KR101146080B1

KR101146080B1 - 글리세롤을 포함하는 탄소원을 이용할 수 있는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 발효산물을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101146080B1
Application number: KR1020080045950A
Authority: KR
Inventors: 주재영; 이근철; 김효진; 배현애; 장진숙
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2008-05-19
Filing date: 2008-05-19
Publication date: 2012-05-15
Also published as: KR20090120083A

Abstract

본 발명은 글리세롤을 일부 또는 단독으로 포함하는 탄소원으로부터 글리세롤을 이용할 수 있는, 글리세롤-3-인산 디하이드로게나아제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase), 글리세롤 키나아제(glycerol kinase) 및 글리세롤 유입 촉진자 단백질(glycerol uptake facilitator protein)의 활성이 보다 증가되어 있는 코리네박테리아 속 미생물을 이용하여 발효를 수행함으로써, 상업적으로 유용한 아미노산을 배지상에 축적하여 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.

코리네박테리움, 글리세롤, glpDFK 오페론, 발효

Description

글리세롤을 포함하는 탄소원을 이용할 수 있는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 발효산물을 생산하는 방법{A MICROORGANISM OF CORYNEBACTERIUM GENUS USING CARBON SOURCES CONTAINING GLYCEROL AND PROCESS FOR PRODUCING FERMENTATION PRODUCT USING THEM}

본 발명은 글리세롤(glycerol) 이용성이 없는 코리네박테리움 속 미생물에 글리세롤-3-인산 디하이드로게나아제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase), 글리세롤 키나아제(glycerol kinase) 및 글리세롤 유입 촉진자 (glycerol uptake facilitator)의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 유전자와 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 강력한 프로모터를 포함하는 글리세롤 이용 관련 오페론을 염색체 내에 도입함으로써, 글리세롤을 포함한 다양한 탄소원의 이용능을 향상시키고 발효산물의 생산을 높일 수 있는 방법에 관한 것이다.

최근 석유 등의 천연자원의 사용량 증가 등으로 인한 고유가 및 이의 사용으로 인한 공해 등의 문제를 해결하기 위하여, 자연계의 재생 가능한 물질을 이용한 대체 에너지 개발이 주목받고 있다. 이 중 가장 주목받는 것은 발효를 통해 얻어지는 바이오에탄올(bioethanol)과 식물유래 오일에서 얻어지는 바이오디젤 (biodiesel)이다. 바이오디젤은 주로 식물 유래의 오일을 기질로 하여 메탄올 (methanol)과 촉매를 이용한 에스테르 형성반응(esterification)을 통해 합성된 지방산 메틸에스테르 혹은 지방산 에틸에스테르를 일컫는다. 이 과정에서 필연적으로 전체 무게의 10% 정도의 비율로 글리세롤이 부산물로서 형성된다.

글리세롤은 C₃H₈O₃로 C₆H₁₂O₆인 글루코오스에 비하여 1단계 환원된 물질로 미생물의 대사 과정상에서 보다 향상된 정도로 환원력을 제공할 수 있다. 발효를 통하여 생산되는 많은 물질이 그 대사과정에서 환원력을 요구하는 경우가 많기 때문에 글리세롤을 기질로서 효과적으로 이용할 수 있다면, 수율 및 생산성에 있어 향상을 가져올 수 있다. 그러나, 이러한 특성에도 불구하고 현재까지 글리세롤을 이용하여 연구된 경우는 로이터린 (reuterin, 참조: Talarico et. al., Antimicrob. Agents Chemother., 32:1854-1858 (1988)), 2,3-부탄디올 (2,3-butanediol, 참조: Biebl, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 50:24-29 (1998)), 1,3-프로판디올 (1,3-propanediol, 참조: Menzel, et. al., Enzyme Microb. Technol., 20:82-86 (1997)), 숙신산 (대한민국 등록특허 제0313134호), 이타콘산 (Itaconic acid, 참조 미국 등록특허 제 5,457,040호), 3-히드록시프로판알데히드 (3-hydroxypropanaldehyde, 참조: Doleyres et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68(4):467-474 (2005)), 프로피온산(propionic acid, 참조: Himmi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 53:435-440 (2000))에 한정되어 있었다. 이러한 이유는 기존 발효 산업에서 효과적으로 이용되었던 탄소원에 비하여 글리세롤이 고가였기 때문이다. 오히려, 발효를 통해 글리세롤을 생산하는 연구가 진행되었다 (Wang et al., Biotechnol. Adv., 19(3):201-223 (2001)).

그러나, 바이오 디젤의 생산량이 늘어남으로써 글리세롤의 생산량이 늘고 따라서, 가격이 하락하고 있는 실정이다. 이러한 점에 근거하여 최근 글리세롤을 포함하는 바이오디젤의 부산물을 이용하여 1,3-프로판디올 (Gonzalez-Pajuelo et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31:442-446, (2004)) 및 수소 및 에탄올을 생산하는 경우 (Ito et al., J. Biosci. Bioeng., 100(3):260-265 (2005))가 보고되었으나, 대표적인 발효제품인 아미노산 및 주요한 대사 산물을 생산하는 경우에는 아직 그 예를 찾을 수 없다.

지금까지 글리세롤은 비누 제조업, 지방산 제조업, 왁스 및 계면활성제 생산 제조업 등에서 생산되었으나, 상기한 바와 같이 바이오디젤의 생산량이 급증함에 따라 부산물인 글리세롤의 생산도 늘어나며 글리세롤을 포함하고 있는 부산물을 효과적으로 처리하는 문제가 발생할 것이다. 또한, 정제된 글리세롤의 경우도 가격이 급락할 것으로 예상된다. 따라서, 글리세롤을 이용하여 효과적으로 발효에 의해 유용한 화학 물질을 생산할 수 있다면 많은 부속 효과를 가져 올 수 있다.

