KR20200026881A - 코리네박테리움 글루타미컴으로부터의 프로모터 및 보조 유전자 발현을 조절하는 데 이의 용도 - Google Patents

코리네박테리움 글루타미컴으로부터의 프로모터 및 보조 유전자 발현을 조절하는 데 이의 용도 Download PDF

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자흐 서버
쥐. 고라 캐서린
쇼운 피. 맨체스터
피터 엔야트
알렉산더 시어러
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지머젠 인코포레이티드
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Abstract

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로부터 분리된 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는 천연 프로모터 및 그로부터 유래 된 돌연변이 프로모터가 제공되는데, 이는 온-경로 및/또는 오프-경로 유전자 발현을 조절, 즉 증가 또는 감소시키는 데 사용될 수 있다. 또한, 증가하는 프로모터 활성을 갖는 복수의 프로모터를 포함하는 프로모터 래더가 제공된다. 또한, 프로모터를 포함하는 숙주 세포 및 재조합 벡터, 및 관심 보조 유전자를 발현하고 숙주 세포를 사용하여 생체분자를 생성하는 방법이 제공된다.

Description

코리네박테리움 글루타미컴으로부터의 프로모터 및 보조 유전자 발현을 조절하는 데 이의 용도
본 발명은 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)으로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 네이티브 프로모터, 및 이로부터 유래된 돌연변이체 프로모터, 프로모터를 포함하는 숙주 세포 및 재조합 벡터, 및 보조 표적 유전자의 발현을 변형하는 방법 및 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 생체분자의 생산 방법에 관한 것이다.
산업적으로 중요한 박테리아의 균주는 생분자 생산에 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 코리네형(coryneform) 박테리아, 특히 코리네박테리움 글루타미컴의 균주는 생체분자, 예컨대 아미노산, 유기산, 비타민, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 생산하도록 배양될 수 있다. 생산 공정을 개선시키기 위해서 계속적인 노력이 행해지고 있다. 상기 공정은 발효 관련 조치, 예컨대, 예를 들어, 교반 및 산소 공급, 또는 발효 영양 공급 스케줄, pH 균형, 대사 산물 제거 동안 당 농도와 같은 배양 배지의 조성물 또는 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 제품 형태로의 후처리 또는 미생물 자체의 고유 성능 특징과 관련하여 개선될 수 있다.
성능 특징은, 예를 들어, 수율, 역가, 생산성, 부산물 제거, 공정 전이(process excursion)에 대한 용인, 최적 성장 온도 및 성장률을 포함할 수 있다. 미생물 균주의 성능을 개선시키는 한 방식은 대사산물의 생산을 제어하는 유전자의 발현을 증가시키는 것이다. 유전자의 증가된 발현은 그 유전자에 의해서 암호화된 효소의 활성을 증가시킬 수 있다. 증가된 효소 활성은 그 효소가 속한 경로에 의해서 제조되는 대사 산물의 합성률을 증가시킬 수 있다. 일부 예에서, 대사산물의 생산율 증가는 다른 세포 공정과 균형을 이루지 않고, 미생물 배양물의 성장을 저해할 수 있다. 때로는, 활성을 하향 조절하는 것이 균주의 성능을 개선시키는 데 중요하다. 예를 들어, 부산물로부터의 재-안내된 플럭스가 수율을 개선시킬 수 있다. 따라서, 대사 경로 내에서 다양한 성분의 발현 수준을 동시에 미세하게 조정하는 것이 흔히 필수적이다.
프로모터는 유전자가 전사되는 비율을 조절하고, 다양한 방식으로 전사에 영향을 미칠 수 있다. 구성적 프로모터(constitutive promoter)는, 예를 들어, 내부 또는 외부 세포 조건에 관계없이 일정한 비율로 이의 연관된 유전자의 전사를 안내하지만, 조절성 프로모터는 내부 및/또는 외부 세포 조건, 예를 들어, 성장률, 온도, 특정 환경 화학물질에 대한 반응 등에 따라서 유전자가 전사하는 비율을 증가 또는 감소시킨다. 프로모터는 이의 정상 세포 배경(context)으로부터 단리되고, 사실상 임의의 유전자의 발현을 조절하도록 조작되어, 세포 성장, 생성물 수율 및/또는 다른 관심 표현형의 효과적인 변형을 가능하게 할 수 있다.
표적 생체분자의 생산을 위해, 프로모터는 전형적으로 숙주 세포에서 표적 생체분자를 만드는 생합성 경로의 성분인 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 예를 들어, 라이신의 생산을 위해, 라이신 생합성 경로의 성분(예를 들어, 교토 유전자 및 게놈 백과 사전(KEGG) 경로 M00030에 정의된 바와 같은)은 이종 프로모터에 기능적으로 연결될 수 있다. 이러한 온-경로(on-pathway) 성분의 분야는 유한하고 잘 탐구되어 있으며, 목표 생체분자 생산을 최적화하기 위해 온-경로 표적 유전자의 발현 또는 활성을 조절함으로써 추가 최적화 가능성이 제한적이다. 그러나, 이종 프로모터를 하나 이상의 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결하고 산업적으로 중요한 숙주 균주에서 이러한 표적 유전자의 발현을 조절함으로써 수득된 이러한 생체분자의 생산성 및 수율에 대한 잠재적 영향은 크게 연구되지 않았다.
따라서, 당업계에는 발현 또는 활성을 증가 또는 감소시키도록 조절될 수 있는 보조 표적 유전자를 확인하고 사용하기 위해 선별하여 표적 생체분자 생산을 향상시킬 수 있는 방법 및 조성물이 여전히 필요하다.
본 발명은 당업계의 이들 및 다른 요구를 해결한다. 요컨대, 본 발명은 하나 이상의 이종성 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이며, 여기서 보조 표적 유전자는 표적 생체분자를 생성하기 위한 생합성 경로의 성분이 아니다. 본 발명은 이종 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 선별, 확인 및 사용하여 표적 생체분자의 생산을 개선하는 방법을 제공한다.
바람직한 실시태양에서, 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, 및 SEQ ID NO:8로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, 또는 SEQ ID NO:7로부터 선택된 서열로 이루어진다.
일부 실시태양에서, 보조 표적 유전자는 GOslim 용어 GO:0003674; GO:0003677; GO:0008150; GO:0034641; 또는 GO:0009058로 분류되는 유전자이다. 바람직하게는, 보조 표적 유전자는 하기 GOslim 용어 GO:0003674; GO:0003677; GO:0008150; GO:0034641; 또는 GO:0009058로 분류되거나 이의 적어도 2, 3, 4 또는 5개로 분류되는 유전자이다. 일부 실시태양에서, 보조 표적 유전자는 다음 KEGG 항목: M00010, M00002, M00007, M00580 또는 M00005의 하나 이상 또는 전부의 유전자로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 보조 표적 유전자는 하기 KEGG 엔트리: M00016; M00525; M00526; M00527; M00030; M00433 M00031; M00020; M00018; M00021; M00338; M00609; M00017; M00019; M00535; M00570; M00432; M00015; M00028; M00763; M00026; M00022; M00023; M00024; M00025; 및 M00040의 하나 이상 또는 전부의 유전자를 포함하는 생합성 경로의 성분이 아니다.
한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 제 1 및 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 숙주 세포를 제공하며, 여기서 제 1 프로모터는 제 1 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결되며, 여기서 제 1 이종 표적 유전자는 표적 생체분자를 생성하기 위한 생합성 경로의 성분이고, 제 2 프로모터는 표적 생체분자를 생성하기 위한 생합성 경로의 성분이 아닌 제 2 이종 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 일부 실시태양에서, 제 1 프로모터는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이로부터 유래된 돌연변이 프로모터일 수 있으며, 이들은 각각 짧은 DNA 서열, 이상적으로는 100개 미만의 염기쌍에 의해 암호화될 수 있는 반면, 제 2 프로모터는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, 및 SEQ ID NO:8로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제 1 및 제 2 프로모터는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, 및 SEQ ID NO:8로부터의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, 또는 SEQ ID NO:7로부터 선택된 서열로 이루어진다.
본 발명의 한 실시태양은 본 발명에 기술된 제 1 및/또는 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시태양은 본발명에 기술된 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 제 1 온-경로의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 일부 실시태양에서, 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 제 1 또는 제 2 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 본 발명의 한 실시태양은 본 발명에 기술된 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시태양은 본 발명에 기술된 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 각각의 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 상이한 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 바람직하게는, 본 발명에 보다 상세하게 기술되고 입증된 바와 같이, 표적 유전자는 동일한 대사 경로의 일부가 아니다. 일부 실시태양에서, 제 1 세트의 표적 유전자는 동일한 대사 경로의 일부이고, 제 2 세트의 표적 유전자는 상이한 경로의 일부이다. 본 발명의 한 실시태양은 본 발명에 기술된 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시태양은 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된 적어도 하나의 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이며; 여기서 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, 및 SEQ ID NO:8로부터 선택된 서열을 포함하고; 여기서 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, 또는 SEQ ID NO:8로부터 선택된 서열을 포함하는 경우, 표적 유전자는 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 내생 유전자가 아니다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 적어도 2개의 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 각각의 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 상이한 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 본 발명의 한 실시태양은 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된 적어도 하나의 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이며; 여기서 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, 및 SEQ ID NO:8로부터 선택된 서열을 포함하고; 여기서 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, 또는 SEQ ID NO:8로부터 선택된 서열을 포함하는 경우, 표적 유전자는 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 내생 유전자가 아니다.
일부 실시태양에서, 재조합 벡터는 적어도 2개의 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 각각의 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 상이한 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 바람직하게는, 본 발명에서보다 상세하게 설명되고 입증된 바와 같이, 표적 유전자는 동일한 대사 경로의 일부가 아니다. 예를 들어, 하나의 표적 유전자는 표적 생체분자의 생산을 위한 온-경로의 표적 유전자일 수 있고, 제 2 표적 유전자는 보조 표적 유전자일 수 있다.
본 발명의 한 실시태양은 본 발명에 기술된 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 경우에, 형질전환된 숙주 세포는 이종 보조 표적 유전자 또는 적어도 하나의 이종 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하며, 상기 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합은 프로모터 래더를 포함한다. 개별 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 상이한 형질전환된 숙주 세포에 있을 수 있고 동일한 이종 보조 표적 유전자 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합은 적어도 하나의 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드 및 적어도 하나의 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:7로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, 및 SEQ ID NO:8로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 제 1 및 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 복수의 숙주 세포의 상이한 숙주 세포에 있고 동일한 이종 보조 표적 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일부 경우에, 형질전환된 숙주 세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7 및/또는 8개의 상이한 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 프로모터 래더를 포함하는 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 상기 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6 및/또는 제 7 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 복수의 형질전환된 숙주 세포의 상이한 숙주 세포에 있고 동일한 이종 보조 표적 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된다.
일부 경우에, 형질전환된 숙주 세포는 이종 보조 표적 유전자 또는 적어도 하나의 이종 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하며, 상기 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합은 온-경로, 쉘 1 및/또는 쉘 2 이종 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 각각의 형질전환된 숙주 세포, 실질적으로 모든 형질전환된 숙주 세포, 또는 대부분의 형질전환된 숙주 세포는 온-경로, 쉘 1 및/또는 쉘 2 이종 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 일 실시태양은 본 발명에 기술된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 보조 표적 유전자의 발현을 변형하는 방법에 관한 것이며, 여기서 각각의 표적 유전자의 변형은 상향-조절 및 하향-조절로부터 독립적으로 선택된다. 바람직하게는, 보조 표적 유전자는 아미노산, 유기산, 핵산, 단백질 또는 폴리머와 같은 생분자의 생합성 경로의 하나 이상의 폴리펩타이드드 또는 단백질을 암호화하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 보조 표적 유전자는 전사 인자, 신호 전달 분자, 시트르산 주기의 성분 또는 당분해 성분의 생합성 경로의 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 생체분자의 생산에 적합한 조건하에서, 본 발명에 기술된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 생체분자를 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 보조 표적 유전자는 아미노산, 유기산, 향료 및 향제, 생체연료, 단백질 및 효소, 폴리머/모노머 및 다른 생물물질, 지질, 핵산, 소분자 치료제, 단백질 또는 펩타이드 치료제, 정제 화학물질(fine chemical), 및 기능식품(nutraceutical)으로부터 선택된 생체분자의 생체합성을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시킨다. 바람직한 실시태양에서, 생체분자는 L-아미노산이다. 구체적인 실시태양에서, L-아미노산은 라이신이다.
일부 실시태양에서, 숙주 세포는 코리네박테리움속에 속한다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미컴이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 아미노산 L-라이신의 생합성에 대한 유전 및 생화학 경로의 다이어그램. 생합성 경로에서 중간체를 우회시키는 유전자(예를 들어, pck, odx, icd, 및 hom)는 강조되어 있다.
하기 설명에서, 본 발명의 다양한 실시태양의 완전한 이해를 제공하기 위해서 특정 구체적인 상세 설명이 언급되어 있다. 그러나, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명이 이들 상세 사항 없이 실시될 수 있음을 이해할 것이다.
그 내용이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위 전체에서, 단어 "포함하다" 및 이의 변형, 예컨대, "포함한다" 및 "포함하는"은 개방형의 포함 의미로, 즉 "포함하지만, 이들로 제한되지 않는"것으로서 해석되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 핵산 분자"는 재조합 DNA 분자 또는 재조합 RNA 분자를 지칭한다. 재조합 핵산 분자는 상이한 기원으로부터의 결합된 핵산 분자를 함유하지만 자연적으로 함께 부착되지 않은 임의의 핵산 분자이다. 재조합 RNA 분자는 재조합 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자를 포함한다. 특히, 재조합 핵산 분자는 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NOs:1 내지 8의 프로모터를 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이종 표적 유전자"는 이것이 특정 게놈에서 작동 가능하게 연결된 프로모터에 의해서 이의 자연 상태(예를 들어, 비-유전적으로 변형된 세포)에서 제어되지 않는 임의의 유전자 또는 암호 서열을 지칭한다. 본 명서서에 제공된 바와 같이, 비-자연 발생 프로모터에 기능적으로 연결된 모든 표적 유전자는 "이종 표적 유전자"인 것으로 간주된다. 보다 구체적으로, SEQ ID NOs:1, 5, 및 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 자연에서 발생하지 않기 때문에, 모든 기능적으로 연결된 표적 유전자 서열은 "이종 표적 유전자" 서열이다. 유사하게, 숙주 세포에서 자연 발생하는 프로모터와 기능적으로 연결되어 있지만 야생형 유기체에서 상기 표적 유전자에 정상적으로 기능적으로 연결되지 않은 숙주 세포에서 모든, 예를 들어 자연 발생의 표적 유전자는 "이종 표적 유전자"이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 이종 표적 유전자는 오페론의 일부인 하나 이상의 표적 유전자를 포함할 수 있다. 즉, 오페론의 내생 프로모터는 SEQ ID NOs:1 내지 8의 핵산 서열을 갖는 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열로 대체된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열"은 연관된 서열 번호에서 언급된 바와 같은 서열을 갖는 핵산을 지칭한다.
"대사 경로" 또는 "생합성 경로"는 일련의 기질에서 생성물로의 전환 반응이고, 이들 각각은 유전자 생성물(예를 들어, 효소)에 의해 촉매되며, 여기서 하나의 전환 반응의 생성물은 다음 전환에 대한 기질로서 작용하며 공급 원료로부터 표적 생체 분자로의 전환 반응을 포함한다. 일부 실시태양에서, 대사 경로는 교토 백과 사전 유전자 및 게놈 KEGG 데이터베이스에 정의된 바와 같은 경로 모듈이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 그 안에 지도 및 경로 모듈을 포함하는 KEGG 데이터베이스에 대한 언급은 본 출원의 우선순위 날짜에 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 지칭한다.
"온-경로(on-pathway)" 이종 표적 유전자는 표적 생체분자가 그것이 존재하는 유기체에서 생성되는 대사 경로에 있는 유전자 생성물(예를 들어, 효소 또는 다중 효소 복합체의 성분)을 암호화하는 이종 표적 유전자이다. 통상적으로, 변형을 표적으로 하는 유전자는 "온-경로"으로 판단되는 유전자, 즉, 관심 분자에 대한 생합성 경로의 일부이거나 그로부터 분기되는 것으로 알려진 대사 효소에 대한 유전자이다interest (Keasling, JD. "Manufacturing molecules through metabolic engineering." Science, 2010). 플럭스 밸런스 분석("FBA")과 같은 방법(Segre et al, "Analysis of optimality in natural and perturbed metabolic networks." PNAS, 2002)은 이러한 유전자의 발견을 자동화할 수 있는 것으로 알려져 있다.
"보조" 또는 "오프-경로(off-pathyway)" 이종 표적 유전자, 또는 "표적 분자의 생산을 위한 생합성 경로의 성분이 아닌" 이종 표적 유전자 등은 표적 생체분자가 그것이 존재하는 유기체에서 생성되는 대사 경로에 있는 유전자 생성물(예를 들어, 효소 또는 다중 효소 복합체의 성분)을 암호화하지 않는 이종 표적 유전자이다.
예를 들어, 표적 생체 분자 L-라이신의 생성을 위한 보조 또는 오프-경로 이종 표적 유전자는 KEGG 경로 모듈 M00016, M00030, M00031, M00433, M00525, M00526 또는 M00527 또는 바람직하게는 이의 모두에 개시되지 않은 유전자이다. 다른 예로서, 표적 생체 분자 세린의 생성을 위한 보조 또는 오프-경로 이종 표적 유전자는 KEGG 경로 모듈 M00020에 개시되지 않은 유전자이다. 다른 예로서, 표적 생체 분자 트레오닌의 생성을 위한 보조 또는 오프-경로 이종 표적 유전자는 KEGG 경로 모듈 M00018에 개시되지 않은 유전자이다. 다른 예로서, 표적 생체 분자 시스테인의 생성을 위한 보조 또는 오프-경로 이종 표적 유전자는 KEGG 경로 모듈 M00021, M00338, 또는 M00609 또는 바람직하게는 이의 모두에 개시되지 않은 유전자이다.
또 다른 예로서, 표적 생체 분자 발린 및/또는 아이소류신의 생성을 위한 보조 또는 오프-경로 이종 표적 유전자는 KEGG 경로 모듈 M00019에 개시되지 않은 유전자이다. 또 다른 예로서, 표적 생체 분자 아이소류신의 생성을 위한 보조 또는 오프-경로 이종 표적 유전자는 KEGG 경로 모듈 M00535, 또는 M00570, 또는 바람직하게는 이들 모두에 개시되지 않은 유전자이다. 또 다른 예로서, 표적 생체 분자 류신의 생성을 위한 보조 또는 오프-경로 이종 표적 유전자는 KEGG 경로 모듈 M00432에 개시되지 않은 유전자이다.
또 다른 예로서, 표적 생체 분자 프롤린의 생성을 위한 보조 또는 오프-경로 이종 표적 유전자는 KEGG 경로 모듈 M00015에 개시되지 않은 유전자이다. 또 다른 예로서, 표적 생체 분자 오르니틴의 생성을 위한 보조 또는 오프-경로 이종 표적 유전자는 KEGG 경로 모듈 M00028, M00763 또는 바람직하게는 이들 모두에 개시되지 않은 유전자이다. 또 다른 예로서, 표적 생체 분자 히스티딘의 생성을 위한 보조 또는 오프-경로 이종 표적 유전자는 KEGG 경로 모듈 M00026에 개시되지 않은 유전자이다.
또 다른 예로서, 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌과 같은 방향족 아미노산은 시키메이트 경로를 통해 생성된다. 따라서, 표적 생체 분자 시키메이트 또는 시키메산 경로의 생합성 생성물인 아미노산(예를 들어, 하나 이상의 표적 생체 분자 트립토판, 티로신 또는 페닐알라닌)의 생성을 위한 보조 또는 오프-경로 이종 표적 유전자는 KEGG 경로 모듈 M00022에 개시되지 않은 유전자이다. 또 다른 예로서, 표적 생체 분자 트립토판의 생성을 위한 보조 또는 오프-경로 이종 표적 유전자는 KEGG 경로 모듈 M00022에 개시되지 않은 유전자이다. 또 다른 예로서, 표적 생체 분자 페닐알라닌의 생성을 위한 보조 또는 오프-경로 이종 표적 유전자는 KEGG 경로 모듈 M00024에 개시되지 않은 유전자이다. 또 다른 예로서, 표적 생체 분자 티로신의 생성을 위한 보조 또는 통로 외 이종 표적 유전자는 KEGG 경로 모듈 M00025, M00040, 또는 이들의 조합에 개시되지 않은 유전자이다.
또 다른 예로서, 일부 실시태양에서, L-라이신 표적 생체 분자를 생산하는 맥락에서, L-라이신을 생성하는 생합성 경로의 성분인 이종 표적 유전자는 이것이 존재하는 유기체에서 다음 유전자 또는 내인성 기능적 오르쏘로그, asd, ask, aspB, cg0931, dapA, dapB, dapD, dapE, dapF, ddh, fbp, hom, icd, lysA, lysE, odx, pck, pgi, ppc, ptsG, pyc, tkt 또는 zwf의 하나이다. 따라서, L-라이신 표적 생체분자를 생산하는 맥락에서, 보조 또는 오프-경로 이종 표적 유전자는 이것이 존재하는 유기체에서 다음 유전자 또는 내인성 기능적 오르쏘로그, asd, ask, aspB, cg0931, dapA, dapB, dapD, dapE, dapF, ddh, fbp, hom, icd, lysA, lysE, odx, pck, pgi, ppc, ptsG, pyc, tkt 또는 zwf의 하나가 아닌 유전자이다.
일부 실시태양에서, 표적 유전자는 "쉘(shell)"로 불리는 우선순위 수준으로 분할되고 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 쉘의 하나 이상의 이종 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되며, 여기서 쉘은 표적 분자 생성에 간접적으로 관여하는 유전자로 구성된다. 본 발명에 사용된 "쉘 1" 유전자는 선택된 대사 경로에 직접 관여하는 생합성 효소를 암호화하는 유전자이다. "쉘 2" 유전자는 비-쉘 1 효소 또는 생합성 경로 내에서 생성물 전환 또는 피드백 신호 전달을 담당하는 다른 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다. "쉘 3" 유전자는 생합성 경로의 발현 조절 또는 숙주 세포 내의 탄소 플럭스 조절을 담당하는 조절 유전자를 포함한다. "쉘 4" 유전자는 쉘 1-3 중 어느 하나에 할당되지 않은 표적 유기체의 유전자이다. 실시예 5는 라이신 생산의 체계적인 게놈-전체 교란을 위해 C. 글루타미쿰의 유전자를 쉘에 할당하는 것을 기술한다.
일부 경우에, 보조 이종 표적 유전자는 표적 분자의 생성을 위한 "쉘 2", "쉘 3" 및/또는 "쉘 4" 이종 표적 유전자이다. 일부 경우에, 보조 이종 표적 유전자는 표적 분자의 생성을 위한 "쉘 3" 및/또는 "쉘 4" 이종 표적 유전자이다. 일부 경우에, 보조 이종 표적 유전자는 표적 분자의 생성을 위한 "쉘 3" 이종 표적 유전자이다. 일부 경우에, 보조 이종 표적 유전자는 표적 분자의 생성을 위한 "쉘 4" 이종 표적 유전자이다. 일부 경우에, 보조 이종 표적 유전자는 표적 분자의 생성을 위한 "쉘 2" 이종 표적 유전자이다.
C. 글루타미쿰에서 라이신 생성과 관련한 예시적인 표적 유전자 및 이들의 쉘 명칭은 하기 표 10에 제공된다.
본 명세서 전체에서 "한 실시태양" 또는 "실시태양"에 대한 언급은 그 실시태양과 관련하여 기술된 특정 특징부, 구조 또는 특징이 본 개시 내용의 적어도 하나의 실시태양에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에서 다양한 곳에서 구 "한 실시태양에서" 또는 "실시태양에서"의 출현은 동일한 실시태양을 반드시 지칭하는 것은 아니다. 명확성을 위해서, 별도의 실시태양의 내용에 기술된, 본 발명의 특정 특징부는 또한 단일 실시태양에서 조합으로 제공될 수 있다는 것이 인지된다. 이에 반해서, 간결성을 위해서, 단일 실시태양의 내용에 기술된, 본 발명의 다양한 특징부는 또한 별개로 또는 임의의 적합한 하위조합으로 제공될 수 있다.
프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오타이드
하기 기준 둘 모두를 충족시키는 네이티브 C. 글루타미컴 프로모터가 식별되었다: 1) 구성적 프로모터의 래더, 즉, 증분으로 증가하는 프로모터 활성 수준을 갖는 복수의 프로모터를 나타냄; 및 2) 짧은 DNA 서열, 이상적으로는 100개 미만의 염기쌍에 의해서 코팅됨. C. 글루타미컴 ATCC 13032에서 전반적인 유전자 발현 수준을 기술하는 공개된 데이터 세트(문헌[Lee et al., Biotechnol Lett (2013) 35:709-717])를 조사하여 상이한 성장 조건에 걸쳐서 구성적으로 발현된 유전자를 식별하였다. 발현 수준이 두 성장 조건에 걸쳐서 일정하게 유지되는(0.33 내지 3의 발현비로서 정의됨) 유전자, 즉 과산화수소를 첨가한 최소 배지 및 과산화수소를 첨가하지 않은 최소 배지 중에서의 케모스타트(chemostat) 성장이 제1 기준을 충족시킨다. C. 글루타미컴 ATCC 13032 전사체를 기술하는 공개된 데이터 세트(문헌[Pfeifer-Sancar et al., BMC Genomics 2013, 14:888])를 조사하여 컴팩트 프로모터를 갖는 유전자, 즉 60개의 염기쌍의 코어 프로모터 영역 및 26 내지 40개 염기쌍 길이의 5' 미번역 영역으로 이루어진 것을 찾았다. 두 데이터 세트를 상호-참조하여 두 기준 모두를 충족시키는 프로모터를 식별하였다. 하기 5종의 야생형 프로모터가 식별되었다(표 1).
상이한 성장 조건하에서 증가하는 수준의 발현 및 구성적 발현을 갖는 C. 글루타미쿰의 프로모터
균주 SEQ ID NO 평균 활성
Pcg1860-eyfp 2 89243
Pcg0007-eyfp 3 44527
Pcg0755-eyfp 4 43592
Pcg3381-eyfp 6 4723
Pcg3121-eyfp 8 98
야생형 프로모터 Pcg1860 및 Pcg3121은 문헌에 기술되어 있지 않다. 야생형 프로모터 Pcg0007-gyrB 또한 문헌에 기술되어 있지 않지만, 뉴만(Neumann) 및 퀴논스(Quinones)(J Basic Microbiol. 1997;37(1):53-69)는 E. 콜라이에서 gyrB 유전자 발현의 조절을 기술한다. 야생형 프로모터 Pcg0755는 메티오닌 생합성 경로의 공지된 부분이다(문헌[Suda et al., Appl Microbiol Biotechnol (2008) 81:505-513]; 및 [Rey et al., Journal of Biotechnology 103 (2003) 51-65]). 야생형 프로모터 Pcg3381은 tatA 동족체이다. 코리네박테리움에서 tatA 경로는 문헌[Kikuchi et al., Applied and Environmental Microbiology, Nov. 2006, p. 7183-7192]에 기술되어 있다. 강력한 구성적 프로모터 Pcg0007이 돌연변이 생성을 위해서 선택되었다. Pcg0007의 예측된-10 요소에서의 6개의 위치(TAAGAT) 중 4개를 무작위화하여 더 강력한 프로모터 변종 및 약화된 프로모터 변종(SEQ ID NOs 1, 5, alc 7) 둘 모두를 생성하였다.
