CN101573438A - 具有增加的l-赖氨酸生产力的棒状杆菌和使用其生产l-赖氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种棒状杆菌(Corynebacterium)变体，其显示出比天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸二羧化酶以及另外的丙酮酸羧化酶的内源活性更大的活性，以及使用所述变体产生L－赖氨酸的方法。

Description

具有增加的L-赖氨酸生产力的棒状杆菌和使用其生产L-赖氨酸的方法
技术领域
[1]本发明涉及棒状杆菌(Corynebacterium)变体，其显示出比天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸二羧化酶(dicarboxylase)以及另外的丙酮酸羧化酶的内源活性更大的活性，以及使用所述变体生产L-赖氨酸的方法。
发明背景
[2]棒状杆菌，特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，是革兰氏阳性微生物，其被广泛用于生产L-氨基酸。在L-氨基酸中，L-赖氨酸可应用于各种工业中，包括动物饲料、制药和化妆品工业。对于在这些工业中的使用，通常使用棒状杆菌菌株经发酵生产L-赖氨酸。
[3]固着有(anchoring)参与赖氨酸生物合成的增强基因的棒状杆菌菌株以及生产L-赖氨酸的方法是本领域众所周知的。例如，美国专利号6,746,855公开了具有增强的lysE基因(赖氨酸输出载体基因(lysineexport carrier gene))的棒状杆菌菌株，向其另外引入选自dapA基因、lysC基因、pyc基因和dapB基因的基因，以及通过培养该菌株生产L-赖氨酸的方法。美国专利号6,221,636公开了携带重组DNA的棒状细菌(coryneform bacterium)，该重组DNA包含编码天冬氨酸激酶的DNA序列——其中L-赖氨酸和L-苏氨酸反馈抑制活性被基本上脱敏，以及包括编码二氨基庚二酸二脱羧酶(decarboxylase)的DNA序列。
[4]在本发明之前公开的任何文件中都没有提及这样的棒状杆菌种(Corynebacterium spp.)，其显示出比其内源活性更高的参与赖氨酸生物合成途径的六种酶的活性，这六种酶是天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸二羧化酶。此外，在本发明之前公开的任何文件中未发现除了这六种酶之外，显示出比丙酮酸羧化酶的内源活性更高活性的棒状杆菌种。
发明内容
技术问题
[5]本发明的一个目的是提供棒状杆菌菌株，所述菌株具有比参与赖氨酸生物合成途径的六种酶的内源活性更高的活性，这六种酶是天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸二羧化酶。
[6]本发明的另一个目的是提供棒状杆菌菌株，所述菌株具有除了比这六种酶内源活性更高之外，比丙酮酸羧化酶的内源活性更高的活性。
[7]本发明的另一个目的是提供使用该微生物生产L-赖氨酸的方法。
技术方案
[8]为了实现上述目的，本发明提供了固着有天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸二羧化酶的棒状杆菌(Corynebacteria)菌株，这些酶显示出比它们各自的内源活性更高的活性。
[9]根据其另一方面，提供了棒状杆菌菌株，其中除了所述六种酶外，丙酮酸羧化酶的活性高于其内源活性。
[10]根据进一步的方面，提供了使用所述微生物生产L-赖氨酸的方法。
[11]
[12]本发明的棒状杆菌菌株以比内源水平高的水平显示出七种酶的活性。根据本发明的提高的酶活性是基于各种因素，包括基因拷贝数增加、用更有效的启动子替换天然启动子以及旨在增加活性的人工突变。更详细地，基因拷贝数可以通过外源等位基因的引入和/或内源基因的扩增而增加。至于基因启动子的置换，其例子包括引入外源启动子——其具有有效活性来表达其下游结构基因并置换内源基因启动子。使用本领域熟知的方法，例如通过在合适的条件下培养，可以容易实现基因扩增。
[13]根据本发明的一方面，本发明棒状细菌的特征是在其核DNA中除了内源基因aspB、lysC、asd、dapA、dapB和lysA之外，存在至少一个拷贝的aspB(编码天冬氨酸转氨酶的基因)、lysC(编码天冬氨酸激酶的基因)、asd(编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因)、dapA(编码二氢吡啶二羧酸合成酶的基因)、dapB(编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因)和lysA(编码二氨基庚二酸二羧化酶的基因)中。在该方面的改进中，有效的外源启动子可以位于各自结构基因起始密码子的上游。
[14]根据本发明的另一方面，本发明棒状细菌的特征是在带有至少一个拷贝的aspB、lysC、asd、dapA、dapB和lysA位于其中的核DNA中，除了内源pyc基因外，存在至少一个拷贝的pyc(丙酮酸羧化酶)基因。。在该方面的改进中，有效的外源启动子位于pyc基因起始密码子的上游，而有效的外源启动子置换六个各自基因的内源启动子。
[15]
[16]只要它属于棒状杆菌属(Corynebacterium)，任何棒状细菌可以用作导入基因的亲本菌株。用于本发明的棒状杆菌微生物的例子包括谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、谷氨酸棒状杆菌、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP-1539、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、乳酸发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentu)ATCC 13869，和由其衍生的L-氨基酸生产突变体或菌株，诸如谷氨酸棒状杆菌KFCC10881和谷氨酸棒状杆菌KFCC11001，优选谷氨酸棒状杆菌KFCC10881。
[17]在本发明的棒状杆菌微生物中，aspB、lysC、asd、dapA、dapB、lysA和pyc分别具有SEQ ID NOS.：25、26、27、28、29、30和37的核苷酸序列，每个序列包含天然的启动子和终止密码子。
[18]本发明的棒状杆菌微生物可以是转化有分别具有图2至6切割图谱的载体pDZ-2aspB、pDZ-2lysC/asd、pDZ-2dapA/dapB、pDZ-2lysA和pDZ-2pyc的棒状细菌。这些载体可以以预先确定的顺序或同时引入。如上所述，各自的外源启动子可以位于基因起始密码子的上游。优选地，微生物在基因组DNA中固着至少一个另外各自的aspB、lysC、asd、dapA、dapB、lysA和pyc拷贝。在可选的或更优选的实施方式中，有效的外源启动子被插入在每一基因的起始密码子和内源启动子之间。可以使用本领域熟知的方法——例如同源重组来实现外源基因插入基因组DNA。
[19]本发明中特别有用的是谷氨酸棒状杆菌KFCC-1008-CJ5，登录号为KCCM10770P。该菌株可以获自谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881，通过引入分别具有图2至5切割图谱的pDZ-2aspB、pDZ-2lysC/asd、pDZ-2dapA/dapB和pDZ-2lysA，在选择培养基中培养转化体，以使得外源基因aspB、lysC、asd、dapA、dapB和lysA与各自的内源等位基因进行同源重组，从而将两个拷贝的aspB、lysC、asd、dapA、dapB和lysA固着在其基因组DNA中。该菌株可以以高于亲本菌株的效率生产L-赖氨酸。通过将具有图6切割图谱的载体pDZ-2pyc另外引入转化体以将两个pyc拷贝固着在基因组DNA中，可以进一步增加L-赖氨酸生产效率。
[20]根据本发明的另一方面，本发明提供以高产率生产L-赖氨酸的方法，该方法包括将异源启动子插入在单个基因的天然启动子和起始密码子之间。
[21]在本发明的实施方式中，用各自异源有效的CJ7启动子替换赖氨酸生物合成基因的启动子。在本发明中有用的CJ7启动子是有效的启动子，其具有SEQ ID NO.44的核苷酸序列，获自之前由本申请人开发的(韩国专利号KR-0620092)产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)。一旦谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881的lysC表达，发现CJ7启动子增加天冬氨酸激酶的活性是内源启动子的两倍。虽然在这里只给出CJ7启动子的例子，但是应该理解的是韩国专利号KR-0620092公开的CJ1至CJ6启动子可以以与CJ7启动子使用的同样方式应用于产赖氨酸菌株的制备，所述CJ1至CJ6启动子分别具有SEQ ID NOS.：45至50的核苷酸序列，获自产氨棒状杆菌。因此，CJ1至CJ6启动子以及CJ7启动子落入的范围，所述异源启动子用于增加根据本发明的感兴趣基因的表达水平。
[22]根据其进一步的方面，本发明提供生产L-赖氨酸的方法，包括：
[23]培养本发明的微生物以在细胞内表达L-赖氨酸或将L-赖氨酸释放至培养基；和
[24]从细胞或培养基回收L-赖氨酸。
[25]培养步骤进一步如下文解释。
[26]根据本发明的L-赖氨酸生产方法中的微生物如上文所述。
[27]对于培养步骤，可以采用本领域熟知的各种方法中的其中一种方法。棒状杆菌菌株可以以分批方法或连续方法培养，诸如补料分批方法或反复补料分批方法。
[28]对于在培养中使用，培养基必须满足待被培养的菌株的要求。棒状杆菌某些种的培养基是本领域熟知的(例如，Manual of Methods forGeneral Bacteriology.American Society for Bacteriology.Washington D.C.，USA，1981)。用于培养的碳源的例子包括糖类和碳水化合物——诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素和类似物，油和脂类——诸如大豆油、葵花油、蓖麻油、椰子油和类似物，脂肪酸——诸如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸和类似物，醇类——诸如丙三醇、乙醇和类似物，以及有机酸——诸如乙酸。这些物质可以单独使用或组合使用。用于本发明细菌的培养基中的氮源的代表有蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浸泡固体(corn steep solid)、大豆粉、尿素和无机化合物诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独使用或组合使用。磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或其钠盐可以作为氮源用于培养基中。而且，培养基需要金属盐，诸如硫酸镁或硫酸离子，作为微生物生长的必须成分。此外，培养基中包含其它必要成分，诸如氨基酸和维生素。代替这些成分本身，可以使用它们的前体。这些成分可以以分批方式或连续方式加入到微生物培养基中。