미생물의 글리세롤 이용은 대장균(Escherichia coli)과 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)에서 잘 알려져 있다. 대장균에 있어서, 세포 외부의 글리세롤은 에너지의 소모 없이 아쿠아글리세로포린(aquaglyceroporin)의 하나인 GlpF를 이용하여 세포 안으로 들어오게 된다(Heller et al., J. Bacteriol. 144:274-278, (1980)). 들어온 글리세롤은 글리세롤 키나아제(glycerol kinase, GlpK)에 의하여 글리세롤-3-인산으로 전환된 후, 글리세롤-3-인산 디히드로게나제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)에 의해 디히드록시아세톤인산(dihydroxyacetonephosphate, DHAP)로 전환되고, 트리오스 인산 이소머라제(Triosephosphate isomerase, TpiA)에 의하여 글리세르알데히드-3-인산(glyceraldehyde-3-phosphate, G-3-P)으로 전환되어 해당과정을 거쳐 대사되게 된다 (Lin EC, Annu. Rev. Microbiol. 30:535-578, (1976)). 글리세롤 키나아제의 활성이 없는 경우에 있어서는 글리세롤 디히드로게나제(glycerol dehydrogenase, Gdh)에 의하여 디히드록시아세톤(dihydroxyacetone, DHA)으로 전환된 후, 글리세롤 키나아제나 디히드록시아세톤 키나아제(dihydroxyacetone kianse, DHA kinase)에 의해 디히드록시아세톤 인산(dihydroxyacetone phosphate: DHAP)으로 전환된 후, 글리세르알데히드-3-인산(glyceraldehyde-3-phosphate: G-3-P)으로 전환되어 대사된다(Paulsen et al., Microbiology, 146:2343-2344, (2000)). 글리세롤의 대사과정은 다양한 형태로 조절을 받는다. 특히 글리세롤과 글루코스가 같이 존재하는 경우, 야생형의 대장균은 배타적으로 글루코스만을 이용한 후 글리세롤을 이용하는 이단계 적응(diauxic growth)을 하는 것으로 알려져 있다 (Lin, Annu. Rev. Microbiol. 30:535-578, (1976)).

코리네박테리움속에 속하는 미생물은 산업적으로 널리 이용되는 미생물이 많은데 그 중 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 라이신, 글루탐산나트륨과 같은 아미노산의 생산에 이용되며, 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes)는 핵산 등의 발효 생산에 산업적으로 널리 이용되 는 균주이다. 코리네박테리아의 경우 발효 탄소원으로서 포도당, 원당등 다양한 탄소원을 이용할 수 있음이 알려져 있으며, xylAB와 같은 유전자 도입을 통해 자일로스 (xylose) 이용성을 부여한 경우도 알려져 있다 (Kawaguchi et al., Appl. Envion. Microbiol. 72(5):3418-3428 (2006)).

코리네박테리움속에 속하는 미생물중 4종의 미생물에 대하여 전체 게놈 서열이 알려져 있다. 본 발명자들의 미공개 연구에 의하면 코리네박테리움 속에 속하는 미생물 중 유일하게 코리네박테리움 디프테리애(Corynebacterium diphtheriae)에 있어서만 완결된 글리세롤을 이용하는 유전자를 찾을 수 있었고, 다른 3종의 코리네박테리움인 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 에피시언스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 제이키움(Corynebacterium jeikeium) 등은 글리세롤 이용하는데 관여하는 글리세롤 유입 촉진자 단백질 등이 결핍되어 있음을 알 수 있었으며, 이러한 유전자의 결손이 코리네박테움 속 미생물이 글리세롤을 효과적으로 이용하는데 있어 장애임을 알 수 있었다.

그러나, 글리세롤 이용 유전자 고유의 프로모터를 외래의 보다 강력한 프로모터로 교체하여 염색체 내에 도입함으로써 글리세롤을 포함한 다양한 탄소원의 이용능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물에 대해서는 개시된 바 없다.

본 발명자들은 산업적으로 효용가치가 높은 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 암모니아게네스 등의 코리네박테리움 속 미생물의 글리세롤 이용 가능성에 대하여 집중적으로 연구를 수행하여, 코리네박테리아에 외래의 글리세롤 이용 유전자를 플라스미드 형태로 도입함으로써 글리세롤 이용성을 부여하였다(대한 민국 특허출원 10-2007-007513; 미공개).

그러나, 글리세롤 이용 유전자가 플라스미드 형태로 도입된 균주의 경우, 발효조 배양시 배양시간의 경과에 따라 플라스미드가 결손되어 글리세롤 이용능이 떨어지며, 발효의 확장(scale up)에 문제가 있음을 확인하였다. 이러한 플라스미드의 불안전성을 개선하고자 염색체 내에 글리세롤 이용 유전자를 도입하고, 고유의 프로모터를 외래의 강력한 프로모터로 교체함으로써 코리네박테리움 속 미생물의 글리세롤 이용성을 획기적으로 개선할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이에, 본 발명의 주요한 목적은 발효조 배양시 플라스미드의 불안정성을 개선하고자 글리세롤-3-인산 디하이드로게나아제, 글리세롤 키나아제 및 글리세롤 유입 촉진자 단백질을 암호화하는 유전자와 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 강력한 프로모터로 구성된 글리세롤 이용 관련 오페론을 염색체 내로 도입하여 글리세롤 자화성이 향상되어 있는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 글리세롤을 단독으로 혹은 다른 탄소원과 함께 효과적으로 이용하는 코리네박테리움 속 유래의 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물이 글리세롤을 일부 또는 단독으로 포함하는 탄소원을 이용함으로써 발효를 통해 유용한 물질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 코리네박테리움 속 미생물에서 글리세롤 자화성을 획기적으로 개선할 수 있도록 하는 글리세롤-3-인산 디하이드로게나아제, 글리세롤 키나아제 및 글리세롤 유입 촉진자 단백질을 암호화하는 유전자와 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 강력한 프로모터로 구성된 글리세롤 이용 관련 오페론을 제공한다.