SEQ ID NOs: 1-8을 포함하는 프로모터의 확인 후, 본 발명자들은 하나 이상의 이러한 프로모터가 생합성 경로의 하나 이상의 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결되어 숙주 세포에서의 그 생합성 경로에 의해 생성된 표적 생체분자의 생성을 증가시킬 수 있다고 결정하였다. SEQ ID NOs: 1-8의 프로모터의 확인 및 특성화, 및 표적 생체분자를 생성하기 위한 하나 이상의 온-경로 이종 표적 유전자의 발현을 상향 조절 및/또는 하향 조절하는 데 이들의 용도는 2016년 12월7 일자로 출원된 PCT/US16/65464에 추가로 기술되며, SEQ ID NO: 1-8의 프로모터; 이종 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는지 여부에 관계없이 상기 프로모터를 포함하는 벡터, 발현 카세트 및 숙주 세포, 및 표적 생체 분자의 생성을 위한 방법 및 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 1-8의 프로모터를 사용)을 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 내용은 본 발명에 참조로 포함된다.
또한, 본 발명자들은 놀랍게도 하나 이상의 이러한 프로모터를 하나 이상의 보조 또는 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결하여 표적 생체분자의 생성을 증가시키거나 표적 생체분자의 생성을 추가로 증가시킬 수 있음을 발견하였다.
예를 들어, 일부 실시태양에서, 하나 이상의 이런 프로모터를 하나 이상의 보조 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결하는 것은 표적 생체분자를 생성하는 생합성 경로의 성분인 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 프로모터를 갖지 않는 균주 배경에서 표적 생체분자의 생성을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 추가로, 일부 실시태양에서, 하나 이상의 이러한 프로모터를 하나 이상의 보조 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결시키는 것은 표적 생체분자를 생성하는 생합성 경로의 성분인 하나 이상의 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 하나 이상의 프로모터를 포함하는 균주 배경에서 표적 생체분자의 생성을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 표적 생체분자의 생성을 위한 생합성 경로의 성분인 하나 이상의 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 하나 이상의 프로모터는 SEQ ID NOs:1-8, SEQ ID NOs: 1, 5, 및 7 및 당업계에 공지된 다른 프로모터로부터 선택될 수 있다. 유사하게, 일부 경우에, 표적 생체분자의 생성을 위한 생합성 경로의 성분이 아닌 하나 이상의 보조 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 하나 이상의 프로모터는 SEQ ID NOs:1-8, SEQ ID NOs: 1, 5, 및 7 및 당업계에 공지된 다른 프로모터로부터 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시태양는 C. 글루타미컴으로부터 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 네이티브 프로모터, 및 증분으로 증가하는 프로모터 활성 수준을 갖는 구성적 프로모터의 래더를 함께 나타내는 이로부터 유래된 돌연변이체 프로모터에 관한 것이며, 여기서 프로모터의 하나 이상의 래더는 표적 생체분자의 생성을 위한 이종 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 일부 실시태양에서, C. 글루타미컴 프로모터는 짧은 DNA 서열에 의해서 암호화될 수 있다. 일부 실시태양에서, C. 글루타미컴 프로모터는 100개 미만의 염기쌍의 DNA 서열에 의해서 암호화될 수 있다. 프로모터는 표적 생체분자의 생성을 위한 생합성 경로에 있는 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함하는 균주를 포함하는 임의의 균주 배경에서 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시태양는 SEQ ID NO:1 (Pcg0007_lib_39), SEQ ID NO:2 (Pcg1860), SEQ ID NO:3 (Pcg0007), SEQ ID NO:4 (Pcg0755), SEQ ID NO:5 (Pcg0007_lib_265), SEQ ID NO:6 (Pcg3381), SEQ ID NO:7 (Pcg0007_lib_119), 또는 SEQ ID NO:8 (Pcg3121)로부터 선택된 서열을 포함하는 프로모터 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 이종 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 1을 포함하는 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 이종 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 2의 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 제공하고, 이를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 이종 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 제공하고, 이를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 이종 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 제공하고, 이를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 이종 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 제공하고, 이를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 이종 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5를 포함하는 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 제공하고, 이를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 제공하고, 이를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 제공하고, 이를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "프로모터 카세트"는 적어도 하나의 이종 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NOs: 1-8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, "프로모터 카세트"는 하나 이상의 링커 폴리뉴클레오타이드, 보조 표적 유전자 이후의 전사 종결인자, 보조 표적 유전자의 출발 코돈의 상류의 리보솜 결합 부위, 및 각각의 조합물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시태양은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, 또는 SEQ ID NO:8로부터 선택된 서열로 이루어진 프로모터 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 실시태양에서, 본 명세서는 SEQ ID NO:1의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 발명은 SEQ ID NO:5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하고, 이를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 바와 같이 프로모터 카세트는 기능적으로 연결되는 이종 표적 유전자의 명칭을 따르는 프로모터 명칭을 참조하여 기술될 수 있다. 예를 들어, 오프-경로 글루코스-6-포스페이트 1-디하이드로게나제 유전자를 암호화하는 유전자 zwf에 기능적으로 연결된, Pcg1860이라는 명칭의 SEQ ID NO: 2의 프로모터는 Pcg1860-zwf로서 지칭된다. 유사하게, Pcg0007_39-lysA는 폴리펩타이드 다이아미노피멜레이트 디카복실라제를 암호화하는 표적 유전자 lysA에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 1의 0007_39 프로모터이다.
본 발명의 한 실시태양은 본 발명에 기술된 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합물에 관한 것이다. 이러한 맥락에서, 용어 "프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합물"은 별개의 단리된 서열로서, 별개의 폴리뉴클레오타이드 분자의 성분으로서, 또는 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자의 성분으로서 존재할 수 있는 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드, 및 이들의 조합물을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드 분자의 예는 염색체 및 플라스미드를 포함한다.
본 발명은 또한 분리된 프로모터 폴리뉴클레오타이드에 관한 것인데, 이것은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, 또는 SEQ ID NO:8에 도시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드로 본질적으로 이루진다. 실시태양에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1의 분리된 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 5의 분리된 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 7의 분리된 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 제공하고, 이를 포함한다.
이러한 맥락에서 용어 "본질적으로"는 1,000개 이하, 800개 이하, 700개 이하, 600개 이하, 500개 이하 또는 400개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 폴리뉴클레오타이드; 및 15,000개 이하, 10,000개 이하, 7,500개 이하, 5,000개 이하, 2,500개 이하, 1,000개 이하, 800개 이하, 700개 이하, 600개 이하, 500개 이하, 또는 400개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 폴리뉴클레오타이드가 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, 또는 SEQ ID NO:8의 폴리뉴클레오타이드의 5' 단부 및 3' 단부 각각에 부가된 것을 의미한다.
SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, 또는 SEQ ID NO:8의 폴리뉴클레오타이드의 5' 단부 및 3' 단부 각각에 부가된 폴리뉴클레오타이드의 상기 두 목록으로부터의 특징부의 임의의 유용한 조합물이 본 명세서에서 본 발명에 따른다. "유용한 조합물"은, 예를 들어, 효율적인 재조합이 수행되는 특징부의 조합물을 의미한다. 대체될 DNA 영역을 플랜킹(flanking)하는 동일한 길이를 부가하여 사용하는 것은 실험 절차에서 상동 재조합에 의한 영역의 전달을 용이하게 한다. 비교적 긴 플랜킹 상동 영역은 환형 DNA 분자들 사이에서 효율적인 재조합에 이롭지만, 그 플랜크의 길이가 증가함에 따라서 대체 벡터의 클로닝은 더 어려워진다(문헌[Wang et al., Molecular Biotechnology, 432:43-53 (2006)]). 본 명세서는 상동 재조합 및 표적 유전자 서열의 대체를 안내하기 위한 적어도 하나의 이종 보조 표적 유전자(예를 들어, "프로모터 카세트")에 기능적으로 연결된 SEQ ID NOs:1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 플랜킹하는 상동 영역을 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 상동 영역은 직접 반복 영역이다. 실시태양에서, 상동 영역은 500개의 염기쌍(bp) 내지 5000bp를 포함하고, 표적 유전자 서열 각각은 프로모터 카세트를 플랜킹한다. 실시태양에서, 상동 영역은 적어도 500bp를 포함하고, 표적 유전자 서열 각각은 프로모터 카세트를 플랜킹한다. 실시태양에서, 상동 영역은 적어도 1000bp(1kb)를 포함하고, 표적 유전자 서열 각각은 프로모터 카세트를 플랜킹한다. 실시태양에서, 상동 영역은 적어도 2kb를 포함하고, 표적 유전자 서열 각각은 프로모터 카세트를 플랜킹한다. 실시태양에서, 상동 영역은 적어도 5kb를 포함하고, 표적 유전자 서열 각각은 프로모터 카세를 플랜킹한다.
본 발명은 추가로 분리된 프로모터 폴리뉴클레오타이드에 관한 것인데, 이것은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, 또는 SEQ ID NO:8에 도시된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 실시태양에서, 단리물 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1의 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 실시태양에서, 단리물 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 5의 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 실시태양에서, 단리물 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 7의 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.
예를 들어, 살아있는 것, 예컨대 미생물로서 존재하는 바와 같은 폴리뉴클레오타이드의 생화학 및 화학 구조에 관련된 상세 사항은 특히 문헌["Biochemie" [Biochemistry] by Berg et al.(Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg Berlin, Germany, 2003; ISBN 3-8274-1303-6)]에서 찾아볼 수 있다.
핵염기 또는 염기 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C) 및 티아민(T)을 함유하는 데옥시리보뉴클레오타이드 단량체로 이루어진 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보-폴리뉴클레오타이드 또는 데옥시리보핵산(DNA)이라 지칭된다. 핵염기 또는 염기 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C) 및 우라실(U)을 함유하는 리보뉴클레오타이드 단량체로 이루어진 폴리뉴클레오타이드는 리보폴리뉴클레오타이드 또는 리보핵산(RNA)이라 지칭된다. 상기 폴리뉴클레오타이드에서 단량체는 3',5'-포스포다이에스터 결합에 의해서 서로에 공유 연결된다.
"프로모터 폴리뉴클레오타이드" 또는 "프로모터" 또는 "프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오타이드"는 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 데옥시리보폴리뉴클레오타이드, 또는 핵산, 바람직하게는 데옥시리보핵산(DNA)을 의미하는데, 이것은 전사될 폴리뉴클레오타이드에 기능적으로 연결될 때, 암호 폴리뉴클레오타이드의 전사의 개시 지점 및 빈도를 결정하고, 이에 의해서 제어된 폴리뉴클레오타이드의 강도가 영향을 받게 한다. 용어 "프로모터 래더"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 증분으로 증가하는 프로모터 활성 수준을 갖는 복수의 프로모터를 지칭한다. 용어 "프로모터 활성"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 폴리뉴클레오타이드 서열의 mRNA로의 전사를 개시하는 프로모터의 능력을 지칭한다. 프로모터 활성을 평가하는 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 PCT/US16/65464의 하기 실시예 2에 기술된 방법을 포함한다. 용어 "구성적 프로모터"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 상당히 연관된 유전자의 전사를 내부 또는 외부 세포 조건에 관계없이 일정한 속도로 안내하는 프로모터를 지칭한다. 일부 경우에, 프로모터 래더의 프로모터는 자극에 반응하여(예를 들어, 화학 작용제에 의한 유도, 열, 냉기, 스트레스, 인산염 부족 등에 의한) 프로모터 강도의 범위를 나타낸다. 일부 경우에, 프로모터 래더의 프로모터는 다양한 구성적 프로모터 강도를 나타낸다.
DNA의 이중-가닥 구조로 인해서, 서열 목록의 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, 또는 SEQ ID NO:8의 가닥에 상보적인 가닥이 마찬가지로 본 발명의 대상이다.
키트
본 발명의 한 실시태양은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:7로부터 선택된 서열을 포함하는 제1 프로모터 폴리뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드에 적합한 저장 수단을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 제1 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:7로부터 선택된 서열로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 키트는 본 명세서에 기술된 적어도 2개의 제1 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 키트는 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 제1 프로모터 폴리뉴클레오타이드, 및 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, 및 SEQ ID NO:8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 적어도 하나의 제2 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 키트는 본 명세서에 기술된 적어도 하나의 제1 프로모터 폴리뉴클레오타이드, 및 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, 및 SEQ ID NO:8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열로 이루어진 적어도 하나의 제2 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합물을 포함한다.
표적 유전자
본 발명의 한 실시태양은 본 명세서에 기술된 바와 같은 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 이종 표적 유전자의 발현을 조절 방법에 관한 것이다. 이종 표적 유전자는 폴리뉴클레오타이드이고, 이의 발현은 본 명세서에 기술된 프로모터에 의해서 제어된다. 이종 표적 유전자는 하나 이상의 폴리펩타이드(들) 또는 비-암호 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 비-암호 RNA를 암호화하는 암호 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 단백질/폴리펩타이드에 대한 폴리뉴클레오타이드 암호는 ATG, GTG 및 TTG, 바람직하게는 ATG 또는 GTG, 특히 바람직하게는 ATG로 이루어진 그룹으로부터 선택된 출발 코돈, 단백질-암호화 서열 및 TAA, TAG 및 TGA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 중단 코돈(들)으로 본질적으로 이루어진다. 이종 표적 유전자는 "온-경로" 또는 "오프-경로" 또는 이의 조합일 수 있다.
"전사"는 상보적인 RNA 분자가 DNA 템플레이트로부터 출발하여 생성되는 과정을 의미한다. 이러한 과정은 단백질, 예컨대 RNA 중합효소, "시그마 인자" 및 전사 조절 단백질이 관련된다. 표적 유전자가 암호 폴리뉴클레오타이드이면, 합성된 RNA(메신저 RNA, mRNA)는 해석 과정에서 템플레이트로서 작용하고, 이것은 그 후 폴리펩타이드 또는 단백질을 생성한다.
"기능적으로 연결된"은 이러한 맥락에서 본 발명에 따른 프로모터 폴리뉴클레오타이드와 추가 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드의 순차적인 배열을 의미하며, 이것은 상기 추가 폴리뉴클레오타이드의 전사를 유발하여 센스 RNA 전사물을 생산한다.
추가 폴리뉴클레오타이드가 폴리펩타이드/단백질을 암호화하고, 출발 코돈에서 출발하고, 중단 코돈을 포함하고, 적절한 경우 전사 종결 서열을 포함하는, 폴리펩타이드에 대한 암호 영역으로 이루어진 표적 유전자이면, "기능적으로 연결된"은 본 발명에 따른 프로모터 폴리뉴클레오타이드와 표적 유전자가 순차적으로 배열하여, 상기 표적 유전자의 전사 및 합성된 RNA의 번역을 유발하는 것을 의미한다.
표적 유전자가 복수의 단백질/폴리펩타이드를 암호화하면, 각각의 유전자는 리보솜-결합 부위 다음에 존재할 수 있다. 적절한 경우, 종결 서열은 마지막 유전자의 하류에 위치된다.
표적 유전자는 바람직하게는 프로테이노제닉 아미노산, 비-프로테이노제닉 아미노산, 비타민, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 유기산의 그룹으로부터 선택된, 생체분자의 생합성 경로의 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화한다. 표적 유전자는 바람직하게는 참고로 포함된 유럽 특허 제EP 1 108 790 A2호의 표 1에 열거된 온-경로 및/또는 오프-경로 표적 유전자 중 하나 이상으로 이루어진다.
본 명세서는 대사 및 생합성 경로에 관여된 유전자로서 유전자 및 게놈의 교토 사전(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes: KEGG)에서 식별 가능한 이종 표적 유전자 중 임의의 하나에 기능적으로 연결된 SEQ ID NOs:1 내지 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공하고, 이를 포함한다. KEGG 데이터베이스는 genome.jp/kegg로 인터넷에서 입수 가능하다.
바람직한 실시태양에서, 표적 생체분자는 아미노산, 단백질 또는 탄수화물 중합체이고, SEQ ID NOs:1 내지 8의 하나 이상의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 시트르산 사이클의 하나 이상의 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 일부 경우에, 보조 표적 유전자는 KEGG 경로 M00010의 유전자로부터 선택된다. 한 실시태양에서, 표적 생체 분자는 아미노산, 단백질 또는 탄수화물 폴리머이고, SEQ ID NOs:1 내지 8의 하나 이상의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 해당 경로의 하나 이상의 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 일부 경우에, 보조 표적 유전자는 KEGG 경로 M00002의 유전자로부터 선택된다. 한 실시태양에서, 표적 생체 분자는 아미노산, 단백질 또는 탄수화물 폴리머이고, SEQ ID NOs:1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상은 펜토스 포스페이트 경로의 하나 이상의 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 일부 경우에, 보조 표적 유전자는 KEGG 경로 M00007 또는 M00580의 유전자, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
한 실시태양에서, 표적 생체분자는 아미노산, 단백질 또는 탄수화물 폴리머이고, SEQ ID NOs:1 내지 8의 하나 이상의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 PRPP 생합성 경로의 하나 이상의 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 일부 경우에, 보조 표적 유전자는 KEGG 경로 M00005의 유전자로부터 선택된다. 일부 경우에, 표적 생체분자는 특정 아미노산 또는 아미노산 세트이고, SEQ ID NOs:1 내지 8의 하나 이상의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 상이한 아미노산 또는 아미노산 세트의 생성을 위한 대사 경로로부터 선택된 하나 이상의 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된다.
한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 지도 번호 00300에 표현된 바와 같은 라이신 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 온-경로 표적 유전자는 라이신 석신일-DAP 생합성 경로로부터 선택된다(M00016). 한 실시태양에서, 하나 이상의 온-경로 표적 유전자는 라이신 아세틸-DAP 생합성 경로로부터 선택된다(M00525). 한 실시태양에서, 하나 이상의 온-경로 표적 유전자는 라이신 DAP 디하이드로게나제 생합성 경로로부터 선택된다(M00526). 한 실시태양에서, 하나 이상의 온-경로 표적 유전자는 라이신 DAP 아미노트랜스퍼라제 생합성 경로로부터 선택된다(M00527). 한 실시태양에서, 하나 이상의 온-경로 표적 유전자는 AAA 경로 생합성 경로으로부터 선택된다(M00030). 한 실시태양에서, 하나 이상의 온-경로 표적 유전자는 2-옥소글루타레이트(M00433) 또는 LysW(M00031)에 의해서 매개되는 라이신 생합성 경로로부터의 라이신 생합성 경로로부터 선택된다.
본 발명은 엔트리 M00020의 유전자를 포함하는 세린 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NOs:1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하고, 이를 포함한다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00018의 유전자를 포함하는 트레오닌 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00021의 유전자를 포함하는 시스테인 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs:1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00338의 유전자를 포함하는 시스테인 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00609의 유전자를 포함하는 시스테인 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00017의 유전자를 포함하는 메티오닌 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs:1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00019의 유전자를 포함하는 발린/아이소루신 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00535의 유전자를 포함하는 아이소루신 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00570의 유전자를 포함하는 아이소루신 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00432의 유전자를 포함하는 루신 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00015의 유전자를 포함하는 프롤린 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00028의 유전자를 포함하는 오르니틴 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00763의 유전자를 포함하는 오르니틴 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00026의 유전자를 포함하는 히스티딘 생합성 경로의 하나 이상의 오프-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00022의 유전자를 포함하는 시키메이트 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs:1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00023의 유전자를 포함하는 트립토판 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00024의 유전자를 포함하는 페닐알라닌 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00025의 유전자를 포함하는 타이로신 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs: 1 내지 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00040의 유전자를 포함하는 타이로신 생합성 경로의 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된다.
바람직한 실시태양에서, SEQ ID NOs:1 내지 8의 하나 이상의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 발명에 기술된 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결되고 SEQ ID NOs:1 내지 8의 하나 이상의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 발명에 기술된 하나 이상의 보조 표적 유전자, 예를 들어 숙주 세포, 숙주 세포의 게놈, 발현 카세트 및/또는 폴리뉴클레오타이드 벡터에 기능적으로 연결된다. 다른 실시 형태에서, SEQ ID NOs:1 내지 8의 하나 이상의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 발명에 기술된 하나 이상의 온-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결되고 하나 이상의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 발명에 기술된 하나 이상의 보조 표적 유전자, 예를 들어 숙주 세포, 숙주 세포의 게놈, 발현 카세트 및/또는 폴리뉴클레오타이드 벡터에 기능적으로 연결된다. 또 다른 실시태양에서, SEQ ID NOs:1 내지 8의 하나 이상의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 발명에 기술된 하나 이상의 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결되고 SEQ ID NOs:1 내지 8의 하나 이상의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 발명에 기술된 하나 이상의 온-경로 표적 유전자, 예를 들어 숙주 세포, 숙주 세포의 게놈, 발현 카세트 및/또는 폴리뉴클레오타이드 벡터에 기능적으로 연결된다.
본 발명은 엔트리 M00020의 유전자를 포함하는 세린 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하고, 이를 포함한다. 한 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00018의 유전자를 포함하는 트레오닌 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00021의 유전자를 포함하는 시스테인 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00338의 유전자를 포함하는 시스테인 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00609의 유전자를 포함하는 시스테인 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00017의 유전자를 포함하는 메티오닌 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00019의 유전자를 포함하는 발린/아이소루신 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00535의 유전자를 포함하는 아이소루신 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00570의 유전자를 포함하는 아이소루신 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00432의 유전자를 포함하는 루신 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00015의 유전자를 포함하는 프롤린 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00028의 유전자를 포함하는 오르니틴 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00763의 유전자를 포함하는 오르니틴 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00026의 유전자를 포함하는 히스티딘 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00022의 유전자를 포함하는 시키메이트 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00023의 유전자를 포함하는 트립토판 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00024의 유전자를 포함하는 페닐알라닌 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00025의 유전자를 포함하는 타이로신 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 실시태양에서, SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 KEGG 엔트리 M00040의 유전자를 포함하는 타이로신 생합성 경로의 하나 이상의 표적 유전자에 기능적으로 연결된다.
본 명세서는 표 2에 제공된 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032 또는 이의 임의의 코리네박테리움 글루타미컴 등가물로부터의 온-경로 또는 오프-경로 이종 표적 유전자 중 임의의 하나에 기능적으로 연결된 SEQ ID NOs:1 내지 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공하고, 이를 포함한다. 서열 출발 및 단부 위치는 게놈 뉴클레오타이드 번호(nucleotide accession) NC_003450.3에 상응한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 상응하는 유전자가 C. 글루타미컴의 다른 균주에 존재하고, 표 2로부터 용이하게 식별될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO:1의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 2의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 6의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공하고, 이를 포함한다.
