CN114835783A - NCgl2747基因突变体及其在制备L-赖氨酸中的应用 - Google Patents
NCgl2747基因突变体及其在制备L-赖氨酸中的应用 Download PDFInfo
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/265—Micrococcus
- C12R2001/28—Micrococcus glutamicus ; Corynebacterium glutamicum
Abstract
本发明公开了NCgl2747基因突变体及其在制备L‑赖氨酸中的应用。本发明公开的NCgl2747基因突变体为序列表中SEQ ID No.3所示的DNA分子，其编码SEQ ID No.4所示的NCgl2747突变蛋白。本发明发现将NCgl2747基因突变为SEQ ID No.3所示的NCgl2747基因突变体或过表达NCgl2747基因突变体后，有助于L‑赖氨酸产量及生长速率的提高，而对基因进行弱化或敲除，不利于L‑赖氨酸的积累，同时会降低菌株的生长速率。说明，本发明的NCgl2747基因突变体及其编码的NCgl2747突变蛋白可以用于制备L‑赖氨酸，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，NCgl2747基因突变体及其在制备L-赖氨酸中的应用。
背景技术
L-赖氨酸具有促进发育、增强免疫力和提高中枢神经组织功能等生理功效，是人体和动物不能自身合成且生长必需的8种基本氨基酸之一。目前，L-赖氨酸是世界上的第二大氨基酸品种，主要生产方法是发酵法，其中谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)等是赖氨酸的重要生产菌株。L-赖氨酸工业产量的约90％用作饲料工业中的营养强化剂，10％用作食品工业中的鲜味剂和甜味剂，以及医药行业中的药物中间体。
对发酵法生产L-赖氨酸的改进可以涉及发酵技术如搅拌和供应氧气；或涉及营养培养基的组成，例如发酵过程中的糖浓度；或涉及将发酵液加工成合适的产品形式，例如通过干燥和造粒发酵液或离子交换色谱；或可以涉及相关微生物本身的固有性能性质。
用于改善这些微生物的性能性质的方法包括是诱变、突变体的选择和筛选。以这种方式获得的菌株对抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷型并产生L-赖氨酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以生产L-赖氨酸的蛋白质与其相关生物材料。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质，该蛋白质名称为NCgl2747A955T，NCgl2747A955T为如下A1)或A)：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
A2)在A1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
本发明还提供了与NCgl2747A955T相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)编码NCgl2747A955T的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)：
b11)序列表中SEQ ID No.3所示的DNA分子；
b12)与b11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码NCgl2747A955T的DNA分子；
b13)在严格条件下与b11)或b12)限定的核苷酸序列杂交，且编码NCgl2747A955T的基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码NCgl2747A955T蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的NCgl2747A955T蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码NCgl2747A955T蛋白质且具有NCgl2747A955T蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码NCgl2747A955T蛋白质的核酸分子的表达盒(NCgl2747A955T基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达NCgl2747A955T蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动NCgl2747A955T基因转录的启动子，还可包括终止NCgl2747A955T基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
上述生物材料中，B2)所述表达盒具体可为SEQ ID No.8所示的DNA分子。
可用现有的表达载体构建含有所述NCgl2747A955T基因表达盒的重组载体。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pK18mobsacB载体或pXMJ19载体。
B3)所述重组载体可为重组载体pK18-NCgl2747A955T，pK18-NCgl2747A955TOE或pXMJ19-NCgl2747A955T。
所述重组载体pK18-NCgl2747A955T是将pK18mobsacB载体的Xbal I和BamH I识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.5所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变得到的重组载体。重组载体pK18-NCgl2747A955T含有SEQ ID No.3所示的突变基因NCgl2747A955T的突变位点(A-T)。
所述pK18-NCgl2747A955TOE为在pK18mobsacB的Xbal I和BamH I的识别序列间插入B2)所述表达盒得到的重组载体。
所述pXMJ19-NCgl2747A955T为在pXMJ19载体中插入B2)所述表达盒得到的重组载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，大肠杆菌(Escherichia coli)，菠萝泛菌(Pantoeaananatis)，短杆菌(Bacillus brevis)或乳酸短杆菌(Brevis lactobacillus)。
在本发明的一个实施例中，所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YP097158或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032。
B4)所述重组微生物为将含有SEQ ID No.1所示的NCgl2747基因的微生物中的NCgl2747基因替换为B1)所述核酸分子得到的重组微生物，或向微生物中导入B1)所述核酸分子并使其得到表达得到的重组微生物。
在本发明的实施例中，所述重组微生物为重组菌YPL-NCgl2747-1、重组菌L2747-1、重组菌YPL-NCgl2747-3、重组菌L2747-3、重组菌YPL-NCgl2747-5或重组菌L2747-5。
所述重组菌YPL-NCgl2747-1为将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YP097158的NCgl2747基因替换为NCgl2747A955T基因，并保持其他序列不变得到的菌株。
所述重组菌L2747-1为将ATCC13032的NCgl2747基因替换为NCgl2747A955T基因，并保持其他序列不变得到的菌株。
所述重组菌YPL-NCgl2747-3是将谷氨酸棒杆菌YP097158的基因组中上同源臂NCgl1741和下同源臂NCgl1742的间隔区替换为NCgl2747A955T基因及其启动子(即序列表中SEQ ID No.8的第1-331位)，保持谷氨酸棒杆菌YP097158的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
所述重组菌L2747-3是将谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组中上同源臂NCgl1741和下同源臂NCgl1742的间隔区替换为NCgl2747A955T基因及其启动子(即序列表中SEQ IDNo.8的第1-331位)，保持谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
所述重组菌YPL-NCgl2747-5为将所述pXMJ19-NCgl2747A955T导入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YP097158中得到的重组菌。
重组菌L2747-5为将所述pXMJ19-NCgl2747A955T导入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032中得到的重组菌。
本发明还提供了一种制备L-赖氨酸的方法，所述方法包括：使受体生物细胞中表达NCgl2747A955T，或提高受体生物细胞中NCgl2747A955T的含量或活性，或提高受体生物细胞中SEQ ID No.2所示蛋白质的含量或活性，得到重组生物细胞；培养所述重组生物细胞，得到L-赖氨酸。
上述方法中，所述生物细胞可为能合成L-赖氨酸的酵母、细菌、藻、真菌、植物细胞或动物细胞。
所述细菌为谷氨酸棒杆菌，如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YP097158。
本发明的细菌包括但不限于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，任何含有序列表中SEQ ID No.1所示的NCgl2747基因且可以合成L-赖氨酸均可利用本发明的SEQ ID No.4所示的NCgl2747突变蛋白质及其相关生物材料来生产L-赖氨酸，如细菌可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，大肠杆菌(Escherichia coli)，菠萝泛菌(Pantoea ananatis)，短杆菌(Bacillus brevis)或乳酸短杆菌(Brevis lactobacillus)。
上述方法可通过向所述受体生物细胞中导入NCgl2747A955T的编码基因并使其得到表达实现，或向所述受体生物细胞中导入SEQ ID No.2所示蛋白质的编码基因并使其得到表达实现；
或，所述受体生物细胞中含有SEQ ID No.1所示的DNA分子，所述方法通过将所述受体生物细胞中SEQ ID No.1所示的DNA分子替换为SEQ ID No.3所示的DNA分子实现。
上述方法中，培养所述重组生物细胞可采用能使所述重组生物细胞生长的培养基进行；
和/或，培养所述重组生物细胞采用能使所述重组生物细胞生长的条件进行。
所述重组生物细胞可为上文所述重组微生物。
本发明还提供了一种用于制备L-赖氨酸的产品，所述产品含有(或其活性成分为)NCgl2747A955T或所述生物材料。
本发明的NCgl2747A955T或所述生物材料可以用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的赖氨酸，所生产的氨基酸还可为谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸和组氨酸、莽草酸，原儿茶酸、丁二酸，a酮戊二酸，柠檬酸、鸟氨酸，瓜氨酸。各种目标产物的生产时，将本发明的NCgl2747A955T置于目的产物合成途径中即可实现目的产物的生产。