본 발명은 또한 글리세롤을 단독으로 혹은 다른 탄소원과 함께 효과적으로 이용하는 코리네박테리움 속 유래의 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 미생물이 글리세롤을 일부 또는 단독으로 포함하는 탄소원을 이용함으로써 발효를 통해 유용한 물질을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 바이오 디젤의 부산물인 글리세롤을 이용하여 유용한 물질을 높은 효율로 효과적으로 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 글리세롤-3-인산 디하이드로게나아제, 글리세롤 키나아제 및 글리세롤 유입 촉진자 단백질을 암호화하는 유전자와 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 강력한 프로모터로 구성된 글리세롤 이용 관련 오페론을 염색체 내로 도입한 미생물을 통하여, 글리세롤 이용 유전자가 플라스미드 형태로 도입된 균주에서 배양 시간의 경과에 따라 플라스미드가 소실되어 글리세롤 이용능이 떨어지고 발효산물의 수율이 떨어지는 문제점을 개선하였다. 또한, 글리세롤이 포함된 복합 탄소원을 포함한 배지 및 글리세롤을 단독으로 포함한 배지에서 효과적으로 유용한 물질을 생산할 수 있기 때문에, 본 발명 의 미생물을 기반한 다른 유용물질을 생산하는 미생물은 효과적으로 글리세롤을 탄소원으로 이용하여 발효할 수 있다.

본 발명은 코리네박테리움 속 미생물에서 글리세롤 자화성을 획기적으로 개선할 수 있도록 하는 글리세롤-3-인산 디하이드로게나아제, 글리세롤 키나아제 및 글리세롤 유입 촉진자 단백질을 암호화하는 유전자와 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 강력한 프로모터로 구성된 글리세롤 이용 관련 오페론을 제공한다.

본 발명의 글리세롤 이용 관련 유전자는 미생물 외부의 글리세롤을 미생물 내부로 들어오도록 하고, 이를 인산화하여 글리세롤-3-인산으로 전환한 후, 이를 디하이드록시아세톤-3-인산으로 전환하여 최종적으로 해당과정의 중간 물질인 글리세르알데히드-3-인산으로 전환하여 대사할 수 있도록 하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로서, 코리네박테리움 속 미생물에서 작동하는 것이면 어느 것이라도 포함된다.

상기 글리세롤 이용 관련 유전자는 글리세롤 유입 촉진자 단백질(Glycerol uptake facilitator protein)을 코딩하는 유전자 (진뱅크 허가번호 NP_940539.1; 이하 glpF로 약칭한다), ATP를 이용하여 인산화함으로써 글리세롤-3-인산을 생산하는 효소인 글리세롤 키나아제 (glycerol kinase)를 코딩하는 유전자 (진뱅크 허가 번호 NP_940538.1; 이하 glpK로 약칭한다) 및 글리세롤-3-인산을 산화하여 디히드록시아세톤-3-인산을 생산하는 효소인 글리세롤-3-인산 디히드로게나아제 (glycerol-3-phosphodihydrogenase)를 코딩하는 유전자 (진뱅크 허가번호 NP_040540.1; 이하 glpD로 약칭한다)를 말한다. 각각의 유전자들은 게놈상에서 연속적으로 존재하였다.

상기 글리세롤 이용 관련 유전자의 예는 동물, 식물, 미생물에서 유래한 유전자를 포함한다. 보다 바람직한 예로서는 미생물에서 유래한 유전자가 포함되며, 보다 더 바람직한 상기 유전자의 예로서 코리네박테리움 디프테리애 NCTC13129(Corynebacterium diphtheriae NCTC13129, 진뱅크 허가번호 NC_002935)로부터 얻어지는 유전자가 포함되며, 그 유전자의 염기서열은 이미 명백하게 밝혀져 있다.

바람직하게는, 본 발명의 글리세롤 이용 관련 오페론은 상기 글리세롤 이용 관련 유전자 및 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 강력한 프로모터로 구성된 오페론(서열번호 12)이며, 상기 프로모터는 pcj7 프로모터인 것이 바람직하다.

상기 pcj7 프로모터는 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 강력한 프로모터로서 당사에서 개발하여 보유하고 있는 것으로(특허 등록번호 KR 10-0620092), 이를 이용하여 코리네박테리움 디프테리애 유래의 글리세롤 이용 관련 오페론인 glpDFK 오페론를 염색체상에서 발현시킬 경우, 고유 프로모터를 이용할 때보다 글리세롤 이용능이 향상된다.

본 발명은 또한 글리세롤을 단독으로 또는 다른 탄소원과 함께 효과적으로 이용하는 코리네박테리움 속 유래의 미생물을 제공한다.

본 발명자들은 플라스미드 형태로 글리세롤 이용 유전자가 도입된 균주에서의 발효조 배양시 플라스미드의 불안정성을 개선하고자, 글리세롤 이용 관련 유전 자 및 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 강력한 프로모터로 구성된 글리세롤 이용 관련 오페론을 염색체 내로 도입함으로써 코리네박테리움 속 미생물에서의 글리세롤 자화성이 향상됨을 알 수 있었다.

하나의 양태로서, 본 발명은 코리네박테리움 디프테리애 유래의 GlpF, GlpK 및 GlpD의 유전자와 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 프로모터로 구성된 글리세롤 이용 관련 오페론을 포함하는 미생물을 제공한다. 상기 유전자는 당업계에 통상적으로 알려진 방법을 통하여 코리네박테리움 속 미생물을 형질전환 할 수 있다.