본 명세서에 따른 코리네박테리움 글루타미컴으로부터의 표적 유전자
Gene ID 상징 Aliases 설명 개시 말단 배향
1021315 NCgl0248 NCgl0248, Cgl0252 aspartate-semialdehyde dehydrogenase 270660 271694 plus
1021300 NCgl0223 NCgl0223, Cgl0226 prephenate dehydrogenase 241880 242902 minus
1021294 NCgl0247 NCgl0247, Cgl0251 aspartate kinase 269371 270636 plus
1021282 NCgl0215 NCgl0215, Cgl0218 Aminotransferase 232257 233282 minus
1021250 NCgl0181 NCgl0181, Cgl0184 glutamine 2-oxoglutarate aminotransferase large subunit 195240 199772 plus
1021247 gltD NCgl0182, Cgl0185 glutamate synthase 199772 201292 plus
1021203 aroE NCgl0409, Cgl0424 quinate/shikimate dehydrogenase 446538 447389 plus
1021149 NCgl0245 NCgl0245, Cgl0248 2-isopropylmalate synthase 266151 267896 minus
1021136 gpmA NCgl0390, Cgl0402 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase 425177 425923 plus
1021131 NCgl0408 NCgl0408, Cgl0423 3-dehydroquinate dehydratase 446087 446524 plus
1021078 NCgl0398 NCgl0398, Cgl0410 pyrroline-5-carboxylate reductase 434877 435698 plus
1020978 trpA NCgl2932, Cgl3035 tryptophan synthase subunit alpha 3239333 3240175 plus
1020976 NCgl2931 NCgl2931, Cgl3034 tryptophan synthase subunit beta 3238083 3239336 plus
1020975 NCgl2930 NCgl2930, trpC, trpF bifunctional indole-3-glycerol phosphate synthase/phosphoribosylanthranilate isomerase 3236642 3238066 plus
1020974 trpD NCgl2929, Cgl3032 anthranilate phosphoribosyltransferase 3235603 3236649 plus
1020973 NCgl2928 NCgl2928, Cgl3031 anthranilate synthase II 3234957 3235583 plus
1020972 NCgl2927 NCgl2927, Cgl3029 anthranilate synthase I 3233404 3234960 plus
1020852 NCgl2809 NCgl2809, Cgl2910 pyruvate kinase 3110462 3112321 minus
1020842 NCgl2799 NCgl2799, Cgl2899 prephenate dehydratase 3098576 3099523 minus
1020841 NCgl2798 NCgl2798, Cgl2898 phosphoglycerate mutase 3097902 3098573 minus
1020788 NCgl2747 NCgl2747, Cgl2844 Aminotransferase 3030670 3031983 plus
1020745 NCgl2704 NCgl2704, Cgl2802 Nucleosidase 2988212 2988772 minus
1020729 NCgl2688 NCgl2688, Cgl2786 cystathionine gamma-synthase 2972058 2973206 minus
1020714 NCgl2673 NCgl2673, Cgl2770 fructose-bisphosphate aldolase 2954239 2955273 minus
1020594 NCgl2557 NCgl2557, Cgl2646 dihydrodipicolinate synthase 2815459 2816397 plus
1020564 NCgl2528 NCgl2528, Cgl2617 D-2-hydroxyisocaproate dehydrogenase 2786754 2787716 minus
1020509 NCgl2474 NCgl2474, Cgl2563 serine acetyltransferase 2723065 2723613 plus
1020508 NCgl2473 NCgl2473, Cgl2562 cysteine synthase 2721905 2722861 plus
1020471 NCgl2436 NCgl2436, Cgl2522 phosphoserine phosphatase 2669555 2670856 minus
1020393 NCgl2360 NCgl2360, Cgl2446 cystathionine gamma-synthase 2590310 2591470 minus
1020370 NCgl2337 NCgl2337, Cgl2423 ribose-5-phosphate isomerase B 2563930 2564403 minus
1020307 NCgl2274 NCgl2274, Cgl2356 gamma-glutamyl kinase 2496668 2497777 minus
1020305 proA NCgl2272, Cgl2354 gamma-glutamyl phosphate reductase 2494337 2495635 minus
1020301 NCgl2268 NCgl2268, Cgl2350 fructose-2,6-bisphosphatase 2491149 2491859 minus
1020260 NCgl2227 NCgl2227, Cgl2309 PLP-dependent aminotransferase 2444607 2445713 plus
1020188 NCgl2155 NCgl2155, Cgl2236 bifunctional RNase H/acid phosphatase 2371410 2372558 minus
1020181 NCgl2148 NCgl2148, Cgl2229 glutamine synthase 2362816 2364156 minus
1020172 NCgl2139 NCgl2139, Cgl2220 threonine synthase 2353598 2355043 minus
1020166 NCgl2133 NCgl2133, Cgl2214 glutamine synthase 2348830 2350263 plus
1020155 NCgl2123 NCgl2123, Cgl2204 branched-chain amino acid aminotransferase 2335913 2337016 minus
1020130 NCgl2098 NCgl2098, Cgl2178 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase 2307695 2309095 minus
1020087 NCgl2055 NCgl2055, Cgl2136 cysteine synthase 2258360 2259313 minus
1020086 NCgl2054 NCgl2054, Cgl2135 diaminopimelate decarboxylase 2255736 2257025 minus
1020080 NCgl2048 NCgl2048, Cgl2129 methionine synthase II 2247004 2248209 minus
1020078 NCgl2046 NCgl2046, Cgl2127 threonine dehydratase 2244862 2246172 minus
1020053 hisD NCgl2021, Cgl2102 histidinol dehydrogenase 2217597 2218925 minus
1020052 NCgl2020 NCgl2020, Cgl2101 histidinol-phosphate aminotransferase 2216491 2217591 minus
1020051 hisB NCgl2019, Cgl2100 imidazoleglycerol-phosphate dehydratase 2215866 2216474 minus
1020048 hisH NCgl2016, Cgl2097 imidazole glycerol phosphate synthase subunit HisH 2212638 2213273 minus
1020047 NCgl2015 NCgl2015, Cgl2096 phosphoribosyl isomerase A 2211879 2212619 minus
1020045 hisF NCgl2013, Cgl2094 imidazole glycerol phosphate synthase subunit HisF 2210270 2211046 minus
1020044 hisI NCgl2012, Cgl2093 phosphoribosyl-AMP cyclohydrolase 2209917 2210273 minus
1020042 NCgl2010 NCgl2010, Cgl2091 indole-3-glycerol phosphate synthase 2208364 2209149 minus
1020040 NCgl2008 NCgl2008, Cgl2089 pyruvate kinase 2205665 2207092 minus
1019930 NCgl1898 NCgl1898, Cgl1973 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate reductase 2081188 2081934 minus
1019928 dapA NCgl1896, Cgl1971 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase 2079278 2080183 minus
1019900 dapF NCgl1868, Cgl1943 diaminopimelate epimerase 2051842 2052675 minus
1019614 NCgl1583 NCgl1583, Cgl1645 L-serine deaminase 1744884 1746233 plus
1019598 aroE NCgl1567, Cgl1629 shikimate 5-dehydrogenase 1724609 1725439 minus
1019592 NCgl1561 NCgl1561, Cgl1623 chorismate synthase 1719666 1720898 minus
1019591 aroK NCgl1560, Cgl1622 shikimate kinase 1719104 1719676 minus
1019590 aroB NCgl1559, Cgl1621 3-dehydroquinate synthase 1717935 1719032 minus
1019571 NCgl1541 NCgl1541, Cgl1603 methionine adenosyltransferase 1699174 1700397 minus
1019566 NCgl1536 NCgl1536, Cgl1598 ribulose-phosphate 3-epimerase 1693259 1693918 minus
1019556 NCgl1526 NCgl1526, Cgl1588 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1682621 1683625 minus
1019555 pgk NCgl1525, Cgl1587 phosphoglycerate kinase 1681187 1682404 minus
1019554 tpiA NCgl1524, Cgl1586 triosephosphate isomerase 1680329 1681108 minus
1019550 NCgl1520 NCgl1520, Cgl1582 ornithine cyclodeaminase 1674120 1675268 minus
1019543 NCgl1513 NCgl1513, Cgl1575 Transaldolase 1666673 1667755 plus
1019542 NCgl1512 NCgl1512, Cgl1574 Transketolase 1664403 1666505 plus
1019512 NCgl1482 NCgl1482, Cgl1540 aconitate hydratase 1626279 1629110 plus
1019480 NCgl1450 NCgl1450, Cgl1507 methionine synthase I cobalamin-binding subunit 1587570 1591235 minus
1019478 hisE NCgl1448, Cgl1505 phosphoribosyl-ATP pyrophosphatase 1586462 1586725 minus
1019477 hisG NCgl1447, Cgl1504 ATP phosphoribosyltransferase 1585600 1586445 minus
1019377 NCgl1347 NCgl1347, Cgl1401 argininosuccinate lyase 1471477 1472910 plus
1019376 NCgl1346 NCgl1346, Cgl1400 argininosuccinate synthase 1470211 1471416 plus
1019374 NCgl1344 NCgl1344, Cgl1398 ornithine carbamoyltransferase 1468565 1469524 plus
1019373 argD NCgl1343, Cgl1397 acetylornithine aminotransferase 1467376 1468551 plus
1019372 NCgl1342 NCgl1342, Cgl1396 acetylglutamate kinase 1466422 1467375 plus
1019371 argJ NCgl1341, Cgl1395 bifunctional ornithine acetyltransferase/N-acetylglutamate synthase 1465210 1466376 plus
1019370 argC NCgl1340, Cgl1394 N-acetyl-gamma-glutamyl-phosphate reductase 1464053 1465126 plus
1019293 leuD NCgl1263, Cgl1316 3-isopropylmalate dehydratase small subunit 1381902 1382495 plus
1019292 NCgl1262 NCgl1262, Cgl1315 3-isopropylmalate dehydratase large subunit 1380440 1381885 plus
1019267 NCgl1237 NCgl1237, Cgl1286 3-isopropylmalate dehydrogenase 1353489 1354511 plus
1019265 NCgl1235 NCgl1235, Cgl1284 D-3-phosphoglycerate dehydrogenase 1350855 1352447 plus
1019254 NCgl1224 NCgl1224, Cgl1273 ketol-acid reductoisomerase 1340724 1341740 plus
1019253 ilvH NCgl1223, Cgl1272 acetolactate synthase small subunit 1340025 1340543 plus
1019252 NCgl1222 NCgl1222, Cgl1271 acetolactate synthase large subunit 1338131 1340011 plus
1019249 NCgl1219 NCgl1219, Cgl1268 dihydroxy-acid dehydratase 1333439 1335280 minus
1019232 NCgl1202 NCgl1202, Cgl1250 6-phosphofructokinase 1315046 1316086 plus
1019167 NCgl1137 NCgl1137, Cgl1184 homoserine kinase 1243855 1244784 plus
1019166 NCgl1136 NCgl1136, Cgl1183 homoserine dehydrogenase 1242507 1243844 plus
1019163 NCgl1133 NCgl1133, Cgl1180 diaminopimelate decarboxylase 1239929 1241266 plus
1019124 NCgl1094 NCgl1094, Cgl1139 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--homocysteine S-methyltransferase 1188385 1190622 minus
1019117 aroE NCgl1087, Cgl1132 shikimate 5-dehydrogenase 1180869 1181675 minus
1019094 NCgl1064 NCgl1064, Cgl1109 succinyl-diaminopimelate desuccinylase 1155731 1156840 plus
1019093 NCgl1063 NCgl1063, Cgl1108 tetrahydrodipicolinate N-succinyltransferase 1154726 1155676 minus
1019091 NCgl1061 NCgl1061, Cgl1106 2,3,4,5-tetrahydropyridine-2,6-dicarboxylate N-succinyltransferase 1152370 1153263 minus
1019042 NCgl1013 NCgl1013, Cgl1058 phosphoglycerate mutase 1107503 1108204 plus
1018983 glyA NCgl0954, Cgl0996 serine hydroxymethyltransferase 1050624 1051928 plus
1018979 NCgl0950 NCgl0950, Cgl0990 phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase 1046610 1047710 plus
1018968 NCgl0939 NCgl0939, Cgl0978 threonine dehydratase 1038718 1039650 minus
1018964 eno NCgl0935, Cgl0974 phosphopyruvate hydratase 1034949 1036226 plus
1018934 NCgl0905 NCgl0905, Cgl0942 ribose-phosphate pyrophosphokinase 997463 998440 minus
1018929 NCgl0900 NCgl0900, Cgl0937 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 993174 994616 plus
1018848 NCgl0819 NCgl0819, Cgl0853 hypothetical protein 910852 911157 minus
1018824 gltA NCgl0795, Cgl0829 type II citrate synthase 877838 879151 plus
1018823 NCgl0794 NCgl0794, Cgl0828 phosphoserine aminotransferase 875982 877112 minus
1018809 NCgl0780 NCgl0780, Cgl0814 Aminotransferase 861592 862755 plus
1018794 NCgl0765 NCgl0765, Cgl0799 fructose-1,6-bisphosphatase 841514 842296 minus
1018759 NCgl0730 NCgl0730, Cgl0764 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase 801187 802479 minus
1018688 NCgl0659 NCgl0659, Cgl0689 pyruvate carboxylase 705211 708633 plus
1018663 NCgl0634 NCgl0634, Cgl0664 monomeric isocitrate dehydrogenase (NADP+) 677828 680044 minus
실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 온-경로 또는 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO:1의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 2의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 6의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다.
실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 온-경로 또는 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO:1의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 2의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 6의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다.. 실시태양에서, 본 명세서는 표 2에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다.
실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 온-경로 또는 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO:1의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 2의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 6의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다.
C.클루카미칸 L-라이신 생합성 경로
상징 유전자 명칭 (EC #) C. Glutamicum Gene 위치 표시
Asd aspartate-semialdehyde dehydrogenase (EC:1.2.1.11) Asd 270660..271694 +
dapA 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase (EC:4.3.3.7) dapA Complement (2079278..2080183) +
dapB dihydrodipicolinate reductase (EC:1.17.1.8) Cgl1973 complement(2081188..2081934) +
dapD 2,3,4,5-tetrahydropyridine-2-carboxylate N-succinyltransferase (EC:2.3.1.117) dapD complement(1153838..1154731) +
dapD 2,3,4,5-tetrahydropyridine-2-carboxylate N-succinyltransferase (EC:2.3.1.117) dapD2 complement(1156194..1157144)
cg0931 N-succinyldiaminopimelate aminotransferase (EC:2.6.1.17) cg0931 863063..864226 +
dapE succinyl-diaminopimelate desuccinylase (EC:3.5.1.18) dapE 1157199..1158308 +
dapF diaminopimelate epimerase (EC:5.1.1.7) dapF complement(2021891..2022724) +
lysA diaminopimelate decarboxylase (EC:4.1.1.20) lysA 1241397..1242734 +
ddh diaminopimelate dehydrogenase (EC:1.4.1.16) Ddh complement(2760062..2761024) +
ask (lysC) Aspartokinase Lysc Alpha And Beta Subunits (EC:2.7.2.4) lysC 269371..270636 +
aspB Aspartate Aminotransferase (EC:2.6.1.1) aspB 256618..257898 +
PTS Phosphotransferase System (PTS); Glucose-Specific Enzyme II BC Component Of PTS (EC:2.7.1.69) ptsG 1424684..1426735 +
zwf glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase (EC:1.1.1.49 1.1.1.363) Zwf 1669327..1670871 +
pgi glucose-6-phosphate isomerase (EC:5.3.1.9) Pgi complement(909227..910849) +
Tkt transketolase (EC:2.2.1.1) Tkt 1665870..1667972 +
fbp 6-phosphofructokinase 1 (EC:2.7.1.11) Cgl1250 1315046..1316086 +
ppc phosphoenolpyruvate carboxylase (EC:4.1.1.31) ppc complement(1678851..1681610) +
pyc pyruvate carboxylase (EC:6.4.1.1) pyc 706684..710106 +
icd isocitrate dehydrogenase (EC:1.1.1.42) Icd complement(679301..681517) -
pck phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) (EC:4.1.1.32) pck complement(3025365..3027197) -
odx Oxaloacetate decarboxylase (EC 4.1.1.3) odx AP017369.1:1508967..1509782 (from C. glutamicum N24) -
hom homoserine kinase (EC:2.7.1.39) Cgl1184 1243855..1244784 -
homoserine dehydrogenase (EC:1.1.1.3); Cgl1183
 1242507..1243844 -
threonine synthase (EC:4.2.3.1) Cgl2220 complement(2353598..2355043) -
실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 온-경로 또는 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO:1의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 2의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 6의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다.
실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 온-경로 또는 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO:1의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 2의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 6의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 3에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다.
본 명세서는 표 4에 제공된 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032 또는 이의 코리네박테리움 글루타미컴 등가물로부터의 온-경로 또는 오프-경로 이종 표적 유전자 중 임의의 하나에 기능적으로 연결된 SEQ ID NOs:1 내지 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 서열 출발 및 단부 위치는 게놈 뉴클레오타이드 어세션 NC_003450.3에 상응한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 상응하는 유전자가 C. 글루타미컴의 다른 균주에 존재하고, 표 4로부터 용이하게 식별될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO:1의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 2의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 6의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다.
C. 글루카미칸 L-메티오닌 생합성 경로
상징 유전자 명칭 (EC #) C. Glutamicum Gene 위치
lysC aspartate kinase [EC:2.7.2.4] Cgl0251 269371..270636
aspartate-semialdehyde dehydrogenase [EC:1.2.1.11] Cgl0252 270660..271694
dapA 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase [EC:4.3.3.7] dapA complement(2079278..2080183)
dapA 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase [EC:4.3.3.7] Cgl2646 2815459..2816397
dapB 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate reductase [EC:1.17.1.8] Cgl1973 complement(2081188..2081934)
dapD 2,3,4,5-tetrahydropyridine-2-carboxylate N-succinyltransferase [EC:2.3.1.117] Cgl1106 complement(1152370..1153263)
dapC N-succinyldiaminopimelate aminotransferase [EC:2.6.1.17] Cgl0814 861592..862755
dapE succinyl-diaminopimelate desuccinylase [EC:3.5.1.18] Cgl1109 1155731..1156840
dapF diaminopimelate epimerase [EC:5.1.1.7] dapF complement(2051842..2052675)
lysA diaminopimelate decarboxylase [EC:4.1.1.20] Cgl1180 1239929..1241266
실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 온-경로 또는 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO:3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 6의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다.
실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 온-경로 또는 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO:1의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 2의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 6의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 4에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다.
본 명세서는 표 5에 제공된 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032 또는 이의 코리네박테리움 글루타미컴 등가물로부터의 오프-경로 이종 표적 유전자 중 임의의 하나에 기능적으로 연결된 SEQ ID NOs:1 내지 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 서열 출발 및 단부 위치는 게놈 뉴클레오타이드 어세션 NC_003450.3에 상응한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 상응하는 유전자가 C. 글루타미컴의 다른 균주에 존재하고, 표 5로부터 용이하게 식별될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO:1의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 2의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 6의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다.
C. 글루타미쿰 오프-경로 표적 유전자
상징 유전자 명칭 (EC #) C. glutamicum Gene 위치
Putative uncharacterized protein Cgl0020 NCgl0019 21501..21872
Rhodanese-related sulfurtransferases NCgl0054 complement(92527..93120)
ureR Transcriptional regulators NCgl0082 complement(128299..128814)
tyrA Prephenate dehydrogenase [EC 1.3.1.12] NCgl0223 complement(283783..284805)
topA DNA topoisomerase 1 [EC 5.99.1.2] NCgl0304 375048..378053
nusG Transcription termination/antitermination protein NusG NCgl0458 604434..605405
rpoB DNA-directed RNA polymerase subunit beta (RNAP subunit beta) [EC 2.7.7.6] NCgl0471 619984..623463
Transcriptional regulators NCgl0601 758218..758801
rhlE Superfamily II DNA and RNA helicases NCgl0737 complement(925165..926439)
prfB Peptide chain release factor 2 (RF-2) NCgl0767 962986..964092
purH Bifunctional purine biosynthesis protein PurH [EC 2.1.2.3], IMP cyclohydrolase [EC 3.5.4.10] NCgl0827 1042072..1043634
Putative uncharacterized protein Cgl1009 NCgl0966 1184332..1185576
rho Transcription termination factor Rho [EC 3.6.4.-] NCgl1152 1386927..1389359
Transcriptional regulator NCgl1261 complement(1533093..1533800)
leuC 3-isopropylmalate dehydratase large subunit [EC 4.2.1.33] NCgl1262 1534054..1535493
ddl D-alanine--D-alanine ligase [EC 6.3.2.4] NCgl1267 1538769..1539844
Predicted transcriptional regulators NCgl1301 1571632..1572609
cmk Cytidylate kinase (CK) [EC 2.7.4.25] NCgl1372 1667477..1668187
ctaB Protoheme IX farnesyltransferase [EC 2.5.1.-] NCgl1511 complement(1826368..1827339)
Transcriptional regulators NCgl2425 complement(2640625..2641119)
tRNA-dihydrouridine synthase [EC 1.3.1.-] NCgl2481 2699108..2700253
Transcriptional regulator NCgl2527 complement(2760930..2761629)
AraC-type DNA-binding domain-containing proteins NCgl2587 2824273..2825286
hspR Predicted transcriptional regulators NCgl2699 complement(2955572..2956012)
dnaK Chaperone protein DnaK (HSP70) NCgl2702 complement(2958093..2959949)
Transcriptional regulator NCgl2802 3083687..3084724
mutM2 Formamidopyrimidine-DNA glycosylase [EC 3.2.2.23] NCgl2898 3217037..3217852
Transcriptional regulator NCgl2921 complement(3246164..3246940)
Uncharacterized membrane protein, putative virulence factor NCgl2982 3305877..3309221
실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO:3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 6의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다.
실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO:1의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 2의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 6의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 5에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다.
실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 나열된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO:1의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 2의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 6의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 나열된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다.
본 명세서는 프로모터 래더를 포함하는 복수의 프로모터 폴리뉴클레오타이드로부터 선택된 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 일부 경우에, 숙주 세포는 프로모터 래더를 포함하는 복수의 형질전환된 숙주 세포의 성분이고, 예를 들어, 복수의 각 세포는 프로모터 래더의 상이한 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 경우에, 복수의 동일하거나 상이한 형질전환된 숙주 세포에서 프로모터 래더의 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 동일한 이종, 예를 들어 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된다. 일부 경우에, 이종 표적 유전자는 쉘 2, 쉘 3 및/또는 쉘 4 이종 표적 유전자이다. 일부 경우에, 이종 표적 유전자는 쉘 3 및/또는 쉘 4 이종 표적 유전자이다. 일부 경우에 이종 표적 유전자는 쉘 4 이종 표적 유전자이다. 일부 경우에, 이종 표적 유전자는 쉘 2 이종 표적 유전자이다. 일부 경우에, 이종 표적 유전자는 쉘 3 이종 표적 유전자이다. 일부 경우에, 이종 표적 유전자는 표 10에 제공된 이종 표적 유전자 또는 임의로 본 발명에 기재된 표 중 어느 하나와 같은 코리네 박테리움 글루 타미쿰으로부터의 이종 표적 유전자이다. 표 10의 서열 시작 및 종료 위치는 게놈 뉴클레오티드 접근 NC_003450.3에 해당한다. 당업자는 상응하는 유전자가 C. 글루 타미쿰의 다른 균주에 존재하고 본 발명으로부터 쉽게 확인될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 경우에, 프로모터 래더를 포함하는 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 비-경로 이종 표적 유전자, 예를 들어 쉘 2, 쉘 3 및/또는 쉘 4 이종 표적 유전자, 표 10에 제공된 오프-경로 이종 표적 유전자, 또는 선택적으로 본 발명에 기재된 표 중 어느 하나의 오프-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NOs: 1 내지 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 경우에 이종 표적 유전자는 쉘 4 이종 표적 유전자이다.
한 실시태양에서, 본 명세서는 쉘 2, 쉘 3 및/또는 쉘 4 이종 표적 유전자, 예를 들어, 표 10에 언급된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO : 1의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 일부 경우에, 이종 표적 유전자는 쉘 4 이종 표적 유전자이다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 쉘 2, 쉘 3 및/또는 쉘 4 이종 표적 유전자, 예를 들어 표 10에 언급된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 2의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 일부 경우에, 이종 표적 유전자는 쉘 4 이종 표적 유전자이다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 쉘 2, 쉘 3 및/또는 쉘 4 이종 표적 유전자, 예를 들어 표 10에 언급된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 일부 경우에, 이종 표적 유전자는 쉘 4 이종 표적 유전자이다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 쉘 2, 쉘 3 및/또는 쉘 4 이종 표적 유전자, 예를 들어 표 10에 언급된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 일부 경우에, 이종 표적 유전자는 쉘 4 이종 표적 유전자이다.
한 실시태양에서, 본 명세서는 쉘 2, 쉘 3 및/또는 쉘 4 이종 표적 유전자, 예를 들어 표 10에 언급된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 일부 경우에, 이종 표적 유전자는 쉘 4 이종 표적 유전자이다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 쉘 2, 쉘 3 및/또는 쉘 4 이종 표적 유전자, 예를 들어 표 10에 언급된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 6의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 일부 경우에, 이종 표적 유전자는 쉘 4 이종 표적 유전자이다.
한 실시태양에서, 본 명세서는 쉘 2, 쉘 3 및/또는 쉘 4 이종 표적 유전자, 예를 들어 표 10에 언급된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 일부 경우에, 이종 표적 유전자는 쉘 4 이종 표적 유전자이다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 쉘 2, 쉘 3 및/또는 쉘 4 이종 표적 유전자, 예를 들어 표 10에 언급된 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 일부 경우에, 이종 표적 유전자는 쉘 4 이종 표적 유전자이다.
한 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 언급된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 언급된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 언급된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 언급된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 언급된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 6의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 언급된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 언급된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 이를 포함한다.
한 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 언급된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 1의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 언급된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 2의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 언급된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 3의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 언급된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 4의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 언급된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 5의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 언급된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 6의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 언급된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 7의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 명세서는 표 10에 언급된 오프-경로 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 숙주 세포는 하나 이상의 프로모터 카세트로 형질전환된 '발현'이라는 제목의 섹션에서 하기에 기술된 유기체를 지칭한다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 숙주 세포는 본 발명에 기술된 바와 같은 하나 이상의 프로모터 카세트를 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 표적 유전자는 아미노산, 유기산, 향료 및 향제, 생물연료, 단백질 및 효소, 중합체/단량체 및 다른 생물물질, 지질, 핵산, 소분자 치료제, 단백질 치료제, 정제 화학물질, 및 기능식품으로부터 선택된 생체분자를 생산하는 생합성 경로와 연관된다.
일부 실시태양에서, 표적 유전자는 항생제, 알칼로이드, 터페노이드, 및 폴리케타이드로부터 선택된 2차 대사산물을 생산하는 생합성 경로와 연관된다. 일부 실시태양에서 표적 유전자는 알코올, 아미노산, 뉴클레오타이드, 항산화제, 유기산, 폴리올, 비타민, 및 지질/지방산으로부터 선택된 1차 대사산물을 생산하는 대사 경로와 연관된다. 일부 실시태양에서, 표적 유전자는 단백질, 핵산, 및 중합체로부터 선택된 거대분자를 생산하는 생합성 경로와 연관된다.
또한, L-아미노산의 생산의 경우 각각의 생합성 경로, 해당(glycolysis), 보충(anaplerosis), 시트르산 사이클, 펜토스 포스페이트 사이클, 아미노산 외수송 및 임의로 조절 단백질의 하나 이상의 효소를 향상, 특히 과발현하는 것이 이로울 수 있다.
따라서, 예를 들어, L-아미노산의 생산의 경우, 하기 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 향상, 특히 과발현되는 것이 이로울 수 있다: 다이하이드로다이피콜리네이트 신타제를 암호화하는 유전자 dapA(유럽 특허 제EP-B 0 197 335)호; 엔올라제를 암호화하는 유전자 eno(독일 특허 제DE: 19947791.4호); 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자 gap(문헌[Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086]); 트라이오스포스페이트 아이소머라제를 암호화하는 유전자 tpi(문헌[Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086]); 3-포스포글리세레이트 카이나제를 암호화하는 pgk(문헌[Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086]); 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자 zwf(일본 특허 제JP-A-09224661호); 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 유전자 pyc(독일 특허 제DE-A-198 31 609호; 문헌[Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086]); 말레이트-퀴논-옥사이도리덕타제를 암호화하는 유전자 mqo(문헌[Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)]); 피드백-저항성 아스파테이트 카이나제를 암호화하는 유전자 lysC(어세션 번호 P26512); 라이신 외수송을 암호화하는 유전자 lysE(독일 특허 제DE-A-195 48 222호); 호모세린 디하이드로게나제을 암호화하는 유전자 hom(유럽 특허 제EP-A 0131171호); 트레오닌 디하이드라타제을 암호화하는 유전자 ilvA(문헌[Moeckel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065-8072)]) 또는 피드백-저항성 트레오닌 디하이드라타제을 암호화하는 대립유전자 ilvA(Fbr)(문헌[Moeckel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842]); 아세토하이드록시 산 신타제를 암호화하는 유전자 ilvBN(유럽 특허 제EP-B 0356739호); 다이하이드록시산 디하이드라타제을 암호화하는 유전자 ilvD(문헌[Sahm and Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979]); 및 Zwa1 단백질을 암호화하는 유전자 zwa1(독일 특허 제DE: 19959328.0호, DSM 13115). 추가로, L-아미노산의 생산의 경우 또한 하기 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 감쇠, 특히 감소시키는 것이 이로울 수 있다: 포스포엔올 피루베이트 카복시카이나제를 암호화하는 유전자 pck(독일 특허 제DE 199 50 409.1호; DSM 13047); 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제를 암호화하는 유전자 pgi(미국 특허 제6,586,214호; DSM 12969); 피루베이트 옥시다제를 암호화하는 유전자 poxB(독일 특허 제DE: 1995 1975.7호; DSM 13114); 및 Zwa2 단백질을 암호화하는 zwa2(독일 특허 제DE: 19959327.2호, DSM 13113).
또한, 아미노산, 특히 L-라이신의 생산의 경우, 바람직하지 않은 부반응을 제거하는 것이 추가로 이로울 수 있다(문헌[Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982]).
따라서, 본 발명에 따른 프로모터는 각각의 경우에 C. 글루타미컴에서 표적 유전자를 과발현 또는 저발현하기 위해서 사용될 수 있다.
표적 생체분자의 생성 최적화를 위한 보조 표적 유전자의 확인 방법
표적 생체분자 생성을 향상시키기 위해 발현 및/또는 활성의 조절을 위한 보조 표적 유전자를 선별 및/또는 확인하는 방법이 본 발명에 기술되어 있다. 일부 경우에, 이종 보조 표적 유전자는 쉘 2, 쉘 3 및/또는 쉘 4 표적 유전자이다. 일부 경우에, 이종 보조 표적 유전자는 쉘 3 및/또는 쉘 4 표적 유전자이다. 일부 경우에, 이종 보조 표적 유전자는 쉘 4 표적 유전자이다. 전형적으로 상기 방법은 형질전환된 숙주 세포의 라이브러리를 선별하는 것을 포함하며, 여기서 라이브러리의 개별 형질전환된 숙주 세포는 라이브러리의 다른 형질전환된 세포와 비교하여 상이한[프로모터 폴리뉴클레오타이드 : 작동 가능하게 연결된 이종 보조 표적 유전자] 조합을 포함한다. 이어서, 이러한 조합은 표적 생체분자 생성을 개선시키고 표적 생체분자의 제조에 사용되거나 추가로 최적화된 라이브러리로부터 확인될 수 있다.
따라서, 상기 방법은 이러한 라이브러리를 제공 및/또는 이러한 라이브러리를 선별 및/또는 개선된 표적 분자 생성을 나타내는 형질전환체를 확인 및/또는 이러한 개선된 형질전환체를 분리 및/또는 이러한 개량된 형질전환체를 저장 또는 확장시키는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 프로모터 래더를 포함한다.