[29]培养基的pH可以用碱性化合物诸如氢氧化钠、氢氧化钾或氨水，或酸性化合物诸如磷酸或硫酸调节。可以加入消泡剂诸如脂肪酸聚乙二醇醚以防止泡沫产生。可以通过将氧或含氧气体(如空气)注入培养基维持有氧状态。当培养生物体时，培养基可以维持在20至45℃的范围内，优选25至40℃的范围。培养持续进行，直到L-氨基酸的生产达到最大。在这点上，达到L-赖氨酸最大量要10至160小时。该氨基酸可以释放到培养基中或可以保留在细胞中。
[30]回收步骤如下进行。从细胞或培养基回收L-赖氨酸是本领域熟知的。L-赖氨酸回收方法的例子包括但不限于：过滤、阴离子交换层析、结晶和HPLC。
有利效果
[31]因为具有比天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸二羧化酶和另外的丙酮酸羧化酶的内源活性更高的酶活性，所以本发明的棒状杆菌微生物可以以更高的产率生产L-赖氨酸。
[32]因此，特征在于使用棒状杆菌微生物的方法可以应用于L-赖氨酸的高产率生产。
附图简述
[33]图1是显示载体pDZ的示意图，所述载体用于核靶向基因进入棒状杆菌。
[34]图2是显示载体pDZ-2aspB的示意图，所述载体用于核靶向基因进入棒状杆菌。
[35]图3是显示载体pDZ-2lysC/asd的示意图，所述载体用于核靶向基因进入棒状杆菌。
[36]图4是显示载体pDZ-2dapA/dapB的示意图，所述载体用于核靶向基因进入棒状杆菌。
[37]图5是显示载体pDZ-2lysA的示意图，所述载体用于核靶向基因进入棒状杆菌。
[38]图6是显示载体pDZ-2pyc的示意图，所述载体用用于核靶向基因进入棒状杆菌。
[39]图7是显示载体pDZ-PCJ7的示意图。
[40]图8是显示载体pDZ-PCJ7/aspB的示意图。
[41]图9是显示载体pDZ-PCJ7/lysC的示意图。
[42]图10是显示载体pDZ-PCJ7/dapA的示意图。
[43]图11是显示载体pDZ-PCJ7/dapB的示意图。
[44]图12是显示载体pDZ-PCJ7/lysA的示意图。
[45]图13是显示载体pDZ-PCJ7/pyc的示意图。
实施发明的最佳方式
[46]通过下述实施例可以获得对本发明更好的理解，这些实施例被阐述以举例说明本发明，而不被解释为对本发明的限制。
[47]
[48]实施例1：用于核靶向基因的载体pDZ的构建和使用该载体插 入基因
[49]基于大肠杆菌(E.coli)克隆载体pACYC177(New EnglandBiolab，GenBank登录号X06402)，如下构建携带棒状杆菌染色体的重组载体pDZ。
[50]使用Klenow酶使得用AcuI和BanI限制性酶处理得到的pACYC177载体消化物变成平端。对于用作选择标记，如下制备大肠杆菌的lacZ基因：通过PCR从大肠杆菌K12 W3110的核DNA进行基因扩增，设计成含有其启动子，然后进行5′末端磷酸化作用，并用T4 DNA聚合酶或多核苷酸激酶产生平端。这两个DNA片段被相互连接以得到环状DNA分子，然后将含有许多限制性位点的人工合成的接头插入环状DNA分子的限制性位点BamHI，以构建核靶向到棒状杆菌的基因的载体pDZ。图1是显示载体pDZ的示意图，所述载体用于将基因核靶向到棒状杆菌。
[51]之后，感兴趣基因被插入棒状杆菌的核DNA。为达到这一目的，谷氨酸棒状杆菌KFCC10881——L-赖氨酸生产菌株，通过电穿孔用含有两个串联的感兴趣基因的拷贝的pDZ载体转化(使用Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545的电脉冲方法)，并在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化体，其中感兴趣基因由于同源性被插入到染色体中。在含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的固体培养基上出现蓝色表明成功地用载体将基因插入核DNA。将最初的核插入菌株振荡培养在营养肉汤中(30℃，8小时)，然后从10-4连续稀释至10-10，之后涂布在含有X-gal的固体培养基上。生长的大部分的克隆染有蓝色。选择白色克隆，其是生长的克隆的少数。这些二次选择的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列，因为它通过交换从基因组除去。最后测试这些菌株对卡那霉素的敏感性，并在最终选择之前通过PCR分析基因结构。
[52]
[53]实施例2：通过突变制备产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌 (KFCC-10881)
[54]要插入负责赖氨酸生物合成途径的基因的菌株以谷氨酸棒状杆菌(KFCC-10881)为基础，谷氨酸棒状杆菌(KFCC-10881)对S-(2-氨乙基)半胱氨酸(S-(2-aminoethyl)cysteine，以后称为“AEC”)具有抗性，并且是高丝氨酸渗漏型的(homoserine-leaky)。
[55]从野生型谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032)制备突变体菌株KFCC-10881。含有107～108细胞/ml浓度母株的培养基用500μg/ml的诱变剂N-甲基-N′-硝基-N-硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，之后称为“NTG”)在30℃处理30min，然后选择在含有5g/l AEC的复合板上生长的克隆。分析初级突变体菌株的ACE抗性和赖氨酸生产力后，用NTG进行次级突变。将由此形成的许多克隆用牙签挑入基本培养基，该基本培养基补充或不补充高丝氨酸以分离高丝氨酸营养缺陷型(次级突变体)，高丝氨酸营养缺陷型不能在缺少高丝氨酸的基本培养基上生长。使高丝氨酸营养缺陷型进行三级突变，以产生高丝氨酸-渗漏型菌株，其通过在含有10mg/L高丝氨酸的基本培养基中温育进行鉴定。检查在培养基中生长的菌株的赖氨酸生产力(表1)。得到的产赖氨酸菌株——其是AEC抗性的以及高丝氨酸渗漏的，保藏在韩国联邦菌物保藏中心(Korean Federation of Culture Collection)，登录号为KFCC-10881。在本实施例中使用的基本培养基和生产培养基描述如下。
[56]表1
Figure A20078003418000121
[57]
[58]基本培养基(pH 7.0)
[59]葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸泡固体5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4 7H2O 0.5g、生物素100μg、氯化硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺3000□、CaCO3 30g(于1升蒸馏水中)。
[60]生产培养基(pH 7.0)
[61]葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸泡固体5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4 7H2O 0.5g、生物素100□、氯化硫胺素1000□、CaCO3 30g(于1升蒸馏水中)。
[62]
[63]实施例3：产赖氨酸谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生的aspB 基因的克隆，重组载体(pDZ-2aspB)的构建和固着aspB的菌株的制备
[64]对参与赖氨酸生物合成途径的aspB基因进行PCR，用实施例2中制备的产赖氨酸的PCR谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板。从NIH GenBank数据获得关于aspB基因的碱基序列(NCBI登记号NC_003450，Ncgl0237)的信息，并用于设计两对引物，以扩增范围从启动子区域到终止密码子的aspB基因(表2)。
[65]表2
  引物   碱基序列   SEQ ID NO.
  F-aspB-Sma I_P1   ccc ggg gcg gtt cag cta gag tta tgc   1
  R-aspB-Hind III_P2   aag ctt tta gtt agc gta atg ctc cgc   2
  F-aspB-Hind III_P3   aag ctt gcg gtt cag cta gag tta tgc   3
R-aspB-Nhe I_P4 gct agc tta gtt agc gta atg ctc cgc 4
[66]
[67]使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板以及使用一组寡核苷酸SEQ ID NOS.1和2或寡核苷酸SEQ ID NOS.3和4作为引物，在PfuUltraTM高保真性DNA聚合酶(Stratagene)存在下进行PCR，进行如下30个循环：96℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸2分钟。发现由此获得的PCR产物是两种类型的aspB基因(aspB-A和aspB-B)，每一种含有1,493bp-长的启动子区域，其分别用一组SEQ IDNOS.1和2以及一组SEQ ID NOS.3和4产生。在TOPO克隆试剂盒(TOPO Cloning Kit)(Invitrogen)帮助下，将PCR产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，以得到重组载体pCR-aspB-A和pCR-aspB-B。这些pCR载体分别用对aspB-A和aspB-B的相反端特异的限制性酶(aspB-A：SmaI+HindIII、aspB-B：HindIII+NheI)处理，以从pCR载体分离aspB基因。这些片段通过3-片连接(3-piece ligation)克隆入pDZ载体的EcoRV-NheI位点，以产生重组载体pDZ-2aspB，其中克隆有串联的两个aspB拷贝。图2是核靶向入棒状杆菌的基因的pDZ-2aspB载体的图谱。
[68]重组载体pDZ-2aspB被转化入实施例2中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881中，然后通过交换在核DNA中紧靠aspB基因插入另外的aspB基因拷贝，以产生固着有两个aspB基因拷贝的产赖氨酸的菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ1。使用引物对SEQID NOS.17和18(表3)，通过PCR证实两个aspB基因拷贝的相邻定位，引物对SEQ ID NOS.17和18设计用于扩增两个aspB基因拷贝之间的接触区域。
[69]表3
  引物   碱基序列   SEQ ID NOS.