本发明在谷氨酸棒杆菌中对NCgl2747基因编码区进行点突变NCgl2747I319F及过表达，有助于L-赖氨酸产量及生长速率的提高，而对基因进行弱化或敲除，不利于L-赖氨酸的积累，同时会降低菌株的生长速率。说明，本发明的NCgl2747I319F及其编码基因可以用于制备L-赖氨酸，具有很好的应用前景。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
生物材料保藏说明
分类命名：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
菌株编号：YP097158
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：CGMCC
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101
保藏日期：2016年8月16日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12856
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
实施例1、构建包含点突变的NCgl2747基因编码区的重组载体
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032基因组序列，设计并合成两对扩增NCgl2747基因编码区的引物，以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YP097158(保藏编号：CGMCC No.12856，保藏日期：2016年8月16日，保藏单位：中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话：010-64807355)及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032的NCgl2747基因编码区(SEQ IDNo.1)中引入点突变，该点突变为将NCgl2747基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第955位腺嘌呤(A)突变为胸腺嘧啶(T)，得到SEQ ID No.3所示的DNA分子(突变后的NCgl2747基因，记为NCgl2747A955T基因)。
其中，SEQ ID No.1所示的NCgl2747基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的NCgl2747蛋白质。
SEQ ID No.3所示的NCgl2747A955T基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.4的突变蛋白质(即NCgl2747A955T蛋白质)。NCgl2747I319F蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID No.4)中的第319位苯丙氨酸(F)由NCgl2747蛋白质第319位的异亮氨酸(I)突变而来。
采用NEBuilder组装技术进行重组载体构建，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，加粗字体的核苷酸为突变位置：
P1：5′-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTCACCCGCTACGAAGTTGT-3′(带下划线的核苷酸序列为pK18上的序列)，
P4：5′-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCTTGTTCTACGAATGCCCAC-3′(带下划线的核苷酸序列为pK18上的序列)。
构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增，获得两条分别带有突变核苷酸，大小分别为624bp和705bp的NCgl2747基因编码区的DNA片段(NCgl2747 Up和NCgl2747 Down)。
将上述两条DNA片段(NCgl2747 Up和NCgl2747 Down)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，与经过酶切(Xbal I与BamHI)后纯化的pK18mobsacB质粒(Addgene公司)用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化大肠杆菌DH5a后长出的单克隆用引物M13F/M13R(M13F：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，M13R：5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)经PCR鉴定后，提取质粒获得序列正确的阳性重组载体记为pK18-NCgl2747A955T，该重组载体上含有卡那霉素抗性标记。
此重组载体pK18-NCgl2747A955T中NCgl2747A955T Up-Down DNA大小1296bp(SEQ IDNo.5)，含有突变位点(A-T)，将导致菌株谷氨酸棒杆菌YP097158中NCgl2747基因编码区的第955位腺嘌呤(A)突变为胸腺嘧啶(T)，最终导致编码蛋白的第319位异亮氨酸(I)变为苯丙氨酸(F)。
重组载体pK18-NCgl2747A955T是将pK18mobsacB载体的Xbal I和BamH I识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.5所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变得到的重组载体。重组载体pK18-NCgl2747A955T含有SEQ ID No.3所示的突变基因NCgl2747A955T的突变位点(A-T)。
实施例2、构建包含基因NCgl2747A955T的工程菌株
将实施例1中的等位替换质粒(pK18-NCgl2747A955T)通过电击转化入L-赖氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YP097158(其构建方法可参见WO2014121669A1；经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的NCgl2747基因编码区)及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032中，在含卡那霉素的固体培养平板上进行培养(培养基成分和培养条件参见表1)。对培养产生的单菌落分别通过实施例1中的引物P1和通用引物M13R进行鉴定，能扩增出1384bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基(该培养基是将表1中的培养基中蔗糖的浓度提高至15g/L得到的培养基)上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR扩增：
P5：5′-TCTATCCAAGGCATACCGC-3′；
P6：5′-TCCCATTGGTTTCACACAG-3′。
将得到的DNA片段(280bp)处理(95℃高温变性10min、迅速冰浴5min)后进行SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphis)电泳(以质粒pK18-NCgl2747A1089C扩增片段为阳性对照，谷氨酸棒杆菌ATCC13032扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件参见表2。由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。再次通过引物P5/P6 PCR扩增阳性菌株NCgl2747A955T基因片段，并连接到PMD19-T载体上进行测序，通过序列比对，碱基序列发生突变(A-T)的菌株为等位替换成功的阳性菌株，将由谷氨酸棒杆菌YP097158及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032得到的阳性菌株分别命名为YPL-NCgl2747-1、L2747-1。
重组菌YPL-NCgl2747-1和L2747-1均含有SEQ ID No.3所示的突变的基因NCgl2747A955T，并均能表达SEQ ID No.4所示的蛋白质。重组菌YPL-NCgl2747-1与谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YP097158的区别仅在于：YPL-NCgl2747-1为将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YP097158的NCgl2747基因替换为NCgl2747A955T基因，并保持其他序列不变得到的菌株，重组菌L2747-1与ATCC13032的区别仅在于：L2747-1为将ATCC13032的NCgl2747基因替换为NCgl2747A955T基因，并保持其他序列不变得到的菌株。
表1培养基的组成和培养条件
表2 SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件
实施例3、构建基因组上过表达NCgl2747基因或NCgl2747A955T基因的工程菌株
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，设计并合成三对扩增上下游同源臂片段及NCgl2747或NCgl2747A955T基因编码区及启动子区的引物，以同源重组的方式在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YP097158及野生谷氨酸棒杆菌ATCC13032中插入NCgl2747或NCgl2747A955T基因。
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P7：5′-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG-3′(带下划线的核苷酸序列为pK18上的序列)，
P8：5′-GATTGAGTAGCAAGTGCTTTGGTGCACCGAGAACAGATG-3′，
P9：5′-CATCTGTTCTCGGTGCACCAAAGCACTTGCTACTCAATC-3′，
P10：5′-GATTTAATTGCGCCATCTGCTACTGCTTGTAAGTGGACAGG-3′，
P11：5′-CCTGTCCACTTACAAGCAGTAGCAGATGGCGCAATTAAATC-3′，
P12：5′-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGATC-3′(带下划线的核苷酸序列为pK18上的序列)。
构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P7/P8，P9/P10，P11/P12进行PCR扩增，获得上游同源臂片段763bp(对应于谷氨酸棒杆菌ATCC13032 NCgl1740部分编码区以及NCgl1741基因及其启动子区，序列如SEQ ID No.6所示)，NCgl2747基因及其启动子片段1645bp(序列如SEQ ID No.7所示)及下游同源臂片段596bp(对应于谷氨酸棒杆菌ATCC13032 NCgl1742基因部分编码区，序列如SEQ ID No.9所示)。PCR反应结束后，对每个模板扩增得到的3个片段采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3个片段与经过Xbal I和BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(Addgene公司)用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物(M13F：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，M13R：5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)经PCR鉴定获得阳性整合质粒(重组载体)，所得重组载体为pK18-NCgl2747OE，该阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。