일반적으로, 라이브러리의 형질전환된 숙주 세포는 온-경로 변형을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 온-경로의 변형은 라이브러리의 모든, 본질적으로 모든, 실질적으로 모든 또는 대부분의 형질전환된 세포에 대해 동일하다. 예를 들어, 라이신 생산의 경우, 라이브러리의 모든, 본질적으로 모든, 실질적으로 모든 또는 대부분의 형질전환된 세포는 온-경로의 이종 표적 유전자 lysA에 작동 가능하게 연결된 프로모터 폴리뉴클레오타이드 및/또는 온-경로의 이종 표적 유전자(들)에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 다른 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 형질전환된 숙주 세포는 야생형 균주 배경을 포함하여 내인성 온-경로의 표적 유전자가 그들의 상응하는 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
형질전환된 세포의 라이브러리는 프로모터 래더를 포함할 수 있으며, 여기서 프로모터 래더의 개별 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 라이브러리의 상이한 세포에 있다. 일반적으로, 프로모터 래더의 상이한 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 상이한 형질전환 세포에서 동일한 이종 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되어있다. 예로서, 8개의 상이한 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 갖고 단일 이종 보조 표적 유전자를 조사하는 프로모터 래더를 포함하는 라이브러리의 경우, 최소 라이브러리 크기는 하나의 세포가 각각의 가능한[프로모터 폴리뉴클레오타이드 : 작동 가능하게 연결된 이종 보조 표적 유전자] 조합을 함유하는 8개의 세포, 또는 하나의 세포가 프로모터 래더의 프로모터 폴리뉴클레오타이드가 없는 대조군 세포인 9개의 세포이다. 당업자는 형질전환된 숙주 세포의 라이브러리가 최소의 세포 세트 또는 이의 라이브러리 또는 이의 서브세트의 최소의 중복 복제물을 복수 (예를 들어,> 10;> 100;> 1,000; 10-1,000; 10-10,000; 또는 100-100,000)를 포함할 수 있음을 이해할 수 있다. 라이브러리는 각각의 조사된 이종 보조 표적 유전자에 대한 추가 세포 세트를 추가로 포함할 수 있어서, 각각의 조사된 이종 보조 표적 유전자는 상이한 세포에서 프로모터 래더의 상이한 프로모터 폴리뉴클레오타이드 각각에 작동 가능하게 연결된다. 이는 라이브러리의 각 세포가 상이한 [프로모터 폴리뉴클레오타이드 : 작동 가능하게 연결된 이종 보조 표적 유전자] 조합을 조사하는 실험인 세포 세트를 제공한다.
라이브러리는 당업자에게 이용 가능한 다수의 기술에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 선택된 배경(예를 들어, lysA 과발현을 위해 변형된)을 갖는 다수의 숙주 세포는 실질적으로 모든 형질전환체가 단일[프로모터 폴리뉴클레오타이드 작동 가능하게 연결된 이종 보조 표적 유전자] 조합을 함유하도록 단일 변형되는 조건하에서 재조합 벡터의 라이브러리로 형질전환될 수 있다. 재조합 벡터는 통합 벡터 일 수 있으며, 제공하는 단계는 숙주 세포의 게놈을 조작하는 것을 포함한다. 형질전환체는 분리, 저장 및/또는 확장될 수 있고, 선택적으로 표적 분자 생성에 대해 분석될 수 있다. 예시적인 분리 방법은 제한 없이 희석, 도금, 스트리킹 및/또는 콜로니 피킹을 포함한다. 예시적인 저장 방법은 동결 보존 또는 포자 형성을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 형질전환체를 분리하고, 적합한 동결 보호제(예를 들어, 글리세롤)와 혼합하고, 얼음 결정 형성을 제한하기에 적합한 조건하에서 극저온 냉동시키고 저장시킬 수 있다.
또한, 조사된 이종 보조 표적 유전자는 복수의(예를 들어, 2개 이상의) 상이한 온-경로의 변형 배경에서 분석될 수 있다. 상이한 온-경로의 배경의 분석은 동시에, 예를 들어 병렬로 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 라이신의 생성을 증가시키기 위한 형질전환된 숙주 세포의 라이브러리는 lysA 과발현 변형을 갖고 복수의[프로모터 폴리뉴클레오타이드 작동 가능하게 연결된 이종 표적 유전자] 조합을 조사하는 형질전환된 숙주 세포의 제 1 서브-라이브러리; 및 다른 또는 추가의 온-경로의 수정을 가짐으로써 제 1 서브 라이브러리와 다른 제 2 서브 라이브러리를 포함할 수 있다. 유사하게, 라이브러리는 오프-경로 변형 배경 및 복수의 [프로모터 폴리뉴클레오타이드 작동 가능하게 연결된 이종 표적 유전자] 조합을 조사 및/또는 복수의 [프로모터 폴리뉴클레오타이드 작동 가능하게 연결된 이종 보조 표적 유전자] 조합을 조사하는 것을 포함하거나 추가로 포함할 수 있다. 예로서, 라이신의 생성을 증가시키기 위한 형질전환된 숙주 세포의 라이브러리는 온-경로 lysA 과발현 변형; 오프-경로 pgi 과발현 변형; 및 다양한[프로모터 폴리뉴클레오타이드 작동 가능하게 연결된 이종 보조 표적 유전자] 조합을 포함하는 배경을 갖는 형질전환된 숙주 세포를 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 방법은 표적 생체분자의 생성 증가를 나타내는 복수의 숙주 세포로부터 숙주 세포를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 확인 단계는 숙주 세포를 확인하기 위한 재현성 필터 및 표적 생체분자의 증가된 생성을 재현할 수 있는 기본 [프로모터 폴리뉴클레오타이드 작동 가능하게 연결된 이종 보조 표적 유전자] 조합을 포함한다. 예를 들어, 확인 단계는 각각의 [프로모터 폴리 뉴클레오티드 작동 가능하게 연결된 이종 보조 표적 유전자] 조합의 중복 복제물을 분석할 수 있고, 모든, 실질적으로 모든 또는 대부분의 여분 복제물에서 재현 가능하게 개량된 표적 생체분자 생산을 나타내는 조합을 확인할 수 있다. 다른 예로서, 선택된 통계적 유의 수준(예를 들어, p <0.05, 0.01, 0.005 또는 0.001)을 충족시키지 않는 조합을 배제하기 위해 통계 필터가 적용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 방법은 라이브러리를 제공하는 반복 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 라이브러리가 제공되고 배양될 수 있으며, 표적 생체분자의 생성 증가를 나타내는 하나 이상의 숙주 세포는 라이브러리의 제 2 라운드 생성 및 선별을 위한 배경 균주를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 후속 반복은 선행 숙주 세포 라이브러리의 2개 이상의 개별 숙주 세포 중에서 선택된 유전자 변이의 조합인 독특한 유전자 변이를 보유하는 개별 숙주 세포를 포함하는 새로운 숙주 세포 라이브러리를 생성한다. 생성된 숙주 세포가 선택된 수준의 표적 생체분자 생성 개량을 획득할 때까지; 라이브러리 제공 및 스크리닝의 추가 라운드가 감소하는 개량을 보일 때까지; 또는 개량 최고점까지 반복을 여러 번 수행 할 수 있다. 한 실시태양에서, 적어도 하나의 라운드는 이종 보조 표적 유전자를 조사한다. 추가로 또는 대안적으로, 온-경로 유전자는 선택적으로 이종 보조 표적 유전자의 추가 조사와 조합하여 라이브러리 생성 및 선별의 초기 또는 이후 라운드에서 조사될 수 있다.
링커
표적 유전자는, 두 폴리뉴클레오타이드가 직접 또는 링커 올리고뉴클레오타이드 또는 링커 폴리뉴클레오타이드에 의해서 서로에 기능적으로 연결되도록, 본 발명에 따른 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 하류, 즉 3' 단부에 위치된다. 프로모터 및 표적 유전자는 링커 올리고뉴클레오타이드 또는 링커 폴리뉴클레오타이드에 의해서 서로에 기능적으로 연결되는 것이 바람직하다. 상기 링커 올리고뉴클레오타이드 또는 링커 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드로 이루어진다.
이와 관련하여, 표현 "직접 서로에 기능적으로 연결된"은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 3' 단부에서 뉴클레오타이드가 표적 유전자의 출발 코돈의 제1 뉴클레오타이드에 직접 연결된다는 것을 의미한다. 이것은 5'-말단 AUG 출발 코돈에서 즉시 출발하는 "무리더(leaderless)" mRNA를 유발하고, 따라서 임의의 다른 번역 개시 신호를 갖지 않는다.
이와 관련하여, 표현 "링커 올리고뉴클레오타이드에 의해서 서로에 기능적으로 연결된"은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 3' 단부에서 뉴클레오타이드가 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클로레오타이드에 의해서 표적 유전자의 출발 코돈의 제1 뉴클레오타이드에 연결된다는 것을 의미한다.
이와 관련하여, 표현 "링커 폴리뉴클레오타이드에 의해서 서로에 기능적으로 연결된"은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8의 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 3' 단부에서 뉴클레오타이드가 6 내지 600개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 폴리뉴클로레오타이드에 의해서 표적 유전자의 출발 코돈의 제1 뉴클레오타이드에 연결된다는 것을 의미한다.
이와 관련하여, 표현 "서로에 기능적으로 연결된"은 표적 유전자의 전사 및 합성된 RNA의 번역이 보장되도록 하는 방식으로, 표적 유전자가 본 발명에 따른 프로모터 폴리뉴클레오타이드에 결합된 것을 의미한다.
기술 요건에 따라서, 링커 폴리뉴클레오타이드는 하기와 같다:
6 - 600, 6 - 500, 6 - 400, 6 - 300, 6 - 200, 6 - 180, 6 -160, 6 - 140, 6 - 120, 6 - 100, 6 - 80, 6 - 60, 6 - 50, 6 - 40, 6 - 30, 6 - 28, 6 - 27, 6 - 26, 또는 6 - 25; 또는
8 - 600, 8 - 500, 8 - 400, 8 - 300, 8 - 200, 8 - 180, 8 -160, 8 - 140, 8 - 120, 8 - 100, 8 - 80, 8 - 60, 8 - 50, 8 - 40, 8 - 30, 8 - 28, 8 - 27, 8 - 26, 또는 8 - 25; 또는
10 - 600, 10 - 500, 10 - 400, 10 - 300, 10 - 200, 10 - 180, 10 - 160, 10 - 140, 10 - 120, 10 - 100, 10 - 80, 10 - 60, 10 - 50, 10 - 40, 10 - 30, 10 - 28, 10 - 27, 10 - 26, 또는 10 - 25; 또는
12 - 600, 12 - 500, 12 - 400, 12 - 300, 12 - 200, 12 - 180, 12 - 160, 12 - 140, 12 - 120, 12 - 100, 12 - 80, 12 - 60, 12 - 50, 12 - 40, 12 - 30, 12 - 28, 12 - 27, 12 - 26, 또는 12 - 25; 또는
14 - 600, 14 - 500, 14 - 400, 14 - 300, 14 - 200, 14 - 180, 14 - 160, 14 - 140, 14 - 120, 14 - 100, 14 - 80, 14 - 60, 14 - 50, 14 - 40, 14 - 30, 14 - 28, 14 - 27, 14 - 26, 또는 14 - 20; 또는
16 - 600, 16 - 500, 16 - 400, 16 - 300, 16 - 200, 16 - 180, 16 - 160, 16 - 140, 16 - 120, 16 - 100, 16 - 80, 16 - 60, 16 - 50, 16 - 40, 16 - 30, 16 - 28, 16 - 27, 16 - 26, 또는 16 - 25; 또는
18 - 600, 18 - 500, 18 - 400, 18 - 300, 18 - 200, 18 - 180, 18 - 160, 18 - 140, 18 - 120, 18 - 100, 18 - 80, 18 - 60, 18 - 50, 18 - 40, 18 - 30, 18 - 28, 18 - 27, 18 - 26, 또는 18 - 25; 또는
20 - 600, 20 - 500, 20 - 400, 20 - 300, 20 - 200, 20 - 180, 20 - 160, 20 - 140, 20 - 120, 20 - 100, 20 - 80, 20 - 60, 20 - 50, 20 - 40, 20 - 30, 20 - 28, 20 - 27, 20 - 26, 또는 20 - 25개의 뉴클레오타이드 길이.
특히 바람직한 실시태양에서, 링커 폴리뉴클레오타이드는 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 뉴클레오타이드 길이인데, 그 이유는 이것이 기능성 구조체를 바람직하게 생산하기 때문이다.
따라서 본 발명은 추가로, 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8, 프로모터 폴리뉴클레오타이드로 본질적으로 이루어진 분리된 프로모터 폴리뉴클레오타이드에 관한 것인데, 이것은 이의 3' 단부에서 뉴클레오타이드를 통해서, 직접 또는 RNA의 번역을 보장하는 링커 폴리뉴클레오타이드에 의해서, 이의 5' 단부에서 ATG 또는 GTG 출발 코돈을 함유하고, 하나 이상의 오프-경로 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 표적 유전자에 기능적으로 연결된다. 프로모터 및 표적 유전자는 링커 폴리뉴클레오타이드에 의해서 서로에 기능적으로 연결되는 것이 바람직하다.
본 발명은 추가로 또한, 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8, 프로모터 폴리뉴클레오타이드로 본질적으로 이루어진 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것인데, 이것은 이의 3' 단부에서 뉴클레오타이드를 통해서 링커 올리고뉴클레오타이드에 기능적으로 연결된다.
또한, 본 발명은 추가로, 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8, 프로모터 폴리뉴클레오타이드로 본질적으로 이루어진 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것인데, 이것은 이의 3' 단부에서 뉴클레오타이드를 통해서 RNA의 번역을 보장하는 링커 폴리뉴클레오타이드에 기능적으로 연결된다.
이와 관련하여, 용어 "본질적으로"는 1,000개 이하, 800개 이하, 700개 이하, 600개 이하, 500개 이하, 또는 400개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 폴리뉴클레오타이드가, 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8, 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 5' 단부에 부가된 것 및 1,000개 이하, 800개 이하, 700개 이하, 600개 이하, 500개 이하, 또는 400개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 폴리뉴클레오타이드가 표적 유전자의 3'에 부가된 것, 또는 15,000개, 10,000개 이하, 7,500개 이하, 5,000개 이하, 2,500개 이하, 1,000개 이하, 800개 이하, 700개 이하, 600개 이하, 500개 이하, 또는 400개 이하의 뉴클레오타이드 길이의 폴리뉴클레오타이드가 링커 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드의 3' 단부에 부가된 것을 의미한다.
폴리뉴클레오타이드의 상기 3종의 목록으로부터의 특징부의 임의의 유용한 조합물은 본 명세서에서 본 발명에 따른다. "유용한 조합물"은, 예를 들어, 효율적인 재조합이 수행되는 특징부의 조합물을 의미한다. 대체될 DNA 영역을 플랜킹하는 동일한 길이를 부가하여 사용하는 것은 실험 절차에서 상동 재조합에 의한 영역의 전달을 용이하게 한다. 비교적 긴 랭킹 상동 영역은 환형 DNA 분자들 사이에서 효율적인 재조합에 이롭지만, 그 플랭크의 길이가 증가함에 따라서 대체 벡터의 클로닝은 더 어려워진다(문헌[Wang et al., Molecular Biotechnology 32:43-53 (2006)]).
또한, 링커 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드의 3' 단부에서의 플랭크는, 3' 단부가 이의 5' 단부에서 ATG 또는 GTG 출발 코돈을 함유하고, 하나 이상의 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 표적 유전자에 기능적으로 연결될 때 15,000개 이하의 뉴클레오타이드 길이로 증가한다.
링커 폴리뉴클레오타이드의 이들 특히 바람직한 실시태양는 이로운 방식으로 RNA의 번역을 보장한다.
예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8, 프로모터 폴리뉴클레오타이드, RNA의 번역을 보장하는 링커 폴리뉴클레오타이드, 및 이의 5' 단부에서 ATG 또는 GTG 출발 코돈을 갖는 하나 이상의 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 표적 유전자 간의 화학적 연결을 용이하게 하기 위해서, 클로닝을 위해서 필요한 기능성 뉴클레오타이드 서열이 이의 5' 단부 및 3' 단부에서 상기 폴리뉴클레오타이드에 혼입될 수 있고, 상기 클로닝 후에도 적어도 부분적으로 유지된다.
용어 "클로닝을 위해서 필요한 기능성 뉴클레오타이드 서열"은 본 명세서에서 임의의 REII(제II형 제한 엔도뉴클레아제) 절단 부위가 존재한다는 것을 나타내고, 이의 서열은 일반적으로 4 내지 8개의 뉴클레오타이드로 이루어진다.
또한, 제한 엔도뉴클레아제에 대한 전달 부위를 제거하기 위해서 돌연변이 생성 프라이머 또는 신규(de novo) 유전자 합성(예를 들어, GENEART AG(레젠버그(Regensburg)(독일 소재))에 의해서)에 의한 부위-특이적인 돌연변이 생성이 후속 클로닝 단계를 위해서 상기 절단 부위가 이롭게 사용되는 것을 가능하게 하기 위해서 서열에 사일런트 돌연변이를 도입할 수 있다고 본 명세서에서 언급되어야 한다.
RNA의 번역을 보장하는 링커 폴리뉴클레오타이드에 기능적으로 연결되는 본 발명에 따른 프로모터로부터 발생한 폴리뉴클레오타이드가 하기 본 명세서에 발현 단위로서 또한 지칭된다.
발현
본 발명은 추가로 미생물에서 표적 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드를 발현하기 위한 본 발명에 따른 프로모터 또는 본 발명에 따른 발현 단위의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프로모터 또는 본 발명에 따른 발현 단위는 합성된 RNA, 바람직하게는 mRNA의, 폴리펩타이드로의 전사 및 번역을 보장한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 미생물의 형질전환된 세포를 지칭한다.
본 개시 내용은, 상기에 상세하게 기술된 재조합 핵산 및 재조합 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 본 개시 내용은 추가로 둘 이상의 재조합 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 숙주 세포는 3종의 재조합 핵산으로 형질전환된다. 상기에 제공된 바와 같이, 핵산은 목적하는 산물의 수율에 대한 전체 효과를 기반으로 하는 생합성 경로로부터 선택될 수 있다. 본 명세서의 숙주 세포에 혼입될 수 있는 재조합 핵산의 수는 실제로 제한이 없다. 발현은 바람직하게는 코리네박테리움 속의 미생물에서 수행된다. 하기 종을 기반으로 하는 코리네박테리움 속 내의 균주가 바람직하다: DSM44549인 기탁된 표준 균주를 갖는 C. 에피션스(efficiens); ATCC13032인 기탁된 표준 균주를 갖는 C. 글루타미컴; 및 C. ATCC6871인 기탁된 표준 균주를 갖는 암모니아제네스(ammoniagenes). C. 글루타미컴 종이 매우 특별하게 바람직하다. 이러한 방식에서, 상응하는 숙주에 존재하지 않거나 검출 가능하지 않은, 특성, 바람직하게는 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 것이 가능하다. 따라서, 예를 들어, 유카와(Yukawa) 등은 구성적 Ptrc 프로모터의 제어 하에서 C. 글루타미컴 R에서 D-자일로스를 사용한 대장균 유전자의 발현을 기술한다(문헌[Applied Microbiology and Biotechnology 81, 691-699 (2008)).
본 명세서는 상기에 기술된 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열의 제어 하에서 생합성 경로의 둘 이상의 유전자를 갖는 C. 글루타미컴과 같은 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 다양한 실시태양에서, 하나 이상의 표적 유전자(예를 들어, 보조 표적 유전자 및/또는 쉘 2 및/또는 쉘 3 및/또는 쉘 4 표적 유전자)는 상기에 기술된 바와 같은 SEQ ID NOs:1 내지 8의 서열을 갖는 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열의 제어 하에 있다. 다른 실시태양에서, 하나 이상의 표적 유전자는 상기에 기술된 바와 같은 SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 서열을 갖는 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열의 제어 하에 있다.
본 명세서에 따른 특정 실시태양에서, C. 글루타미컴 숙주 세포는 SEQ ID NOs:1 내지 8의 서열을 갖는 프로모터의 제어 하에서 둘 이상의 표적 유전자를 갖는다. 본 명세서에 따른 특정 다른 실시태양에서, C. 글루타미컴 숙주 세포는 SEQ ID NOs:1, 5 또는 7의 서열을 갖는 프로모터의 제어 하에서 둘 이상의 표적 유전자를 갖는다. 상동 재조합을 사용하여, 본 개시 내용의 프로모터는 내생 프로모터 및 내생 서열을 대체하여 이종 유전자에 기능적으로 연결된 프로모터를 제조한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 재조합이 이의 네이티브 유전자좌에서 유전자를 유지하면서 내생 프로모터의 대체를 유발한다는 것을 인지할 것이다. 특정 비제한적인 예가 하기 표 8에 설명되어 있다. 다중 프로모터-이종 표적쌍(예를 들어, 프로모터 카세트)은 숙주 세포의 게놈으로 쉽게 도입될 수 있다. 실시태양에서, 프로모터 카세트는 숙주 세포에 순차적으로 혼입될 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 개시 내용의 재조합 벡터는 단일 구조체에서 둘 이상의 상이한 프로모터 카세트를 제공한다. 본 명세서는 기술된 방법을 사용하여 개발될 수 있는 프로모터 대체물의 수에 어떤 실제 제한도 제공하지 않는다.
또한, 프로모터 래더를 포함하는 복수의 숙주 세포가 기술되며, 여기서 복수의 하나의 세포는 이종 표적 유전자, 예를 들어 보조 표적 유전자, 쉘 2 표적 유전자, 쉘 3 표적에 작동 가능하게 연결된 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함한다 유전자, 또는 쉘 4 표적 유전자를 포함하고, 복수의 제 2 세포는 동일한 이종 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 제 2 프로모터 폴리 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 제 1 및 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 프로모터 래더의 상이한 프로모터 폴리뉴클레오타이드이다.
일부 경우에, 복수의 숙주 세포는 동일한 이종 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 제 3 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복수의 제 3 세포를 추가로 포함하며, 여기서 제 3 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 제 1 및 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드와 상이한 프로모터 래더의 프로모터 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 경우에, 복수의 숙주 세포는 동일한 이종 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 제 4 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복수의 제 4 세포를 추가로 포함하고, 여기서 제 4 프로모터 폴리 뉴클레오티드는 제 1, 제 2 및 제 3 프로모터 폴리뉴클레오타이드와 상이한 프로모터 래더의 프로모터 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 경우에, 복수의 숙주 세포는 동일한 이종 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 제 5 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복수의 제 5 세포를 추가로 포함하며, 여기서 제 5 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 프로모터 폴리뉴클레오타이드와 상이한 프로모터 래더의 프로모터 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 경우에, 복수의 숙주 세포는 동일한 이종 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 제 6 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복수의 제 6 세포를 추가로 포함하며, 여기서 제 6 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 제 1, 제 2, 제 3, 제 4 및 제 5 프로모터 폴리뉴클레오타이드와 상이한 프로모터 래더의 프로모터 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 경우에, 복수의 숙주 세포는 동일한 이종 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 제 7 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복수의 제 7 세포를 추가로 포함하며, 여기서 제 7 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5 및 제 6 프로모터 폴리뉴클레오타이드와 상이한 프로모터 래더의 프로모터 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 경우에, 복수의 숙주 세포는 동일한 이종 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 제 8 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복수의 제 8 세포를 추가로 포함하며, 여기서 제 8 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6 및 제 7 프로모터 폴리뉴클레오타이드와 상이한 프로모터 래더의 프로모터 폴리뉴클레오타이드이다.
일부 경우에, 프로모터 래더의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7 및/또는 제 8 프로모터 폴리뉴클레오타이드 각각은 SEQ ID NO:1-8로부터 선택된다. 일부 경우에, 프로모터 래더의 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1, 5 및 7로부터 선택된다. 복수의 세포의 수는 적어도 약 1 x 105, 1 x 106 또는 1 x 107 세포를 포함할 수 있다.
실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007-lysA 및 Pcg3121-pgi를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg1860-pyc 및 Pcg0007-zwf를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007-lysA 및 Pcg0007-zwf를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3121-pck 및 Pcg0007-zwf를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007_39-ppc 및 Pcg0007-zwf를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3121-pck 및 Pcg3121-pgi를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3381-ddh 및 Pcg0007-zwf를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007_265-dapB 및 Pcg0007-zwf를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007-zwf 및 Pcg3121-pgi를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3381-ddh 및 Pcg3121-pgi를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3121-pgi 및 Pcg1860-pyc를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg1860-pyc 및 Pcg0007_265-dapB를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg1860-pyc 및 Pcg0007-lysA를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg1860-asd 및 Pcg0007-zwf를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007_265-dapB 및 Pcg3121-pgi를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg1860-pyc 및 Pcg1860-asd를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3381-aspB 및 Pcg1860-pyc를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3381-fbp 및 Pcg1860-pyc를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3381-ddh 및 Pcg3381-fbp를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0755-ptsG 및 Pcg3121-pgi를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg1860-pyc 및 Pcg3121-pck를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg1860-asd 및 Pcg3121-pgi를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg1860-asd 및 Pcg3381-fbp를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007_39-lysE 및 Pcg3381-fbp를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3381-fbp 및 Pcg0007-lysA를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007_39-lysE 및 Pcg1860-pyc를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3121-pgi 및 Pcg3381-fbp를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3121-pck 및 Pcg0007-lysA를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007-lysA 및 Pcg0007_265-dapB를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007_265-dapB 및 Pcg1860-asd를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3121-pgi 및 Pcg0007_265-dapD를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007-lysA 및 Pcg3381-ddh를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3121-pck 및 Pcg1860-asd를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007-lysA 및 Pcg1860-asd를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3121-pck 및 Pcg0007_265-dapB를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3381-ddh 및 Pcg1860-asd를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007_39-ppc 및 Pcg1860-asd를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007_39-ppc 및 Pcg0007-lysA를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3381-ddh 및 Pcg0007_265-dapB를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007_265-dapB 및 Pcg3381-fbp를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007_39-ppc 및 Pcg0007_265-dapB를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3381-aspB 및 Pcg3121-pck를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007_265-dapB 및 Pcg0007_265-dapD를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007_39-lysE 및 Pcg3381-aspB를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007_39-lysE 및 Pcg0007_265-dapD를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3381-aspB 및 Pcg0007_265-dapB를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg1860-asd 및 Pcg0007_265-dapD를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3381-aspB 및 Pcg0007-lysA를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg3381-aspB 및 Pcg3381-ddh를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0755-ptsG 및 Pcg1860-pyc를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0755-ptsG 및 Pcg3381-fbp를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0007-zwf 및 Pcg3381-fbp를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다. 실시태양에서 숙주 세포는 프로모터 카세트 Pcg0755-ptsG 및 Pcg0007_265-dapD를 포함하는 유전자 이식된 C. 글루타미컴 숙주 세포이다.
본 발명은 상기에 기술된 바와 같은 3종 이상의 프로모터 카세트를 갖는 숙주 세포를 제공하고, 이를 포함한다. 실시태양에서, 숙주 세포는 Pcg0007_39-zwf, Pcg0007_39-lysA 및 Pcg1860-pyc 프로모터 카세트를 포함한다. 실시태양에서, 숙주 세포는 C. 글루타미컴 숙주 세포이다.
한 실시태양에서, 숙주 세포는 상기 프로모터 카세트의 임의의 하나를 포함 및/또는 pcg0007_39-dnak; pcg0007_39-cg0074; pcg3121-cg0074; pcg1860-rhle_609; pcg3121-cg1144; pcg1860-rhle_609; pcg0007_39-cg2899_2194; pcg0007_39-cg1486; pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-cmk; pcg0007_39-rpob_383; pcg0007_39-ddl; pcg0007_39-cg0027; pcg0007_39-ddl; pcg0007_39-rpob_383; pcg0007_39-rpob_383; pcg0007_39-cg0027; pcg1860-cg1144; pcg0007_39-cg0725; pcg0007_39-cg0027; pcg0007_39-cg1527; pcg0007_39-ddl; pcg0007_39-rpob_383; pcg0007_39-cg0725; pcg0007_39-cg0725; pcg0007_39-ddl; pcg0007_39-cg0725; pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-cg0725; pcg0007_39-hspr; pcg0007_39-cg3352; pcg0007_39-cg2899_2194; pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-cg2965; pcg0007_39-rpob_383; pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-cg2899_2194; pcg0007_39-cg0074; pcg3121-cg0074; pcg0007_39-cg2766; pcg3121-cg1144; pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-cg2899; pcg0007_39-rho; pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-cg0725; pcg1860-cg1144; pcg0007_39-cg2766 pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-urer; pcg0007_39-nusg; pcg3121-mutm2_2522; pcg0007_39-ddl; pcg1860-cg1144; pcg0007_39-cg2899; pcg0007_39-cg2965; pcg0007_39-ddl; pcg3121-mutm2_2522; pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-cg2766; pcg0007_39-tyra; pcg0007_39-cg1486; pcg0007_39-cg2899; pcg0007_39-cg0027; pcg0007_39-ncgl1511; pcg0007_39-ncgl1262; pcg0007_39-cg3419; pcg0007_39-cg1486; pcg0007_39-cg3210; pcg0007_39-cg1486; pcg0007_39-cg1486; pcg0007_39-cg1486; pcg0007_39-cg1486; pcg0007_39-ncgl0767; pcg0007_39-ncgl2481; pcg0007_39-tyra; pcg0007_39-cg1486; pcg0007_39-ncgl1511; pcg0007_39-ncgl0827; pcg0007_39-tyra; pcg0007_39-cg1486; pcg0007_39-ncgl1262; pcg0007_39-cg1486; pcg0007_39-ncgl1262; pcg0007_39-ncgl1262; pcg0007_39-ncgl0767; pcg0007_39-ncgl0304; pcg0007_39-ncgl1511; pcg0007_39-ncgl0767; pcg0007_39-ncgl1262; pcg0007_39-ncgl1511; pcg0007_39-ncgl0767; pcg0007_39-ncgl0767; pcg0007_39-ncgl1262; pcg0007_39-cg1486; pcg0007_39-ncgl1262; pcg0007_39-ncgl0304; pcg0007_39-ncgl1262; pcg0007_39-ncgl0767; pcg0007_39-ncgl1262 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 전부의 조합을 포함한다.