  F-M-aspB   gca gtg gac tgt ccc tgc   17
  R-M-aspB   cct gca gcg aaa ctg aac tc   18
[70]
[71]实施例4：产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生的 lysC/asd基因的克隆，重组载体(pDZ-2lysC/asd)的构建和固着lysC/asd 的菌株的制备
[72]从NIH GenBank的数据获得关于lysC/asd基因的碱基序列(NCBI登记号NC_003450，Ncgl0247～0248)的信息，并用于设计两对引物，以扩增从启动子区域到终止密码子的aspB基因(表4)，方式同实施例3。
[73]表4
引物   碱基序列   SEQ ID NOS.
lysC-F1(BamHI)   ttg cac gga tcc cag ggt agt tga cta aag   5
asd-R1(SmaI)   atg gat ccc ggg tat caa cgc gtc ggt aga   6
lysC-F2(SmaI)   ttg cac ccc ggg cag ggt agt tga cta aag   7
asd-R2(PvuI)   atg gat cga tcg tat caa cgc gtc ggt aga   8
[74]
[75]使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板以及使用一组寡核苷酸SEQ ID NOS.1和2或寡核苷酸SEQ ID NOS.3和4作为引物，在PfuUltraTM高保真性DNA聚合酶(Stratagene)存在下进行PCR，进行如下30个循环：在96℃变性30秒，在52℃退火30秒，在72℃延伸3分钟。
[76]发现由此获得的PCR产物是两种类型的lysC/asd基因：lysC/asd-A和lysC/asd-B，每一种含有2,805bp-长的启动子区域，其分别用一组SEQ ID NOS.5和6以及一组SEQ ID NOS.7和8产生。在TOPO克隆试剂盒(TOPO Cloning Kit)(Invitrogen)帮助下，将PCR产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，以得到重组载体pCR-lysC/asd-A和pCR-lysC/asd-B。
[77]这些pCR载体分别用对lysC/asd-A和lysC/asd-B的相反端特异的限制性酶(lysC/asd-A：BamHI+SmaI，lysC/asd-B：SmaI+PvuI)处理，以从pCR载体分离lysC/asd基因。这些片段通过3-片连接反应克隆入pDZ载体的BamHI-PvuI位点，以构建重组载体pDZ-2lysC/asd，其中克隆有串联的两个lysC/asd拷贝。图3是核靶向入棒状杆菌的基因的pDZ-2lysC/asd载体的图谱。
[78]重组载体pDZ-2lysC/asd被转化入实施例3中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ1中，然后通过交换在核DNA中紧靠lysC/asd基因插入另外的lysC/asd基因拷贝，以产生固着有两个lysC/asd基因拷贝的产赖氨酸的菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ2。使用一组引物(表5)，通过PCR鉴定两个aspB基因拷贝的相邻定位，所述一组引物设计用于扩增两个aspB基因拷贝之间的接触区域。
[79]表5
  引物  碱基序列   SEQ ID NOS.
  lysC-2  cat ggc gag gat ccc gtt aga aat acg ctc   19
  asd-1  ttc acg ccg aat tcg aca agg caa tca ccg   20
[80]
[81]实施例5：产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生的 dapA/dapB基因的克隆，重组载体(pDZ-2dapA/dapB)的构建和固着有 dapA/dapB的菌株的制备
[82]从NIH GenBank的数据获得关于dapA/dapB基因的碱基序列(NCBI登记号NC_003450，Ncgl1896～1898)的信息。dapA基因被确定包含dapB基因和具有位于它们之间的功能未知的ORF(Ncgl1897)的操纵子。信息被用于设计两对引物，以扩增范围从dapB启动子到终止密码子的全dapB-ORF(Ncgl1897)-dapA基因(表6)。
[83]表6
  引物   碱基序列   SEQ ID NOS.
  Dap-EcoRI-F   gac gaa ttc tca ttg gcg ttt ccg gat cc   9
  Dap-SacI-R   tca gag ctc aca agc gcc aag gaa cta cc   10
  Dap-SacI-F   tga gag ctc tca ttg gcg ttt ccg gat cc   11
  Dap-XhoI-R   tgt ctc gag aca agc gcc aag gaa cta cc   12
[84]
[85]使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板以及使用一组寡核苷酸SEQ ID NOS.9和10或寡核苷酸SEQ ID NOS.11和12作为引物，在PfuUltraTM高保真性DNA聚合酶(Stratagene)存在下进行PCR，进行如下30个循环：96℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸3分钟。
[86]发现由此获得的PCR产物是两种类型的dapA/dapB基因：dapA/dapB-A和dapA/dapB-B，每一种含有3,210bp-长的启动子区域，其分别用一组SEQ ID NOS.9和10以及一组SEQ ID NOS.11和12产生。在TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)帮助下，将PCR产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，得到重组载体pCR-dapA/dapB-A和pCR-dapA/dapB-B。
[87]这些PCR载体用对dapA/dapB-A和dapA/dapB-B的相反端特异的相应限制性酶(dapA/dapB-A：EcoRI+SacI，dapA/dapB-B：SacI+XhoI)处理，以从PCR载体分离dapA/dapB基因。这些片段通过3-片连接(3-pieceligation)克隆入pDZ载体的EcoRI-XhoI位点，以构建重组载体pDZ-2dapA/dapB，其中克隆有串联的两个dapA/dapB拷贝。图4是pDZ-2dapA/dapB载体的图谱。
[88]重组载体pDZ-2dapA/dapB被转化入实施例4中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ2中，然后通过交换在核DNA中紧靠dapA/dapB基因插入另外的dapA/dapB基因拷贝，以产生固着有两个dapA/dapB基因拷贝的产赖氨酸的菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ3。使用一组引物对(表7)，通过PCR鉴定两个dapA/dapB基因拷贝的相邻定位，所述一组引物设计成扩增两个dapA/dapB基因拷贝之间的接触区域。
[89]表7
  引物  碱基序列   SEQ ID NOS.
  Dap-seq-3  agg cat ttc att ggc a   21
  Dap-seq-5  ttt gcg tgc cgc agc a   22
[90]
[91]实施例6：产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生的 lysA基因的克隆，重组载体(pDZ-2lysA)的构建和固着lysA的菌株的 制备
[92]从NIH GenBank数据获得关于lysA基因的碱基序列(NCBI登记号NC_003450，Ncgl1132～1133)的信息。经分析，lysA基因包含argS基因(精氨酰-tRNA合成酶)和操纵子。该信息被用于设计两对引物，以扩增范围从argS启动子到终止密码子的全argS-lysA基因(表8)。
[93]表8
  引物   碱基序列   SEQ ID NOS.
  FargHN1  ATT AAG CTT TGC ATG GGC ACGTCG ATG   13
  RargHN1  ATT GCG GCC GCT CCA CGG CGAAGG TGA AG   14
  FargNX2  ATT GCG GCC GCT GCA TGG GCACGT CGA TG   15
  RargNX2  ATT CTA GAT CCA CGG CGA AGGTGA AG   16
[94]
[95]使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板以及使用一组寡核苷酸SEQ ID NOS.13和14或寡核苷酸SEQ ID NOS.15和16作为引物，在PfuUltraTM高保真性DNA聚合酶(Stratagene)存在下进行PCR，进行如下30个循环：96℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸4分钟。
[96]发现由此获得的PCR产物是两种类型的argS/lysA基因：argS/lysA-A和argS/lysA-B，每一种含有3,359bp-长的启动子区域，其分别用一组SEQ ID NOS.13和14以及一组SEQ ID NOS.15和16产生。在TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)帮助下，将PCR产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，得到重组载体pCR-argS/lysA-A和pCR-argS/lysA-B。
[97]这些pCR载体用对argS/lysA-A和argS/lysA-B的相反端特异的相应限制性酶(argS/lysA-A：HindIII+NotI，argS/lysA-B：NotI+XbaI)处理，以从PCR载体分离argS/lysA基因。这些片段通过3-片连接克隆入pDZ载体的HindIII-XbaI位点，以构建重组载体pDZ-2lysA，其中克隆有串联的两个argS/lysA拷贝。图5是pDZ-2lysA载体的图谱。
[98]重组载体pDZ-2lysA被转化入实施例5中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ3中，然后通过交换在核DNA中紧靠lysA基因插入另外的lysA基因拷贝，以产生固着有两个lysA基因拷贝的产赖氨酸的菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ4。使用一组引物(表9)，通过PCR确定两个lysA基因拷贝的相邻定位，所述一组引物设计成扩增两个lysA基因拷贝之间的接触区域。
[99]表9
  引物   碱基序列   SEQ ID NOS.
  2lysAR  GAGATC AGC TGGTGT CAT GG   23
  2lysAF5  ATC CAC AGC GAA CTG GGC G   24
[100]
[101]产赖氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ4——其固着有六个负责体内赖氨酸生物合成的基因，于2006年8月21日保藏在韩国联邦菌物保藏中心，登录号KCCM10770P。
[102]
[103]实施例7：产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生的 pycGene的克隆，重组载体(pDZ-2pyc)的构建和固着pyc的菌株的制 备
[104]从NIH GenBank数据获得关于pyc基因的碱基序列(NCBI登记号NC_003450，Ncgl0659)的信息，并用于设计两对引物)，以扩增范围从启动子区域到终止密码子的pyc基因(表10)，方式如实施例3。
[105]表10
 引物   碱基序列   SEQ ID NOS.
 pyc-XbaI-F   ggc tct aga agg att gct ttg tgc act cct g   31
 pyc-EcoRV-R   gaa gat atc gag cct tgg tct cca tct tc   32
 pyc-EcoRV-F   gaa gat atc agg att gct ttg tgc act cct g   33
 pyc-HindIII-R   gac aag ctt gag cct tgg tct cca tct tc   34
[106]
[107]使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板以及使用一组寡核苷酸SEQ ID NOS.31和32或寡核苷酸SEQ ID NOS.33和34作为引物，在PfuUltraTM高保真性DNA聚合酶(Stratagene)存在下进行PCR，进行如下30个循环：96℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸4分钟。发现由此获得的PCR产物是两种类型的pyc基因：pyc-A和pyc-B，每一种含有3,925bp-长的启动子区域，其分别用一组SEQ ID NOS.31和32以及一组SEQ ID NOS.33和34产生。在TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)帮助下，将PCR产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，以得到重组载体pCR-pyc-A和pCR-pyc-B。
[108]这些pCR载体用对pyc-A和pyc-B的相反端特异的相应限制性酶(pyc-A：XbaI和EcoRV，pyc-B：EcoRV和HindIII)处理，以从pCR载体分离pyc基因。这些片段通过3-片连接克隆入pDZ载体的XbaI-HindIII位点，以构建重组载体pDZ-2pyc，其中克隆有串联的两个pyc拷贝。图6是pDZ-2pyc载体的图谱。
[109]重组载体pDZ-2pyc被转化入实施例6中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ4中，然后通过交换在核DNA中紧靠pycA基因插入另外的pycA基因拷贝，以产生固着有两个pyc基因拷贝的产赖氨酸的菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ5。使用一组引物(表11)，通过PCR确定两个pyc基因拷贝的相邻定位，所述一组引物设计成扩增两个pyc基因拷贝之间的接触区域。
[110]表11
  引物  碱基序列   SEQ ID NOS.