SEQ ID No.7中，第1-331位为NCgl1741基因的启动子，第332-1645位为NCgl1741基因。
以谷氨酸棒杆菌YPL-NCgl2747-1为模板，分别以引物P7/P8，P9/P10，P11/P12进行PCR扩增，获得上游同源臂片段763bp(对应于谷氨酸棒杆菌ATCC13032 NCgl1740部分编码区以及NCgl1741基因及其启动子区，序列如SEQ ID No.6所示)，NCgl2747A955T基因及其启动子片段1645bp(序列如SEQ ID No.8所示)及下游同源臂片段596bp(对应于谷氨酸棒杆菌ATCC13032 NCgl1742基因部分编码区，序列如SEQ ID No.9所示)。PCR反应结束后，对每个模板扩增得到的3个片段采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3个片段与经过Xbal I和BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(Addgene公司)用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物(M13F：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，M13R：5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)经PCR鉴定获得阳性整合质粒(重组载体)，所得重组载体为pK18-NCgl2747A955TOE，该阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。
SEQ ID No.8中，第1-331位为NCgl2747A955T基因的启动子，第332-1645位为NCgl2747A955T基因。
将测序正确的整合质粒(pK18-NCgl2747OE、pK18-NCgl2747A955TOE)分别电转化入谷氨酸棒杆菌菌株YP097158及野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过P13/P14引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1959bp(序列如SEQ ID No.10所示)的片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。将阳性菌株在含15％蔗糖的固体培养平板(该培养基是将表1中的培养基中蔗糖的浓度提高至15g/L得到的培养基)上划线培养，对培养产生的单菌落进一步采用P15/P16引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1600bp(序列如SEQ ID No.11所示)的菌为NCgl2747或NCgl2747A1089C基因及其启动子整合到谷氨酸棒杆菌基因组上同源臂NCgl1741和下同源臂NCgl1742的间隔区上的阳性菌株，将以谷氨酸棒杆菌YP097158为出发菌获得的菌株分别命名为YPL-NCgl2747-2(不含突变点)和YPL-NCgl2747-3(含突变点)，将以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌获得的菌株分别命名为L2747-2(不含突变点)和L2747-3(含突变点)。
重组菌YPL-NCgl2747-2含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的NCgl2747基因；具体地，重组菌YPL-NCgl2747-2是将谷氨酸棒杆菌YP097158的基因组中上同源臂NCgl1741和下同源臂NCgl1742的间隔区替换为NCgl2747基因及其启动子(即序列表中SEQ ID No.7的第1-331位)，保持谷氨酸棒杆菌YP097158的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝NCgl2747基因的重组菌可以显著和稳定地提高NCgl2747基因的表达量。
重组菌L2747-2含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的NCgl2747基因；具体地，重组菌L2747-2是将谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组中上同源臂NCgl1741和下同源臂NCgl1742的间隔区替换为NCgl2747基因及其启动子(即序列表中SEQ ID No.7的第1-331位)，保持谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝NCgl2747基因的重组菌可以显著和稳定地提高NCgl2747基因的表达量。
重组菌YPL-NCgl2747-3含有SEQ ID No.3所示的突变的NCgl2747A955T基因；具体地，重组菌YPL-NCgl2747-3是将谷氨酸棒杆菌YP097158的基因组中上同源臂NCgl1741和下同源臂NCgl1742的间隔区替换为NCgl2747A955T基因及其启动子(即序列表中SEQ ID No.8的第1-331位)，保持谷氨酸棒杆菌YP097158的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
重组菌L2747-3含有SEQ ID No.3所示的突变的NCgl2747A955T基因；具体地，重组菌L2747-3是将谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组中上同源臂NCgl1741和下同源臂NCgl1742的间隔区替换为NCgl2747A955T基因及其启动子(即序列表中SEQ ID No.8的第1-331位)，保持谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
PCR鉴定引物如下所示：
P13：5′-TCCAAGGAAGATACACGCC-3′(对应上同源臂NCgl1740的外侧)，
P14：5′-GGTCGTAGATTTCATCGGC-3′(对应NCgl2747基因内部)，
P15：5′-CAACGGTGTCTCAGAACTAATC-3′(对应NCgl2747基因内部)，
P16：5′-TGGTCGTTGGAATCTTGC-3′(对应下同源臂NCgl1742的外侧)。
实施例4、构建质粒上过表达NCgl2747基因或NCgl2747A955T基因的工程菌株
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，设计并合成一对扩增NCgl2747或NCgl2747A1089C基因编码区及启动子区的引物，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P17：5′-GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCAAAGCACTTGCTACTCAATC-3′(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列)，
P18：5′-ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACCTACTGCTTGTAAGTGGACAGG-3′(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列)。
构建方法：分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032和YPL-NCgl2747-1为模板，以引物P17/P18进行PCR扩增，获得NCgl2747基因及其启动子片段(序列如SEQ ID No.12所示)和NCgl2747A955T基因及其启动子片段1715bp(序列如SEQ ID No.13所示)，对扩增产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收，回收的DNA片段与经EcoR I酶切回收的穿梭质粒pXMJ19用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性过表达质粒pXMJ19-NCgl2747(含有NCgl2747基因)和pXMJ19-NCgl2747A955T(含有NCgl2747A955T基因)，将阳性质粒送测序。因该质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素来筛选质粒是否转化到菌株中。
SEQ ID No.12中，第37-367位为NCgl2747基因的启动子，第368-1681位为NCgl2747基因。
SEQ ID No.13中，第37-367位为NCgl2747A955T基因的启动子，第368-1681位为NCgl2747A955T基因。
将测序正确的pXMJ19-NCgl2747和pXMJ19-NCgl2747A955T质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌YP097158及野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过引物M13R(-48)/P18(M13R(-48):AGCGGATAACAATTTCACACAGGA)进行PCR鉴定。以谷氨酸棒杆菌YP097158为出发菌获得的菌株分别被命名为YPL-NCgl2747-4(含质粒pXMJ19-NCgl2747)和YPL-NCgl2747-5(含质粒pXMJ19-NCgl2747A955T)，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌获得的菌株分别命名为L2747-4(含质粒pXMJ19-NCgl2747)和L2747-5(含质粒pXMJ19-NCgl2747A955T)。
重组菌YPL-NCgl2747-4和L2747-4含有带SEQ ID No.1所示的NCgl2747基因的质粒；
重组菌YPL-NCgl2747-5和L2747-5含有带SEQ ID No.3所示的突变的NCgl2747A955T基因的质粒。
实施例5、构建基因组上缺失NCgl2747基因的工程菌株
根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组序列，合成两对扩增NCgl2747基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P19：5′-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGCAGCAAGTAGCCTGGGTAT-3′(带下划线的核苷酸序列为pK18上的序列)，
P20：5′-AGAAGATGAAGGACGTGGGTAACTTCCTGTCCACT-3′，
P21：5′-AGTGGACAGGAAGTTACCCACGTCCTTCATCTTCTCCGAC-3′，
P22：5′-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCACGCAACACTTGATGGAGT-3′(带下划线的核苷酸序列为pK18上的序列)。