본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며, 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.

본 명세서에 있어 '형질전환'이란 용어는 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입된 것이든 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 어느 것이든지 포함된다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트 (expression cassette) 의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부 위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 형질전환은 glpDFK 오페론를 포함하는 벡터로 숙주세포를 형질전환한 후, 형질전환된 숙주세포로부터 수득된 플라스미드를 전기펄스법으로 도입하여 수행된다.

본 발명에 있어 글리세롤을 이용하여 유용한 물질을 효과적으로 생산하기 위해 글리세롤 이용 관련 유전자로 형질전환된 미생물은 코리네박테리에과 (Corynebacteriaceae)에 포함되는 미생물을 들 수 있으며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 (Corynebacterium)속에 속하는 미생물이다. 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 (예. ATCC13032), 코리네박테리움 암모니아게네스 (예. ATCC 6872), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum) (예. ATCC13869), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum) (예. ATCC14067), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes) (예. FERM-BP1539), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens) (예. C. efficiens str. YS-314) 등으로 이루어지는 종의 군으로부터 선택되는 미생물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기의 종으로부터 아미노산이나 핵산과 같은 유용한 물질을 생산하는 미생물, 예를 들어 글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 SM5, 라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 CgGB3 이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

코리네박테리움 디프테리에 유래의 glpDFK 유전자의 고유 프로모터를 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 프로모터로 교체한 pCR-P_pcj7glpDFK 벡터로 클로닝하여 코리네박테리아 글루타미쿰 CgGB에 형질전환 하였으며, 제작된 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) CO03-0012(KCCM10895P)로 명명하였다.

본 발명은 또한 코리네박테리움 속 미생물이 글리세롤을 일부 또는 단독으로 포함하는 탄소원을 이용함으로써 발효를 통해 유용한 물질을 생산하는 방법을 제공한다.

보다 구체적으로는, 글리세롤을 이용 가능하게 하는 유전자 조합인 서열번호 12의 염기서열을 갖는 glpDFK 오페론을 포함하는 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 형질전환된 숙주세포로부터 얻어진 플라스미드를 코리네박테리아에 전기펄스법을 통하여 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환된 코리네박테리아를 탄소원으로서 글리세롤을 일부 또는 단독으로 포함하는 배양배지에 접종하여 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 발효산물을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 글리세롤을 이용하여 발효산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 유용 물질을 생산하는 방법에서, 상기 미생물의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방 법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들면, "Biochemical Engineering"( James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)에 개시되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 본 발명에서 사용되는 배지는 글리세롤을 탄소원으로서 일부 혹은 전부 포함한다. 그 외의 적정량의 탄소원은 다양하게 이용될 수 있다. 특히 바람직한 탄소원은 포도당이다. 사용될 수 있는 질소원의 예는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소, 또는 이산화탄소 가스를 주입한다. 배양물의 온도는 보 통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양 기간은 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1 : 코리네박테리아에서 작동할 수 있는 글리세롤 이용관련 유전자의 탐색 및 클로닝

코리네박테리움 글루타미쿰에는 글리세롤 이용하는데 관여하는 글리세롤 유입 촉진자 단백질 등이 결핍되어 있어서 글리세롤을 이용하지 못한다. 코리네박테리움 속에 속하는 미생물 중 유일하게 코리네박테리움 디프테리애 (Corynebacterium diphtheriae)에 있어서만 완결된 글리세롤을 이용하는 유전자를 찾을 수 있었다.

코리네박테리움 디프테리애의 글리세롤 이용 관련 유전자의 염기서열은 이미 명백하게 밝혀져 있으며 공개되어 있다. 미국 국립보건원 진뱅크 (NIH GeneBank)로부터 코리네박테리움 디프테리애의 글리세롤 이용 관련 단백질인 GlpF, GlpK, GlpD를 코딩하는 유전자(glpF, glpK 및 glpD) 및 주변 염기서열에 대한 정보를 획득하였다. 코리네박테리움 디프테리애의 glpF의 진뱅크 허가 번호는 NP_940539.1, glpK의 진뱅크 허가 번호는 NP_940538.1, glpD의 진뱅크 허가번호는 NP_040540.1이었다. 각각의 유전자들은 게놈상에서 연속적으로 존재하였으며, 이를 이용하여 각 각 한차례의 PCR법을 통하여 각각 3종의 유전자 전부를 단일 폴리뉴클레오티드로 증폭하였다. 코리네박테리움 디프테리애의 글리세롤 이용 관련 유전자의 PCR법을 통한 증폭에는 서열 번호 1과 2의 프라이머가 사용되었다.

서열 번호 1 : 5' GATGCGGCCGCGCTGTGTGGCGTATGTCG 3'

서열 번호 2 : 5' GATGCGGCCGCAATCATCAAACCCAACCCCA 3'

코리네박테리움 디프테리애의 글리세롤 이용 관련 유전자 증폭을 위하여 코리네박테리움 디프테리애 NCTC13129의 염색체를 생물자원센터(American Type Culture Collection; ATCC)로부터 구매하였다 (ATCC 인증번호 700971D-5). 코리네박테리움 디프테리애 NCTC13129의 염색체를 주형으로 하여 PCR법을 통해 글리세롤 이용 관련 유전자를 증폭하였다. PCR법의 조건은 94℃ 에서 3분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 4분 30초 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 4281 bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 얻어진 폴리뉴클레오티드를 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen 사)를 이용하여 pCR2.1에 클로닝하였다.