  2pyc-F  ctg agg aag agc agg cgc acc tcg   35
  2pyc-R  ttc cgc aca ctc gcg ggc aag ctg   36
[111]
[112]结果，产赖氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ5固着有七个参与赖氨酸生物合成的基因。
[113]
[114]实施例8：从固着负责赖氨酸生物合成的基因的菌株生产赖氨 酸
[115]培养分别在实施例6和7中制备的产L-赖氨酸菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ4和KFCC-10881-CJ5，以生产L-赖氨酸，如下所述。
[116]将谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881、KFCC-10881-CJ4和KFCC-10881-CJ5接种在含有25ml下述种子培养基的240ml-角挡板瓶(corner baffle flask)中，并于30℃以200rpm振荡培养20小时。然后，将1ml的每一培养物接种入含有24ml下述生产培养基的250ml-角挡板瓶中，并于30℃以200rpm振荡培养120小时。种子培养基和生产培养基包含下面的组合物。
[117]
[118]种子培养基(pH 7.0)
[119]葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO47H2O 0.5g、生物素100□、盐酸硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺2000□(于1升蒸馏水中)。
[120]生产培养基(pH 7.0)
[121]葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸泡固体5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4 7H2O 0.5g、生物素100□、氯化硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺3000□和CaCO3 30g(于1升蒸馏水中)。
[122]
[123]培养完成后，进行HPLC分析以确定菌株生产的L-赖氨酸的量。谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881、KFCC10881-CJ4和KFCC10881-CJ5培养物中的L-赖氨酸浓度总结在下表12中。
[124]表12
Figure A20078003418000201
[125]
[126]从表12可见，发现与母株KFCC-10881相比，固着有六个参与赖氨酸生物合成的基因的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ4增加赖氨酸生产力约7％。而且，测量到与母株KFCC-10881相比，谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ5获得约8％的赖氨酸生产增加，谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ5除了六种赖氨酸生物合成基因外还固着有pyc基因。
[127]
[128]实施例9：固着三个lysC/asd基因拷贝的产赖氨酸谷氨酸棒状 杆菌KFCC-10881-衍生菌株的制备
[129]实施例4中制备的重组载体pDZ-2lysC/asd被转化入实施例6中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ4，然后通过交换在核DNA中紧靠两个相邻lysC/asd基因拷贝插入另外的lysC/asd基因拷贝，以产生固着有三个lysC/asd基因拷贝的产赖氨酸菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ6。使用一组引物(表13)，通过PCR确定串联的三个lysC/asd基因拷贝的排列，所述一组引物设计成扩增三个lysC/asd基因拷贝之间的接触区域。
[130]表13
 引物   碱基序列   SEQ ID NOS.
 3lysC-F   ggg cga att ctg cag at   38
 3lysC-R   atc tgc aga att cgc cc   39
[131]
[132]经发现，产赖氨酸菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ6的天冬氨酸激酶活性为KFCC10881-CJ4的2.1倍，这通过根据Pechere J.F.和Capony J.P.(Anal Biochem 22：536-539，1968)使用天冬氨酰异羟肟酸(aspartyl hydroxamate)的方法测量(表14)。
[133]表14
  菌株   天冬氨酸激酶活性(倍数)
  KFCC10881-CJ4   1
  KFCC10881-CJ5   2.1
[134]
[135]实施例10：固着三个dapA/dapB基因拷贝的产赖氨酸谷氨酸 棒状杆菌KFCC-10881-衍生菌株的制备
[136]实施例5中制备的重组载体pDZ-2dapA/dapB被转化入实施例9中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ6，然后通过交换在核DNA中紧靠两个相邻dapA/dapB基因拷贝插入另外的dapA/dapB基因拷贝，以产生固着有三个dapA/dapB基因拷贝的产赖氨酸菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ7。使用一组引物(表15)，通过PCR确定串联的三个dapA/dapB基因拷贝的排列，所述一组引物设计成扩增三个dapA/dapB基因拷贝之间的接触区域。
[137]表15
 引物  碱基序列   SEQ ID NOS.
 3lysC-F  aaa cgc caa tga gag ctc tca   40
 3lysC-R  ctt ggc gct tgt gag ctc tga   41
[138]
[139]实施例11：从固着负责赖氨酸生物合成的复合基因的菌株生产 赖氨酸
[140]培养在实施例10中制备的产L-赖氨酸菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ7，以生产L-赖氨酸，如下所述。
[141]将谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ4和KFCC-10881-CJ7接种在含有25ml下述种子培养基的250ml-角挡板瓶中，并于30℃以200rpm振荡培养20小时。然后，将1ml的每一培养物接种入含有24ml下述生产培养基的250ml-角挡板瓶中，并于30℃以200rpm振荡培养120小时。种子培养基和生产培养基包含下面的组合物。
[142]
[143]种子培养基(pH 7.0)
[144]葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4 7H2O 0.5g、生物素100□、盐酸硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺2000□(于1升蒸馏水中)。
[145]生产培养基(pH 7.0)
[146]葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸泡固体5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4 7H2O 0.5g、生物素100□、氯化硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺3000□、CaCO3 30g(于1升蒸馏水中)。
[147]
[148]培养完成后，进行HPLC分析以确定菌株生产的L-赖氨酸的量。谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ4和KFCC-10881-CJ7培养物中的L-赖氨酸浓度总结在下表16中。
[149]表16
Figure A20078003418000221
Figure A20078003418000231
[150]
[151]从表16可见，发现与母株KFCC-10881-CJ4相比，参与赖氨酸生物合成的三个基因以三副本方式固着的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ7增加赖氨酸生产力约11％。
[152]
[153]实施例12：启动子置换载体的构建和置换赖氨酸生物合成基因 的外源启动子的菌株的制备
[154]基于pDZ，对于赖氨酸生物合成基因，用外源有效CJ7启动子置换天然启动子。CJ7启动子是强大的、产氨棒状杆菌-衍生的启动子，其具有SEQ ID NOS.44至50表示的碱基。它公开在韩国专利号0620092中，授权给本申请人。当谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881的核lysC在CJ7启动子存在下表达时，发现天冬氨酸激酶活性被提高到使用固有启动子的2倍高。
[155]如下制备将CJ7启动子引入产赖氨酸菌株的核DNA的载体。
[156]首先，用限制性酶XbaI和NdeI处理pDZ载体。在作为引物的SEQ ID NOS.42和43(表17)存在下进行PCR，所述引物设计用于将XbaI和NdeI位点分别插入在PCR产物的5′-和3′-端，所述PCR产物由产氨棒状杆菌的核DNA的CJ7启动子扩增得到。在用XbaI和NdeI处理后，CJ7启动子PCR产物被连接到截短的pDZ载体，以得到pDZ-PCJ7载体，其用作将CJ7启动子引入菌株的核DNA的初级质粒(图7)。
[157]表17
  引物   碱基序列   SEQ ID NOS.