본 발명에 따른 프로모터 또는 본 발명에 따른 발현 단위는 추가로 예를 들어, 수율, 역가, 생산성, 부산물 제거, 공정 전이에 대한 용인, 최적 성장 온도 및 성장률을 포함할 수 있는, 미생물의 성능 특징을 개선시키기 위해서 사용된다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 프로모터 또는 본 발명에 따른 발현 단위는 미생물에서 표적 유전자를 상향-조절(과발현)하기 위해서 사용된다. 과발현은 일반적으로 출발 균주(모 균주) 또는 야생형 균주(후자가 출발 균주인 경우)와 비교하여 리보핵산, 단백질(폴리펩타이드) 또는 효소의 세포내 농도 또는 활성을 증가시키는 것을 의미한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 프로모터 또는 본 발명에 따른 발현 단위는 미생물에서 표적 유전자를 하향-조절(저발현)하기 위해서 사용된다. 저발현은 일반적으로 출발 균주(모 균주) 또는 야생형 균주(후자가 출발 균주인 경우)와 비교하여 리보핵산, 단백질(폴리펩타이드) 또는 효소의 세포내 농도 또는 활성을 감소시키는 것을 의미한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 프로모터 및/또는 발현 단위의 조합물 미생물에서 1종을 초과하는 표적 유전자의 발현을 조절하기 위해서 사용되며, 여기서 각각의 표적 유전자는 상항-조절 또는 하향-조절된다. 일부 실시태양에서 프로모터 및/또는 발현 단위의 조합물에 의해서 상향- 또는 하향-조절된 표적 유전자는 동일한 대사 경로의 일부이다. 일부 실시태양에서 프로모터 및/또는 발현 단위의 조합물에 의해서 상향- 또는 하향-조절된 표적 유전자는 동일한 대사 경로의 일부가 아니다.
본 명세서에 기술된 프로모터는 예를 들어 약한 프로모터를 사용하거나 또는 낮은 활성을 갖는 상응하는 효소를 암호화하거나 또는 상응하는 유전자 또는 효소(단백질)을 불활성화시키는 유전자 또는 대립 유전자를 사용함으로써 상응하는 DNA에 의해서 암호화된 미생물에서 하나 이상의 효소(단백질)의 세포내 활성을 감쇠(감소 또는 제거)시키기 위해서 관련 기술 분야에 매우 널리 공지된 다른 방법과 조합하여 사용될 수 있고, 임의로는 이들 조치를 조합할 수 있다.
유전자 발현의 감소는 적합한 배양 또는 유전자 발현의 신호 구조의 유전적 변형(돌연변이)에 의해서 일어날 수 잇다. 유전자 발현의 신호 구조는 예를 들어, 억제 유전자, 활성 유전자, 작동인자, 프로모터, 감쇠인자, 리보솜 결합 부위, 출발 코돈 및 종결인자이다. 전문가는 이에 대한 정보를, 예를 들어 특허 출원 제WO 96/15246호, 문헌[Boyd and Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988))], [Voskuil and Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998)], [Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998))], [Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996))], [Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999))] 및 유전 및 분자 생물학의 공지된 문헌, 예컨대, 예를 들어 크니퍼스(Knippers)에 의한 문헌("Molekulare Genetik [Molecular Genetics]", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995)] 또는 비나커(Winnacker)에 의한 문헌("Gene und Klone [Genes and Clones]", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990)]에서 찾아볼 수 있다.
효소 단백질의 촉매 특성의 변화 또는 감소로 이어지는 돌연변이는 선행 기술로부터 공지되어 있고; 언급될 수 있는 예는 퀴(Qiu) 및 굿만(Goodman)(Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), 수기모토(Sugimoto) 등(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) 및 뫼켈(Moeckel)("Die ThreonindehydrataseausCorynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms [Threonine dhydratase from Corynebacterium glutamicum: Cancelling the allosteric regulation and structure of the enzyme]", Reports from the Juelich Research Centre, Juel-2906, ISSN09442952, Juelich, Germany, 1994)의 작업이다. 포괄적인 설명은 유전 및 분자 생물학의 공지된 문헌, 예컨대, 예를 들어 하게만(Hagemann)에 의한 문헌("Allgemeine Genetik [General Genetics]", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986)에서 찾아볼 수 있다.
가능한 돌연변이는 전이, 전환, 삽입 및 결손이다. 효소 활성에 대한 아미노산 변화의 효과에 따라서, 미스센스 돌연변이 또는 논센스 돌연변이가 지칭된다. 유전자에서 적어도 하나의 염기쌍의 삽입 또는 결손은 프레임 이동 돌연변이로 이어지는데, 이는 이의 결과로서 부정확한 아미노산이 혼입되거나 또는 번역이 조기에 방해되기 때문이다. 몇몇 코돈의 결손은 전형적으로 효소 활성의 완전한 손실로 이어진다. 이러한 돌연변이의 생성에 대한 설명은 선행 기술이고, 유전 및 분자 생물학의 공지된 문헌, 예컨대, 예를 들어, 크니퍼스의 문헌("Molekulare Genetik [Molecular Genetics]", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995), 비나커에 의한 문헌("Gene und Klone [Genes and Clones]", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990) 또는 하게만에 의한 문헌("Allgemeine Genetik [General Genetics]", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986)에서 찾아볼 수 있다. C. 글루타미컴의 유전자를 돌연변이화시키는 일반적인 방법은 슈바저(Schwarzer) 및 퓔러(Puehler)에 의해서 기술된 유전자 파괴 및 유전자 교환 방법이다(Bio/Technology 9, 84-87 (1991)).
유전자 파괴 방법에서, 관심 유전자의 암호 영역의 중심 부분은 C. 글루타미컴에서가 아니라, 숙주(전형적으로 E. 콜라이)에서 복제할 수 있는 플라스미드 벡터에서 클로닝된다. 가능한 벡터는, 예를 들어, pSUP301(문헌[Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)]), pK18mob 또는 pK19mob(Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994)]), pK18mobsacB 또는 pK19mobsacB(문헌[Jaeger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)]), pGEM-T(프로메가 코퍼레이션(Promega corporation)(미국 위스콘신주 매디슨 소재)), pCR2.1-TOPO(문헌[Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84]; 미국 특허 제5,487,993호), pCR(등록상표)블런트(Blunt)(인비트로젠(Invitrogen)(네덜란드 그로닌겐 소재); 문헌[Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)]) 또는 pEM1(문헌[Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516])이다. 이어서, 유전자의 암호 영역의 중심 부분을 함유하는 플라스미드 벡터는 접합 또는 형질전환에 의해서 C. 글루타미컴의 목적하는 균주로 전달된다. 접합 방법은 예를 들어, 문헌[Schaefer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994))]에 기술되어 있다. 형질전환 방법은 예를 들어, 문헌[Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988))], [Dunican and Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989))] 및 [Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994))]에 기술되어 있다. "교차(cross-over)" 사건에 의한 상동 재조합 후, 해당 유전자의 암호 영역은 벡터 서열에 의해서 방해되고, 2개의 불완전한 대립유전자가 수득되는데, 하나는 3' 단부가 결손된 것이고, 하나는 5' 단부가 결손된 것이다. 이 방법은 C. 글루타미컴의 recA 유전자를 제거하기 위해서 예를 들어, 피츠패트릭(Fitzpatrick) 등(문헌[Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)])에 의해서 사용되었다.
유전자 교환 방법에서, 돌연변이, 예컨대, 예를 들어, 결손, 삽입 또는 염기 교환은 관심 유전자에서 시험관내에서 확립된다. 제조된 대립유전자는 이번에는 C. 글루타미컴에 대해서 복제성이 아닌 벡터에서 클로닝되고, 이것은 이어서 형질전환 또는 접합에 의해서 C. 글루타미컴의 목적하는 숙주로 전달된다. 통합을 야기하는 제1 "교차" 사건 및 표적 유전자에서 또는 표적 서열에서 절제를 야기하는 적합한 제2 "교차" 사건에 의해서 상동 재조합 후, 돌연변이 또는 대립유전자의 혼입이 달성된다. 이 방법은 예를 들어 C. 글루타미컴의 pyc 유전자를 결손에 의해서 제거하기 위해서 페터스-웬디쉬(Peters-Wendisch)(문헌[Microbiology 144, 915-927 (1998)])에 의해서 사용되었다.
본 명세서에 기술된 프로모터는 예를 들어 유전자의 복사체 또는 유전자들의 수를 증가시키거나, 강한 프로모터를 사용하거나, 또는 강한 활성을 갖는 상응하는 효소를 암호화하는 유전자를 사용함으로써, 상응하는 DNA에 의해서 암호화되는 유기체에서 하나 이상의 효소의 세포내 활성을 증가(향상)시키기 위해서 관련 기술 분야에 매우 널리 공지된 다른 방법과 조합하여 사용될 수 있고, 임의로는 이들 조치를 조합할 수 있다.
과발현을 달성하기 위해서 상응하는 유전자의 복사체 수를 증가시키거나, 또는 대안적으로 구조체 유전자의 상류에 위치된 프로모터 및 조절 영역 또는 리보솜 결합 부위를 돌연변이화할 수 있다. 구조체 유전자의 상류에 혼입된 발현 카세트가 동일한 방식으로 작용한다. 유도성 프로모터에 의해서, 효소 아미노산 생산의 과정 동안 발현을 증가시키는 것이 또한 가능하다. 발현은 m-RNA의 수명을 연장시킬 목적의 조치에 의해서 유사하게 개선된다. 추가로, 효소 활성은 또한 효소 단백질의 분해를 예방함으로써 향상된다. 유전자 또는 유전자 구조체는 상이한 수의 복사체를 갖는 플라스미드 중에 존재할 수 있거나, 또는 염색체 내에에서 통합 및 증폭될 수 있다. 대안적으로, 관련 유전자의 과발현은 배지의 조성 및 배양 조건을 변경함으로써 추가로 달성될 수 있다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 특히 문헌[Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987))], [Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994))], [Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))], [Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991))], 유럽 특허 명세서 제0 472 869호, 미국 특허 제4,601,893호, 문헌[Schwarzer and Puehler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)], [Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))], [LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))], 특허 출원 제WO 96/15246호, 문헌[Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993))], 일본 공개 명세서 제JP-A-10-229891호, 문헌[Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))], [Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996))] 및 유전 및 분자 생물학에 대한 공지된 문헌에서 상기에 대한 상세 사항을 찾아볼 수 있다.
유전자는 예를 들어 에피좀 플라스미드에 의해서 과발현될 수 있다. 적합한 플라스미드는 코리네형 박테리아 내에서 복제된 것이다. 다수의 공지된 플라스미드 벡터, 예컨대 예를 들어 pZ1(문헌[Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554)], pEKEx1(문헌[Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)) 또는 pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)])가 잠적(cryptic) 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1을 기반으로 한다. 다른 플라스미드 벡터, 예컨대 예를 들어 pCG4(미국 특허 제4,489,160호), 또는 pNG2(문헌[Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)]), 또는 pAG1(미국 특허 제5,158,891호)을 기반으로 하는 것이 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
추가로, 또한 염색체 내에서 통합에 의해서 유전자 증폭의 과정이 사용될 수 있는 것의 도움을 받는 플라스미드 벡터가 적합하고, 예컨대 예를 들어, hom-thrB 오페론의 복제 및 증폭에 대한 문헌[Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))]에 기술되어 있다. 이러한 방법에서, 완전한 유전자는 C. 글루타미컴이 아닌 숙주(전형적으로, E. 콜라이) 내에서 복제할 수 있는 플라스미드 벡터 내로 클로닝된다. 적합한 벡터는 예를 들어 pSUP301(문헌[Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)]), pK18mob 또는 pK19 mob(문헌[Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994)]), pGEM-T(프로메가 코퍼레이션, 미국 위스콘신주 매디슨 소재), pCR2.1-TOPO(문헌[Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84]; 미국 특허 제5,487,993호), pCR(등록상표)블런트(인비트로젠, 네덜란드 그로닌겐 소재); 문헌[Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993))], pEM1(문헌[Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516]) 또는 pBGS8(문헌[Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342])이다. 이어서, 증폭될 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터는 C. 글루타미컴의 목적하는 균주 내에서의 접합 또는 형질전환에 의해서 전달된다. 접합 방법은 예를 들어, 문헌[Schaefer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994))]에 기술되어 있다. 형질전환 방법은 예를 들어, 문헌[Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988))], [Dunican and Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989))] 및 [Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994))]에 기술되어 있다. 교차 사건에 의한 상동 재조합 후, 생성된 균주는 관련 유전자의 적어도 2개의 복사체를 함유한다.
유전자 발현의 조절 방법, 즉 증가 또는 감소 방법은 시험관내에서 제공된 DNA 분자를 사용하여 미생물이 생산되는 재조합 방법을 포함한다. 이러한 DNA 분자는 예를 들어, 프로모터, 발현 카세트, 유전자, 대립유전자, 암호 영역 등을 포함한다. 이들은 형질전환, 접합, 형질도입 방법 또는 유사한 방법에 의해서 목적하는 미생물 내에 도입된다.
본 발명의 경우에, 프로모터는 바람직하게는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8의 폴리뉴클레오타이드이고, 발현 카세트는 바람직하게는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8의 폴리뉴클레오타이드인데, 이것은 이의 3' 단부에서 뉴클레오타이드를 통해서 링커 폴리뉴클레오타이드(이것은 RNA의 번역을 보장함)에 기능적으로 연결된다.
본 발명에 따른 프로모터 또는 본 발명에 따른 발현 유닛을 사용하는 과발현의 조치는 과발현을 유발하는 조치 전에 균주 중의 상기 폴리펩타이드의 활성 또는 농도를 기준으로, 상응하는 폴리펩타이드의 활성 또는 농도를 통상적으로 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 바람직하게는 1,000%, 2,000%, 4,000%, 10,000% 또는 20,000% 이하만큼 증가시킨다.
발현 또는 과발현의 정도는 유전자로부터 전사된 mRNA의 양을 측정하고, 폴리펩타이드의 양을 결정하고, 효소 활성을 결정함으로써 설정될 수 있다.
mRNA의 양은 특히 "노던 블로팅(Northern Blotting)" 및 정량 RT-PCR 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 정량 RT-PCR은 중합효소 연쇄 반응 이전에 역전사를 포함한다. 이를 위해서, 예를 들어 문헌[Jungwirth et al. (FEMS Microbiology Letters 281, 190-197 (2008))]에 기술된 바와 같이, 로슈 다이어그나스틱스(Roche Diagnostics)(베링거 만하임 게엠베하(Boehringer Mannheim GmbH), 로슈 몰레큘러 바이오케미컬스(Roche Molecular Biochemicals), 만하임, 저머니(Mannheim, Germany))로부터의 라이트사이클러(상표명) 시스템(LightCycler™ System)이 사용될 수 있다. 단백질의 농도는 겔에서 적절한 평가 소프트웨어를 사용하여 1-차원 및 2-차원 단백질 겔 분별 및 후속의 단백질 농도의 광학 식별을 통해서 측정될 수 있다. 코리네형 박테리아에 대한 단백질 겔의 통상적인 제조 방법 및 상기 단백질의 통상적인 식별 방법은 문헌[Hermann et al. (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001))]에 기술된 절차이다. 단백질 농도는 마찬가지로 검출될 단백질에 대해서 특이적인 항체를 사용한 웨스턴-블롯 혼성화(문헌[Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]) 및 농도 결정을 위한 적절한 소프트웨어를 사용한 후속 광학 평가(문헌[Lohaus and Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2630-2647 (1999)])에 의해서 측정될 수 있다. 수집된 데이터의 통계학적 유의성은 T 시험(문헌[Gosset, Biometrika 6(1): 1-25 (1908)])에 의해서 결정된다.
본 발명에 따른 프로모터를 사용한 표적 유전자의 과발현 조치는 추가 과발현 조치와 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 과발현은 선행 기술에서 사용 가능한 다중도에 의해서 달성된다. 이들은 유전자의 발현을 안내 또는 제어하는 뉴클레오타이드 서열을 변형하는 것에 더하여 복사체 수를 증가시키는 것을 포함한다. 복사체 수는, 미생물의 세포질 내에서 복제하는 플라스미드에 의해서 증가될 수 있다. 이로 인해서, 플라스미드의 존재비는 미생물의 매우 상이한 군에 대해서 선행 기술에 기술되어 있고, 이러한 플라스미드는 유전자의 복사체 수의 목적하는 증가를 설정하기 위해서 사용될 수 있다. 코리네박테리움 속에 적합한 플라스미드는 예를 들어, 문헌[Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 27-40, (2003))], 및 문헌[Stansen et al. (Applied and Environmental Microbiology 71, 5920-5928 (2005))]에 기술되어 있다.
복사체 수는 추가 복사체를 미생물의 염색체 내에 도입함으로써 적어도 하나(1)의 복사체가 추가로 증가될 수 있다. 코리네박테리움 속에 적합한 방법은 예를 들어, 특허 제WO 03/014330호, 제WO 03/040373호 및 제WO 04/069996호에 기술되어 있다.
유전자 발현은 표적 유전자의 상류에 복수의 프로모터를 위치시키거나 또는 그것을 발현될 유전자에 기능적으로 연결시키고, 이러한 방식으로 증가된 발현을 달성함으로써 추가로 증가될 수 있다. 이의 예는 특허 제WO 2006/069711호에 기술되어 있다.
유전자의 전사는, 적절한 경우, 전사를 억제(억제 단백질)하거나 또는 촉진(활성화 단백질)시키는 단백질에 의해서 제어된다. 따라서, 과발현은 활성화 단백질의 발현을 증가시키거나, 억제 단백질의 발현을 감소 또는 차단하거나, 억제 단백질의 결합 부위를 달리 제거함으로써 마찬가지로 달성될 수 있다. 연장률은 암호 사용에 의해서 영향을 받고, 출발 균주에서 빈번한 RNA(tRNA)를 전달하기 위해서 코돈을 사용함으로써 번역을 향상시키는 것이 가능하다. 더욱이, 출발 코돈을 다수의 미생물 에서 가장 빈번한(E. 콜라이에서 77%) ATG 코돈으로 대체하는 것은 번역을 상당히 개선시킬 수 있는데, 그 이유는 예를 들어 문헌(Khudyakov et al., FEBS Letters 232(2):369-71(1988)]; Reddy et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82(17):5656-60 (1985))에서와 같이, RNA 수준에서, AUG 코돈은 코돈 GUG 및 UUG보다 2배 내지 3배 더 효과적이기 때문이다. 또한 출발 코돈 주변의 서열을 최적화시키는 것이 가능한데, 그 이유는 출발 코돈과 플랜킹 영역 간의 상승작용 효과가 기술되어 있기 때문이다(문헌[Stenstroem et al., Gene 273(2):259-65 (2001)]; [Hui et al., EMBO Journal 3(3):623-9 (1984)]).
DNA 취급, DNA의 분해 및 결찰, 형질전환 및 형질전환체의 선택에 대한 설명은 특히 문헌[Sambrook et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 의해서 공지된 매뉴얼에서 찾아볼 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
키르크너(Kirchner) 및 토취(Tauch)(문헌[Journal of Biotechnology 104:287-299 (2003))]는 C. 글루타미컴에서 사용된 벡터의 선택을 기술한다.
본 발명에 따른 벡터를 사용한 상동 재조합은 염색체 상의 DNA 분절이 벡터에 의해서 세포에 수송되는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드로 대체되는 것을 허용한다. 벡터의 환형 DNA 분자와 염색체 상의 표적 DNA 간의 효율적인 재조합을 위해서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드로 대체될 DNA 영역은 벡터의 통합 부위 및 DNA의 교환 부위를 결정하는 표적 부위에 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 단부에 제공된다.
따라서, 본 발명에 따른 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 1) 염색체에서 표적 유전자의 네이티브 유전자 좌에서 네이티브 프로모터로 대체될 수 있거나, 또는 2) 후자의 네이티브 유전자 좌 또는 또 다른 유전자 좌에서 표적 유전자와 통합될 수 있다.
"표적 유전자의 네이티브 유전자 좌에서 네이티브 프로모터의 교환"은 유전자의 자연 발생 프로모터(이것은 통상적으로 이의 뉴클레오타이드 서열의 형태에서 상응하는 야생형 또는 상응하는 출발 유기체에서 이의 유전자 좌에서 단일 복사체에 의해서 본래 존재함)가 대체된다는 사실을 의미한다.
"또 다른 유전자 좌"는 뉴클레오타이드 서열이 표적 유전자의 서열과 상이한 유전자 좌를 의미한다. 상기 다른 유전자 좌 또는 상기 다른 유전자 좌에서 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 염색체 내에 위치되고, 일반적으로 성장 및 목적하는 화학 화합물의 생산에 필수적이지 않다. 추가로 염색체 내의 유전자 사이 영역, 즉, 암호 기능이 없는 뉴클레오타이드 서열을 사용하는 것이 가능하다.
발현 또는 과발현은 바람직하게는 코리네박테리움 속의 미생물에서 수행된다. 코리네박테리움 속 내에서, 하기 종을 기반으로 하는 균주가 바람직하다: DSM44549인 기탁된 표준 균주를 갖는 C. 에피션스; ATCC13032인 기탁된 표준 균주를 갖는 C. 글루타미컴; 및 C. ATCC6871인 기탁된 표준 균주를 갖는 암모니아제네스. C. 글루타미컴 종이 매우 특별하게 바람직하다.
코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미컴 종의 적합한 균주가 특히 공지된 야생형 균주이다: 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032, 코리네박테리움 아세토글루타미컴 ATCC15806, 코리네박테리움 아세토아시도필리움(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola ) ATCC17965, 코리네박테리움 써모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869, 및 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020; 및 이들로부터 제조된 L-아미노산-생산 돌연변이체, 또는 균주, 예컨대, 예를 들어, L-라이신-생산 균주: 코리네박테리움 글루타미컴 FERM-P 1709, 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708, 브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM-P 1712, 코리네박테리움 글루타미컴 FERM-P 6463, 코리네박테리움 글루타미컴 FERM-P 6464, 코리네박테리움 글루타미컴 DM58-1, 코리네박테리움 글루타미컴 DG52-5, 코리네박테리움 글루타미컴 DSM5714, 및 코리네박테리움 글루타미컴 DSM12866.
용어 "마이크로코쿠스 글루타미쿠스(Micrococcus glutamicus)"가 또한 C. 글루타미컴에 대해서 사용되어 왔다. C. 에피션스 종의 일부 대표자는 또한 선행 기술에서 C. 써모아미노제네스, 예컨대 예를 들어, 균주 FERM BP-1539로서 지칭되어 왔다.
본 발명에 따른 발현 또는 과발현의 조치에 대해서 사용되는 미생물 또는 균주(출발 균주)는 바람직하게는 주변 영양 배지로 목적하는 정제 화학물질을 분비하고, 그것을 축적하는 능력을 이미 보유한다. 표현 "생산하는"은 또한 하기 본 명세서에 대해서 사용된다. 보다 구체적으로, 과발현 조치를 위해서 사용되는 균주는 세포 또는 영양 배지에 목적하는 정제 화학물질을 120시간 이하, 96시간 이하, 48시간 이하, 36시간 이하, 24시간 이하, 또는 12시간 이하 동안, 적어도 0.10g/L, 적어도 0.25g/L, 적어도 0.5g/L, 적어도 1.0g/L, 적어도 1.5g/L, 적어도 2.0g/L, 적어도 4.0g/L, 또는 적어도 10.0g/L의 농도로 축적하는 능력을 보유한다. 출발 균주는 바람직하게는 돌연변이 생성 및 선택에 의해서, 재조합 DNA 기술에 의해서, 또는 두 방법 모두의 조합에 의해서 제조된 균주이다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명의 조치에 적합한 미생물은 또한 먼저 야생 균주, 예컨대, 예를 들어 C. 글루타미컴 표준 균주 ATCC 13032 또는 균주 ATCC 14067에서 표적 유전자의 과발현 또는 저발현을 위해서 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8, 본 발명에 따른 프로모터를 사용하고, 이어서 선행 기술에 기술된 추가 유전자 조치에 의해서, 미생물이 목적하는 정제 화학물질(들)을 생산하게 함으로써 수득될 수 있다는 것을 이해한다.
용어 "생체분자"는 본 발명의 조치와 관련하여 아미노산, 유기산, 비타민, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 의미한다. 프로테이노제닉 아미노산, 비-프로테이노제닉 아미노산, 거대분자, 및 유기산이 특히 바람직하다.
"프로테이노제닉 아미노산"은 자연 단백질, 즉, 미생물, 식물, 동물 및 인간의 단백질에 존재하는 아미노산을 의미한다. 이것은 이것이 펩타이드 결합을 통해서 서로에 연결된 단백질에 대한 구조 단위로서 기능한다.
L-아미노산 또는 아미노산이 본 명세서 하기에 언급되는 경우, 이것은 L-아스파라긴, L-트레오닌, L-세린, L-글루타메이트, L-글리신, L-알라닌, L-시스테인, L-발린, L-메티오닌, L-아이소루신, L-루신, L-타이로신, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-라이신, L-트립토판 및 L-아르기닌 군으로부터 선택된, 이들의 염을 비롯한, 하나 이상의 아미노산을 의미하는 것으로 이해된다. L-라이신이 특히 바람직하다. L-아미노산, 특히 라이신은 인간 의약 및 약제학 산업에서, 식품 산업에서, 매우 특별하게는 동물 사료에서 사용된다. 따라서 아미노산, 특히 L-라이신의 제조를 위한 개선된 신규 공정을 제공하는 것이 일반적으로 흥미롭다.
용어 단백질 및 폴리펩타이드는 상호 교환 가능하다.
본 발명은 정제 화학물질을 생산하는 미생물을 제공하며, 상기 미생물은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8로부터 선택된 프로모터와 같은 프로모터 래더의 프로모터를 사용함으로써, 특히 출발 균주에 비교할 때, 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시킨다.
발효 제조법
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 정제 화학물질의 발효 제조 공정을 추가로 제공한다:
a) 본 발명에 따른 상기에 기술된 미생물을 적합한 배지 중에서 배양하여, 발효 브로스를 생성하는 단계; 및
b) a)의 발효 브로스 및/또는 미생물의 세포에서 정제 화학물질을 농축시키는 단계.
본 명세서에서 정제 화학물질-함유 발효 브로스로부터 정제 화학물질 또는 액체 또는 고체 정제 화학물질-함유 산물을 수득하는 것이 바람직하다. 생산된 미생물을 목적하는 유기-화학 화합물을 생산하기 위한 목적으로 ―예를 들어, 특허 제WO 05/021772호에 기술된 바와 같이― 연속적으로 또는 회분식 공정(회분식 배양)으로 불연속적으로 또는 유가식 또는 반복 유가식 공정으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법에 대한 일반적인 요약은 케미엘(Chmiel)에 의한 문헌(Bioprozeβtechnik. 1: Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) 또는 소토하스(Storhas)에 의한 문헌(Bioreaktoren and periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))에서 입수 가능하다.