构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P19/P20和P21/P22进行PCR扩增，获得敲除NCgl2747的上游同源臂片段647bp及下游同源臂片段753bp。对扩增的产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，回收的DNA片段与经过Xbal I/BamHI酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(Addgene公司)用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性敲除载体pK18-ΔNCgl2747，该质粒含有整个敲除NCgl2747同源臂片段1400bp(序列如SEQ ID No.14所示)和卡那霉素抗性作为筛选标记，将该质粒送测序。
将测序正确的敲除质粒pK18-ΔNCgl2747电转化入谷氨酸棒杆菌YP097158和野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过引物P19/P22进行PCR鉴定：同时扩增出大小1400bp及2549bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出2549bp条带的菌株为原菌。将阳性菌株在15％蔗糖固体培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用引物P19/P22进行PCR鉴定，扩增出大小为1400bp条带的菌株为NCgl2747基因编码区被敲除的阳性菌株。再次通过P19/P22引物PCR扩增阳性菌株NCgl2747片段，并连接到pMD19-T载体进行测序，将测序正确的菌株命名为YPL-NCgl2747-6(谷氨酸棒杆菌YP097158基因组上的NCgl2747基因被敲除)和L2747-6(野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组上的NCgl2747基因被敲除)。
实施例6、L-赖氨酸发酵实验
将实施例1-5构建的菌株和谷氨酸棒杆菌原始菌株YP097158和ATCC13032在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以表3所示的培养基和表4所示的控制工艺进行发酵实验，发酵结束采用茚三酮比色法检测L-赖氨酸产量，用分光光度计测量OD(660nm)。每个菌株重复三次，结果如表5所示。
表3发酵培养基配方
| 成分 | 配方 |
| 淀粉水解糖 | 30g/L |
| 硫酸铵 | 12g/L |
| 硫酸镁 | 0.87g/L |
| 糖蜜 | 20g/L |
| 酸化玉米浆 | 3mL/L |
| 磷酸 | 0.4mL/L |
| 氯化钾 | 0.53g/L |
| 消泡剂(2％泡敌) | 4mL/L |
| 硫酸亚铁 | 120mg/L |
| 硫酸锰 | 120mg/L |
| 烟酰胺 | 42mg/L |
| 泛酸钙 | 6.3mg/L |
| 维生素B1 | 6.3mg/L |
| 铜、锌盐溶液 | 0.6g/L |
| 生物素 | 0.88mg/L |
表4发酵控制工艺
表5L-赖氨酸发酵实验结果
结果如表5所示，在谷氨酸棒杆菌中对NCgl2747基因编码区进行点突变NCgl2747I319F及过表达，有助于L-赖氨酸产量及生长速率的提高，而对基因进行弱化或敲除，不利于L-赖氨酸的积累，同时会降低菌株的生长速率。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司
<120> NCgl2747基因突变体及其在制备L-赖氨酸中的应用
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1314
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 1
gtgactacag acaagcgcaa aacctctaag accaccgaca ccgccaacaa ggctgtgggc 60
gcggatcagg cagcgcgtcc cactcggcga acaactcgcc gcatcttcga tcagtcggag 120
aagatgaagg acgtgctgta cgagatccgt ggcccggtgg ccgcggaggc ggaacgcatg 180
gagcttgatg ggcataacat cttaaagctc aacacgggaa atccagccgt gttcggattc 240
gatgcccccg acgtgattat gcgtgacatg atcgccaacc ttccaacttc ccaagggtat 300
tccacctcca aaggcattat tccggcccgg cgagcagtgg tcacccgcta cgaagttgtg 360
cccggattcc cccacttcga tgttgatgat gtgttcttag gcaacggtgt ctcagaacta 420
atcaccatga ccacccaagc actcctcaac gacggcgatg aagttcttat ccccgcaccg 480
gactacccac tgtggactgc cgcaacctcc ctggctggtg gtaagcctgt gcactacctc 540
tgtgatgagg aagatgactg gaacccatcc atcgaagaca tcaagtccaa aatctcagag 600
aaaaccaaag ctattgtggt gatcaacccc aacaacccca cgggagctgt ctacccgcgc 660
cgggtgttgg aacaaatcgt cgagattgca cgcgagcatg acctgctgat tttggccgat 720
gaaatctacg accgcattct ctacgatgat gccgagcaca tcagcctggc aacccttgca 780
ccagatctcc tttgcatcac atacaacggt ctatccaagg cataccgcgt cgcaggatac 840
cgagctggct ggatggtatt gactggacca aagcaatacg cacgtggatt tattgagggc 900
ctcgaactcc tcgcaggcac tcgactctgc ccaaatgtcc cagctcagca cgctattcag 960
gtagctctcg gtggacgcca gtccatctac gacctcactg gcgaacacgg ccgactcctg 1020
gaacagcgca acatggcatg gacgaaactc aacgaaatcc caggtgtcag ctgtgtgaaa 1080
ccaatgggag ctctatacgc gttccccaag ctcgacccca acgtgtacga aatccacgac 1140
gacacccaac tcatgctgga tcttctccgt gccgagaaaa tcctcatggt tcagggcact 1200
ggcttcaact ggccacatca cgatcacttc cgagtggtca ccctgccatg ggcatcccag 1260
ttggaaaacg caattgagcg cctgggtaac ttcctgtcca cttacaagca gtag 1314
<210> 2
<211> 437
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 2
Met Thr Thr Asp Lys Arg Lys Thr Ser Lys Thr Thr Asp Thr Ala Asn
1 5 10 15
Lys Ala Val Gly Ala Asp Gln Ala Ala Arg Pro Thr Arg Arg Thr Thr
20 25 30
Arg Arg Ile Phe Asp Gln Ser Glu Lys Met Lys Asp Val Leu Tyr Glu
35 40 45
Ile Arg Gly Pro Val Ala Ala Glu Ala Glu Arg Met Glu Leu Asp Gly
50 55 60
His Asn Ile Leu Lys Leu Asn Thr Gly Asn Pro Ala Val Phe Gly Phe
65 70 75 80
Asp Ala Pro Asp Val Ile Met Arg Asp Met Ile Ala Asn Leu Pro Thr
85 90 95
Ser Gln Gly Tyr Ser Thr Ser Lys Gly Ile Ile Pro Ala Arg Arg Ala
100 105 110
Val Val Thr Arg Tyr Glu Val Val Pro Gly Phe Pro His Phe Asp Val
115 120 125
Asp Asp Val Phe Leu Gly Asn Gly Val Ser Glu Leu Ile Thr Met Thr
130 135 140
Thr Gln Ala Leu Leu Asn Asp Gly Asp Glu Val Leu Ile Pro Ala Pro
145 150 155 160
Asp Tyr Pro Leu Trp Thr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Gly Gly Lys Pro
165 170 175
Val His Tyr Leu Cys Asp Glu Glu Asp Asp Trp Asn Pro Ser Ile Glu
180 185 190
Asp Ile Lys Ser Lys Ile Ser Glu Lys Thr Lys Ala Ile Val Val Ile
195 200 205
Asn Pro Asn Asn Pro Thr Gly Ala Val Tyr Pro Arg Arg Val Leu Glu
210 215 220
Gln Ile Val Glu Ile Ala Arg Glu His Asp Leu Leu Ile Leu Ala Asp
225 230 235 240
Glu Ile Tyr Asp Arg Ile Leu Tyr Asp Asp Ala Glu His Ile Ser Leu
245 250 255
Ala Thr Leu Ala Pro Asp Leu Leu Cys Ile Thr Tyr Asn Gly Leu Ser
260 265 270
Lys Ala Tyr Arg Val Ala Gly Tyr Arg Ala Gly Trp Met Val Leu Thr
275 280 285
Gly Pro Lys Gln Tyr Ala Arg Gly Phe Ile Glu Gly Leu Glu Leu Leu
290 295 300
Ala Gly Thr Arg Leu Cys Pro Asn Val Pro Ala Gln His Ala Ile Gln
305 310 315 320
Val Ala Leu Gly Gly Arg Gln Ser Ile Tyr Asp Leu Thr Gly Glu His
325 330 335
Gly Arg Leu Leu Glu Gln Arg Asn Met Ala Trp Thr Lys Leu Asn Glu
340 345 350
Ile Pro Gly Val Ser Cys Val Lys Pro Met Gly Ala Leu Tyr Ala Phe
355 360 365
Pro Lys Leu Asp Pro Asn Val Tyr Glu Ile His Asp Asp Thr Gln Leu
370 375 380
Met Leu Asp Leu Leu Arg Ala Glu Lys Ile Leu Met Val Gln Gly Thr
385 390 395 400
Gly Phe Asn Trp Pro His His Asp His Phe Arg Val Val Thr Leu Pro
405 410 415
Trp Ala Ser Gln Leu Glu Asn Ala Ile Glu Arg Leu Gly Asn Phe Leu