  PCJ7-F-XbaI   tct agaaga aac atc cca gcg cta c   42
  PCJ7-R-NdeI   cat atggag tgt ttc ctt tcg ttg   43
[158]
[159]用实施例2中制备的产赖氨酸菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板，进行PCR，以获得两种类型的DNA片段，该片段是CJ7启动子置换引入核DNA的基因各自的天然启动子所必需的，也就是从碱基+2起向下游方向延伸的大约300bp长的部分天然启动子片段和大约300bp长的部分ORF。设计这样的用于PCR的引物，以便XbaI位点插入在部分天然启动子片段的PCR产物的相反端，NdeI位点插入在部分ORF的PCR产物的相反端。这些PCR产物用各自的限制性酶处理。pDZ-PCJ7用XbaI消化以连接到部分天然启动子片段的截短的PCR产物，然后用NdeI消化以连接到部分ORF的截短的PCR产物，从而构建重组质粒，分别称为pDZ-PCJ7-aspB、pDZ-PCJ7-lysCasd、pDZ-PCJ7-dapA、pDZ-PCJ7-dapB、pDZ-PCJ7-argSlysA和pDZ-PCJ7-pyc，每一种包含位于两个PCR DNA片段之间的CJ7启动子(图8至13)。
[160]质粒被用于目标基因的重组，如下所述。首先，将重组载体pDZ-PCJ7-aspB转化入产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881，然后在核DNA中aspB基因的启动子区域进行与CJ7启动子的交换。以同样的方式，其它重组质粒被转化以产生新菌株KFCC-10881-PCJ7-5，其中CJ7启动子位于aspB、lysCasd、dapA、dapB和argSlysA基因的启动子区域中。除了启动子，pyc基因的启动子用CJ7启动子置换以产生KFCC-10881-PCJ7-6。
[161]
[162]实施例13：在具有赖氨酸生物合成基因的外源启动子的菌株中 生产赖氨酸
[163]培养产L-赖氨酸菌株——谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-PCJ7-5和KFCC-10881-PCJ7-6，以产生L-赖氨酸，如下所述。
[164]将谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881、KFCC-10881-PCJ7-5和KFCC-10881-PCJ7-6接种在含有25ml下述种子培养基的250ml-角挡板瓶中，并于30℃以200rpm振荡培养20小时。然后，将1ml的每一培养物接种入含有24ml下述生产培养基的250ml-角挡板瓶中，并于30℃以200rpm振荡培养120小时。种子培养基和生产培养基包含下面的组合物。
[165]
[166]种子培养基(pH 7.0)
[167]葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4 7H2O 0.5g、生物素100□、盐酸硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺2000□(于1升蒸馏水中)。
[168]生产培养基(pH 7.0)
[169]葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸泡固体5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4 7H2O 0.5g、生物素100□、氯化硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺3000□和CaCO3 30g(于1升蒸馏水中)。
[170]
[171]培养完成后，进行HPLC分析以确定菌株生产的L-赖氨酸的量。谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881、KFCC-10881-PCJ7-5和KFCC-10881-PCJ7-6培养物中的L-赖氨酸浓度总结在下表18中。
[172]表18
Figure A20078003418000251
[173]
[174]从表18可见，发现与母株KFCC-10881相比，其中固着有六个参与赖氨酸生物合成的基因和它们各自的外源CJ7启动子的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-PCJ7-5，以及除了六个基因和启动子外还固着pyc基因和其CJ7启动子的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-PCJ7-6，分别增加赖氨酸生产力约17.4％和18.6％。
[175]
[176]实施例14：在固着负责赖氨酸生物合成的额外基因和具有其置 换的外源启动子的菌株中，赖氨酸生物合成酶的活性
[177]分析分别在实施例6、10和12中制备的产L-赖氨酸菌株——谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ4、KFCC10881-CJ7和KFCC-10881-PCJ7-5——的天冬氨酸激酶和二氨基庚二酸二羧化酶活性，这两种酶作为赖氨酸生物合成酶的代表，原因是它们的活性相对容易被测量。对于天冬氨酸激酶活性通过Pechere J.F.和Capony J.P.(AnalBiochem 22：536-539，1968)的方法测量，对于二氨基庚二酸二羧化酶活性通过J.Cremer等人的方法测量，发现与起始母株KFCC10881(表19)相比，修饰的产赖氨酸菌株增加酶活性。
[178]表19
Figure A20078003418000261
[179]
序列表
<110>CJ株式会社
<120>具有增加的L-赖氨酸生产力的棒状杆菌
     和使用其生产L-赖氨酸的方法
<150>KR1020060089672
<151>2006-09-15
<160>50
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>aspB扩增的正向引物
<400>1
cccggggcgg ttcagctaga gttatgc                                         27
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>aspB扩增的反向引物
<400>2
aagcttttag ttagcgtaat gctccgc                                         27
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>aspB扩增的正向引物
<400>3
aagcttgcgg ttcagctaga gttatgc                                         27
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>aspB扩增的反向引物
<400>4
gctagcttag ttagcgtaat gctccgc                                         27
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>lysCasd扩增的正向引物
<400>5
ttgcacggat cccagggtag ttgactaaag                                      30
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>lysCasd扩增的反向引物
<400>6
atggatcccg ggtatcaacg cgtcggtaga                                      30
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>lysCasd扩增的正向引物
<400>7
ttgcaccccg ggcagggtag ttgactaaag                                      30
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>lysCasd扩增的反向引物
<400>8
atggatcgat cgtatcaacg cgtcggtaga                                      30
<210>9
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>dapAdapB扩增的正向引物
<400>9
gacgaattct cattggcgtt tccggatcc                                       29
<210>10
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>dapAdapB扩增的反向引物
<400>10
tcagagctca caagcgccaa ggaactacc                                       29
<210>11
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>dapAdapB扩增的正向引物
<400>11
tgagagctct cattggcgtt tccggatcc                                       29
<210>12
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>dapAdapB扩增的反向引物
<400>12
tgtctcgaga caagcgccaa ggaactacc                                       29
<210>13
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>argSlysA扩增的正向引物
<400>13
attaagcttt gcatgggcac gtcgatg                                         27
<210>14
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>argSlysA扩增的反向引物
<400>14
attgcggccg ctccacggcg aaggtgaag                                       29
<210>15
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>argSlysA扩增的正向引物
<400>15
attgcggccg ctgcatgggc acgtcgatg                                       29
<210>16
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>argSlysA扩增的反向引物
<400>16
attctagatc cacggcgaag gtgaag                                          26
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
gcagtggact gtccctgc                                                   18
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
cctgcagcga aactgaactc                                                 20
<210>19
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
catggcgagg atcccgttag aaatacgctc                                      30
<210>20
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
ttcacgccga attcgacaag gcaatcaccg                                      30
<210>21
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
aggcatttca ttggca                                                     16
<210>22
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
tttgcgtgcc gcagca                                                     16
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
gagatcagct ggtgtcatgg                                                  20
<210>24
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
atccacagcg aactgggcg                                                   19
<210>25
<211>1488
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400>25
gcggttcagc tagagttatg cgaaggatcc cgtgcggcgt ttatcttgtg aactccccca      60
gggcaggaat gcagcaaggg tcagcgagct ctgacgggtg cgcgggatcc cctaaaacgt     120
ctagagtagt ggcttgaggt cactgctctt tttttgtgcc cttttttggt ccgtctattt     180
tgccaccaca tgcggaggta cgcagttatg agttcagttt cgctgcagga ttttgatgca     240
gagcgaattg gtttgttcca cgaggacatt aagcgcaagt ttgatgagct caagtcaaaa     300
aatctgaagc tggatcttac tcgcggtaag ccttcgtcgg agcagttgga tttcgctgat     360
gagttgttgg cgttgcctgg taagggtgat ttcaaggctg cggatggtac tgatgtccgt     420
aactatggcg ggctggatgg catcgttgat attcgccaga tttgggcgga tttgctgggt     480
gttcctgtgg agcaggtctt ggcgggggat gcttcgagct tgaacatcat gtttgatgtg     540
atcagctggt cgtacatttt cggtaacaat gattcggttc agccttggtc gaaggaagaa     600
accgttaagt ggatttgccc tgttccgggc tatgatcgcc atttctccat cacggagcgt     660
ttcggctttg agatgatttc tgtgccaatg aatgaagacg gccctgatat ggatgctgtt     720
gaggaattgg tgaagaatcc gcaggttaag ggcatgtggg ttgttccggt gttttctaac     780
ccgactggtt tcacggtgac agaagacgtc gcaaagcgtc taagcgcaat ggaaaccgca     840
gctccggact tccgcgttgt gtgggataat gcctacgccg ttcatacgct gaccgatgaa     900
ttccctgagg ttatcgatat cgtcgggctt ggtgaggccg ctggcaaccc gaaccgtttc     960
tgggcgttca cttctacttc gaagatcact ctcgcgggtg cgggcgtgtc gttcttcctc    1020
acctctgcgg agaaccgcaa gtggtacacc ggccatgcgg gtatccgtgg cattggccct    1080
aacaaggtca atcagttggc tcatgcgcgt tactttggcg atgctgaggg agtgcgcgcg    1140
gtgatgcgta agcatgctgc gtcgttggct ccgaagttca acaaggttct ggagattctg    1200
gattctcgcc ttgctgagta cggtgtcgcg cagtggactg tccctgcggg cggttacttc    1260