실시예 2 : 획득된 glpDFK 유전자의 염기서열 결정

얻어진 플라스미드를 제한효소인 NotI으로 잘라 글리세롤 이용 관련 유전자가 포함되어 있는 DNA 절편을 획득한 후, 이를 대장균-코리네박테리움 셔틀 벡터인 pECCG117로 클로닝하여 대장균 TOP10에 형질전환하였다. 통상의 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 pECCG117-cdi glpDFK를 획득하였다. pECCG117-cdi glpDFK 의 DNA 염기서열을 결정하였을 때, 기존의 게놈시퀀싱 결과와 다른 5개의 염기서열 변화가 있음을 확인하였다(염기서열 3). 각각의 염기서열의 변화는 54번째의 티민이 시티딘으로, 1598번째의 아데닌이 구아닌으로, 2608번째의 아데닌이 구아닌으로, 2829번째의 아데닌이 구아닌으로, 3037번째의 아데닌이 구아닌으로 변화한 것이다. 이중 2829번째의 염기서열의 변화만이 아미노산의 변이를 유발하였으며, 나머지 4개의 염기서열의 변이는 침묵 돌연 변이(silent mutation)로 판명되었다. 변형된 아미노산은 glpK 영역의 56번째 아스파라긴이 세린으로 변화한 것이었다.

본 발명자들은 변이된 아미노산을 원래의 아스파라긴으로 복원하는 실험을 통하여, 변이된 아미노산이 이미 알려진 코리네박테리움 디프테리애의 glpK와 동일한 단백질을 생산할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3 : 코리네박테리움 속 미생물의 글리세롤 이용 유전자를 염색체에 도입시키기 위한 벡터 제작

코리네박테리아 암모니아게네스 유래의 강력한 프로모터를 포함하는 글리세롤 이용 관련 오페론을 염색체 내에 도입하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 내의 내재적 유전자 사이에 코리네박테리아 암모니아게네스 유래의 강력한 프로모터를 포함하는 글리세롤 이용 관련 오페론을 도입하는 방법을 사용하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰과 코리네박테리움 디프테리애의 글리세롤 이용 관련 glpDFK 오페론은 상동성이 없기 때문에 상기 미생물 염색체 내로 도입하기 위 해서는 염색체내 임의의 내재적인 유전자가 필요하였다. 염색체내 내재적 유전자로서 아미노산 투과효소(amino acid permease)를 암호화하는 유전자인 NCgl0929는 본 발명자의 앞선 연구 결과에 의하면 NCgl0929 유전자가 불활성화 되거나 다른 유전자가 도입되더라도 상기 미생물의 생육이나 라이신 농도에는 영향을 주지 않았다.

상기 염색체내 내재적인 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터로 상기 미생물을 형질전환 시키고, 선별 마커 하에서 배양하는 경우 상기 유전자의 일부 서열과 상기 미생물 내의 내재적 유전자가 상동 재조합을 일으키게 된다. 상기 상동 재조합에 의하여 상기 미생물 내의 상기 내재적 유전자는 재조합되고, 재조합된 유전자 중에서 상기 마커를 포함하는 재조합체만이 선별 마커에 의하여 선별 되게 된다.

상기 방법에 의해 내재적 NCgl0929 유전자 사이에 코리네박테리움 디프테리애의 글리세롤 이용 관련 glpDFK 오페론을 도입한 미생물을 얻을 수 있었다.

본 실시예에서는 상기 NCgl0929 유전자 사이에 외래 글리세롤 이용 유전자인 코리네박테리움 디프테리애의 glpDFK 오페론을 도입하기 위하여 다음과 같은 과정으로 벡터를 제작하였다.

상기 NCgl0929 유전자에 항생제 마커가 포함된 벡터를 제작하기 위하여 서열번호 4와 5의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하고, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 NCgl0929 유전자 단편을 증폭하였다. PCR은 변성 96℃에서 30초, 어닐링 54℃에서 30초, 중합 72℃에서 30초를 30회 반복하였다. 증폭된 NCgl0929 유전자 단편을 TOPO 클로닝 키트(Invitrogen, 미국)를 이용하여 대장균 플라스미드 pCR2.1에 클로닝하여 pCR- 0929 플라스미드를 얻었다.

서열번호 4: 5' GAATTCGGTTGCCTTCTTC 3'

서열번호 5: 5' TGTCAAGAAAGCAGCTTG 3'

다음으로, 코리네박테리움 디프테리애의 glpDFK 오페론의 자가 프로모터를 강력한 프로모터로 교체하기 위하여 다음과 같은 과정으로 벡터를 제작하였다.

코리네박테리움 디프테리애의 glpDFK의 ORF 부위를 PCR 법을 통하여 증폭하였으며, HpaI의 제한 효소 부위를 포함한 서열 번호 6과 PstI의 제한효소 부위를 포함한 서열번호7의 프라이머가 사용되었다.

서열번호 6: 5' GTTAACGTGGCAACTATGACCACGA 3'

서열번호 7: 5' CTGCAGTGGATAGTTCGTCGGGTT 3'

증폭된 4064 bp의 폴리뉴클레오티드는 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen 사)를 이용하여 pCR2.1에 클로닝하였으며, 기존의 획득된 코리네박테리움 디프테리애의 gkpDFK와 염기서열이 동일함을 확인하였다(대한민국 특허출원 10-2007-007513(미공개); 서열번호 3).

다음은 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 pcj7 프로모터를 확보하기 위하여 서열번호 8과 KpnI의 제한효소 부위를 포함한 서열번호 9를 이용하여 PCR법을 통하여 교체를 위한 프로모터 부위를 증폭하였으며, 이 때 pfu DNA 중합효소를 이용하여 평활 말단을 가진 DNA를 확보하였다.

