기탁기관
명칭 : DSMZ-도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하 주소 : 독일 데-38124 브라운쉬바이크 마쉐로더 벡 1베	국제기탁기관을 대표하는 권한을 갖는 사람(들) 또는 증명관(들)의 서명(들) : 서 명 날짜 : 2002년 6월 6일

3. 해당 칸에 크로스로 표시한다.

4. 정보가 요구되고 시험 결과가 음성인 경우 기입한다.

양식 DSMZ-BP/9(단독면) 12/2001

국 제 양 식

데구사 아게

독일 33790 할레(베슈트프) 칸트슈트라쎄 2

I.미생물의 동정
기탁자가 정한 동정 표시: ATCC21513_17lysE::lysE	국제기탁기관에 의한 수탁 번호 : DSM 15037
II. 과학적 성질 및/또는 분류학상의 위치
상기 I란의 미생물에는 하기의 사항을 기재한 문서가 첨부되어 있다. ( × ) 과학적 성질 ( × ) 분류학상의 위치 (해당되는 경우 ×로 표시)
III. 수령 및 수탁
본 국제기탁기관은 2002년 6월 5일(원기탁일)¹에 수령된 상기 I란의 미생물을 수탁한다.
IV. 전환 요구서의 수령
상기 I란의 미생물은 (원기탁일)에 본 국제기탁기관에 의해 수령되었고 원 기탁물의 부다페스트 조약하의 기탁물로의 전환 요구서는 본 기관에 의해 (전환요구서 수령일)에 수령되었다.
V. 국제기탁기관
명칭 : DSMZ-도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하 주소 : 독일 데-38124 브라운쉬바이크 마쉐로더 벡 1베	국제기탁기관을 대표하는 권한을 갖는 사람(들) 또는 증명관(들)의 서명(들) : 서 명 날짜 : 2002년 6월 6일

양식 DSMZ-BP/4(단독면) 12/2001

국 제 양 식

데구사 아게

독일 33790 할레(베슈트프) 칸트슈트라쎄 2

I. 기탁자	II. 미생물 동정
성명: 데구사 아게 주소: 독일 33790 할레(베슈트프) 칸트슈트라쎄 2	국제기탁 기관에 의한 수탁 번호: DSM 15038 기탁일 또는 이전일¹: 2002년 6월 5일
III. 생존 진술서
상기 II란의 미생물 생존성은 2002년 6월 5일자로 시험되었다.² 시험일에 이 미생물은 ( × )³ 생존가능한 상태. ( )³ 더 이상 생존불가능한 상태.
IV. 생존 시험시의 조건 ⁴

V. 국제기탁기관
명칭 : DSMZ-도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하 주소 : 독일 데-38124 브라운쉬바이크 마쉐로더 벡 1베	국제기탁기관을 대표하는 권한을 갖는 사람(들) 또는 증명관(들)의 서명(들) : 서 명 날짜 : 2002년 6월 6일

3. 해당 칸에 크로스로 표시한다.

4. 정보가 요구되고 시험 결과가 음성인 경우 기입한다.

양식 DSMZ-BP/9(단독면) 12/2001

국 제 양 식

데구사 아게

독일 33790 할레/베슈트프 칸트슈트라쎄 2

I.미생물의 동정
기탁자가 정한 동정 표시: ATCC21513_17zwa1::zwa1	국제기탁기관에 의한 수탁 번호 : DSM 15038
II. 과학적 성질 및/또는 분류학상의 위치
상기 I란의 미생물에는 하기의 사항을 기재한 문서가 첨부되어 있다. ( × ) 과학적 성질 ( × ) 분류학상의 위치 (해당되는 경우 ×로 표시)
III. 수령 및 수탁
본 국제기탁기관은 2002년 6월 5일(원기탁일)¹에 수령된 상기 I란의 미생물을 수탁한다.
IV. 전환 요구서의 수령
상기 I란의 미생물은 (원기탁일)에 본 국제기탁기관에 의해 수령되었고 원 기탁물의 부다페스트 조약하의 기탁물로의 전환 요구서는 본 기관에 의해 (전환요구서 수령일)에 수령되었다.
V. 국제기탁기관
명칭 : DSMZ-도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하 주소 : 독일 데-38124 브라운쉬바이크 마쉐로더 벡 1베	국제기탁기관을 대표하는 권한을 갖는 사람(들) 또는 증명관(들)의 서명(들) : 서 명 날짜 : 2002년 6월 6일