420 425 430
Ser Thr Tyr Lys Gln
435
<210> 3
<211> 1314
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
gtgactacag acaagcgcaa aacctctaag accaccgaca ccgccaacaa ggctgtgggc 60
gcggatcagg cagcgcgtcc cactcggcga acaactcgcc gcatcttcga tcagtcggag 120
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gagcttgatg ggcataacat cttaaagctc aacacgggaa atccagccgt gttcggattc 240
gatgcccccg acgtgattat gcgtgacatg atcgccaacc ttccaacttc ccaagggtat 300
tccacctcca aaggcattat tccggcccgg cgagcagtgg tcacccgcta cgaagttgtg 360
cccggattcc cccacttcga tgttgatgat gtgttcttag gcaacggtgt ctcagaacta 420
atcaccatga ccacccaagc actcctcaac gacggcgatg aagttcttat ccccgcaccg 480
gactacccac tgtggactgc cgcaacctcc ctggctggtg gtaagcctgt gcactacctc 540
tgtgatgagg aagatgactg gaacccatcc atcgaagaca tcaagtccaa aatctcagag 600
aaaaccaaag ctattgtggt gatcaacccc aacaacccca cgggagctgt ctacccgcgc 660
cgggtgttgg aacaaatcgt cgagattgca cgcgagcatg acctgctgat tttggccgat 720
gaaatctacg accgcattct ctacgatgat gccgagcaca tcagcctggc aacccttgca 780
ccagatctcc tttgcatcac atacaacggt ctatccaagg cataccgcgt cgcaggatac 840
cgagctggct ggatggtatt gactggacca aagcaatacg cacgtggatt tattgagggc 900
ctcgaactcc tcgcaggcac tcgactctgc ccaaatgtcc cagctcagca cgcttttcag 960
gtagctctcg gtggacgcca gtccatctac gacctcactg gcgaacacgg ccgactcctg 1020
gaacagcgca acatggcatg gacgaaactc aacgaaatcc caggtgtcag ctgtgtgaaa 1080
ccaatgggag ctctatacgc gttccccaag ctcgacccca acgtgtacga aatccacgac 1140
gacacccaac tcatgctgga tcttctccgt gccgagaaaa tcctcatggt tcagggcact 1200
ggcttcaact ggccacatca cgatcacttc cgagtggtca ccctgccatg ggcatcccag 1260
ttggaaaacg caattgagcg cctgggtaac ttcctgtcca cttacaagca gtag 1314
<210> 4
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
Met Thr Thr Asp Lys Arg Lys Thr Ser Lys Thr Thr Asp Thr Ala Asn
1 5 10 15
Lys Ala Val Gly Ala Asp Gln Ala Ala Arg Pro Thr Arg Arg Thr Thr
20 25 30
Arg Arg Ile Phe Asp Gln Ser Glu Lys Met Lys Asp Val Leu Tyr Glu
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Ser Gln Gly Tyr Ser Thr Ser Lys Gly Ile Ile Pro Ala Arg Arg Ala
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Val Val Thr Arg Tyr Glu Val Val Pro Gly Phe Pro His Phe Asp Val
115 120 125
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130 135 140
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Gly Pro Lys Gln Tyr Ala Arg Gly Phe Ile Glu Gly Leu Glu Leu Leu
290 295 300
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355 360 365
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<211> 1296
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
tcacccgcta cgaagttgtg cccggattcc cccacttcga tgttgatgat gtgttcttag 60
gcaacggtgt ctcagaacta atcaccatga ccacccaagc actcctcaac gacggcgatg 120
aagttcttat ccccgcaccg gactacccac tgtggactgc cgcaacctcc ctggctggtg 180
gtaagcctgt gcactacctc tgtgatgagg aagatgactg gaacccatcc atcgaagaca 240
tcaagtccaa aatctcagag aaaaccaaag ctattgtggt gatcaacccc aacaacccca 300
cgggagctgt ctacccgcgc cgggtgttgg aacaaatcgt cgagattgca cgcgagcatg 360
acctgctgat tttggccgat gaaatctacg accgcattct ctacgatgat gccgagcaca 420
tcagcctggc aacccttgca ccagatctcc tttgcatcac atacaacggt ctatccaagg 480
cataccgcgt cgcaggatac cgagctggct ggatggtatt gactggacca aagcaatacg 540
cacgtggatt tattgagggc ctcgaactcc tcgcaggcac tcgactctgc ccaaatgtcc 600
cagctcagca cgcttttcag gtagctctcg gtggacgcca gtccatctac gacctcactg 660
gcgaacacgg ccgactcctg gaacagcgca acatggcatg gacgaaactc aacgaaatcc 720
caggtgtcag ctgtgtgaaa ccaatgggag ctctatacgc gttccccaag ctcgacccca 780
acgtgtacga aatccacgac gacacccaac tcatgctgga tcttctccgt gccgagaaaa 840
tcctcatggt tcagggcact ggcttcaact ggccacatca cgatcacttc cgagtggtca 900
ccctgccatg ggcatcccag ttggaaaacg caattgagcg cctgggtaac ttcctgtcca 960
cttacaagca gtagtagttg ttaggattca ccacgaatct caggattttt gagattcgtg 1020
gtgaattttt gcgttttcca gtcaggctcc tgcaactttc ggaccgattt cagaggggcg 1080
gagctggttt gtggtggatc cttgaaatgg aacctcgcag gaagctttca ggaagaccaa 1140
gttgggccta ggggtggcgg gattgcaaaa atccgtcccc ggttcgccat gaaatgctga 1200
ttttgatcga atctttgcgc taactgtagg gcgggttcag ggggtgaatg caccacgagc 1260
aacccgaagg gtgcgaagtg ggcattcgta gaacaa 1296
<210> 6
<211> 763
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
aatgcgttct ggactgaggt gaccaccatg caagacgagg tggacctagt gatcaccaac 60
ccgccgtttt ctctgttccg tgagttcctg agttggctat tacacggtga cgtgttgttt 120
tctatcatcg gtaacgcgaa cgtaatcaca tatctaggtg cctgaatcta gattaaaact 180
ataaacatta tttaaaacca ttgccttatt ggagcatgct gcaagctttt cgcggtgggc 240
ttgcaacatc ttacatcaga atgaatgatg ttaaacacct aataagttca agtagttaaa 300
aggaaatatc aacaatgtta cgaaaagcat ctatcacgct aatgatatcc gttacgctct 360
taacatgtgc ctctccagca caggcactgt catcacaagc actctcgtca gaaagctcca 420
cttcgcagag tgattctcct acgcaatttg ttgcgagtat agctgcgccc ttcaataaga 480
acttaaccta tgagcagcgc aaagccattc gtttcggacc tacgacagaa caagaagcag 540
aacaatgctt ggcaaagtat ggtcgcgatg gcgaggggcc atggcctgct attgctatct 600
atcctgactg ctccttcgat actatcgaac aagatttcta tgatcaagca atatccaaag 660
ccctctcagt aatcagtctg ggaagctcct agaagactcg taacgaccaa aagcaccgag 720
aacagatgca actcaagccc atttacatct gttctcggtg cac 763
<210> 7
<211> 1645
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
caaagcactt gctactcaat catggtaaac agcctggtcg cagtccttca cgattcaaac 60
tttgccttcc gctacgcctt ccacctgatc atcatagaag acggtgaagt aacagcagcc 120
ggagatccca cagagatcgt cactgcggga ctgatcgaag aagtctacaa cgtcaaagcc 180