서열번호 8: 5' GTGTTTCCTTTCGTTGGGTACG 3'

서열번호 9: 5' AGGTACCCTTCCTTCCACGGAC 3'

제작된 pCR-glpDFK 플라스미드는 제한효소 HpaI과 PstI을 처리하여 glpDFK를 포함한 DNA 절편을 획득하였으며, pcj7 프로모터 부위는 KpnI을, pECCG117은 KpnI과 PstI을 처리하여 DNA 절편을 각각 획득하였다. 이 세가지 DNA 절편을 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 연결한 후 대장균 TOP10에 형질전환 하였으며, 통상의 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 획득된 플라스미드를 pECCG117-pcj7-(cdi)glpDFK로 명명하였다.

제작된 pECCG117-pcj7-(cdi)glpDFK 플라스미드는 SmaI과 NruI을 처리하여 pcj7-glpDFK를 포함한 DNA 절편을 획득하였으며, 대장균 플라스미드 pCR-0929에 클로닝하여 pCR-P_pcj7glpDFK-1플라스미드를 얻었다.

실시예 4 : 라이신 생산균주로의 글리세롤 이용유전자 염색체내 도입 균주제작

Appl. Microbiol. Biotechnol.(1999) 52:541-545에 개시된 형질전환법을 이용하여 실시예 1에서 제작한 pCR-0929-P_pcj7glpDFK 플라스미드를 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CgGB3에 전기 펄스법으로 형질전환하였다.

배양 2일째 획득한 형질전환주들로부터 글리세롤 이용 유전자 삽입 여부를 확인하기 위하여 PCR을 수행하였다. PCR은 형질전환주 염색체 DNA를 주형으로 서열 번호 10과 11의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하였고, pCR-0929-P_pcj7glpDFK 플라스미드를 포함하는 약500bp의 glpDFK 단편을 증폭하였다.

서열번호 10: 5' CAACAGCCTGCGCACCTC 3'

서열번호 11: 5' CGAAATAGGTCATGGGGCCTA 3'

그 결과 상동 재조합에 의한 교차(cross-over)에 의하여 pCR-0929-P_pcj7glpDFK 플라스미드가 염색체 DNA 상의 NCgl0929 유전자 중간부분에 삽입됨으로서 글리세롤 유전자가 염색체상에 도입되었음이 확인된 균주를 획득하였고, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 CO03-0012로 명명하였다.

이를 2007년 12월 6일자로 대한민국 서울 특별시 서대문구 홍제 1동 361-221번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) CO03-0012 (수탁번호 KCCM10895P)로 기탁하였다.

실시예 5 : 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 CO03 -0012 (KCCM10895P)의 글리세롤을 이용한 라이신 생산

하기의 종배지 25 mL을 함유하는 250 mL 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 CgGB3과 실시예 2에서 얻어진 코리네박테리움 글루타미쿰 CO03-0012(KCCM10895P) 균주를 배양하여 L-라이신을 생산하였다.

먼저 하기의 생산배지 24 mL 을 함유하는 250 mL 코너-바플 플라스크 1 mL의 종 배양액을 각각 접종하고, 30℃에서 72시간 동안 진탕배양 (200 rpm)하였다. 배양 종료 후 아미노산 분석기에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 코리네박테 리움 글루타미쿰 CgGB3과 CO03-0012(KCCM10895P) 에 대한 배양물 중의 L-라이신에 대한 결과는 아래 표 1 와 같다.

균주	글루코스:글리세롤 = (g/L)	잔여 글루코스	잔여 글리세롤	라이신 생산량	OD₅₆₂
(1)^*	90:00	0.0	0.0	9.5	130.0
(1)^*	70:20	0.0	20.0	5.0	118.0
(2)^*	90:00	0.0	0.0	11.0	130.8
(2)^*	70:20	0.0	0.0	11.0	140.4
(3)^*	90:00	0.0	0.0	11.6	129.0
(3)^*	70:20	0.0	8.8	9.6	120.0
(4)^*	90:00	0.0	0.0	12.0	130.2
(4)^*	70:20	0.0	0.0	12.4	141.0

(1)^* : CgGB3

(2)^*: CgGB3 with pECCG117 -cdi glpDFK (plasmid 상태)

(3)^* : CgGB3::pCR-0929-P_cdi-glpDFK(염색체 도입)

(4)^* : CgGB3:: pCR-0929-P_pcj7-glpDFK(염색체 도입)

상기 결과에서 보듯이 모균주[(1)^*결과]의 경우는 글리세롤을 전혀 이용하지 못하였으며, 플라스미드 상태로 도입한 경우[(2)^*결과]는 글리세롤을 이용하였지만, 발효조 배양시 배양시간의 경과에 따라서 플라스미드가 결손되어 글리세롤 이용능이 떨어지며 발효의 확장(scale up)에 문제가 있음을 확인하였다. 이러한 플라스미드의 불안정성을 개선하고자 코리네박테리움 디프테리애 자체 프로모터와 글리세롤 이용 유전자가 염색체 상에 도입되었을 경우[(3)^*결과], 글리세롤 이용성이 다소 떨어지는 결과가 나타났다. 그 이유는 플라스미드의 복제수(plasmid copy) 때문으로 사료된다. 이를 해결하고자 고유의 프로모터보다 강한 외래 프로모터인 pcj7로 교체한 글리세롤 이용 유전자를 염색체에 도입한 결과[(4)^*결과], 글리세롤 이용성이 향상되었고, 균주의 안정성 및 라이신 생산도 증가한 것을 확인하였다.

종배지 ( pH 7.0)

원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄ _?7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 μg, 티아민 HCl 1000 μg, 칼슘-판토텐산 2000 μg, 니코틴아마이드 2000 μg (공정수 1리터 기준)

생산배지 ( pH 7.0)

포도당 100 g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, 콩 단백질 (Soy protein) 2.5 g, 콘 스티프 솔리드(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄ 1g, MgSO₄ _?7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 μg, 티아민 염산염 1000 μg, 칼슘-판토텐산 2000 μg, 니코틴아마이드 3000 μg, CaCO₃ 30 g (공정수 1 리터 기준)

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

도1은 Ncgl0929 유전자 사이에 코리네박테리움 디프테리애의 glpDFK 오페론의 자가 프로모터를 강력한 프로모터로 교체하여 클로닝된 pCR-0929-P_pcj7glpDFK 벡터를 나타낸 도면이다.