사용될 배양 배지 또는 발효 배지는 적합한 방식으로 각각의 균주의 요건을 충족해야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지의 설명은 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 존재한다. 용어 배양 배지 및 발효 배지는 상호 교환 가능하다.
탄소 공급원으로서, 설탕 및 탄수화물, 예컨대, 예를 들어, 글루코스, 수크로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 당밀, 사탕무 또는 사탕수수 가공으로부터의 수크로스-함유 용액, 전분, 전분 가수분해물, 및 셀룰로스; 오일 및 지방, 예컨대, 예를 들어, 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛 지방; 지방산, 예컨대, 예를 들어, 팔미트산, 스테아르산, 및 리놀레산; 알코올, 예컨대, 예를 들어, 글리세롤, 메탄올, 및 에탄올; 및 유기산, 예컨대, 예를 들어, 아세트산 또는 락트산을 사용할 수 있다.
질소 공급원으로서, 유기 질소-함유 화합물, 예컨대 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분, 및 우레아; 또는 무기 화합물, 예컨대 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 및 질산암모늄을 사용할 수 있다. 질소 공급원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
인 공급원으로서, 인산, 포타슘 다이하이드로겐 포스페이트 또는 다이포타슘 하이드로겐 포스페이트 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 사용할 수 있다.
배양 배지는 추가로 염을, 예를 들어 금속, 예컨대, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 철의 클로라이드 또는 설페이트 형태로, 예컨대 예를 들어 황산마그네슘 또는 황산철을 포함할 수 있고, 이것은 성장에 필수적이다. 마지막으로, 필수 성장 인자, 예컨대 아미노산, 예를 들어 호모세린 및 비타민, 예를 들어 티아민, 비오틴 또는 판토텐산이 상기에 언급된 물질에 더하여 사용될 수 있다.
상기 출발 물질은 단일 배취의 형태로 배양물에 첨가될 수 있거나 또는 적합한 방식으로 배양 동안 공급될 수 있다.
배양물의 pH는 염기성 화합물, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 수성 암모니아; 또는 산 화합물, 예컨대 인산 또는 황산을 적합한 방식으로 사용함으로써 제어될 수 있다. pH는 일반적으로는 6.0 내지 8.5, 바람직하게는 6.5 내지 8의 값으로 조정된다. 거품 생성을 제어하기 위해서, 소포제, 예컨대, 예를 들어, 지방산 폴리글리콜 에스터를 사용할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지시키기 위해서, 배지에 적합한 선택된 물질, 예컨대, 예를 들어, 항생제를 첨가할 수 있다. 발효는 바람직하게는 호기 조건하에서 수행된다. 이들 조건을 유지시키기 위해서, 산소 또는 산소-함유 기체 혼합물, 예컨대, 예를 들어, 공기가 배양물에 도입된다. 과산화수소가 풍부한 액체를 마찬가지로 사용할 수 있다. 발효는, 적절한 경우, 승압, 예를 들어 0.03 내지 0.2MPa의 승압에서 수행된다. 배양물의 온도는 일반적으로는 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃, 특히 바람직하게는 30℃ 내지 37℃이다. 회분식 또는 유가식 공정에서, 배양은 바람직하게는 회수되기에 충분한 목적하는 유기-화학 화합물의 양이 형성될 때까지 계속된다. 이러한 목적은 일반적으로 10시간 내지 160시간 내에 달성된다. 연속식 공정에서, 더 긴 배양 시간이 가능하다. 미생물의 활성은 발효 배지 및/또는 상기 미생물의 세포에서 유기-화학 화합물의 농축(축적)을 유발한다.
적합한 발효 배지의 예는 특히 특허 제US 5,770,409호, 제US 5,990,350호, 제US 5,275,940호, 제WO 2007/012078호, 제US 5,827,698호, 제WO 2009/043803호, 제US 5,756,345호 및 제US 7,138,266호에서 찾아볼 수 있다.
발효 동안 1회(들) 이상에서 농도를 측정하기 위한 L-아미노산의 분석은 이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해서 L-아미노산을 분리하고, 그 후 문헌[Spackman et al. (Analytical Chemistry 30:1190-1206 (1958))]에 기술된 바와 같이, 닌하이드린을 사용하여 칼럼-후 유도체화함으로써 수행될 수 있다. 컬럼-후 유도체화를 위해서 닌하이드린 대신에 오르토-프탈다이알데하이드를 또한 사용할 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피에 대한 개요 문헌은 문헌[Pickering (LC-GC Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989))]에서 찾아볼 수 있다.
마찬가지로 오르토-프탈다이알데하이드 또는 페닐 아이소싸이오사이아네이트를 사용하여 컬럼-전 유도체화를 수행하고, 생성된 아미노산 유도체를 바람직하게는 고-성능 액체 크로마토그래피(HPLC)의 형태의 역-상(RP) 크로마토그래피에 의해서 분별시킬 수 있다. 이러한 유형의 방법은 예를 들어, 문헌[Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51:1167-1174 (1979))]에 기술되어 있다.
검출은 광도계(흡광, 형광)에 의해서 수행된다.
아미노산 분석법에 대한 검토는 특히, 로츠페이크(Lottspeich) 및 조르바스(Zorbas)의 문헌["Bioanalytik"(Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany 1998)]에서 찾아볼 수 있다.
발효 과정 동안 하나 이상의 시간 지점(들)에서 α-케토산의 농도의 측정은 케토산 및 다른 분비된 산물을, 예를 들어 0.025M의 황산에 의해서, H+ 형태로 설폰화 스타이렌-다이바이닐벤젠 중합체 상에서의, 이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는, 양이온 교환 크로마토그래피에 의해서 분리하고, 그 이후에 215nm(대안적으로 또한 230 또는 275nm)에서의 UV 검출함으로써 수행될 수 있다. 바람직하게는, REZEK RFQ - 패스트 프룻(Fast Fruit) H+ 칼럼(페노메넥스(Phenomenex))이 사용될 수 있지만, 상 분리를 위한 다른 공급물(예를 들어, 바이오라드(BioRad)로부터의 애미넥스(Aminex))이 실현 가능하다. 유사한 분리는 그 공급원에 의해서 응용예에 기술되어 있다.
농도(단위 부피당 형성된 화합물), 수율(소모된 단위 탄소 공급원당 형성된 화합물), 형성(단위 부피 및 시간당 형성된 화합물) 및 특이적인 형성(단위 건조 세포 물질 또는 건조 바이오매스당 형성된 화합물 또는 단위 세포 단백질 및 시간당 형성된 화합물) 또는 그 밖의 다른 공정 파라미터 및 이들의 조합의 군으로부터 선택된 파라미터 중 하나 이상과 관련하여, 본 발명에 따른 프로모터 변종을 함유하는 공정 또는 발효 공정의 성능은 본 발명에 따른 프로모터 변종을 함유하지 않는 미생물을 사용하는 공정 또는 발효 공정을 기준으로 적어도 0.5%, 적어도 1%, 적어도 1.5%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 100% 증가된다. 이것은 대규모 산업 공정과 관련하여 매우 가치가 있다고 간주된다.
발효 조치는 목적하는 정제 화학물질, 바람직하게는 아미노산, 유기산, 비타민, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 함유하는 발효 브로스를 생성한다.
이어서, 정제 화학물질을 함유하는 산물을 액체 또는 고체 형태로 제공, 생산, 또는 회수한다.
발효 브로스는 미생물이 특정 시간 및 특정 온도에서 배양되는 발효 배지 또는 영양 배지를 의미한다. 발효 동안 발효 배지 또는 배지들은 목적하는 화합물의 생산 및 전형적으로는 증식 및 생존을 보장하는 모든 물질 또는 성분을 포함한다.
발효가 완결될 때, 생성된 발효 브로스는 따라서 하기를 포함한다:
a) 미생물의 바이오매스(세포 물질), 상기 바이오매스는 상기 미생물의 세포의 증식으로 인해서 생산됨;
b) 발효 동안 형성된 목적하는 정제 화학물질;
c) 발효 동안 가능하게 형성되는 유기 부산물; 및
d) 사용된 발효 배지 또는 출발 물질의 구성요소, 예컨대, 예를 들어, 비타민, 예컨대 비오틴 또는 염, 예컨대 마그네슘 설페이트(이것은 발효시 소모되지 않음).
유기 부산물은 목적하는 특정 화합물에 더하여 발효에서 사용된 미생물에 의해서 생산되고, 임의로 분비되는 물질을 포함한다.
발효 브로스를 배양 용기 또는 발효 탱크로부터 제거하고, 적절한 경우 수집하고, 액체 또는 고체 형태로 정제 화학물질을 함유하는 산물을 제공하는 데 사용한다. 표현 "정제 화학물질-함유 산물을 회수하는"이 또한 이것을 위해서 또한 사용된다. 가장 단순한 경우에, 발효 탱크로부터 제거된, 정제 화학물질-함유 발효 브로스 자체가 회수된 산물을 구성한다.
하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조치 중 하나 이상이 목적하는 유기-화학 화합물의 농축 및 정제를 달성한다:
발효 브로스로부터의, a) 물의 부분적인 제거(0% 초과 내지 80% 미만) 내지 완전한 제거(100%) 또는 사실상 완전한 제거(80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상);
b) 바이오매스의 부분적인 제거(0% 초과 내지 80% 미만) 내지 완전한 제거(100%) 또는 사실상 완전한 제거(80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상), 후자는 제거 전에 임의로 불활성화됨;
c) 발효 동안 형성된 유기 부산물의 부분적인 제거(0% 초과 내지 80% 미만) 내지 완전한 제거(100%) 또는 사실상 완전한 제거(80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.3% 이상, 또는 99.7% 이상); 및
d) 발효에서 소모되지 않은 사용된 발효 배지 또는 출발 물질의 구성요소의 부분적인 제거(0% 초과) 내지 완전한 제거(100%) 또는 사실상 완전한 제거(80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.3% 이상, 또는 99.7% 이상). 상기 화합물의 목적하는 함량을 갖는 산물을 이러한 방식으로 단리한다.
물의 부분적인 제거(0% 초과 내지 80% 미만) 내지 완전한 제거(100%) 또는 사실상 완전한 제거(80% 이상 내지 100% 미만)(조치 a))는 또한 건조로서 지칭된다.
공정의 한 변형에서, 물, 바이오매스, 유기 부산물 및 사용된 발효 배지의 소모되지 않은 구성요소의 완전한 제거 또는 사실상 완전한 제거는 목적하는 유기-화학 화합물의 순수한(80중량% 이상, 90중량% 이상) 또는 고-순도(95중량% 이상, 97중량% 이상, 또는 99중량% 이상) 산물 형태를 생성한다. 조치 a), b), c) 및 d)를 위한 기술적인 지시 사항의 존재비는 선행 기술에서 입수 가능하다.
요건에 따라서, 바이오매스를 분리 방법, 예컨대, 예를 들어, 원심분리, 여과, 경사분리 또는 이들의 조합에 의해서 발효 브로스로부터 완전히 또는 부분적으로 분리할 수 있거나, 또는 그 내에 완전히 남겨둘 수 있다. 적절한 경우, 바이오매스 또는 바이오매스-함유 발효 브로스를 적합한 공정 단계 동안, 예를 들어, 열 처리(가열)에 의해서 또는 산의 첨가에 의해서 불활성화시킨다.
일 절차에서, 바이오매스를 완전히 또는 사실상 완전히 제거하여, 0(0%) 또는 최대 30%, 최대 20%, 최대 10%, 최대 5%, 최대 1% 또는 최대 0.1%의 바이오매스가 제조된 산물 중에 남긴다. 추가 절차에서, 바이오매스를 제거하지 않거나, 또는 단지 적은 비율로 제거하여, 모든(100%) 또는 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 99.9% 초과의 바이오매스가 제조된 산물 중에 남아있다. 본 발명에 따른 한 공정에서, 따라서, 바이오매스를 0% 이상 내지 100% 이하의 비율로 제거한다.
마지막으로, 최종 산물의 취급 특성을 개선시키도록, 발효 후 수득된 발효 브로스를, 바이오매스의 완전한 제거 또는 부분적인 제거 전에 또는 후에, 무기산, 예컨대, 예를 들어, 염화수소산, 황산, 또는 인산; 또는 유기산, 예컨대, 예를 들어, 프로피온산을 사용하여 산성 pH로 조정할 수 있다(영국 특허 제1,439,728호 또는 유럽 특허 제1 331220호). 바이오매스의 완전한 함량을 갖는 발효 브로스를 산성화시키는 것이 마찬가지로 가능하다. 마지막으로, 소듐 바이설파이트(NaHCO3, 영국 특허 제1,439,728호) 또는 또 다른 염, 예를 들어 아황산의 암모늄, 알칼리 금속, 또는 알칼리 토금속 염을 첨가함으로써 브로스를 또한 안정화시킬 수 있다.
바이오매스의 제거 동안, 발효 브로스에 존재하는 임의의 유기 또는 무기 고체를 부분적으로 또는 완전히 제거한다. 발효 브로스에 용해된 유기 부산물, 및 발효 배지의 용해된 소모되지 않은 구성요소(출발 물질)는 적어도 부분적으로(0% 초과), 바람직하게는 적어도 25%의 정도로, 특히 바람직하게는 적어도 50%의 정도로, 매우 특히 바람직하게는 적어도 75%의 정도로 산물 중에 남아있다. 적절한 경우, 이것은 또한 완전히(100%) 또는 사실상 완전히 남아있는데, 이는 생성물 중에서 95% 초과 또는 98% 초과 또는 99% 초과를 의미한다. 이러한 의미에서, 산물이 발효 브로스의 구성요소의 적어도 일부를 포함하면, 이는 또한 용어 "발효 브로스를 기반으로 하는 산물"에 의해서 기술된다.
그 후, 물을 브로스로부터 제거하거나, 또는 상기 브로스를 공지된 방법에 의해서, 예컨대, 예를 들어, 회전 증발기, 박막 증발기, 강하막 증발기를 사용하여, 역삼투에 의해서, 또는 나노여과에 의해서 걸쭉하게 하거나 또는 농축시킨다. 이어서, 이러한 농축된 발효 브로스를 동결 건조, 분무 건조, 분무 과립화의 방법에 의해서, 또는 다른 공정, 예컨대, 예를 들어 특허 제PCT/EP2004/006655호에 따라서 기술된 바와 같이, 순환 유동층으로 자유-유동 산물, 특히 미세 분말 또는 바람직하게는 거친 과립으로 후처리할 수 있다. 적절한 경우 스크리닝 또는 가루 제거에 의해서 생성된 과립으로부터 목적하는 산물을 단리한다. 발효 브로스를 직접, 즉, 사전 농축 없이, 분무 건조 또는 분무 과립화에 의해서 건조시키는 것이 또한 가능하다.
"자유-유동"은 상이한 크기의 오리피스를 갖는 일련의 유리 오리피스 용기로부터, 5㎜ 오리피스를 갖는 용기 외부로 방해 없이 유동하는 분말을 의미한다(문헌[Klein: Seifen, Oele, Fette, Wachse 94, 12 (1968)]).
"미세한"은 주로(50% 초과) 20 내지 200㎛ 직경의 입자 크기를 갖는 분말을 의미한다.
"거친"은 주로(50% 초과) 200 내지 2000㎛ 직경의 입자 크기를 갖는 산물을 의미한다.
입자 크기 측정은 레이저 회절 분광분석법에 의해서 수행될 수 있다. 상응하는 방법은 문헌["Teilchengroeβenmessung in der Laborpraxis" by R. H. Mueller and R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996)] 또는 문헌["Introduction to Particle Technology" by M. Rhodes, published by Wiley &Sons (1998)]에 기술되어 있다.
자유-유동, 미세 분말을 이번에는 적합한 압착 또는 과립화 공정에 의해서 거칠고, 상당히 자유-유동하고, 저장 가능하고, 실질적으로 가루가 없는 산물로 전환시킬 수 있다.
용어 "가루가 없는"은 산물이 직경이 100㎛ 미만인 입자 크기를 단지 적은 비율(5% 미만)로 포함한다는 것을 의미한다.
"저장 가능한"은 본 발명의 내용에서 각각의 유기-화학 화합물의 임의의 실질적인 손실 없이, 건조 및 냉각 환경에서 적어도 일(1)년 이상, 바람직하게는 적어도 1.5년 이상, 특히 바람직하게는 이(2)년 이상 동안 저장될 수 있는 산물을 의미한다. "실질적인 손실"은 5% 초과의 손실을 의미한다.
식품 또는 사료의 가공에서 결합제, 겔화제 또는 증점제로서 일반적으로 사용되는 바와 같은 통상의 유기 또는 무기 보조제 또는 담체, 예컨대 전분, 젤라틴, 셀룰로스 유도체 또는 유사한 물질, 또는 추가 물질, 예컨대, 예를 들어, 실리카, 실리케이트(유럽 특허 제EP0743016A호) 및 스테아레이트를 과립화 또는 압착 동안 사용하는 것이 이롭다.
생성된 과립의 표면을 특허 제WO04/054381호에 기술된 바와 같은 오일 또는 지방으로 처리하는 것이 추가로 이롭다. 사용될 수 있는 오일은 광유, 식물유 또는 식물유의 혼합물이다. 이러한 오일의 예는 대두유, 올리브유, 대두유/레시틴 혼합물이다. 이러한 방식에서, 실리콘유, 폴리에틸렌 그리콜 또는 하이드록시 에틸셀룰로스가 또한 적합하다. 과립의 표면을 상기 오일로 처리하는 것은 산물의 내마모성 증가 및 가루 함량의 감소를 달성한다. 산물 중의 오일 함량은 공급 첨가제의 총량을 기준으로, 0.02 내지 2.0중량%, 바람직하게는 0.02 내지 1.0중량%, 매우 특히 바람직하게는 0.2 내지 1.0중량%이다.
바람직한 산물은 100 내지 1800㎛의 입자 크기를 97중량% 이상의 비율로 갖거나, 또는 300 내지 1800㎛의 직경의 입자 크기를 95중량% 이상의 비율로 갖는다. 가루, 즉 100pm 미만의 입자 크기를 갖는 입자의 비율은 바람직하게는 0 초과 내지 1중량%, 특히 바람직하게는 0.5중량%를 초과하지 않는다.
그러나, 대안적으로, 산물은 또한 사료 가공에서 공지되고 통상적인 유기 또는 무기 담체, 예컨대, 예를 들어, 실리카, 실리케이트, 미일(meal), 겨, 밀가루, 전분, 설탕 등 상에 흡착될 수 있고/있거나 통상의 증점제 또는 결합제와 혼합 및 안정화될 수 있다. 이에 대한 사용 및 공정의 예는 문헌(문헌[Die Muehle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, page 817])에 기술되어 있다.
하기 실시예는 제한이 아닌, 설명의 목적을 위해서 제공된다.
실시예
실시예 1: L- 라이신 생합성 경로에 대한 후보 프로모터의 적용
본 발명의 프로모터는 숙주 세포에서 생체분자의 생산을 위한 개선된 방법에 유용하다. 본 개시 내용의 프로모터의 적용 및 사용의 예는 아미노산 L-라이신의 생산에 관한 것이다.
도 1은 L-라이신의 합성에 대한 생합성 경로를 제시하고, 경로로부터 중간체를 우회시키는 유전자 pck, odx, icd, 및 hom (예를 들어, 호모세린/트레오닌 신타제 경로)를 포함하는데, 이것은 전체 L-라이신 수율 감소로 이어진다. C. 글루타미컴 균주 ATCC 13032에서의 기호, 유전자 명칭, 효소 번호(Enzyme Commission number: EC number), 및 지도 위치를 표 3에 제공한다.
표 3에 제공된 바와 같이 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NOs:1 내지 8의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 효모 상동 재조합 클로닝 기술을 사용하여 코리네박테리움 클로닝 벡터 내로 클로닝하여 각각의 프로모터가 직접 반복 영역에 의해서 플랜킹된 벡터를 조립하여 표적 유전자 좌에서 코리네박테리움 글루타미칸 내의 상동 재조합을 제공한다. 재조합 시, 내생 프로모터를 내생 C. 글루타미칸 좌에서 각각의 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NOs:1 내지 8의 프로모터에 의해서 대체한다. 프로모터 및 기능적으로 연결된 표적 유전자를 포함하는 다양한 표적화 벡터는 0.5Kb, 1Kb, 2Kb, 및 5Kb 범위의 상동성 반복 암 길이의 범위를 포함한다. 템플레이트로서 상업적으로 공급되는 올리고 및 상기에 기술된 숙주 균주 게놈 DNA를 사용하여 각각의 DNA 삽입물을 상동 영역의 PCR 증폭에 의해서 생산하였다. 게놈에 도입될 프로모터를 올리고 테일에서 암호화하였다. PCR 단편을 효모에서 상동 재조합을 사용하여 벡터 골격 내에서 조립하였다.
벡터를 먼저 표준 열 충격 형질전환 기술을 사용하여 E. 콜라이 내에서 형질전환시키고, 올바르게 조립된 클론을 식별 및 확인한다. 형질전환된 E. 콜라이 박테리아를 조립 성공에 대해서 시험한다. 각각의 E. 콜라이 형질전환 플레이트로부터의 4개의 집락을 배양하고, PCR을 통해서 올바른 조립에 대해서 시험한다. 벡터를 E. 콜라이 숙주에서 증폭시켜서 코리네박테리움 형질전환에 대한 벡터 DNA를 제공한다.
확인된 클론을 전기천공을 통해서 코리네박테리움 글루타미컴 숙주 세포 내에서 형질전환시킨다. 각각의 형질전환에 대해서, DNA ㎍당 집락 형성 단위(Colony Forming Unit: CFU)를 삽입물 크기의 함수로서 측정한다. 코리네박테리움 게놈 통합을 상동성 암 길이의 함수로서 분석한다. 암이 짧을수록 효율이 더 낮다.
삽입 카세트의 성공적인 통합으로서 식별된 코리네박테리움의 배양물을 sacb 선택 유전자의 루프 아웃을 위한 카운터 선택을 위해서 5%의 수크로스를 함유하는 배지 상에서 배양하였다. 다양한 상동성 직접 반복 암에 대한 수크로스 내성 빈도는 암 길이에 따라서 유의하게 달라지지 않는다. 이들 결과는, 루프아웃 효율이 0.5 kb 내지 5kb의 상동성 암 길이 전체에서 변함없이 유지된다는 것을 제안한다.
루프 아웃 사건을 추가로 확인하기 위해서, 수크로스 내성을 나타내는 집락을 배양하고, 서열분석을 퉁해서 분석한다. 삽입 게놈 영역의 서열분석에 대한 결과를 하기 표 6에 요약한다.
결과 빈도 (샘플링 오류 95% 신뢰)
Successful Loop out 13% (9%/20%)
Loop Still present 42% (34%/50%)
Mixed read 44% (36%/52%)
서열분석 결과는 루프 아웃에서 10 내지 20% 효율성을 나타낸다. 임의의 특정 이론에 제한되고자 함이 아니지만, 루프-아웃은 삽입 서열에 좌우될 수 있다. 올바르더라도, 10 내지 20개의 수크로스-저항성 집락을 선택하는 것이 상당히 성공적인 비율로 이어진다.
통합 시, 재조합 벡터는 내생 프로모터 서열을 Pcg1860(SEQ ID NO: 2), Pcg0007(SEQ ID NO: 3), Pcg0755(SEQ ID NO: 4), Pcg0007_lib_265(SEQ ID NO: 5), Pcg3381(SEQ ID NO: 6), Pcg007_lib_119(SEQ ID NO: 7), 및 Pcg3121(SEQ ID NO: 8)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터로 대체한다. 생성된 재조합 균주는 다음 목록에 제공된다:
Pcg1860-asd; Pcg0755-asd; Pcg0007_119-asd; Pcg3121-asd; Pcg0007_265-asd; Pcg3381-asd; Pcg1860-ask; Pcg0755-ask; Pcg3121-ask; Pcg0007_119-ask; Pcg0007_265-ask; Pcg3381-ask; Pcg3381-aspB; Pcg0007_119-aspB; Pcg0007_119-cg0931; Pcg1860-cg0931; Pcg0007_265-cg0931; Pcg0007_39-cg0931; Pcg0755-cg0931; Pcg0007-cg0931; Pcg0007-dapA; Pcg3381-dapA; Pcg0007_265-dapA; Pcg0007_119-dapA; Pcg0007_265-dapB; Pcg0755-dapB; Pcg0007-dapB; Pcg3381-dapB; Pcg1860-dapB; Pcg3121-dapB; Pcg0007_119-dapB; Pcg0007_265-dapD; Pcg0007_119-dapD; Pcg3381-dapD; Pcg0007_39-dapD; Pcg3121-dapD; Pcg0007-dapD; Pcg1860-dapD; Pcg0755-dapD; Pcg3381-dapE; Pcg3121-dapE; Pcg0755-dapE; Pcg0007_119-dapE; Pcg1860-dapE; Pcg0007_39-dapE; Pcg0007_265-dapF; Pcg3381-dapF; Pcg0007_119-dapF; Pcg0007-dapF; Pcg1860-dapF; Pcg0007_39-dapF; Pcg3381-ddh; Pcg3121-ddh; Pcg0007_119-ddh; Pcg0007_39-ddh; Pcg1860-ddh; Pcg0007_265-ddh; Pcg0755-ddh; Pcg0007-ddh; Pcg3381-fbp; Pcg0007_119-fbp; Pcg1860-fbp; Pcg0007-fbp; Pcg3121-fbp; Pcg0755-fbp; Pcg0755-hom; Pcg3381-hom; Pcg1860-hom; Pcg3121-hom; Pcg0007_119-icd; Pcg3121-icd; Pcg3381-icd; Pcg1860-icd; Pcg0007_39-icd; Pcg0007-icd; Pcg0007_265-icd; Pcg0007-lysA; Pcg0007_39-lysA; Pcg3121-lysA; Pcg0007_265-lysA; Pcg0007_119-lysA; Pcg3381-lysA; Pcg0007_39-lysE; Pcg0007-lysE; Pcg0007_265-lysE; Pcg3121-lysE; Pcg3381-lysE; Pcg0007_119-lysE; Pcg3381-odx; Pcg0007_265-odx; Pcg0755-odx; Pcg0007-odx; Pcg1860-odx; Pcg0007_39-odx; Pcg0007_119-odx; Pcg3121-odx; Pcg3121-pck; Pcg3381-pck; Pcg0007_119-pck; Pcg0007_265-pck; Pcg0755-pck; Pcg0007_39-pck; Pcg0007-pck; Pcg1860-pck; Pcg3121-pgi; Pcg0007_119-pgi; Pcg3381-pgi; Pcg0007_265-pgi; Pcg1860-pgi; Pcg0007-pgi; Pcg0007_39-ppc; Pcg0007_265-ppc; Pcg0755-ppc; Pcg3381-ppc; Pcg0007_119-ppc; Pcg1860-ppc; Pcg3121-ppc; Pcg0755-ptsG; Pcg1860-ptsG; Pcg0007_39-ptsG; Pcg3381-ptsG; Pcg0007_119-ptsG; Pcg3121-ptsG; Pcg1860-pyc; Pcg0755-pyc; Pcg0007_39-pyc; Pcg0007_265-pyc; Pcg0007-pyc; Pcg3381-pyc; Pcg0007_119-pyc; Pcg3121-pyc; Pcg3121-tkt; Pcg0007_119-tkt; Pcg0755-tkt; Pcg0007-tkt; Pcg3381-tkt; Pcg0007_265-tkt; Pcg0007-zwf; Pcg0755-zwf; Pcg0007_265-zwf; 및 Pcg1860-zwf; Pcg3121-zwf.