atttcccttg atgtggttcc tggtacggcg tctcgcgtgg ctgagttggc taaggaagcc    1320
ggcatcgcgt tgacgggtgc gggttcttct tacccgctgc gtcaggatcc ggagaacaaa    1380
aatctccgtt tggcaccgtc gctgcctcca gttgaggaac ttgaggttgc catggatggc    1440
gtggctacct gtgtgctgtt ggcagcagcg gagcattacg ctaactaa                 1488
<210>26
<211>1506
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌
<400>26
cagggtagtt gactaaagag ttgctcgcga agtagcacct gtcacttttg tctcaaatat      60
taaatcgaat atcaatatat ggtctgttta ttggaacgcg tcccagtggc tgagacgcat     120
ccgctaaagc cccaggaacc ctgtgcagaa agaaaacact cctctggcta ggtagacaca     180
gtttattgtg gtagagttga gcgggtaact gtcagcacgt agatcgaaag gtgcacaaag     240
gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga     300
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc     360
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt     420
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc     480
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct     540
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt     600
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat     660
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg     720
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat     780
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa     840
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct     900
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg     960
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc    1020
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg    1080
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc    1140
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc    1200
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac    1260
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt    1320
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc    1380
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca    1440
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga    1500
cgctaa                                                               1506
<210>27
<211>1299
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌
<400>27
agttttaaag gagtagtttt acaatgacca ccatcgcagt tgttggtgca accggccagg      60
tcggccaggt tatgcgcacc cttttggaag agcgcaattt cccagctgac actgttcgtt     120
tctttgcttc cccacgttcc gcaggccgta agattgaatt ccgtggcacg gaaatcgagg     180
tagaagacat tactcaggca accgaggagt ccctcaagga catcgacgtt gcgttgttct     240
ccgctggagg caccgcttcc aagcagtacg ctccactgtt cgctgctgca ggcgcgactg     300
ttgtggataa ctcttctgct tggcgcaagg acgacgaggt tccactaatc gtctctgagg     360
tgaacccttc cgacaaggat tccctggtca agggcattat tgcgaaccct aactgcacca     420
ccatggctgc gatgccagtg ctgaagccac ttcacgatgc cgctggtctt gtaaagcttc     480
acgtttcctc ttaccaggct gtttccggtt ctggtcttgc aggtgtggaa accttggcaa     540
agcaggttgc tgcagttgga gaccacaacg ttgagttcgt ccatgatgga caggctgctg     600
acgcaggcga tgtcggacct tatgtttcac caatcgctta caacgtgctg ccattcgccg     660
gaaacctcgt cgatgacggc accttcgaaa ccgatgaaga gcagaagctg cgcaacgaat     720
cccgcaagat tctcggtctc ccagacctca aggtctcagg cacctgcgtc cgcgtgccgg     780
ttttcaccgg ccacacgctg accattcacg ccgaattcga caaggcaatc accgtggacc     840
aggcgcagga gatcttgggt gccgcttcag gcgtcaagct tgtcgacgtc ccaaccccac     900
ttgcagctgc cggcattgac gaatccctcg ttggacgcat ccgtcaggac tccactgtcg     960
acgataaccg cggtctggtt ctcgtcgtat ctggcgacaa cctccgcaag ggtgctgcgc    1020
taaacaccat ccagatcgct gagctgctgg ttaagtaaaa acccgccatt aaaaactccg    1080
cttgagtgct acactttaag cggggtttta atgtttgagg ggcgatgggg gtcgagcttg    1140
tgaagtggaa ttttccacaa gttttaagtt tctttagcag gggaaacact gctgatagca    1200
ctagcgataa agaacatgaa aatgcaacgg agctagcggc cgaagcttta gcggatgtca    1260
tttttcagtg gaaaaactgg gtctaccgac gcgttgata                           1299
<210>28
<211>1422
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌
<400>28
cgcaaagctc acacccacga gctaaaaatt catatagtta agacaacatt tttggctgta      60
aaagacagcc gtaaaaacct cttgctcgtg tcaattgttc ttatcggaat gtggcttggg     120
cgattgttat gcaaaagttg ttaggttttt tgcggggttg tttaaccccc aaatgaggga     180
agaaggtaac cttgaactct atgagcacag gtttaacagc taagaccgga gtagagcact     240
tcggcaccgt tggagtagca atggttactc cattcacgga atccggagac atcgatatcg     300
ctgctggccg cgaagtcgcg gcttatttgg ttgataaggg cttggattct ttggttctcg     360
cgggcaccac tggtgaatcc ccaacgacaa ccgccgctga aaaactagaa ctgctcaagg     420
ccgttcgtga ggaagttggg gatcgggcga agctcatcgc cggtgtcgga accaacaaca     480
cgcggacatc tgtggaactt gcggaagctg ctgcttctgc tggcgcagac ggccttttag     540
ttgtaactcc ttattactcc aagccgagcc aagagggatt gctggcgcac ttcggtgcaa     600
ttgctgcagc aacagaggtt ccaatttgtc tctatgacat tcctggtcgg tcaggtattc     660
caattgagtc tgataccatg agacgcctga gtgaattacc tacgattttg gcggtcaagg     720
acgccaaggg tgacctcgtt gcagccacgt cattgatcaa agaaacggga cttgcctggt     780
attcaggcga tgacccacta aaccttgttt ggcttgcttt gggcggatca ggtttcattt     840
ccgtaattgg acatgcagcc cccacagcat tacgtgagtt gtacacaagc ttcgaggaag     900
gcgacctcgt ccgtgcgcgg gaaatcaacg ccaaactatc accgctggta gctgcccaag     960
gtcgcttggg tggagtcagc ttggcaaaag ctgctctgcg tctgcagggc atcaacgtag    1020
gagatcctcg acttccaatt atggctccaa atgagcagga acttgaggct ctccgagaag    1080
acatgaaaaa agctggagtt ctataaatat gaatgattcc cgaaatcgcg gccggaaggt    1140
tacccgcaag gcgggcccac cagaagctgg tcaggaaaac catctggata cccctgtctt    1200
tcaggcacca gatgcttcct ctaaccagag cgctgtaaaa gctgagaccg ccggaaacga    1260
caatcgggat gctgcgcaag gtgctcaagg atcccaagat tctcagggtt cccagaacgc    1320
tcaaggttcc cagaaccgcg agtccggaaa caacaaccgc aaccgttcca acaacaaccg    1380
tcgcggtggt cgtggacgtc gtggatccgg aaacgccaat ga                       1422
<210>29
<211>1787
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌
<400>29
acaagcgcca aggaactacc tgcggaacgg gcggtgaagg gcaacttaag tctcatattt      60
caaacatagt tccacctgtg tgattaatcc ctagaacgga acaaactgat gaacaatcgt     120
taacaacaca gaccaaaacg gtcagttagg tatggatatc agcaccttct gaacgggtac     180
gtctagactg gtgggcgttt gaaaaactct tcgccccacg aaaatgaagg agcataatgg     240
gaatcaaggt tggcgttctc ggagccaaag gccgtgttgg tcaaactatt gtggcagcag     300
tcaatgagtc cgacgatctg gagcttgttg cagagatcgg cgtcgacgat gatttgagcc     360
ttctggtaga caacggcgct gaagttgtcg ttgacttcac cactcctaac gctgtgatgg     420
gcaacctgga gttctgcatc aacaacggca tttctgcggt tgttggaacc acgggcttcg     480
atgatgctcg tttggagcag gttcgcgact ggcttgaagg aaaagacaat gtcggtgttc     540
tgatcgcacc taactttgct atctctgcgg tgttgaccat ggtcttttcc aagcaggctg     600
cccgcttctt cgaatcagct gaagttattg agctgcacca ccccaacaag ctggatgcac     660
cttcaggcac cgcgatccac actgctcagg gcattgctgc ggcacgcaaa gaagcaggca     720
tggacgcaca gccagatgcg accgagcagg cacttgaggg ttcccgtggc gcaagcgtag     780
atggaatccc ggttcatgca gtccgcatgt ccggcatggt tgctcacgag caagttatct     840
ttggcaccca gggtcagacc ttgaccatca agcaggactc ctatgatcgc aactcatttg     900
caccaggtgt cttggtgggt gtgcgcaaca ttgcacagca cccaggccta gtcgtaggac     960
ttgagcatta cctaggcctg taaaggctca tttcagcagc gggtggaatt ttttaaaagg    1020
agcgtttaaa ggctgtggcc gaacaagtta aattgagcgt ggagttgata gcgtgcagtt    1080
cttttactcc acccgctgat gttgagtggt caactgatgt tgagggcgcg gaagcactcg    1140
tcgagtttgc gggtcgtgcc tgctacgaaa cttttgataa gccgaaccct cgaactgctt    1200
ccaatgctgc gtatctgcgc cacatcatgg aagtggggca cactgctttg cttgagcatg    1260
ccaatgccac gatgtatatc cgaggcattt ctcggtccgc gacccatgaa ttggtccgac    1320
accgccattt ttccttctct caactgtctc agcgtttcgt gcacagcgga gaatcggaag    1380
tagtggtgcc cactctcatc gatgaagatc cgcagttgcg tgaacttttc atgcacgcca    1440
tggatgagtc tcggttcgct ttcaatgagc tgcttaatgc gctggaagaa aaacttggcg    1500
atgaaccgaa tgcactttta aggaaaaagc aggctcgtca agcagctcgc gctgtgctgc    1560
ccaacgctac agagtccaga atcgtggtgt ctggaaactt ccgcacctgg aggcatttca    1620