<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> A microorganism of corynebacterium genus using carbon sources containing glycerol and process for producing fermentation product using them <130> PA07-0366 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of glpDFK <400> 1 gatgcggccg cgctgtgtgg cgtatgtcg 29 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of glpDFK <400> 2 gatgcggccg caatcatcaa acccaacccc a 31 <210> 3 <211> 4261 <212> DNA <213> Corynebacterium diphtheriae <400> 3 gctgtgtggc gtatgtcgcg cagcccgttt tttgccgcca ccaccactgg ttacatcacc 60 tgctaccagt tgttatcatc tccgaaacta aaaaacttgc tctaggggtc tagtctgcct 120 aacttacggt tcagtagggt tggggcaaac ctcggacgca aagaaggagt gtggcaacta 180 tgaccacgaa atcccattgc acattcaacc ccgactacta ccaggacgtc tggcagcgct 240 tcggtgaaga agaatacgac gttgtcgtca tcggtggcgg ctccgtcggc gcaggcgcag 300 gcctcgacgc agccatccgc ggcctcaaag tggccgtcgt agagtcccga gacttcgcag 360 ccggcacctc ctcacgatca tcaaaaatgt tccacggtgg cctgcgatat ctcgccatgc 420 tggacttcaa gctagtggcc gaatccctcc acgagcgcga actcaacatg tcgacgctcg 480 caccgcacct agtcaagccg ctgaaattcc tcttccccct cacacaccac gtgtgggaac 540 gggtgatgat gttcggcggc tttactcttt acgacctcat gggcggcgca aaatcagtcc 600 ccatgcaaaa gcactactcc cgcaagggaa cactcgccat ggccccagga ctaaaagacg 660 acgctgtggt cggatccgtc cgctactttg acacgcttgt cgacgacgcc cgccacacca 720 tgacagtcct acgcaccgcc ggcgaactcg gcgcagatgt tcgcccctcc acccaagtag 780 tcggctttga aaaagacggc caacgcgtgg tcggcgccat cctccaagac accgacaccg 840 gcgaacaaac caccatccgc ggcaaggtat tcatcaacgc caccggcgta tggaacgacc 900 acattgaaaa gctcgccggc ggcaacggcc ccttctcggt ccacgcctcc aagggcgtac 960 acatcgtggt accaaagaac gtctttgatg ccgacgcagc catgtgcttt gtcaccgaaa 1020 agtccgtgct cttcgtgatc ccatggggtg aatactggat catcggcacc accgacaccg 1080 actgggatct caaccgcgca gaccccgcac caactgccgc cgacatcaac tacatcctcg 1140 acgaagtcaa ccagcgagtc cgccggccca tccaacactc cgacatcgtc ggcgtgtact 1200 ccggactccg cccgctgctc tccggcaaat ccgacaccac caccaagctg tcgcgcaacc 1260 acgccgtagc aaaggtcatg cctggactcg tctccgtcgc cggcggtaag tacaccacct 1320 accgtgtgat cggcaaggat gcagtcgacc tcgccaccga agacttggac ttccgcgtac 1380 cagcctccga atcggaacgc accccgatcc tcggtgccga cggctaccac gccctacaaa 1440 accaagcacc acgcatcgcc cgcaccttcg gcaccacaga ggacgtcgtc gagcacctgc 1500 tcggccgcta cggctccctc gtccatgagg tcctagaacc gagcgtcgat aaacctgagc 1560 tgctcgaacc catcccaggc gcgccgggct acattaaggc agaggccgtc tatgccgtca 1620 cccacgaggg tgccctgcac gtcgaggaca tcgtggaacg tcgcctacgt gccggcatcg 1680 aatacgccga ccgtggcgtt gccgcagctc ccgccatcgc cgagctcgtt gccgactacc 1740 ttggctggga cgccgagcgc accgccgccg aggtcaccgc gttcaccgac cgcgtgtccg 1800 ccgaaatcgc cgccgagaag gagctcactg acaaagccgc caacgagcac atcgtggcag 1860 gctccgcggt gcgcagctat gtggatgtgt caggtgataa ctaatgaccg ccctacaagc 1920 attcggctgg gagtttttgg gcacagccct cctgcttctc ctcggtaacg gcgtttgcgc 1980 cgtcaacagc ctgcgcacct ccgcaggcaa aggcactggc tgggtgctta tcgctttcgg 2040 ctggggcatg gcggtattcg tcggtgcctc agtggcaagc cccagcggcg gccacctcaa 2100 cccagcggtc actatcgcgc tggcgatcaa aggcagcaca ccatggaacc tggtaggcgg 2160 ctatgttctc gggcagttcc tcggagccat gtttggtgca atcctgtgct ggctgacatt 2220 caagcagctt ttcgacgcca acaacaccga cgaaaacgga aacgtcacgg gagctaaccg 2280 caccaccggc ggtatcttct tcaccggccc cgcccacaat cagaacgggt ggaacatggt 2340 caccgagttc atcggcacct gcgtactgct gctgttcatc ttcttcggcc ccaccggcgg 2400 cgacctaggc cccatgacct atttcgcagt cgcctttgtg atcgttgcca taggcttgtc 2460 gctaggcaca ccgaccggct acgccatcaa ccctgtgcgt gacctcggcc cccgcctgat 2520 gtacgccttc gtgctgccca ttaaagacaa aggatccgcg aactggggct atgcctgggt 2580 tccgatcgtc ggccccatga tcgccgcggt cttctgcgga gtgctggcca ctgtagtgct 2640 gtagtgaaag ggaaccacac caatgaatca accacagtat gttgctgcga ttgaccaagg 2700 aacgacgtcg acacgctgca tcattttcga ccacaacggc caacaagtag gcgttggcca 2760 gtacgaacac gaacaaatct tcccccaaaa aggctgggta gagcacaacc caatggaaat 2820 