양식 DSMZ-BP/4(단독면) 12/2001

국 제 양 식

데구사 아게

독일 33790 할레/퀸세벡크 칸트슈트라쎄 2

I.미생물의 동정
기탁자가 정한 동정 표시: DH5alphamcr/pK18mobsacB2xlysCSma2/1	국제기탁기관에 의한 수탁 번호 : DSM 14244
II. 과학적 성질 및/또는 분류학상의 위치
상기 I란의 미생물에는 하기의 사항을 기재한 문서가 첨부되어 있다. ( × ) 과학적 성질 ( × ) 분류학상의 위치 (해당되는 경우 ×로 표시)
III. 수령 및 수탁
본 국제기탁기관은 2001년 4월 20일(원기탁일)¹에 수령된 상기 I란의 미생물을 수탁한다.
IV. 전환 요구서의 수령
상기 I란의 미생물은 (원기탁일)에 본 국제기탁기관에 의해 수령되었고 원 기탁물의 부다페스트 조약하의 기탁물로의 전환 요구서는 본 기관에 의해 (전환요구서 수령일)에 수령되었다.
V. 국제기탁기관
명칭 : DSMZ-도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하 주소 : 독일 데-38124 브라운쉬바이크 마쉐로더 벡 1베	국제기탁기관을 대표하는 권한을 갖는 사람(들) 또는 증명관(들)의 서명(들) : 서 명 날짜 : 2001년 4월 26일

양식 DSMZ-BP/4(단독면) 0196

국 제 양 식

데구사 아게

독일 33790 할레/퀸세벡크 칸트슈트라쎄 2

I. 기탁자	II. 미생물 동정
성명: 데구사 아게 주소: 독일 33790 할레/퀸세벡크 칸트슈트라쎄 2	국제기탁 기관에 의한 수탁 번호: DSM 14244 기탁일 또는 이전일¹: 2001년 4월 20일
III. 생존 진술서
상기 II란의 미생물 생존성은 2001년 4월 20일자로 시험되었다.² 시험일에 이 미생물은 ( × )³ 생존가능한 상태. ( )³ 더 이상 생존불가능한 상태.
IV. 생존 시험시의 조건 ⁴

V. 국제기탁기관
명칭 : DSMZ-도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하 주소 : 독일 데-38124 브라운쉬바이크 마쉐로더 벡 1베	국제기탁기관을 대표하는 권한을 갖는 사람(들) 또는 증명관(들)의 서명(들) : 서 명 날짜 : 2001년 4월 26일

3. 해당 칸에 크로스로 표시한다.

4. 정보가 요구되고 시험 결과가 음성인 경우 기입한다.

양식 DSMZ-BP/4(단독면) 0196

<110> Degussa AG <120> Coryneform bacteria which produce chemical compounds II <130> 5-2001-008058-2 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1263 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(1263) <223> lysC wild-type gene <400> 1 gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg 48 Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct 96 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat 144 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt 192 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc 240 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg 288 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc 336 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc 384 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc 432 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg 480 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt 528 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag 576 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc 624 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205 tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat 672 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220 gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg 720 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc 768 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att 816 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270 tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat 864 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285 gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa 912 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300 gac ggc acc acc gac atc acc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc 960 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc 1008 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct 1056 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350 ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg 1104 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt 1152 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca 1200 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat 1248 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 gca ggc acc gga cgc 1263 Ala Gly Thr Gly Arg 420 <210> 2 <211> 421 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Arg 420 <210> 3 <211> 1263 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(1263) <223> lysC-fbr allele lysC T311I <400> 3 gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg 48 Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct 96 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat 144 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt 192 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc 240 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg 288 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc 336 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc 384 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc 432 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg 480 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt 528 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag 576 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc 624 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205 tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat 672 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220 gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg 720 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc 768 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att 816 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270 tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat 864 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285 gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa 912 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300 gac ggc acc acc gac atc atc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc 960 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc 1008 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct 1056 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350 ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg 1104 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt 1152 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca 1200 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat 1248 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 gca ggc acc gga cgc 1263 Ala Gly Thr Gly Arg 420 <210> 4 <211> 421 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Arg 420 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer lysCK1 <400> 5 tcggtgtcat cagagcattg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer lysCK2 <400> 6 tcggttgcct gagtaatgtc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> LC-lysC1-fbr <400> 7 aaccgttctg ggtatttccg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> LC-lysC2-fbr <400> 8 tccatgaact ctgcggtaac 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> oligonucleotide lysC311-C <400> 9 gcaggtgaag atgatgtcgg t 21 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(35) <223> Oligonukleotid lysC311-A <400> 10 tcaagatctc catcgcgcgg cggccgtcgg aacga 35 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer lysEK-1 <400> 11 tgcttgcaca aggacttcac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer lysEK-2 <400> 12 tatggtccgc aagctcaatg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer zwa1-A2 <400> 13 cacttgtcct caccactttc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer zwa1-E1 <400> 14 ttctactggg cgtactttcg 20