다수의 단일 집락을 선택하고, 접종시키고, 소규모 배양으로서 성장시킨다. 시험 프로모터를 포함하는 각각의 새로 생성된 균주를 산물 역가 성능을 평가하도록 설계된 소규모 배양물에서 라이신 수율에 대해서 시험한다. 산업 규모 배양으로부터의 배지를 사용하여 소규모 배양을 수행한다. 표준 비색 검정법을 사용하여 탄소 소진(즉, 단일 배취 수율을 대표함)으로 산물 역가를 광학적으로 측정한다. 간략하면, 농축된 검정법 혼합물을 제조하고, 시약의 최종 농축물이 160mM의 인산나트륨 완충제, 0.2mM 암플렉스 레드(Amplex Red), 0.2U/㎖ 호스래쉬 퍼옥시다제(Horseradish Peroxidase) 및 0.005U/㎖의 라이신 옥시다제이도록 발효 샘플에 첨가한다. 반응이 완결되고, 560nm 파장에서 테칸 M1000 플레이트 분광광도계를 사용하여 광학 밀도를 측정한다.
일부 경우에, L-라이신의 수율은 비-조작된 균주보다 24%(예를 들어, 재조합 균주 7000007840)를 초과하게 증가된다. 다른 실시태양에서, L-라이신의 수율은 거의 90% 감소된다(예를 들어, 재조합 균주 700000773). pgi 및 zwf에 대한 프로모터의 교환은 L-라이신 생산에 대해서 10%를 초과하게 개선시킨다.
특히, L-라이신의 생산은 가장 활성인 프로모터를 혼입한 것에 단순히 좌우되지 않는다. 라이신 수율은 비교적 약한 프로모터(예를 들어, 1, 7x, 또는 48x의 상대적인 프로모터 발현을 갖는 pgi, 또는 7x의 상대적인 프로모터 강도에서 dapB)에 의해서 최대화되거나, 중간 발현(예를 들어, 454x의 상대적인 프로모터 발현을 갖는 lysA)에 의해서 최대화된다. 특정 경우에, 발현은 상대적인 프로모터 강도가 최대화되는 경우 최대이다(예를 들어, ppc). 유전 경로에서 유전자의 위치는 L-라이신 수율의 상대적인 증가 또는 감소 또는 최적 프로모터 강도를 신뢰할 수 있게 예측하지 않는다. 예를 들어, cg0931의 높은 수준 발현은 개선 수율을 유발하지만, dapD의 더 높은 수준은 개선 또는 수율 감소를 유발하지 않는다.
실시예 2: L- 라이신 생합성 경로를 조작
L-라이신의 수율은 표적 유전자에 대해서 프로모터 쌍을 스와핑(swapping)함으로써 변형된다. 실시예 1의 구조체를 다음과 같이 재조합 유기체를 제조한다:
Pcg0007-lysA와 Pcg3121-pgi의 조합은 L-라이신의 최고 수율을 제공한다.
L-라이신 생합성 경로에서 표적 유전자의 쌍을 이룬 프로모터 스와핑
균주 ID 번호 PRO Swap 1 PRO Swap 2 평균
수율
(A 560 ) 		Std Dev
7000008489 4 Pcg0007-lysA Pcg3121-pgi 1.17333 0.020121
7000008530 8 Pcg1860-pyc Pcg0007-zwf 1.13144 0.030023
7000008491 7 Pcg0007-lysA Pcg0007-zwf 1.09836 0.028609
7000008504 8 Pcg3121-pck Pcg0007-zwf 1.09832 0.021939
7000008517 8 Pcg0007_39-ppc Pcg0007-zwf 1.09502 0.030777
7000008502 4 Pcg3121-pck Pcg3121-pgi 1.09366 0.075854
7000008478 4 Pcg3381-ddh Pcg0007-zwf 1.08893 0.025505
7000008465 4 Pcg0007_265-dapB Pcg0007-zwf 1.08617 0.025231
7000008535 8 Pcg0007-zwf Pcg3121-pgi 1.06261 0.019757
7000008476 6 Pcg3381-ddh Pcg3121-pgi 1.04808 0.084307
7000008510 8 Pcg3121-pgi Pcg1860-pyc 1.04112 0.021087
7000008525 8 Pcg1860-pyc Pcg0007_265-dapB 1.0319 0.034045
7000008527 8 Pcg1860-pyc Pcg0007-lysA 1.02278 0.043549
7000008452 5 Pcg1860-asd Pcg0007-zwf 1.02029 0.051663
7000008463 4 Pcg0007_265-dapB Pcg3121-pgi 1.00511 0.031604
7000008524 8 Pcg1860-pyc Pcg1860-asd 1.00092 0.026355
7000008458 4 Pcg3381-aspB Pcg1860-pyc 1.00043 0.020083
7000008484 8 Pcg3381-fbp Pcg1860-pyc 0.99686 0.061364
7000008474 8 Pcg3381-ddh Pcg3381-fbp 0.99628 0.019733
7000008522 8 Pcg0755-ptsG Pcg3121-pgi 0.99298 0.066021
7000008528 8 Pcg1860-pyc Pcg3121-pck 0.99129 0.021561
7000008450 4 Pcg1860-asd Pcg3121-pgi 0.98262 0.003107
7000008448 8 Pcg1860-asd Pcg3381-fbp 0.97814 0.022285
7000008494 8 Pcg0007_39-lysE Pcg3381-fbp 0.97407 0.027018
7000008481 8 Pcg3381-fbp Pcg0007-lysA 0.9694 0.029315
7000008497 8 Pcg0007_39-lysE Pcg1860-pyc 0.9678 0.028569
7000008507 8 Pcg3121-pgi Pcg3381-fbp 0.96358 0.035078
7000008501 8 Pcg3121-pck Pcg0007-lysA 0.96144 0.018665
7000008486 8 Pcg0007-lysA Pcg0007_265-dapB 0.94523 0.017578
7000008459 8 Pcg0007_265-dapB Pcg1860-asd 0.94462 0.023847
7000008506 2 Pcg3121-pgi Pcg0007_265-dapD 0.94345 0.014014
7000008487 8 Pcg0007-lysA Pcg3381-ddh 0.94249 0.009684
7000008498 8 Pcg3121-pck Pcg1860-asd 0.94154 0.016802
7000008485 8 Pcg0007-lysA Pcg1860-asd 0.94135 0.013578
7000008499 8 Pcg3121-pck Pcg0007_265-dapB 0.93805 0.013317
7000008472 8 Pcg3381-ddh Pcg1860-asd 0.93716 0.012472
7000008511 8 Pcg0007_39-ppc Pcg1860-asd 0.93673 0.015697
7000008514 8 Pcg0007_39-ppc Pcg0007-lysA 0.93668 0.027204
7000008473 8 Pcg3381-ddh Pcg0007_265-dapB 0.93582 0.030377
7000008461 7 Pcg0007_265-dapB Pcg3381-fbp 0.93498 0.037862
7000008512 8 Pcg0007_39-ppc Pcg0007_265-dapB 0.93033 0.017521
7000008456 8 Pcg3381-aspB Pcg3121-pck 0.92544 0.020075
7000008460 8 Pcg0007_265-dapB Pcg0007_265-dapD 0.91723 0.009508
7000008492 8 Pcg0007_39-lysE Pcg3381-aspB 0.91165 0.012988
7000008493 8 Pcg0007_39-lysE Pcg0007_265-dapD 0.90609 0.031968
7000008453 8 Pcg3381-aspB Pcg0007_265-dapB 0.90338 0.013228
7000008447 8 Pcg1860-asd Pcg0007_265-dapD 0.89886 0.028896
7000008455 8 Pcg3381-aspB Pcg0007-lysA 0.89531 0.027108
7000008454 6 Pcg3381-aspB Pcg3381-ddh 0.87816 0.025807
7000008523 8 Pcg0755-ptsG Pcg1860-pyc 0.87693 0.030322
7000008520 8 Pcg0755-ptsG Pcg3381-fbp 0.87656 0.018452
7000008533 4 Pcg0007-zwf Pcg3381-fbp 0.84584 0.017012
7000008519 8 Pcg0755-ptsG Pcg0007_265-dapD 0.84196 0.025747
실시예 3: 오프 -경로 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터로 L- 라이신 생합성 경로 조작
L-라이신의 수율은 오프-경로 제 2 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함시킴으로써 변형된다. 이종 표적 유전자는 ncgl0009, ncgl0019, ncgl0054, ncgl0082, ncgl0142, ncgl0223, ncgl0241, ncgl0242, ncgl0304, ncgl0306, ncgl0356, ncgl0398, ncgl0408, ncgl0424, ncgl0425, ncgl0427, ncgl0439, ncgl0458, ncgl0471, ncgl0531, ncgl0546, ncgl0564, ncgl0573, ncgl0578, ncgl0581, ncgl0598, ncgl0600, ncgl0601, ncgl0641, ncgl0663, ncgl0668, ncgl0737, ncgl0767, ncgl0813, ncgl0823, ncgl0827, ncgl0853, ncgl0874, ncgl0877, ncgl0905, ncgl0916, ncgl0966, ncgl1065, ncgl1124, ncgl1137, ncgl1152, ncgl1187, ncgl1196, ncgl1202, ncgl1203, ncgl1208, ncgl1261, ncgl1262, ncgl1267, ncgl1301, ncgl1320, ncgl1322, ncgl1364, ncgl1366, ncgl1371, ncgl1372, ncgl1457, ncgl1484, ncgl1500, ncgl1503, ncgl1508, ncgl1511, ncgl1545, ncgl1550, ncgl1583, ncgl1607, ncgl1855, ncgl1858, ncgl1880, ncgl1886, ncgl1900, ncgl1905, ncgl1911, ncgl1928, ncgl1948, ncgl1961, ncgl2001, ncgl2002, ncgl2019, ncgl2048, ncgl2077, ncgl2104, ncgl2147, ncgl2153, ncgl2190, ncgl2204, ncgl2210, ncgl2211, ncgl2247, ncgl2250, ncgl2274, ncgl2286, ncgl2287, ncgl2298, ncgl2327, ncgl2399, ncgl2425, ncgl2440, ncgl2441, ncgl2446, ncgl2449, ncgl2472, ncgl2473, ncgl2481, ncgl2491, ncgl2505, ncgl2527, ncgl2535, ncgl2538, ncgl2559, ncgl2567, ncgl2569, ncgl2576, ncgl2587, ncgl2614, ncgl2669, ncgl2684, ncgl2699, ncgl2702, ncgl2755, ncgl2789, ncgl2790, ncgl2802, ncgl2827, ncgl2886, ncgl2898, ncgl2901, ncgl2905, ncgl2921, ncgl2929, ncgl2930, ncgl2931, ncgl2982, 및 ncgl2984로부터 선택된다.
상기 확인된 이종 오프-경로 유전자의 일부에 상동성인 서열에 연결된 본 발명에 확인된 프로모터를 함유하는 구조체는 표 8 및 9에 제공된 재조합 숙주 세포 유기체를 제조하는 데 사용된다. 통합시, 재조합 벡터는 내인성 프로모터 서열을 Pcg1860 (SEQ ID NO : 2), Pcg0007 (SEQ ID NO : 3), Pcg0755 (SEQ ID NO : 4), Pcg0007_lib_265 (SEQ ID NO : 5), Pcg3381 (SEQ ID NO : 6), Pcg007_lib_119 (SEQ ID NO : 7) 및 Pcg3121 (SEQ ID NO : 8)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터로 내인성 프로모터 서열을 대체한다. 생성된 재조합 균주의 목록은 하기 표 8에 제공된다.
다수의 단일 콜로니(표 8의 N)가 소규모 배양물로서 선택, 접종 및 성장된다. 테스트 프로모터를 포함하는 각각의 새로 생성된 균주는 생성물 역가 성능을 평가하도록 디자인된 소규모 배양에서 라이신 수율에 대해 테스트된다. 소규모 배양은 산업 배양의 배지를 사용하여 수행된다. 생성물 역가는 표준 비색 분석법에 의해 탄소 소진(즉, 단일 배치 수율을 나타내는)에서 광학적으로 측정된다. 간략하게, 농축된 분석 혼합물을 제조하고 최종 농도의 시약이 160 mM 인산 나트륨 완충액, 0.2 mM 앰플렉스 레드, 0.2 U/mL 호오스래디쉬 퍼옥시다제 및 0.005 U/mL의 라이신 산화 효소가 되도록 발효 샘플에 첨가된다. 반응이 완료되고 광학 밀도는 560nm 파장에서 Tecan M1000 플레이트 분광 광도계를 사용하여 측정한다다.
표 8에 도시된 바와 같이, L-라이신의 수율은 오프-경로 표적 유전자에 기능적으로 연결된 이종 프로모터를 포함하지 않는 부모 균주에 비해 14%(예를 들어, 재조합 균주 7000152451) 이상 증가된다. 표 9에서 3개 이상의 상이한 균주에 적용된 프로모터 대체물 중에서, 가장 우수한 성능의 변형은 pcg0007_39-cg0725 (6개의 균주에서 6.5%의 수율 변화의 평균), pcg0007_39-ncgl1262 (9개의 균주에서 6.3%의 수율 변화의 평균) 및 pcg0007_39-cg2766 (23개 균주에서 평균 5.1% 수율 변화)이다.
특히, L-라이신의 생성은 가장 활발한 프로모터의 혼입에 대한 단순한 의존성이 아니다. pcg3121-mutm2_2522 변형은 약한 프로모터를 수반하지만 4개의 균주에서 평균 5%의 수율을 향상시켰다.
비-L-라이신 생합성 유전자의 변형된 발현 및 적어도 3%의 기준으로부터 수율 변화를 갖는 C. 글루타미쿰의 재조합 균주, 프로모터-표적 변형은 적어도 5개의 상이한 균주 배경에서 적용되었다
균주 프로모터-표적 N 평균 (A 560 ) 표준
오차 		% 기준에서 수율 변화
7000011650 pcg0007_39-dnak 16 0.939907 0.005637 14.40616
7000011837 pcg0007_39-cg0074 8 0.924085 0.005601 12.48029
7000012092 pcg3121-cg0074 8 0.927409 0.006967 12.88495
7000051494 pcg1860-rhle_609 14 1.060682 0.005131 8.870004
7000051495 pcg3121-cg1144 16 1.055172 0.0054 8.30446
7000071062 pcg1860-rhle_609 18 0.744484 0.007673 3.518385
7000101786 pcg0007_39-cg2899_2194 20 1.059718 0.00367 3.920982
7000101932 pcg0007_39-cg1486 6 1.057967 0.008648 3.749293
7000101946 pcg0007_39-cg2766 448 1.075533 0.003077 5.471888
7000102382 pcg0007_39-cmk 8 1.056225 0.007802 3.57847
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표 9에 도시된 바와 같이, 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결될 때 라이신 생산에서 유의미한 증가를 나타내는 오프-경로 표적 유전자는 특정 GOSlim 용어의 과다 표현을 나타낸다.
비-L-라이신 생합성 유전자의 변형된 발현 및 적어도 3%의 기준으로부터의 수율 변화, 및 관련된 GOSlim 용어를 갖는 C. 글루타미쿰의 재조합 균주
프로모터-표적 N 부모에 비한 개량 GOSlims
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실시예 4 : 상이한 쉘에 속하는 유전자에 의한 L- 라이신 생합성 조절 평가
C. 글루타미쿰 게놈에 걸친 유전자좌는 유전자 발현을 조절하는 천연 프로모터가 SEQ ID NOs: 1-8로부터 선택된 프로모터로 대체되는 균주를 생성함으로써 라이신 생산에 대한 잠재적 영향에 대해 테스트되었다. SEQ ID NOs: 1-8에 의해 정의된 프로모터로부터 하나 이상의 프로모터로 천연 프로모터를 개별적으로 치환함으로써 각각의 유전자좌의 영향을 테스트하였다.
균주는 다중 실험에서 라이신 생산에 대해 테스트되었고 모든 실험에 걸친 각 균주의 평균 성능을 계산하고 프로모터 변형이 결여된 대조군 균주와 비교하였다. 단일 유전자 변화에 의해 상이한 모든 균주 쌍이 계산되었고, 변화가 있는 균주와 변화가 없는 균주 사이의 96시간에서의 라이신 생성의 차이가 계산되었다. 이 성능 차이가 이 변경으로 다른 모든 변형 쌍에서 0보다 현저하게 큰 경우(p = 0.01에서) 변경은 적중(hit)으로 정의된다.
표 10은 테스트된 각각의 유전자좌/프로모터 변형 조합 및 그 성능을 제공한다. 각각의 유전자좌는 본 발명에 정의된 바와 같은 쉘 명칭이 제공된다. 표 10은 각각의 변형된 유전자좌의 유전자좌 ID, 발현을 변형하는 데 사용되는 프로모터, 변형을 함유하는 균주가 균주 성능에 유의한 차이가 있었는지, 특정 유전자좌와 관련된 유전자의 쉘 할당을 제공한다. 표 10에 나타낸 바와 같이, 다수의 상이한 프로모터를 사용하여 동일한 유전자좌를 테스트함으로써, 출원인은 라이신 생성에 대한 계통 성능과 알려진 관계가 이전에 확인되지 않은 쉘 4 유전자를 포함하여 균주 성능에 영향을 미치는 유전자좌를 암호화 유전자를 확인할 수 있었다(예를 들어, 49-54 행 참조).
생체분자 생성을 위한 상이한 표적 유전자 쉘로부터 프로모터/표적 유전자 조합의 체계적인 샘플링
locus_id 프로모터 any_above_threshold 쉘
ncgl0009 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0009 pcg3121 FALSE 3
ncgl0015 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0015 pcg3381 FALSE 3
ncgl0019 pcg0007_39 TRUE 3
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ncgl0019 pcg3121 FALSE 3
ncgl0019 pcg3381 FALSE 3
ncgl0026 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0031 pcg0007_39 FALSE 3
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ncgl0042 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0042 pcg1860 TRUE 3
ncgl0054 pcg0007_39 TRUE 4
ncgl0054 pcg3121 FALSE 4
ncgl0082 pcg0007_119 FALSE 3
ncgl0082 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0082 pcg1860 TRUE 3
ncgl0082 pcg3121 FALSE 3
ncgl0082 pcg3381 FALSE 3
ncgl0082 wt FALSE 3
ncgl0111 pcg0007_39 TRUE 4
ncgl0167 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0167 pcg1860 TRUE 3
ncgl0167 pcg3121 FALSE 3
ncgl0182 pcg0007_39 FALSE 2
ncgl0182 pcg1860 FALSE 2
ncgl0182 pcg3121 TRUE 2
ncgl0211 pcg0007_39 TRUE 2
ncgl0211 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0211 pcg3121 FALSE 2
ncgl0211 pcg3121 FALSE 3
ncgl0211 pcg3381 FALSE 2
ncgl0211 pcg3381 FALSE 3
ncgl0223 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0223 pcg0755 FALSE 3
ncgl0223 pcg2613 FALSE 3
ncgl0223 pcg3381 FALSE 3
ncgl0253 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0253 pcg1860 TRUE 3
ncgl0253 pcg3121 FALSE 3
ncgl0253 pcg3381 FALSE 3
ncgl0254 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0280 pcg1860 TRUE 3
ncgl0281 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0281 pcg3381 FALSE 3
ncgl0304 pcg0007_119 FALSE 4
ncgl0304 pcg0007_39 TRUE 4
ncgl0304 pcg0755 FALSE 4
ncgl0304 pcg1860 FALSE 4
ncgl0304 pcg2613 FALSE 4
ncgl0304 wt FALSE 4
ncgl0306 pcg0007_39 TRUE 4
ncgl0306 pcg0755 FALSE 4
ncgl0306 pcg2613 FALSE 4
ncgl0306 pcg3381 FALSE 4
ncgl0355 pcg0007_39 TRUE 2
ncgl0355 pcg0755 FALSE 2
ncgl0355 pcg1860 FALSE 2
ncgl0355 pcg2613 FALSE 2
ncgl0355 pcg3121 FALSE 2
ncgl0355 pcg3381 FALSE 2
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ncgl0359 pcg0007_39 FALSE 2
ncgl0359 pcg1860 TRUE 2
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ncgl0380 pcg0007_39 TRUE 3
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ncgl0419 pcg0007_39 TRUE 3
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ncgl0439 pcg0007_39 FALSE 3
ncgl0439 pcg1860 TRUE 3
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ncgl0439 pcg3381 FALSE 3
ncgl0445 pcg0007_39 TRUE 3
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ncgl0453 pcg0007_39 TRUE 3
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ncgl0458 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0458 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0458 pcg0007_39 FALSE 3
ncgl0458 pcg3381 FALSE 3
ncgl0458 pcg3381 FALSE 3
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ncgl0471 pcg0007_39 FALSE 3
ncgl0471 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0471 pcg0007_39 FALSE 3
ncgl0471 pcg1860 FALSE 3
ncgl0471 pcg1860 FALSE 3
ncgl0471 pcg1860 FALSE 3
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ncgl0531 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0531 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0531 pcg1860 TRUE 3
ncgl0531 pcg3121 FALSE 3
ncgl0531 pcg3381 FALSE 3
ncgl0531 pcg3381 FALSE 3
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ncgl0548 pcg0007_39 TRUE 3
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ncgl0565 pcg0007_39 FALSE 3
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ncgl0581 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0581 pcg0007_39 TRUE 3
ncgl0581 pcg3121 FALSE 3
ncgl0581 pcg3121 FALSE 3
ncgl0581 pcg3381 FALSE 3
ncgl0581 pcg3381 FALSE 3
ncgl0598 pcg0007_39 TRUE 4
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ncgl0634 pcg0007 TRUE 2
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ncgl0634 pcg0007_265 FALSE 2
ncgl0634 pcg0007_39 FALSE 1
ncgl0634 pcg0007_39 FALSE 2
ncgl0634 pcg0755 FALSE 1
ncgl0634 pcg0755 FALSE 2
ncgl0634 pcg1860 TRUE 1
ncgl0634 pcg1860 TRUE 2
ncgl0634 pcg3121 FALSE 1
ncgl0634 pcg3121 FALSE 2
ncgl0634 pcg3381 FALSE 1
ncgl0634 pcg3381 FALSE 2
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ncgl0634 wt FALSE 2
ncgl0634 wt FALSE 1
ncgl0634 wt FALSE 2
ncgl0634 wt FALSE 1
ncgl0634 wt FALSE 2
ncgl0634 wt FALSE 1
ncgl0634 wt FALSE 2
ncgl0634 wt FALSE 1
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ncgl0655 pcg1860 TRUE 3
ncgl0655 pcg1860 TRUE 3
ncgl0655 pcg3121 FALSE 3
ncgl0655 pcg3121 FALSE 3
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ncgl0698 pcg3121 FALSE 3
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ncgl0817 pcg0007_265 TRUE 1
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ncgl0817 pcg0755 TRUE 1
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실시예 5 : 체계적인 게놈-전체 교란을 위한 C. 글루타미쿰 게놈의 유전자 의 다양한 쉘로의 할당
유전자의 확인:
확인된 유전자는 라이신 생산에 대한 그들의 영향의 관련성에 기초하여 4개의 쉘(1-4)로 분리되었다.
쉘 1 및 2의 경우, C. 글루타미쿰 게놈의 유전자에 유형 균주 ATCC 13032의 서열에 상동성으로 주석을 달았다. 쉘 1과 2에서 각 유전자의 기능은 KEGG 경로 데이터베이스를 사용하여 결정되었다. 쉘 3의 경우, C. 글루타미쿰 게놈의 유전자에 RAST 서버를 사용하여 주석을 달았다. 쉘 3에서 각 유전자의 기능은 각 유전자의 주석이 달린 설명에서 자연어 검색 용어를 사용하여 결정되었다. 이 검색어는 관심 대사 영역의 이름에서 가져온 문자열이다.
각 쉘에 할당:
확인된 유전자는 기질 글루코오스와 생성물 라이신 사이의 직접적인 대사 중간체의 전환에 관여하는 경우 쉘 1에 할당되었다. 이것은 글루코오스의 세포로의 이동, 라이신의 세포 밖으로 이동, 및 각 중간체로 전환되고 궁극적으로 라이신으로 전환되는 글루코오스에 원래 함유된 탄소의 전환에 관여하는 효소를 포함하였다.
확인된 유전자가 질소 대사, TCA주기 또는 RNA 분해 효소 KEGG 경로 맵의 일부인 것으로 확인된 경우 쉘 2에 할당하였다. 이러한 신진 대사 영역은 라이신 생성과의 관련성에 기초하여 선택되다: 라이신은 바이오 매스와 비교하여 상당한 질소를 함유하고, TCA 사이클은 라이신과 바이오 매스의 합성을 위한 에너지를 증가 시키며, RNA 분해 효소는 산업 발효 동안 충분한 생산을 위해 중요한 단백질 발현을 조절한다.
세포막 수송, 전사, 펩티도글리칸 생합성, 지방산 생합성 및 비오틴 대사의 일부인 것으로 확인된 경우, 확인된 유전자를 쉘 3에 할당하였다. 이러한 대사 영역은 산업 발효에서 라이신 생산과 관련이 있지만 쉘 2에서 확인된 영역보다 적다. 운송은 각 세포의 생산성을 높이는 데 중요하다. 전사와 관련된 유전자의 변경은 세포 전체에서 유전자의 체계적인 변형을 허용하고; 펩티도글리칸 및 지방산 합성은 라이신의 중간체 중 하나의 종점인 세포벽 생합성에 관여하고; 비오틴은 라이신 대사 경로에 있는 효소의 중요한 보조 인자이다.
확인된 유전자는 쉘 1 내지 3 중 어느 하나에 속하지 않으면 쉘 4에 할당하였다.
본 명세서에서 지칭된 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 간행물은 본 설명과 일관되는 정도로 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.