ttggcatgcg agccagtgaa catgcagacg tcgaaatccg cgaagtagcg gtagaatgtt    1680
taagaaagct gcaggtagca gcgccaactg ttttcggtga ttttgagatt gaaactttgg    1740
cagacggatc gcaaatggca acaagcccgt atgtcatgga cttttaa                  1787
<210>30
<211>3360
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌
<400>30
tgcatgggca cgtcgatgct gccacattga gcggaggcaa tatctacctg aggtgggcat      60
tcttcccagc ggatgttttc ttgcgctgct gcagtgggca ttgataccaa aaaggggcta     120
agcgcagtcg aggcggcaag aactgctact acccttttta ttgtcgaacg gggcattacg     180
gctccaagga cgtttgtttt ctgggtcagt taccccaaaa agcatataca gagaccaatg     240
atttttcatt aaaaaggcag ggatttgtta taagtatggg tcgtattctg tgcgacgggt     300
gtacctcggc tagaatttct ccccatgaca ccagctgatc tcgcaacatt gattaaagag     360
accgcggtag aggttttgac ctcccgcgag ctcgatactt ctgttcttcc ggagcaggta     420
gttgtggagc gtccgcgtaa cccagagcac ggcgattacg ccaccaacat tgcattgcag     480
gtggctaaaa aggtcggtca gaaccctcgg gatttggcta cctggctggc agaggcattg     540
gctgcagatg acgccattga ttctgctgaa attgctggcc caggcttttt gaacattcgc     600
cttgctgcag cagcacaggg tgaaattgtg gccaagattc tggcacaggg cgagactttc     660
ggaaactccg atcacctttc ccacttggac gtgaacctcg agttcgtttc tgcaaaccca     720
accggaccta ttcaccttgg cggaacccgc tgggctgccg tgggtgactc tttgggtcgt     780
gtgctggagg cttccggcgc gaaagtgacc cgcgaatact acttcaacga tcacggtcgc     840
cagatcgatc gtttcgcttt gtcccttctt gcagcggcga agggcgagcc aacgccagaa     900
gacggttatg gcggcgaata cattaaggaa attgcggagg caatcgtcga aaagcatcct     960
gaagcgttgg ctttggagcc tgccgcaacc caggagcttt tccgcgctga aggcgtggag    1020
atgatgttcg agcacatcaa atcttccctg catgagttcg gcaccgattt cgatgtctac    1080
taccacgaga actccctgtt cgagtccggt gcggtggaca aggccgtgca ggtgctgaag    1140
gacaacggca acctgtacga aaacgagggc gcttggtggc tgcgttccac cgaattcggc    1200
gatgacaaag accgcgtggt gatcaagtct gacggcgacg cagcctacat cgctggcgat    1260
atcgcgtacg tggctgataa gttctcccgc ggacacaacc taaacatcta catgttgggt    1320
gctgaccacc atggttacat cgcgcgcctg aaggcagcgg cggcggcact tggctacaag    1380
ccagaaggcg ttgaagtcct gattggccag atggtgaacc tgcttcgcga cggcaaggca    1440
gtgcgtatgt ccaagcgtgc aggcaccgtg gtcaccctag atgacctcgt tgaagcaatc    1500
ggcatcgatg cggcgcgtta ctccctgatc cgttcctccg tggattcttc cctggatatc    1560
gatctcggcc tgtgggaatc ccagtcctcc gacaaccctg tgtactacgt gcagtacgga    1620
cacgctcgtc tgtgctccat cgcgcgcaag gcagagacct tgggtgtcac cgaggaaggc    1680
gcagacctat ctctactgac ccacgaccgc gaaggcgatc tcatccgcac actcggagag    1740
ttcccagcag tggtgaaggc tgccgctgac ctacgtgaac cacaccgcat tgcccgctat    1800
gctgaggaat tagctggaac tttccaccgc ttctacgatt cctgccacat ccttccaaag    1860
gttgatgagg atacggcacc aatccacaca gcacgtctgg cacttgcagc agcaacccgc    1920
cagaccctcg ctaacgccct gcacctggtt ggcgtttccg caccggagaa gatgtaacaa    1980
tggctacagt tgaaaatttc aatgaacttc ccgcacacgt atggccacgc aatgccgtgc    2040
gccaagaaga cggcgttgtc accgtcgctg gtgtgcctct gcctgacctc gctgaagaat    2100
acggaacccc actgttcgta gtcgacgagg acgatttccg ttcccgctgt cgcgacatgg    2160
ctaccgcatt cggtggacca ggcaatgtgc actacgcatc taaagcgttc ctgaccaaga    2220
ccattgcacg ttgggttgat gaagaggggc tggcactgga cattgcatcc atcaacgaac    2280
tgggcattgc cctggccgct ggtttccccg ccagccgtat caccgcgcac ggcaacaaca    2340
aaggcgtaga gttcctgcgc gcgttggttc aaaacggtgt gggacacgtg gtgctggact    2400
ccgcacagga actagaactg ttggattacg ttgccgctgg tgaaggcaag attcaggacg    2460
tgttgatccg cgtaaagcca ggcatcgaag cacacaccca cgagttcatc gccactagcc    2520
acgaagacca gaagttcgga ttctccctgg catccggttc cgcattcgaa gcagcaaaag    2580
ccgccaacaa cgcagaaaac ctgaacctgg ttggcctgca ctgccacgtt ggttcccagg    2640
tgttcgacgc cgaaggcttc aagctggcag cagaacgcgt gttgggcctg tactcacaga    2700
tccacagcga actgggcgtt gcccttcctg aactggatct cggtggcgga tacggcattg    2760
cctataccgc agctgaagaa ccactcaacg tcgcagaagt tgcctccgac ctgctcaccg    2820
cagtcggaaa aatggcagcg gaactaggca tcgacgcacc aaccgtgctt gttgagcccg    2880
gccgcgctat cgcaggcccc tccaccgtga ccatctacga agtcggcacc accaaagacg    2940
tccacgtaga cgacgacaaa acccgccgtt acatcgccgt ggacggaggc atgtccgaca    3000
acatccgccc agcactctac ggctccgaat acgacgcccg cgtagtatcc cgcttcgccg    3060
aaggagaccc agtaagcacc cgcatcgtgg gctcccactg cgaatccggc gatatcctga    3120
tcaacgatga aatctaccca tctgacatca ccagcggcga cttccttgca ctcgcagcca    3180
ccggcgcata ctgctacgcc atgagctccc gctacaacgc cttcacacgg cccgccgtcg    3240
tgtccgtccg cgctggcagc tcccgcctca tgctgcgccg cgaaacgctc gacgacatcc    3300
tctcactaga ggcataacgc ttttcgacgc ctgaccccgc ccttcacctt cgccgtggag    3360
                                                                     3360
<210>31
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pyc扩增的正向引物
<400>31
ggctctagaa ggattgcttt gtgcactcct g                                     31
<210>32
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pyc扩增的反向引物
<400>32
gaagatatcg agccttggtc tccatcttc                                        29
<210>33
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pyc扩增的正向引物
<400>33
gaagatatca ggattgcttt gtgcactcct g                                    31
<210>34
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pyc扩增的反向引物
<400>34
gacaagcttg agccttggtc tccatcttc                                       29
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
ctgaggaaga gcaggcgcac ctcg                                            24
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
ttccgcacac tcgcgggcaa gctg                                            24
<210>37
<211>3925
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌
<400>37
aggattgctt tgtgcactcc tgggttttca ctttgttaag cagttttggg gaaaagtgca     60
aagtttgcaa agtttagaaa tattttaaga ggtaagatgt ctgcaggtgg aagcgtttaa    120
atgcgttaaa cttggccaaa tgtggcaacc tttgcaaggt gaaaaactgg ggcggggtta    180
gatcctgggg ggtttatttc attcactttg gcttgaagtc gtgcaggtca ggggagtgtt    240
gcccgaaaac attgagagga aaacaaaaac cgatgtttga ttgggggaat cgggggttac    300
gatactagga cgcagtgact gctatcaccc ttggcggtct cttgttgaaa ggaataatta    360
ctctagtgtc gactcacaca tcttcaacgc ttccagcatt caaaaagatc ttggtagcaa    420
accgcggcga aatcgcggtc cgtgctttcc gtgcagcact cgaaaccggt gcagccacgg    480
tagctattta cccccgtgaa gatcggggat cattccaccg ctcttttgct tctgaagctg    540
tccgcattgg taccgaaggc tcaccagtca aggcgtacct ggacatcgat gaaattatcg    600
gtgcagctaa aaaagttaaa gcagatgcca tttacccggg atacggcttc ctgtctgaaa     660
atgcccagct tgcccgcgag tgtgcggaaa acggcattac ttttattggc ccaaccccag     720
aggttcttga tctcaccggt gataagtctc gcgcggtaac cgccgcgaag aaggctggtc     780
tgccagtttt ggcggaatcc accccgagca aaaacatcga tgagatcgtt aaaagcgctg     840
aaggccagac ttaccccatc tttgtgaagg cagttgccgg tggtggcgga cgcggtatgc     900
gttttgttgc ttcacctgat gagcttcgca aattagcaac agaagcatct cgtgaagctg     960
aagcggcttt cggcgatggc gcggtatatg tcgaacgtgc tgtgattaac cctcagcata    1020
ttgaagtgca gatccttggc gatcacactg gagaagttgt acacctttat gaacgtgact    1080
gctcactgca gcgtcgtcac caaaaagttg tcgaaattgc gccagcacag catttggatc    1140
cagaactgcg tgatcgcatt tgtgcggatg cagtaaagtt ctgccgctcc attggttacc    1200
agggcgcggg aaccgtggaa ttcttggtcg atgaaaaggg caaccacgtc ttcatcgaaa    1260
tgaacccacg tatccaggtt gagcacaccg tgactgaaga agtcaccgag gtggacctgg    1320
tgaaggcgca gatgcgcttg gctgctggtg caaccttgaa ggaattgggt ctgacccaag    1380
ataagatcaa gacccacggt gcagcactgc agtgccgcat caccacggaa gatccaaaca    1440
acggcttccg cccagatacc ggaactatca ccgcgtaccg ctcaccaggc ggagctggcg    1500
ttcgtcttga cggtgcagct cagctcggtg gcgaaatcac cgcacacttt gactccatgc    1560
tggtgaaaat gacctgccgt ggttccgact ttgaaactgc tgttgctcgt gcacagcgcg    1620
cgttggctga gttcaccgtg tctggtgttg caaccaacat tggtttcttg cgtgcgttgc    1680
tgcgggaaga ggacttcact tccaagcgca tcgccaccgg attcattgcc gatcacccgc    1740
acctccttca ggctccacct gctgatgatg agcagggacg catcctggat tacttggcag    1800
atgtcaccgt gaacaagcct catggtgtgc gtccaaagga tgttgcagct cctatcgata    1860
agctgcctaa catcaaggat ctgccactgc cacgcggttc ccgtgaccgc ctgaagcagc    1920