Claims

L-리신을 생산하는 코리네형 세균으로서,

당해 코리네형 세균이 lysC^FBR, lysE, 및 zwa1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유전자의 2개 이상의 복사체를 포함하고, 이때 상기 복사체들은 코리네형 세균의 상기 lysC^FBR, lysE, 및 zwa1 유전자의 천연 부위에 탠덤 배열로 존재하고 L-리신의 생산을 위해 요구되는 유전자에 속하고,

또한 당해 코리네형 세균은, 탠덤 배열로 상기 유전자의 2개 복사체를 보유하며 코리네형 세균에서 복제하지 않는 벡터를 사용한 형질전환에 의해 수득되며, 이때 사용된 벡터의 서열의 어떠한 잔기도 상기 유전자의 양 측면에 잔존하지 않거나, 사용된 벡터의 서열의 잔기 중 1 내지 24개 뉴클레오티드가 상기 유전자의 양 측면에 잔존함을 특징으로 하는, L-리신을 생산하는 코리네형 세균.
제1항에 있어서, 명시된 유전자의 적어도 제3 복사체를 추가의 유전자 부위에 갖고, 사용된 벡터의 서열의 어떠한 잔기도 상기 제3 복사체의 양 측면에 잔존하지 않거나, 사용된 벡터의 서열의 잔기 중 1 내지 24개 뉴클레오티드가 상기 제3 복사체의 양 측면에 잔존함을 특징으로 하는, L-리신을 생산하는 코리네형 세균.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제1항에 따른 천연 부위 또는 제2항에 따른 추가의 유전자 부위에 항생제 내성을 부여하는 뉴클레오티드 서열을 함유하지 않음을 특징으로 하는, L-리신을 생산하는 코리네형 세균.
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제1항 또는 제2항에 있어서, lysE 유전자의 2개 이상의 복사체를 포함하는, L-리신을 생산하는 코리네형 세균.
제1항 또는 제2항에 있어서, zwa1 유전자의 2개 이상의 복사체를 포함하는, L-리신을 생산하는 코리네형 세균.
제1항에 있어서, 아스파르테이트 키나제의 피드백(feed back) 내성 형태를 암호화하는 lysC^FBR 대립형질유전자가 복제된, L-리신을 생산하는 코리네형 세균.
제7항에 있어서, 서열번호 2의 위치 279의 알라닌의 발린으로의 치환, 서열번호 2의 위치 301의 세린의 페닐알라닌으로의 치환, 서열번호 2의 위치 308의 트레오닌의 이소루이신으로의 치환, 서열번호 2의 위치 301의 세린의 타이로신으로의 치환, 서열번호 2의 위치 345의 글라이신의 아스파르트산으로의 치환, 서열번호 2의 위치 320의 아르기닌의 글라이신으로의 치환, 서열번호 2의 위치 311의 트레오닌의 이소루이신으로의 치환, 및 서열번호 2의 위치 381의 세린의 페닐알라닌으로의 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 치환을 함유하는 피드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC^FBR 대립형질유전자가 복제된, L-리신을 생산하는 코리네형 세균.
제7항에 있어서, 피드백 내성 아스파르테이트 키나제가 서열번호 4에 따른 아미노산 서열을 갖는, L-리신을 생산하는 코리네형 세균.
제7항에 있어서, lysC^FBR 대립형질유전자가 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는, L-리신을 생산하는 코리네형 세균.
제1항, 제9항 또는 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 탠덤 배열로 서열번호 3에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖는, lysC 유전자의 하나의 복사체 및 lysC^FBR 대립형질유전자의 하나의 복사체를 포함하는, L-리신을 생산하는 코리네형 세균.
제1항, 제2항 또는 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 속에 속하는, L-리신을 생산하는 코리네형 세균.
제11항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 종에 속하는, L-리신을 생산하는 코리네형 세균.
a) 제1항, 제2항 또는 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 코리네형 세균을 발효시킴을 포함하는, L-리신을 생산하는 방법.
제14항에 있어서,

a) 발효 브로쓰 내 L-리신을 농축하는 단계 및

b) 발효 브로쓰로부터 L-리신을 분리하는 단계

를 포함하는 방법.
제15항에 있어서,

바이오매스가 0%을 초과하는 양으로부터 100% 이하까지의 양으로 존재하는 발효 브로쓰로부터 L-리신을 분리하는 단계를 포함하는 방법.
제DSM14244호하에 균주 이. 콜라이의 순수 배양물 형태로 기탁된 pK18mobsacB2xlysCSma2/1.
수탁 번호 제DSM15036호하에 순수 배양물의 형태로 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM13992lysC^FBR::lysC^FBR.
수탁 번호 제DSM15037호하에 순수 배양액의 형태로 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC21513_17lysE::lysE.
수탁 번호 제DSM15038호하에 순수 배양물의 형태로 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC21513_17zwa1::zwa1.
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