상기 내용으로부터, 본 명세서에 기술된 특정 실시태양가 설명의 목적을 위해서 본 명세서에 기술되어 있지만, 다양한 변형이 본 명세서에 기술된 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 행해질 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 개시 내용은 첨부된 청구범위에 의한 것을 제한하고는 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> ZYMERGEN INC. <120> PROMOTERS FROM CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM AND USES THEREOF IN REGULATING ANCILLARY GENE EXPRESSION <130> ZMG-004/PCT <140> <141> <150> 62/516,609 <151> 2017-06-07 <160> 286 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 97 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> source <223> /note="Pcg0007_39" <400> 1 tgccgtttct cgcgttgtgt gtggtactac gtggggacct aagcgtgtat tatggaaacg 60 tctgtatcgg ataagtagcg aggagtgttc gttaaaa 97 <210> 2 <211> 93 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> source <223> /note="Pcg1860" <400> 2 cttagctttg acctgcacaa atagttgcaa attgtcccac atacacataa agtagcttgc 60 gtatttaaaa ttatgaacct aaggggttta gca 93 <210> 3 <211> 97 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> source <223> /note="Pcg0007" <400> 3 tgccgtttct cgcgttgtgt gtggtactac gtggggacct aagcgtgtaa gatggaaacg 60 tctgtatcgg ataagtagcg aggagtgttc gttaaaa 97 <210> 4 <211> 98 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> source <223> 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415 Ala Asn Gly Leu Phe Ala Tyr Gly Gln Phe Asp Ala Asn Ala Ala Asn 420 425 430 Ile Leu Gly Trp Thr Leu Ser Phe Ser Ala Phe Thr Leu Ile Pro Tyr 435 440 445 Ala Leu Val Leu Leu His Leu Arg Val Phe Tyr Ala Arg Glu Glu Val 450 455 460 Trp Thr Pro Thr Phe Ile Ile Ala Gly Ile Thr Ala Thr Lys Val Val 465 470 475 480 Leu Ser Leu Leu Ala Pro Leu Leu Ser Ser Ser Pro Glu Arg Val Val 485 490 495 Val Leu Leu Gly Ala Ala Asn Gly Phe Ser Phe Ile Thr Gly Ala Val 500 505 510 Ile Gly Ala Tyr Leu Leu Arg Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Met Arg 515 520 525 Ser Leu Ala Lys Thr Ser Leu Trp Ala Leu Gly Ser Ala Ala Val Gly 530 535 540 Ala Ala Ala Ala Trp Ala Leu Gly Trp Leu Ile Gln Ala Val Val Gly 545 550 555 560 Asp Phe Leu Leu Gly Thr Leu Ser Ser Val Gly Tyr Leu Leu Tyr Leu 565 570 575 Ala Val Leu Gly Val Phe Phe Ile Ile Ile Thr Gly Ile Val Leu Ser 580 585 590 Arg Ser Gly Leu Pro Glu Val Gln Asn Leu Gly Gln Ala Leu Thr Arg 595 600 605 Ile Pro Gly Met Ser Arg Phe Ile Arg Pro Asn Thr Lys Ile Ser Leu 610 615 620 Asp Val Gly Glu Val Ser Gln Gln Asp Phe Ser Thr Gln Leu Val Ala 625 630 635 640 Pro Ser Glu Phe Ser Ala Thr Pro Val Pro Pro Pro Met Ser Ala Gly 645 650 655 Ile Val Arg Gly Pro Arg Leu Val Pro Gly Ala Pro Val Gly Asp Gly 660 665 670 Arg Phe Arg Leu Leu Ala Asp His Gly Gly Val Gln Gly Ala Arg Phe 675 680 685 Trp Gln Ala Arg Glu Ile Ala Thr Gly Lys Glu Val Ala Leu Ile Phe 690 695 700 Val Asp Thr Ser Gly Asn Ala Pro Phe Ala Pro Leu Ser Ser Ala Ala 705 710 715 720 Ala Ala Gly Ile Ala Tyr Glu Val Gln Arg Arg Thr Lys Lys Leu Ala 725 730 735 Ser Leu Gly Ser Leu Ala Val Ala Pro Asn Ile Tyr Ser Glu Ala Tyr 740 745 750 Arg Asn Gly Cys Leu Ile Val Ala Asp Trp Val Pro Gly Ser Ser Leu 755 760 765 Ser Ala Val Ala Glu Ser Gly Ala Asp Pro Arg Ala Ala Ala Phe Ala 770 775 780 Leu Ala Glu Leu Thr Glu Thr Ile Gly Glu Ala His Glu Met Gly Ile 785 790 795 800 Pro Ala Gly Leu Asp Asn Lys Cys Arg Ile Arg Ile Asn Thr Asp Gly 805 810 815 His Ala Val Leu Ala Phe Pro Ala Ile Leu Pro Asp Ala Ser Glu Leu 820 825 830 Arg Asp Ala Lys Ser Leu Ala Ser Ala Ala Glu Met Leu Ile Asp Ala 835 840 845 Thr Leu Ala Pro Ser Asp Val Lys Ala Met Val Thr Glu Ala Gln Gly 850 855 860 Leu Ala Thr Glu Asp Asn Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Ala Met Ala Met 865 870 875 880 Arg Thr Cys Gly Leu Phe Thr Glu Glu Pro Thr His Leu Val Val Lys 885 890 895 Lys Glu Lys Thr Pro Lys Pro Ala Thr Arg Asp Gly Phe Gly Ala Ser 900 905 910 Asp Tyr Thr Val Lys Gly Met Ala Ala Ile Ala Ala Val Val Ile Ile 915 920 925 Leu Val Ser Leu Val Ala Ala Gly Thr Ala Phe Leu Thr Ser Phe Phe 930 935 940 Gly Ser Ser Thr Asn Glu Gln Ser Pro Leu Ala Ser Val Glu Ala Thr 945 950 955 960 Thr Ser Ala Thr Pro Glu Pro Val Gly Pro Pro Val Tyr Leu Asp Leu 965 970 975 Asp Gln Ala Arg Thr Trp Asp Asp Gly Ala Gly Thr Asp Val Thr Asp 980 985 990 Val Thr Asp Gly Asn Thr Ser Thr Ala Trp Thr Ser Thr Gly Gly Asp 995 1000 1005 Gly Leu Leu Val Asp Leu Ser Thr Pro Ala Arg Leu Asp Arg Val 1010 1015 1020 Ile Leu Thr Thr Gly Thr Gly Ser Asp Ser Asn Val Thr Ser Thr 1025 1030 1035 Val Lys Ile Tyr Ala Phe Asn Asp Ala Ser Pro His Ser Leu Ser 1040 1045 1050 Glu Gly Ile Glu Ile Gly Thr Val Asp Tyr Ser Gly Arg Ser Leu 1055 1060 1065 Ser His Ser Ile Arg Asp Ser Ser Lys Leu Pro Gly Gln Val Glu 1070 1075 1080 Ser Met Val Ile Leu Val Asp Glu Val His Ser Ser Gln Thr Ser 1085 1090 1095 Asp Thr Asn Pro Gln Met Gln Ile Ala Glu Val Gln Leu Val Gly 1100 1105 1110 Trp <210> 286 <211> 317 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> source <223> /note="ncgl2984" <400> 286 Met Ser Glu Glu Gln Ser Ala Val Ala Pro Lys Ile His Asp Val Ala 1 5 10 15 Ile Ile Gly Ser Gly Pro Ala Gly Tyr Thr Ala Ala Val Tyr Ala Ala 20 25 30 Arg Ala Asp Leu Asn Pro Ile Met Phe Glu Gly Tyr Glu Tyr Gly Gly 35 40 45 Ser Leu Met Thr Thr Thr Asp Val Glu Asn Phe Pro Gly Phe Glu Lys 50 55 60 Gly Ile Leu Gly Pro Glu Leu Met Glu Asn Met Arg Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Arg Phe Gly Thr Asp Met His Met Glu Leu Val Asp Arg Val Asp Leu 85 90 95 Thr Gly Asp Ile Lys Lys Leu Trp Val Gly Asp Asp Glu Tyr His Ala 100 105 110 Arg Ala Val Ile Leu Ser Met Gly Ser Ala Pro Arg Tyr Leu Gly Val 115 120 125 Lys Gly Glu Gln Glu Leu Leu Gly Arg Gly Val Ser Ala Cys Ala Thr 130 135 140 Cys Asp Gly Phe Phe Phe Arg Asp Gln Asp Ile Ala Val Ile Gly Gly 145 150 155 160 Gly Asp Ser Ala Met Glu Glu Ala Thr Phe Leu Thr Lys Phe Ala Arg 165 170 175 Ser Val Thr Ile Val His Arg Arg Glu Glu Phe Arg Ala Ser Ala Ile 180 185 190 Met Leu Glu Arg Ala Gln Lys Asn Glu Lys Ile Arg Phe Val Thr Asn 195 200 205 Lys Thr Val Glu Glu Val Ile Glu Ala Asp Gly Lys Val Ser Gly Leu 210 215 220 Lys Leu Asn Asp Thr Val Thr Gly Glu Asp Ser Val Leu Asp Val Thr 225 230 235 240 Ala Met Phe Val Ala Ile Gly His Asp Pro Arg Ser Glu Ile Leu Ala 245 250 255 Gly Gln Val Glu Val Asp Pro Ser Asn Tyr Val Leu Val Gln Glu Pro 260 265 270 Ser Thr Arg Thr Asn Leu Asp Gly Val Phe Ala Ala Gly Asp Leu Val 275 280 285 Asp Ser His Tyr Gln Gln Ala Ile Thr Ala Ala Gly Ser Gly Cys Arg 290 295 300 Ala Ala Ile Asp Ala Glu His Tyr Leu Ala Ser Leu Ala 305 310 315

Claims (91)

  1. 적어도 하나의 이종 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NOs: 1 내지 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포.
  2. 다음을 포함하는 숙주 세포:
    a. 적어도 하나의 제 1 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열, 상기 하나 이상의 제 1 이종 표적 유전자는 표적 생체분자를 생성하기 위한 생합성 경로의 성분이며, 상기 표적 생체분자는 아미노산, 유기산, 단백질 및 폴리머로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 및
    b. 적어도 하나의 제 2 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결된 SEQ ID NOs: 1 내지 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열, 상기 하나 이상의 제 2 이종 표적 유전자는 보조 표적 유전자이다.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열이 SEQ ID NOs:1, 5 및 7로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 보조 표적 유전자는 GOslim 용어 GO:0003674; GO:0003677; GO:0008150; GO:0034641; 또는 GO:0009058로 분류되는 유전자인 숙주 세포.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 보조 표적 유전자는 다음 GOslim 용어: GO:0003674; GO:0003677; GO:0008150; GO:0034641; 및 GO:0009058로 분류되거나 이의 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개로 분류되거나 분류되는 유전자인 숙주 세포.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 숙주 세포가 분리되는 숙주 세포.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 보조 표적 유전자는 다음 KEGG 엔트리: M00016; M00525; M00526; M00527; M00030; M00433 M00031; M00020; M00018; M00021; M00338; M00609; M00017; M00019; M00535; M00570; M00432; M00015; M00028; M00763; M00026; M00022; M00023; M00024; M00025; 및 M00040 중 하나 이상 또는 전부의 유전자를 포함하는 생합성 경로의 성분이 아닌 숙주 세포.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 보조 표적 유전자는 숙주 세포에서 asd, ask, aspB, cg0931, dapA, dapB, dapD, dapE, dapF, ddh, fbp, hom, icd, lysA, lysE, odx, pck, pgi, ppc, ptsG, pyc, tkt 또는 zwf, 또는 이의 내인성 기능적 오르쏘로그가 아닌 숙주 세포.
  9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 보조 표적 유전자는 다음 KEGG 엔트리: M00010, M00002, M00007, M00580 또는 M00005 중 하나 이상 또는 전부의 유전자로부터 선택되는 숙주 세포.
  10. 제 2 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제 1 이종 표적 유전자는 아미노산 생합성 경로의 성분인 유전자인 숙주 세포.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포:
    유전자 및 게놈의 교토 백과 사전(KEGG)의 엔트리 M00016의 유전자를 포함하는 라이신 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00525의 유전자를 포함하는 라이신 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00526의 유전자를 포함하는 라이신 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00527의 유전자를 포함하는 라이신 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00030의 유전자를 포함하는 라이신 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00433의 유전자를 포함하는 라이신 생합성 경로; 및
    KEGG 엔트리 M00031의 유전자를 포함하는 라이신 생합성 경로.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 KEGG 엔트리 M00020의 유전자를 포함하는 세린 생합성 경로로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 KEGG 엔트리 M00018의 유전자를 포함하는 트레오닌 생합성 경로로 이루어진 그룹에서 선택되는 숙주 세포.
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포:
    KEGG 엔트리 M00021의 유전자를 포함하는 시스테인 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00338의 유전자를 포함하는 시스테인 생합성 경로; 및/또는
    KEGG 엔트리 M00609의 유전자를 포함하는 시스테인 생합성 경로.
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 KEGG 엔트리 M00017의 유전자를 포함하는 메티오닌 생합성 경로로 이루어진 그룹에서 선택되는 숙주 세포.
  16. 제 10 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 KEGG 엔트리 M00019의 유전자를 포함하는 발린/아이소류신 생합성 경로로 이루어진 그룹에서 선택되는 숙주 세포.
  17. 제 10 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포:
    KEGG 엔트리 M00535의 유전자를 포함하는 이소류신 생합성 경로; 및/또는
    KEGG 엔트리 M00570의 유전자를 포함하는 이소류신 생합성 경로.
  18. 제 10 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 KEGG 엔트리 M00432의 유전자를 포함하는 류신 생합성 경로로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포.
  19. 제 10 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 KEGG 엔트리 M00015의 유전자를 포함하는 프롤린 생합성 경로로 이루어진 그룹에서 선택되는 숙주 세포.
  20. 제 10 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포:
    KEGG 엔트리 M00028의 유전자를 포함하는 오르니틴 생합성 경로; 및
    KEGG 엔트리 M00763의 유전자를 포함하는 오르니틴 생합성 경로.
  21. 제 10 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 KEGG 엔트리 M00026의 유전자를 포함하는 히스티딘 생합성 경로로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포.
  22. 제 10 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포:
    KEGG 엔트리 M00022의 유전자를 포함하는 시키메이트 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00023의 유전자를 포함하는 트립토판 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00024의 유전자를 포함하는 페닐알라닌 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00025의 유전자를 포함하는 티로신 생합성 경로; 및
    KEGG 엔트리 M00040의 유전자를 포함하는 티로신 생합성 경로.
  23. 제 2 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID NOs:1 내지 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고, 각각의 추가의 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 추가의 제 2 이종 표적 서열에 기능적으로 연결되고, 상기 적어도 하나의 추가의 제 2 이종 표적 유전자는 보조 표적 유전자인 숙주 세포.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제 2 이종 표적 유전자 및 상기 적어도 하나의 추가의 제 2 이종 표적 유전자가 동일한 대사 경로의 일부인 숙주 세포.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제 2 이종 표적 유전자 및 상기 적어도 하나의 추가의 제 2 이종 표적 유전자가 동일한 대사 경로의 일부가 아닌 숙주 세포.
  26. 제 2 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID NOs:1 내지 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고, 각각의 추가의 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 추가의 제 1 이종성 표적 유전자에 기능적으로 연결되며, 여기서 적어도 하나의 제 1 이종 표적 유전자 및 적어도 하나의 추가의 제 1 이종 표적 유전자는 동일한 대사 경로에 있는 숙주 세포.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    코리네박테리움 속에 속하는 숙주 세포.
  28. 제 27 항에 있어서,
    코리네박테리움 글루타미쿰인 숙주 세포.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    보조 표적 유전자는 SEQ ID NOs:148-286으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 숙주 세포.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    보조 표적 유전자가 SEQ ID NOs:9-147로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 숙주 세포.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 생체분자 생산에 적합한 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는 표적 생체분자를 생성하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    상기 생체분자는 L-아미노산인 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    상기 L-아미노산이 L-라이신인 방법.
  34. 다음을 포함하는 복수의 숙주 세포:
    a. 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 프로모터를 포함하는 프로모터 그룹으로부터 선택된 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제 1 숙주 세포, 여기서 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 이종 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되며, 여기서 이종 표적 유전자는 표적 생체분자의 생성을 위한 경로 내의 유전자 및 표적 생체분자의 생산을 위한 경로에서 벗어난 이종 보조 표적 유전자로부터 선택된다;
    b. 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 프로모터를 포함하는 프로모터 그룹으로부터 선택된 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제 2 숙주 세포, 여기서 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 이종 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결되며, 상기 제 1 및 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 상이하다.
  35. 제 34 항에 있어서,
    상기 복수의 숙주 세포는 적어도 1x106개의 세포를 포함하는 복수의 숙주 세포.
  36. 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서,
    증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 프로모터를 포함하는 상기 프로모터 그룹은 구조성 프로모터인 복수의 숙주 세포.
  37. 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서,
    증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 프로모터를 포함하는 상기 프로모터 그룹은 유도성 프로모터인 복수의 숙주 세포.
  38. 제 34 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 상기 이종 보조 표적 유전자는 쉘 3 또는 쉘 4 표적 유전자이고; 및/또는 상기 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 쉘 3 또는 4 이종 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되는 복수의 숙주 세포.
  39. 제 34 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 및/또는 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 상기 이종 보조 표적 유전자는 다음 KEGG 엔트리: M00016; M00525; M00526; M00527; M00030; M00433 M00031; M00020; M00018; M00021; M00338; M00609; M00017; M00019; M00535; M00570; M00432; M00015; M00028; M00763; M00026; M00022; M00023; M00024; M00025; 및 M00040의 하나 이상 또는 전부의 유전자를 포함하는 생합성 경로의 성분이 아닌 복수의 숙주 세포.
  40. 제 34 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 및/또는 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 상기 이종 보조 표적 유전자는 숙주 세포에서 asd, ask, aspB, cg0931, dapA, dapB, dapD, dapE, dapF, ddh, fbp, hom, icd, lysA, lysE, odx, pck, pgi, ppc, ptsG, pyc, tkt 또는 zwf, 또는 이의 내인성 기능적 오르쏘로그가 아닌 복수의 숙주 세포.
  41. 제 34 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 및/또는 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 상기 이종 보조 표적 유전자는 다음 KEGG 엔트리: M00010, M00002, M00007, M00580 또는 M00005의 하나 이상 또는 전부의 유전자로부터 선택되는 복수의 숙주 세포.
  42. 제 34 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 및/또는 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 상기 이종 보조 표적 유전자는 GOslim 용어 GO:0003674; GO:003677; GO:0008150; GO:0034641; 또는 GO:009058하에서 분류되는 복수의 숙주 세포.
  43. 제 42 항에 있어서,
    상기 제 1 및/또는 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 상기 이종 보조 표적 유전자는 다음 GOslim 용어: GO:0003674; GO:0003677; GO:0008150; GO:0034641; GO:0009058로 분류되거나 이의 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개로 분류되는 유전자인 복수의 숙주 세포.
  44. 제 34 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 표적 생체분자의 생성을 위한 샙합성 경로의 쉘 1에서 이종 표적 유전자와 같은 표적 생체분자 생성을 위한 온-경로 이종 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되는 복수의 숙주 세포.
  45. 제 34 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 이종 쉘 2 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되는 복수의 숙주 세포.
  46. 제 34 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 생체분자의 상기 생성 경로는 아미노산 생합성 경로인 복수의 숙주 세포.
  47. 제 46 항에 있어서,
    아미노산 생합성 경로는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 복수의 숙주 세포:
    유전자 및 게놈의 교토 백과 사전(KEGG)의 엔트리 M00016의 유전자를 포함하는 라이신 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00525의 유전자를 포함하는 라이신 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00526의 유전자를 포함하는 라이신 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00527의 유전자를 포함하는 라이신 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00030의 유전자를 포함하는 라이신 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00433의 유전자를 포함하는 라이신 생합성 경로; 및
    KEGG 엔트리 M00031의 유전자를 포함하는 라이신 생합성 경로.
  48. 제 46 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 KEGG 엔트리 M00020의 유전자를 포함하는 세린 생합성 경로로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 복수의 숙주 세포.
  49. 제 46 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 KEGG 엔트리 M00018의 유전자를 포함하는 트레오닌 생합성 경로로 이루어진 그룹에서 선택되는 복수의 숙주 세포.
  50. 제 46 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 복수의 숙주 세포:
    KEGG 엔트리 M00021의 유전자를 포함하는 시스테인 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00338의 유전자를 포함하는 시스테인 생합성 경로; 및/또는
    KEGG 엔트리 M00609의 유전자를 포함하는 시스테인 생합성 경로.
  51. 제 46 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 KEGG 엔트리 M00017의 유전자를 포함하는 메티오닌 생합성 경로로 이루어진 그룹에서 선택되는 복수의 숙주 세포.
  52. 제 46 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 KEGG 엔트리 M00019의 유전자를 포함하는 발린/아이소류신 생합성 경로로 이루어진 그룹에서 선택되는 복수의 숙주 세포.
  53. 제 46 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 복수의 숙주 세포:
    a. KEGG 엔트리 M00535의 유전자를 포함하는 이소류신 생합성 경로; 및/또는
    b. KEGG 엔트리 M00570의 유전자를 포함하는 이소류신 생합성 경로.
  54. 제 46 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 KEGG 엔트리 M00432의 유전자를 포함하는 류신 생합성 경로로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 복수의 숙주 세포.
  55. 제 46 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 KEGG 엔트리 M00015의 유전자를 포함하는 프롤린 생합성 경로로 이루어진 그룹에서 선택되는 복수의 숙주 세포.
  56. 제 46 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 복수의 숙주 세포:
    a. KEGG 엔트리 M00028의 유전자를 포함하는 오르니틴 생합성 경로; 및
    b. KEGG 엔트리 M00763의 유전자를 포함하는 오르니틴 생합성 경로.
  57. 제 46 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 KEGG 엔트리 M00026의 유전자를 포함하는 히스티딘 생합성 경로로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 복수의 숙주 세포.
  58. 제 46 항에 있어서,
    상기 아미노산 생합성 경로는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 복수의 숙주 세포:
    KEGG 엔트리 M00022의 유전자를 포함하는 시키메이트 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00023의 유전자를 포함하는 트립토판 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00024의 유전자를 포함하는 페닐알라닌 생합성 경로;
    KEGG 엔트리 M00025의 유전자를 포함하는 티로신 생합성 경로; 및
    KEGG 엔트리 M00040의 유전자를 포함하는 티로신 생합성 경로.
  59. 제 34 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드 및 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 동일한 이종 보조 표적 유전자 서열에 작동 가능하게 연결되는 복수의 숙주 세포.
  60. 제 34 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서,
    복수가 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 프로모터를 포함하는 프로모터 그룹으로부터 선택된 제 3 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제 3 숙주 세포를 추가로 포함하며, 여기서 제 3 프로모터는 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결되며 제 1, 제 2 및 제 3 프로모터는 상이한 복수의 숙주 세포.
  61. 제 60 항에 있어서,
    제 1, 제 2, 및 제 3 프로모터는 동일한 이종 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되는 복수의 숙주 세포.
  62. 제 60 항 또는 제 61 항에 있어서,
    복수가 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 프로모터를 포함하는 프로모터 그룹으로부터 선택된 제 4 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제 4 숙주 세포를 추가로 포함하며, 여기서 제 4 프로모터는 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결되며 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 프로모터는 상이한 복수의 숙주 세포.
  63. 제 62 항에 있어서,
    제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 프로모터는 동일한 이종 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되는 복수의 숙주 세포.
  64. 제 62 항 또는 제 63 항에 있어서,
    복수가 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 프로모터를 포함하는 프로모터 그룹으로부터 선택된 제 5 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제 5 숙주 세포를 추가로 포함하며, 여기서 제 5 프로모터는 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결되며 제 1, 제 2, 제 3, 제 4 및 제 5 프로모터는 상이한 복수의 숙주 세포.
  65. 제 64 항에 있어서,
    제 1, 제 2, 제 3, 제 4 및 제 5 프로모터는 동일한 이종 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되는 복수의 숙주 세포.
  66. 제 64 항 또는 제 65 항에 있어서,
    복수가 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 프로모터를 포함하는 프로모터 그룹으로부터 선택된 제 6 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제 6 숙주 세포를 추가로 포함하며, 여기서 제 6 프로모터는 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결되며 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5 및 제 6 프로모터는 상이한 복수의 숙주 세포.
  67. 제 66 항에 있어서,
    제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6 및 제 7 프로모터는 동일한 이종 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되는 복수의 숙주 세포.
  68. 제 66 항 또는 제 67 항에 있어서,
    복수가 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 프로모터를 포함하는 프로모터 그룹으로부터 선택된 제 8 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제 8 숙주 세포를 추가로 포함하며, 여기서 제 8 프로모터는 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결되며 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7 및 제 8 프로모터는 상이한 복수의 숙주 세포.
  69. 제 68 항에 있어서,
    제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7 및 제 8 프로모터는 동일한 이종 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되는 복수의 숙주 세포.
  70. 제 34 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 숙주 세포가 코리네박테리움 숙주 세포인 복수의 숙주 세포.
  71. 제 71 항에있어서,
    상기 코리네박테리움 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰 숙주 세포인 복수의 숙주 세포.
  72. 제 34 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 표적 분자의 생성을 위해 선택된 대사 경로에 직접 관여하는 이종 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 복수의 숙주 세포.
  73. 제 34 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 따른 복수의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  74. 적어도 하나의 이종 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결된 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하는 복수의 형질전환된 숙주 세포로서, 상기 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합은 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 프로모터를 포함하는 복수의 형질전환된 숙주 세포.
  75. 제 74 항에 있어서,
    상기 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 조합은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 적어도 하나의 제 1 프로모터 폴리뉴클레오타이드 및 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, 및 SEQ ID NO:8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 적어도 하나의 제 2 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질전환된 숙주 세포.
  76. 제 74 항 또는 제 75 항에 있어서,
    각각의 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 상이한 이종 표적 유전자에 기능적으로 연결되는 형질전환된 숙주 세포.
  77. 제 74 항 또는 제 75 항에 있어서,
    각각의 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 동일한 이종 보조 표적 유전자에 기능적으로 연결되는 형질전환된 숙주 세포.
  78. 제 74 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 따른 복수의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  79. 다음을 포함하여 표적 생체분자의 생성을 증가시키는 방법:
    a. 복수의 숙주 세포를 제공하는 단계, 여기서 복수의 숙주 세포는 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 이종 프로모터를 포함하고, 복수의 프로모터는 각각 이종 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되고 복수의 프로모터의 적어도 하나의 프로모터는 이종 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된다;
    b. 표적 생체분자를 생성하기에 적합한 조건하에서 복수의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    c. 대조군 세포와 비교하여 증가된 표적 생체분자의 생성을 나타내는 복수의 숙주 세포로부터 숙주 세포를 확인하는 단계.
  80. 제 79 항에 있어서,
    확인된 숙주 세포를 복수의 다른 숙주 세포로부터 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  81. 제 80 항에 있어서,
    방법은 분리된 숙주 세포를 저장하는 단계를 포함하는 방법.
  82. 제 80 항에 있어서,
    방법은 분리된 숙주 세포를 확장시키는 단계를 포함하는 방법.
  83. 제 79 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항에 있어서,
    복수의 숙주 세포는 적어도 제 1 및 제 2 숙주 세포를 포함하고, 제 1 및 제 2 숙주 세포는 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 이종 프로모터로부터 선택된 상이한 프로모터로 형질전환되며 상이한 프로모터는 동일한 이종 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되는 방법.
  84. 제 83 항에 있어서,
    복수의 숙주 세포는 제 3 숙주 세포를 추가로 포함하고, 여기서 제 1, 제 2 및 제 3 숙주 세포는 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 이종 프로모터로부터 선택된 상이한 프로모터로 형질전환되며 상이한 프로모터는 동일한 이종 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되는 방법.
  85. 제 84 항에 있어서,
    복수의 숙주 세포는 제 4 숙주 세포를 추가로 포함하고, 여기서 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 숙주 세포는 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 이종 프로모터로부터 선택된 상이한 프로모터로 형질전환되며 상이한 프로모터는 동일한 이종 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되는 방법.
  86. 제 85 항에 있어서,
    복수의 숙주 세포는 제 5 숙주 세포를 추가로 포함하고, 여기서 제 1, 제 2, 제 3, 제 4 및 제 5 숙주 세포는 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 이종 프로모터로부터 선택된 상이한 프로모터로 형질전환되며 상이한 프로모터는 동일한 이종 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되는 방법.
  87. 제 86 항에 있어서,
    복수의 숙주 세포는 제 6 숙주 세포를 추가로 포함하고, 여기서 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5 및 제 6 숙주 세포는 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 이종 프로모터로부터 선택된 상이한 프로모터로 형질전환되며 상이한 프로모터는 동일한 이종 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되는 방법.
  88. 제 87 항에 있어서,
    복수의 숙주 세포는 제 7 숙주 세포를 추가로 포함하고, 여기서 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6 및 제 7 숙주 세포는 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 이종 프로모터로부터 선택된 상이한 프로모터로 형질전환되며 상이한 프로모터는 동일한 이종 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되는 방법.
  89. 제 88 항에 있어서,
    복수의 숙주 세포는 제 8 숙주 세포를 추가로 포함하고, 여기서 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7 및 제 8 숙주 세포는 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 이종 프로모터로부터 선택된 상이한 프로모터로 형질전환되며 상이한 프로모터는 동일한 이종 보조 표적 유전자에 작동 가능하게 연결되는 방법.
  90. 제 79 항 내지 제 89 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 보조 표적 유전자는 쉘 3 및/또는 쉘 4 표적 유전자인 방법.
  91. 제 79 항 내지 제 90 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제공하는 단계는 이종 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 점진적으로 증가하는 수준의 프로모터 활성을 갖는 복수의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터 라이브러리로 복수의 숙주 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 방법.
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