ttggcccagc cgcgtttgct cgtgatctcc gtgagcagga cgcactggca gttactgata    1980
ccaccttccg cgatgcacac cagtctttgc ttgcgacccg agtccgctca ttcgcactga    2040
agcctgcggc agaggccgtc gcaaagctga ctcctgagct tttgtccgtg gaggcctggg    2100
gcggcgcgac ctacgatgtg gcgatgcgtt tcctctttga ggatccgtgg gacaggctcg    2160
acgagctgcg cgaggcgatg ccgaatgtaa acattcagat gctgcttcgc ggccgcaaca    2220
ccgtgggata caccccgtac ccagactccg tctgccgcgc gtttgttaag gaagctgcca    2280
gctccggcgt ggacatcttc cgcatcttcg acgcgcttaa cgacgtctcc cagatgcgtc    2340
cagcaatcga cgcagtcctg gagaccaaca ccgcggtagc cgaggtggct atggcttatt    2400
ctggtgatct ctctgatcca aatgaaaagc tctacaccct ggattactac ctaaagatgg    2460
cagaggagat cgtcaagtct ggcgctcaca tcttggccat taaggatatg gctggtctgc    2520
ttcgcccagc tgcggtaacc aagctggtca ccgcactgcg ccgtgaattc gatctgccag    2580
tgcacgtgca cacccacgac actgcgggtg gccagctggc aacctacttt gctgcagctc    2640
aagctggtgc agatgctgtt gacggtgctt ccgcaccact gtctggcacc acctcccagc    2700
catccctgtc tgccattgtt gctgcattcg cgcacacccg tcgcgatacc ggtttgagcc    2760
tcgaggctgt ttctgacctc gagccgtact gggaagcagt gcgcggactg tacctgccat    2820
ttgagtctgg aaccccaggc ccaaccggtc gcgtctaccg ccacgaaatc ccaggcggac    2880
agttgtccaa cctgcgtgca caggccaccg cactgggcct tgcggatcgt ttcgaactca    2940
tcgaagacaa ctacgcagcc gttaatgaga tgctgggacg cccaaccaag gtcaccccat    3000
cctccaaggt tgttggcgac ctcgcactcc acctcgttgg tgcgggtgtg gatccagcag    3060
actttgctgc cgatccacaa aagtacgaca tcccagactc tgtcatcgcg ttcctgcgcg    3120
gcgagcttgg taaccctcca ggtggctggc cagagccact gcgcacccgc gcactggaag    3180
gccgctccga aggcaaggca cctctgacgg aagttcctga ggaagagcag gcgcacctcg    3240
acgctgatga ttccaaggaa cgtcgcaata gcctcaaccg cctgctgttc ccgaagccaa    3300
ccgaagagtt cctcgagcac cgtcgccgct tcggcaacac ctctgcgctg gatgatcgtg    3360
aattcttcta cggcctggtc gaaggccgcg agactttgat ccgcctgcca gatgtgcgca    3420
ccccactgct tgttcgcctg gatgcgatct ctgagccaga cgataagggt atgcgcaatg    3480
ttgtggccaa cgtcaacggc cagatccgcc caatgcgtgt gcgtgaccgc tccgttgagt    3540
ctgtcaccgc aaccgcagaa aaggcagatt cctccaacaa gggccatgtt gctgcaccat    3600
tcgctggtgt tgtcaccgtg actgttgctg aaggtgatga ggtcaaggct ggagatgcag    3660
tcgcaatcat cgaggctatg aagatggaag caacaatcac tgcttctgtt gacggcaaaa    3720
tcgatcgcgt tgtggttcct gctgcaacga aggtggaagg tggcgacttg atcgtcgtcg    3780
tttcctaaac ctttctgtaa aaagccccgc gtcttcctca tggaggaggc ggggcttttt    3840
gggccaagat gggagatggg tgagttggat ttggtctgat tcgacacttt taagggcaga    3900
gatttgaaga tggagaccaa ggctc                                          3925
<210>38
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
gggcgaattc tgcagat                                                     17
<210>39
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
atctgcagaa ttcgccc                                                     17
<210>40
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>40
aaacgccaat gagagctctc a                                                21
<210>41
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>41
cttggcgctt gtgagctctg a                                               21
<210>42
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>42
tctagaagaa acatcccagc gctac                                           25
<210>43<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>43
catatggagt gtttcctttc gttg                                            24
<210>44
<211>318
<212>DNA
<213>产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)CJHB100
<400>44
agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg     60
gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg    120
catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct    180
cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac    240
agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc    300
caacgaaagg aaacactc                                                  318
<210>45
<211>301
<212>DNA
<213>产氨棒状杆菌CJHB100
<400>45
caccgcgggc ttattccatt acatggaatg accaggaatg gcagggaatg cgacgaaatt     60
gactgtgtcg ggagcttctg atccgatgct gccaaccagg agagaaaata atgacatgtg    120
caggcacgct ggtgagctgg agatttatga tctcaagtac cttttttctt gcactcgagg    180
gggctgagtg ccagaatggt tgctgacacc aggttgaggt tggtacacac tcaccaatcc    240
tgccgtcgcg ggcgcctgcg tggaacataa accttgagtg aaacccaatc taggagatta    300
a                                                                    301
<210>46
<211>285
<212>DNA
<213>产氨棒状杆菌CJHB100
<400>46
aattccacca gacgttgttt agtaagtgcc cgaattctcg gttggtgcag ttgcttttcg     60
atgaatggga gaacctcgaa tacttccgcg tctctacttt ccggtacgtg ccacacagag    120
cagagcaatc ggtggaagag cacgacagat tagtagcgct tatcgaagcc caggcagaag    180
atttctacat cgaatcccaa gcccgcaacc accgcctgac aaccgcaacg acctaccgcc    240
aacgtttaaa ttccgaaaat catcacgaag aacaaggagt gcaca                    285
<210>47
<211>291
<212>DNA
<213>产氨棒状杆菌CJHB100
<400>47
gctgcctaca tctggacttc tgacctgaag cgctcccaca acttcgcgca aaacgttgaa     60
gccggcatgg tctggttgaa ctccaacaac gtccgtgacc tgcgcacccc attcggtggc    120
gtcaaggcat ccggtctggg gcatgagggc ggctaccgct ccattgactt ctacaccgac    180
caacaggccg tacacatcaa cttaggcgaa gtccacaacc cagtcttcgg caagcaaacc    240
aactaattct ccctcatcca cactcccctt ttaacctcac taggagtcat c             291
<210>48
<211>312
<212>DNA
<213>产氨棒状杆菌CJHB100
<400>48
actgggaggg taggggtcac gctgaattag caggtcacat cctgttgctt gagctggccg     60
ttaccctcct aggatccgag atgattcttg tagaggacta acgtccgcac aaatcttccg    120
cgggatgctc aaatcaccct tagctggttt gaaaaatccg tggcataaat ctaggatcgt    180
gtaactggca cgaaaagaaa gcgtcatcgg cgcttgggaa catcttttta agatattcct    240
caagtgccgt gacatctgtc aaccccgtgg ctgcgagagt cgtagtcaca atgaagtcca    300
ggaggacata ca                                                        312
<210>49
<211>249
<212>DNA
<213>产氨棒状杆菌CJHB100
<400>49
tcggacatat acggatttac ctgctgcaat cgcgccggcc cttgctcgaa attgcgtgaa     60
ttttagtctg attgtgttgg aatatccgca gaatgtgtgg gtttgctttt ataaatctgc    120
gcagtgtagg gaacctcggt actatcggca gtgtcggaga aacttcctcg atataaatct    180
ttgaagtaat tctcccaggc aatagctttt gacgtactcc gcttcccaac tttttaggag    240
acaactacc                                                            249
<210>50
<211>332
<212>DNA
<213>产氨棒状杆菌CJHB100
<400>50
ggcttcatcg tcgtctttga tccgatgcga gtccattaac ccaaactcct taaagcccgt     60
aaaacggggg tattccaaca cggttatcca cagtttaacc gttattcggg ggtaatccta    120
acccaaatca ttacggaaac tccaatctgg ctcacaatat cctccatgat tctagggaca    180
cccaatcagg tgcacccgct tcctgcgaca acgagtcaaa ctcggcaaag ccctcaacct    240
gtcggtctag aatatatata ccgcccggtc tagtgttgtg gtgtacacta acgataaacc    300
aacaaagttg tctattaaga ggaggccatt tc                                  332

Claims (15)

1.一种棒状杆菌(Corynebacteria)微生物，其与天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸二羧化酶各自的内源活性相比，显示出增加的酶活性。
2.根据权利要求1所述的棒状杆菌微生物，其与丙酮酸羧化酶的内源活性相比，进一步显示出增加的酶活性。
3.根据权利要求1所述的棒状杆菌微生物，其中所述增加的天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸二羧化酶的酶活性归因于棒状细菌的aspB基因、lysC基因、asd基因、dapA基因、dapB基因和lysA基因的表达增加。
4.根据权利要求2所述的棒状杆菌微生物，其中所述增加的丙酮酸羧化酶酶活性归因于棒状细菌pyc基因的表达增加。
5.根据权利要求3或4所述的棒状杆菌微生物，其中所述表达增加是由于引入了一个或多个拷贝的对应于所述微生物内源基因的外源等位基因。
6.根据权利要求5所述的棒状杆菌微生物，其中所述微生物是具有登录号KFCC10881的棒状细菌。
7.根据权利要求5所述的棒状杆菌微生物，其中所述aspB基因、所述lysC基因、所述asd基因、所述dapA基因、所述dapB基因、所述lysA基因和所述pyc基因分别具有SEQ ID NOS.25、26、27、28、29、30和37的核苷酸序列。
8.根据权利要求5所述的棒状杆菌微生物，其中所述引入通过将分别具有图2至6的切割图的载体转化入棒状细菌而进行。
9.根据权利要求5所述的棒状杆菌微生物，其中所述外源等位基因被固着在所述微生物的核DNA中。
10.根据权利要求5所述的棒状杆菌微生物，其中所述微生物是具有登录号KCCM 10770P的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)KFCC10881-CJ4。
11.根据权利要求3至10中任一项所述的棒状杆菌微生物，其中所述表达增加由于每一所述基因的外源启动子的引入所致。
12.根据权利要求11所述的棒状杆菌微生物，其中所述外源启动子具有SEQ ID NOS.44至50其中之一所示的核苷酸序列。
13.根据权利要求12所述的棒状杆菌微生物，其中所述外源启动子是SEQ ID NO.44的核苷酸序列。
14.根据权利要求11所述的棒状杆菌微生物，其中所述外源启动子通过将图8至13其中至少一种载体引入棒状细菌而引入。
15.一种生产L-赖氨酸的方法，其包括：
培养权利要求1至14任一项所述的微生物；和
从所述微生物的细胞或细胞培养物中回收赖氨酸。
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