tgtgcatccc agaccccgtg aacagcaaac cgatgatcgt gccactggaa agatcttagg 240
cagccgtggg attacaccct tttagagcta gaacagtaaa aattcaccca atagctttca 300
actacgcaca caaagtggca acattgagcg ggtgactaca gacaagcgca aaacctctaa 360
gaccaccgac accgccaaca aggctgtggg cgcggatcag gcagcgcgtc ccactcggcg 420
aacaactcgc cgcatcttcg atcagtcgga gaagatgaag gacgtgctgt acgagatccg 480
tggcccggtg gccgcggagg cggaacgcat ggagcttgat gggcataaca tcttaaagct 540
caacacggga aatccagccg tgttcggatt cgatgccccc gacgtgatta tgcgtgacat 600
gatcgccaac cttccaactt cccaagggta ttccacctcc aaaggcatta ttccggcccg 660
gcgagcagtg gtcacccgct acgaagttgt gcccggattc ccccacttcg atgttgatga 720
tgtgttctta ggcaacggtg tctcagaact aatcaccatg accacccaag cactcctcaa 780
cgacggcgat gaagttctta tccccgcacc ggactaccca ctgtggactg ccgcaacctc 840
cctggctggt ggtaagcctg tgcactacct ctgtgatgag gaagatgact ggaacccatc 900
catcgaagac atcaagtcca aaatctcaga gaaaaccaaa gctattgtgg tgatcaaccc 960
caacaacccc acgggagctg tctacccgcg ccgggtgttg gaacaaatcg tcgagattgc 1020
acgcgagcat gacctgctga ttttggccga tgaaatctac gaccgcattc tctacgatga 1080
tgccgagcac atcagcctgg caacccttgc accagatctc ctttgcatca catacaacgg 1140
tctatccaag gcataccgcg tcgcaggata ccgagctggc tggatggtat tgactggacc 1200
aaagcaatac gcacgtggat ttattgaggg cctcgaactc ctcgcaggca ctcgactctg 1260
cccaaatgtc ccagctcagc acgctattca ggtagctctc ggtggacgcc agtccatcta 1320
cgacctcact ggcgaacacg gccgactcct ggaacagcgc aacatggcat ggacgaaact 1380
caacgaaatc ccaggtgtca gctgtgtgaa accaatggga gctctatacg cgttccccaa 1440
gctcgacccc aacgtgtacg aaatccacga cgacacccaa ctcatgctgg atcttctccg 1500
tgccgagaaa atcctcatgg ttcagggcac tggcttcaac tggccacatc acgatcactt 1560
ccgagtggtc accctgccat gggcatccca gttggaaaac gcaattgagc gcctgggtaa 1620
cttcctgtcc acttacaagc agtag 1645
<210> 8
<211> 1645
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
caaagcactt gctactcaat catggtaaac agcctggtcg cagtccttca cgattcaaac 60
tttgccttcc gctacgcctt ccacctgatc atcatagaag acggtgaagt aacagcagcc 120
ggagatccca cagagatcgt cactgcggga ctgatcgaag aagtctacaa cgtcaaagcc 180
tgtgcatccc agaccccgtg aacagcaaac cgatgatcgt gccactggaa agatcttagg 240
cagccgtggg attacaccct tttagagcta gaacagtaaa aattcaccca atagctttca 300
actacgcaca caaagtggca acattgagcg ggtgactaca gacaagcgca aaacctctaa 360
gaccaccgac accgccaaca aggctgtggg cgcggatcag gcagcgcgtc ccactcggcg 420
aacaactcgc cgcatcttcg atcagtcgga gaagatgaag gacgtgctgt acgagatccg 480
tggcccggtg gccgcggagg cggaacgcat ggagcttgat gggcataaca tcttaaagct 540
caacacggga aatccagccg tgttcggatt cgatgccccc gacgtgatta tgcgtgacat 600
gatcgccaac cttccaactt cccaagggta ttccacctcc aaaggcatta ttccggcccg 660
gcgagcagtg gtcacccgct acgaagttgt gcccggattc ccccacttcg atgttgatga 720
tgtgttctta ggcaacggtg tctcagaact aatcaccatg accacccaag cactcctcaa 780
cgacggcgat gaagttctta tccccgcacc ggactaccca ctgtggactg ccgcaacctc 840
cctggctggt ggtaagcctg tgcactacct ctgtgatgag gaagatgact ggaacccatc 900
catcgaagac atcaagtcca aaatctcaga gaaaaccaaa gctattgtgg tgatcaaccc 960
caacaacccc acgggagctg tctacccgcg ccgggtgttg gaacaaatcg tcgagattgc 1020
acgcgagcat gacctgctga ttttggccga tgaaatctac gaccgcattc tctacgatga 1080
tgccgagcac atcagcctgg caacccttgc accagatctc ctttgcatca catacaacgg 1140
tctatccaag gcataccgcg tcgcaggata ccgagctggc tggatggtat tgactggacc 1200
aaagcaatac gcacgtggat ttattgaggg cctcgaactc ctcgcaggca ctcgactctg 1260
cccaaatgtc ccagctcagc acgcttttca ggtagctctc ggtggacgcc agtccatcta 1320
cgacctcact ggcgaacacg gccgactcct ggaacagcgc aacatggcat ggacgaaact 1380
caacgaaatc ccaggtgtca gctgtgtgaa accaatggga gctctatacg cgttccccaa 1440
gctcgacccc aacgtgtacg aaatccacga cgacacccaa ctcatgctgg atcttctccg 1500
tgccgagaaa atcctcatgg ttcagggcac tggcttcaac tggccacatc acgatcactt 1560
ccgagtggtc accctgccat gggcatccca gttggaaaac gcaattgagc gcctgggtaa 1620
cttcctgtcc acttacaagc agtag 1645
<210> 9
<211> 596
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
cagatggcgc aattaaatca agatctcaga actcattttt caatctcttc ttttagggca 60
cccgtcatca attgagctat cggccattca ttaaaaactg cgcgtcgatc aaccgaaagc 120
tgagtaagca aaaaattcgc ctcttctcta tcgtcaagaa gcaaagcgca accaatcata 180
atctcgctat agttgtctgg gtgcattgtt tgatcaagat tatgcctaaa agatcgaatt 240
tctgttcttt gtgaatccag taatccagtt tggcgataca aaatttgcca accattaagc 300
ctgtaaattg gcgactcttc tcgatctcgt tccacgagcc aatcattgag agcttgagct 360
gctataagaa atgcagtttt cctgctctgc tcagaatcag ctgccttaat taggcgaagc 420
accatccatg tggcgagatt atcaacatca acagtttctt caagcgctga atagaaatca 480
acaagcttat ccaaatgcag attcaatact gatggaagcc atcgattatc aatgagctcg 540
tacggcgtca ctcgctcgat tgaggagtcg ctccgatccg ttgaaggtgt catagc 596
<210> 10
<211> 1959
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
tccaaggaag atacacgccc gaagaagctc cgttaatgga cgctcttcta ttaagccttt 60
tctgatggat acaagcagag aatcagtcat gctaaatatc ataatccatc aaacatttga 120
tcggtgtcaa tcaatgcgtt ctggactgag gtgaccacca tgcaagacga ggtggaccta 180
gtgatcacca acccgccgtt ttctctgttc cgtgagttcc tgagttggct attacacggt 240
gacgtgttgt tttctatcat cggtaacgcg aacgtaatca catatctagg tgcctgaatc 300
tagattaaaa ctataaacat tatttaaaac cattgcctta ttggagcatg ctgcaagctt 360
ttcgcggtgg gcttgcaaca tcttacatca gaatgaatga tgttaaacac ctaataagtt 420
caagtagtta aaaggaaata tcaacaatgt tacgaaaagc atctatcacg ctaatgatat 480
ccgttacgct cttaacatgt gcctctccag cacaggcact gtcatcacaa gcactctcgt 540
cagaaagctc cacttcgcag agtgattctc ctacgcaatt tgttgcgagt atagctgcgc 600
ccttcaataa gaacttaacc tatgagcagc gcaaagccat tcgtttcgga cctacgacag 660
aacaagaagc agaacaatgc ttggcaaagt atggtcgcga tggcgagggg ccatggcctg 720
ctattgctat ctatcctgac tgctccttcg atactatcga acaagatttc tatgatcaag 780
caatatccaa agccctctca gtaatcagtc tgggaagctc ctagaagact cgtaacgacc 840
aaaagcaccg agaacagatg caactcaagc ccatttacat ctgttctcgg tgcaccaaag 900
cacttgctac tcaatcatgg taaacagcct ggtcgcagtc cttcacgatt caaactttgc 960
cttccgctac gccttccacc tgatcatcat agaagacggt gaagtaacag cagccggaga 1020
tcccacagag atcgtcactg cgggactgat cgaagaagtc tacaacgtca aagcctgtgc 1080
atcccagacc ccgtgaacag caaaccgatg atcgtgccac tggaaagatc ttaggcagcc 1140
gtgggattac acccttttag agctagaaca gtaaaaattc acccaatagc tttcaactac 1200
gcacacaaag tggcaacatt gagcgggtga ctacagacaa gcgcaaaacc tctaagacca 1260
ccgacaccgc caacaaggct gtgggcgcgg atcaggcagc gcgtcccact cggcgaacaa 1320
ctcgccgcat cttcgatcag tcggagaaga tgaaggacgt gctgtacgag atccgtggcc 1380
cggtggccgc ggaggcggaa cgcatggagc ttgatgggca taacatctta aagctcaaca 1440
cgggaaatcc agccgtgttc ggattcgatg cccccgacgt gattatgcgt gacatgatcg 1500
ccaaccttcc aacttcccaa gggtattcca cctccaaagg cattattccg gcccggcgag 1560
cagtggtcac ccgctacgaa gttgtgcccg gattccccca cttcgatgtt gatgatgtgt 1620
tcttaggcaa cggtgtctca gaactaatca ccatgaccac ccaagcactc ctcaacgacg 1680
gcgatgaagt tcttatcccc gcaccggact acccactgtg gactgccgca acctccctgg 1740
ctggtggtaa gcctgtgcac tacctctgtg atgaggaaga tgactggaac ccatccatcg 1800
aagacatcaa gtccaaaatc tcagagaaaa ccaaagctat tgtggtgatc aaccccaaca 1860
accccacggg agctgtctac ccgcgccggg tgttggaaca aatcgtcgag attgcacgcg 1920
agcatgacct gctgattttg gccgatgaaa tctacgacc 1959
<210> 11
<211> 1600
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
caacggtgtc tcagaactaa tcaccatgac cacccaagca ctcctcaacg acggcgatga 60
agttcttatc cccgcaccgg actacccact gtggactgcc gcaacctccc tggctggtgg 120
taagcctgtg cactacctct gtgatgagga agatgactgg aacccatcca tcgaagacat 180
caagtccaaa atctcagaga aaaccaaagc tattgtggtg atcaacccca acaaccccac 240
gggagctgtc tacccgcgcc gggtgttgga acaaatcgtc gagattgcac gcgagcatga 300
cctgctgatt ttggccgatg aaatctacga ccgcattctc tacgatgatg ccgagcacat 360
cagcctggca acccttgcac cagatctcct ttgcatcaca tacaacggtc tatccaaggc 420
ataccgcgtc gcaggatacc gagctggctg gatggtattg actggaccaa agcaatacgc 480
acgtggattt attgagggcc tcgaactcct cgcaggcact cgactctgcc caaatgtccc 540
agctcagcac gctattcagg tagctctcgg tggacgccag tccatctacg acctcactgg 600
cgaacacggc cgactcctgg aacagcgcaa catggcatgg acgaaactca acgaaatccc 660
aggtgtcagc tgtgtgaaac caatgggagc tctatacgcg ttccccaagc tcgaccccaa 720
cgtgtacgaa atccacgacg acacccaact catgctggat cttctccgtg ccgagaaaat 780
cctcatggtt cagggcactg gcttcaactg gccacatcac gatcacttcc gagtggtcac 840
cctgccatgg gcatcccagt tggaaaacgc aattgagcgc ctgggtaact tcctgtccac 900
ttacaagcag tagcagatgg cgcaattaaa tcaagatctc agaactcatt tttcaatctc 960
ttcttttagg gcacccgtca tcaattgagc tatcggccat tcattaaaaa ctgcgcgtcg 1020
atcaaccgaa agctgagtaa gcaaaaaatt cgcctcttct ctatcgtcaa gaagcaaagc 1080
gcaaccaatc ataatctcgc tatagttgtc tgggtgcatt gtttgatcaa gattatgcct 1140
aaaagatcga atttctgttc tttgtgaatc cagtaatcca gtttggcgat acaaaatttg 1200
ccaaccatta agcctgtaaa ttggcgactc ttctcgatct cgttccacga gccaatcatt 1260
gagagcttga gctgctataa gaaatgcagt tttcctgctc tgctcagaat cagctgcctt 1320
aattaggcga agcaccatcc atgtggcgag attatcaaca tcaacagttt cttcaagcgc 1380
tgaatagaaa tcaacaagct tatccaaatg cagattcaat actgatggaa gccatcgatt 1440
atcaatgagc tcgtacggcg tcactcgctc gattgaggag tcgctccgat ccgttgaagg 1500
tgtcatagca aaatgatgac gcttggaaat tacttcatga taagtccact cccctgcaac 1560
atcaccaggg tgagctatca acgcaagatt ccaacgacca 1600
<210> 12
<211> 1715
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atcccccaaa gcacttgcta ctcaatcatg 60
gtaaacagcc tggtcgcagt ccttcacgat tcaaactttg ccttccgcta cgccttccac 120
ctgatcatca tagaagacgg tgaagtaaca gcagccggag atcccacaga gatcgtcact 180
gcgggactga tcgaagaagt ctacaacgtc aaagcctgtg catcccagac cccgtgaaca 240
gcaaaccgat gatcgtgcca ctggaaagat cttaggcagc cgtgggatta caccctttta 300
gagctagaac agtaaaaatt cacccaatag ctttcaacta cgcacacaaa gtggcaacat 360
tgagcgggtg actacagaca agcgcaaaac ctctaagacc accgacaccg ccaacaaggc 420
tgtgggcgcg gatcaggcag cgcgtcccac tcggcgaaca actcgccgca tcttcgatca 480
gtcggagaag atgaaggacg tgctgtacga gatccgtggc ccggtggccg cggaggcgga 540
acgcatggag cttgatgggc ataacatctt aaagctcaac acgggaaatc cagccgtgtt 600
cggattcgat gcccccgacg tgattatgcg tgacatgatc gccaaccttc caacttccca 660
agggtattcc acctccaaag gcattattcc ggcccggcga gcagtggtca cccgctacga 720
agttgtgccc ggattccccc acttcgatgt tgatgatgtg ttcttaggca acggtgtctc 780
agaactaatc accatgacca cccaagcact cctcaacgac ggcgatgaag ttcttatccc 840
cgcaccggac tacccactgt ggactgccgc aacctccctg gctggtggta agcctgtgca 900
ctacctctgt gatgaggaag atgactggaa cccatccatc gaagacatca agtccaaaat 960
ctcagagaaa accaaagcta ttgtggtgat caaccccaac aaccccacgg gagctgtcta 1020
cccgcgccgg gtgttggaac aaatcgtcga gattgcacgc gagcatgacc tgctgatttt 1080
ggccgatgaa atctacgacc gcattctcta cgatgatgcc gagcacatca gcctggcaac 1140
ccttgcacca gatctccttt gcatcacata caacggtcta tccaaggcat accgcgtcgc 1200
aggataccga gctggctgga tggtattgac tggaccaaag caatacgcac gtggatttat 1260
tgagggcctc gaactcctcg caggcactcg actctgccca aatgtcccag ctcagcacgc 1320
tattcaggta gctctcggtg gacgccagtc catctacgac ctcactggcg aacacggccg 1380
actcctggaa cagcgcaaca tggcatggac gaaactcaac gaaatcccag gtgtcagctg 1440
tgtgaaacca atgggagctc tatacgcgtt ccccaagctc gaccccaacg tgtacgaaat 1500
ccacgacgac acccaactca tgctggatct tctccgtgcc gagaaaatcc tcatggttca 1560
gggcactggc ttcaactggc cacatcacga tcacttccga gtggtcaccc tgccatgggc 1620
atcccagttg gaaaacgcaa ttgagcgcct gggtaacttc ctgtccactt acaagcagta 1680
ggttttggcg gatgagagaa gattttcagc ctgat 1715
<210> 13
<211> 1715
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atcccccaaa gcacttgcta ctcaatcatg 60
gtaaacagcc tggtcgcagt ccttcacgat tcaaactttg ccttccgcta cgccttccac 120
ctgatcatca tagaagacgg tgaagtaaca gcagccggag atcccacaga gatcgtcact 180
gcgggactga tcgaagaagt ctacaacgtc aaagcctgtg catcccagac cccgtgaaca 240
gcaaaccgat gatcgtgcca ctggaaagat cttaggcagc cgtgggatta caccctttta 300
gagctagaac agtaaaaatt cacccaatag ctttcaacta cgcacacaaa gtggcaacat 360
tgagcgggtg actacagaca agcgcaaaac ctctaagacc accgacaccg ccaacaaggc 420
tgtgggcgcg gatcaggcag cgcgtcccac tcggcgaaca actcgccgca tcttcgatca 480
gtcggagaag atgaaggacg tgctgtacga gatccgtggc ccggtggccg cggaggcgga 540
acgcatggag cttgatgggc ataacatctt aaagctcaac acgggaaatc cagccgtgtt 600
cggattcgat gcccccgacg tgattatgcg tgacatgatc gccaaccttc caacttccca 660
agggtattcc acctccaaag gcattattcc ggcccggcga gcagtggtca cccgctacga 720
agttgtgccc ggattccccc acttcgatgt tgatgatgtg ttcttaggca acggtgtctc 780
agaactaatc accatgacca cccaagcact cctcaacgac ggcgatgaag ttcttatccc 840
cgcaccggac tacccactgt ggactgccgc aacctccctg gctggtggta agcctgtgca 900
ctacctctgt gatgaggaag atgactggaa cccatccatc gaagacatca agtccaaaat 960
ctcagagaaa accaaagcta ttgtggtgat caaccccaac aaccccacgg gagctgtcta 1020
cccgcgccgg gtgttggaac aaatcgtcga gattgcacgc gagcatgacc tgctgatttt 1080
ggccgatgaa atctacgacc gcattctcta cgatgatgcc gagcacatca gcctggcaac 1140
ccttgcacca gatctccttt gcatcacata caacggtcta tccaaggcat accgcgtcgc 1200
aggataccga gctggctgga tggtattgac tggaccaaag caatacgcac gtggatttat 1260
tgagggcctc gaactcctcg caggcactcg actctgccca aatgtcccag ctcagcacgc 1320
ttttcaggta gctctcggtg gacgccagtc catctacgac ctcactggcg aacacggccg 1380
actcctggaa cagcgcaaca tggcatggac gaaactcaac gaaatcccag gtgtcagctg 1440
tgtgaaacca atgggagctc tatacgcgtt ccccaagctc gaccccaacg tgtacgaaat 1500
ccacgacgac acccaactca tgctggatct tctccgtgcc gagaaaatcc tcatggttca 1560
gggcactggc ttcaactggc cacatcacga tcacttccga gtggtcaccc tgccatgggc 1620
atcccagttg gaaaacgcaa ttgagcgcct gggtaacttc ctgtccactt acaagcagta 1680
ggttttggcg gatgagagaa gattttcagc ctgat 1715
<210> 14
<211> 1400
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
gcagcaagta gcctgggtat tcgccacgga cgtgaatatt gccgaaggca tagtcctcgt 60
gggacttttg ctgggcggta agttgatcgc gtgggtccgg ggtaatgcca taacgaggaa 120
cggcaataat catgcaaccg atctggtttt gtgggtcgat ctcatgagca atcttagttg 180
ccaaagcact tgctactcaa tcatggtaaa cagcctggtc gcagtccttc acgattcaaa 240
ctttgccttc cgctacgcct tccacctgat catcatagaa gacggtgaag taacagcagc 300
cggagatccc acagagatcg tcactgcggg actgatcgaa gaagtctaca acgtcaaagc 360
ctgtgcatcc cagaccccgt gaacagcaaa ccgatgatcg tgccactgga aagatcttag 420
gcagccgtgg gattacaccc ttttagagct agaacagtaa aaattcaccc aatagctttc 480
aactacgcac acaaagtggc aacattgagc gggtgactac agacaagcgc aaaacctcta 540
agaccaccga caccgccaac aaggctgtgg gcgcggatca ggcagcgcgt cccactcggc 600
gaacaactcg ccgcatcttc gatcagtcgg agaagatgaa ggacgtgggt aacttcctgt 660
ccacttacaa gcagtagtag ttgttaggat tcaccacgaa tctcaggatt tttgagattc 720
gtggtgaatt tttgcgtttt ccagtcaggc tcctgcaact ttcggaccga tttcagaggg 780
gcggagctgg tttgtggtgg atccttgaaa tggaacctcg caggaagctt tcaggaagac 840
caagttgggc ctaggggtgg cgggattgca aaaatccgtc cccggttcgc catgaaatgc 900
tgattttgat cgaatctttg cgctaactgt agggcgggtt cagggggtga atgcaccacg 960
agcaacccga agggtgcgaa gtgggcattc gtagaacaat cccagaggaa agccgtacgg 1020
ctttcctcga catgatcaat caaggtatgt caggtcttgc tgcgtctaca gcggtcgggg 1080
tcagtgaatt caccgggcga aagtgggcga aggccgccgg ggtgaaactg acccgcggcc 1140
cgcgaggtgg caatgctttt gacaccgccg agaaacttga gattgcagcc agcatgctag 1200
agaaaggatg cctaccccga gaaatcggcg agtatgtcgg catgactcgg gccaatatat 1260
ccctatggcg caaacaaggc ccagacaagc ttcgccaacg cgcagccacc ttgcgcaccg 1320
gcaagcgagc agctgaattc atccacgccc cggtgatggg cccttattat gggccacgca 1380
cactccatca agtgttgcgt 1400
Claims (10)
1.蛋白质，为如下A1)或A)：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
A2)在A1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)：
b11)序列表中SEQ ID No.3所示的DNA分子；
b12)与b11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
b13)在严格条件下与b11)或b12)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的基因组DNA分子。
4.根据权利要求2或3所述的生物材料，其特征在于：B2)所述表达盒为SEQ ID No.8所示的DNA分子；
B4)所述重组微生物为将含有SEQ ID No.1所示的NCgl2747基因的微生物中的NCgl2747基因替换为B1)所述核酸分子得到的重组微生物，或向微生物中导入B1)所述核酸分子并使其得到表达得到的重组微生物。
5.一种制备L-赖氨酸的方法，包括：使受体生物细胞中表达权利要求1所述蛋白质，或提高受体生物细胞中权利要求1所述蛋白质的含量或活性，或提高受体生物细胞中SEQ IDNo.2所示蛋白质的含量或活性，得到重组生物细胞；培养所述重组生物细胞，得到L-赖氨酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述生物细胞为能合成L-赖氨酸的酵母、细菌、藻、真菌、植物细胞或动物细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述细菌为谷氨酸棒杆菌。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述方法通过向所述受体生物细胞中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因并使其得到表达实现，或向所述受体生物细胞中导入SEQ ID No.2所示蛋白质的编码基因并使其得到表达实现；
或，所述受体生物细胞中含有SEQ ID No.1所示的DNA分子，所述方法通过将所述受体生物细胞中SEQ ID No.1所示的DNA分子替换为SEQ ID No.3所示的DNA分子实现。
9.根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于：培养所述重组生物细胞采用能使所述重组生物细胞生长的培养基进行；
和/或，培养所述重组生物细胞采用能使所述重组生物细胞生长的条件进行。
10.一种用于制备L-赖氨酸的产品，含有权利要求1所述蛋白质或权利要求2-4中任一所述生物材料。
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