ctgggccagc acgcgccaag ccgttgggac agcactcgcc gaaagcgacg tctcccgtga 2880 agacatcgta gccgtaggca taacaaacca gcgtgaaacc acggtggtct ggaacaaaac 2940 tactggtgaa cccatatata acgccattgt gtggcaggac acccgcacta actccatctg 3000 ctcggagtta gcccaaggcg accctgcccg gtggcagaaa cgtaccggtt tgctcatcaa 3060 ctcatacccc gcgggccccc gactcaagtg gatattggac aacgtcgagg gtgcccgcga 3120 actagcagag aacggcgatt tgctcttcgg aaccattgat acgtggttgc tgtggaacct 3180 gaccggcggt gccgagggtg acaacggcca gcctgccgtt cacgctaccg acgtaaccaa 3240 tgcctcccgc accctactca tggatctgga atccctgcaa tgggatgagg aactatgtgc 3300 cgcgttggat attccaatgc aggtgttgcc agagattcgt ccttcagttg gtaacttcgg 3360 ccaagtacgt gcacgtggat cactagctgg tgttccgatc cgcgccatcc tcggtgacca 3420 gcaagccgca atgttcggac aggcatgctt ccggccaggt gatgccaaat gtacatacgg 3480 cacggggttg ttccttctgg agaacacagg caaaaccccg aagcattccg aaaacggttt 3540 gctcaccacc gtgtgtttcc agctcgaagg cgaaaaaccg gtctatgccc tcgaaggatc 3600 cgttgccatg gggggctcgc tcgtccaatg gctacgcgac aaccttcaaa tcatcccgaa 3660 ctcgcccgcc attgaaaacc tcgcacgcga agtacccgac aacggtggcg tgtacatcgt 3720 ccccgcattc tccggactat tcgcaccacg ctggcgcccc gacgcccgcg gggtcatcgt 3780 gggcctgacc cgctttgcca accgcaagca cctcgcccgc gcagtactcg aggccaccgc 3840 ctaccaagtg cgcgaagtga tcgatgccat ggtcgcggat tccggagtag aactcaccga 3900 aatgcgtgtc gacggcggca tggtcatgaa cgaactgctc atgcaattcc aagccgacgt 3960 cctacgatcc gacgtcacgc gccccaagaa catcgagacc acagccaccg gcgtagccta 4020 cgcagccggc ctcggcgtgg gctactggga cagcctcgac gtactccgca acatgaacga 4080 agtggacaaa acctggcacg ccaagatgga cgccgacaag atcgacgagc tccttgccga 4140 atggaacaaa gcagtcgaac gcacctacaa ctgggaaaac taactgcctc ctgaaataac 4200 agcaaacccg acgaactatc cagctcgtcg ggtttgtttt gtggggttgg gtttgatgat 4260 t 4261 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of NCgl0929 <400> 4 gaattcggtt gccttcttc 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of NCgl0929 <400> 5 tgtcaagaaa gcagcttg 18 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of glpDFK ORF <400> 6 gttaacgtgg caactatgac cacga 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of glpDFK ORF <400> 7 ctgcagtgga tagttcgtcg ggtt 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of CJ7 promoter <400> 8 agtgtttcct ttcgttgggt acg 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of CJ7 promoter <400> 9 taggtaccct tccttccacg gac 23 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for confirmation of glpDFK <400> 10 tcaacagcct gcgcacctc 19 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for confirmation of glpDFK <400> 11 gcgaaatagg tcatggggcc ta 22 <210> 12 <211> 4270 <212> DNA <213> corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium diphteriae <400> 12 gtgcctaaaa ccgcatgcgg cttaggctcc aagataggtt ctgcgcggcc gggtaatgca 60 tcttctttag caacaagttg aggggtaggt gcaaataaga acgacataga aatcgtctcc 120 tttctgtttt taatcaacat acaccaccac ctaaaaattc cccgaccagc aagttcacag 180 tattcgggca caatatcgtt gccaaaatat tgtttcggaa tatcatggga tacgtaccca 240 acgaaaggaa acactaacgt ggcaactatg accacgaaat cccattgcac attcaacccc 300 gactactacc aggacgtctg gcagcgcttc ggtgaagaag aatacgacgt tgtcgtcatc 360 ggtggcggct ccgtcggcgc aggcgcaggc ctcgacgcag ccatccgcgg cctcaaagtg 420 gccgtcgtag agtcccgaga cttcgcagcc ggcacctcct cacgatcatc aaaaatgttc 480 cacggtggcc tgcgatatct cgccatgctg gacttcaagc tagtggccga atccctccac 540 gagcgcgaac tcaacatgtc gacgctcgca ccgcacctag tcaagccgct gaaattcctc 600 ttccccctca cacaccacgt gtgggaacgg gtgatgatgt tcggcggctt tactctttac 660 gacctcatgg gcggcgcaaa atcagtcccc atgcaaaagc actactcccg caagggaaca 720 ctcgccatgg ccccaggact aaaagacgac gctgtggtcg gatccgtccg ctactttgac 780 acgcttgtcg acgacgcccg ccacaccatg acagtcctac gcaccgccgg cgaactcggc 840 gcagatgttc gcccctccac ccaagtagtc ggctttgaaa aagacggcca acgcgtggtc 900 ggcgccatcc tccaagacac cgacaccggc gaacaaacca ccatccgcgg caaggtattc 960 atcaacgcca ccggcgtatg gaacgaccac attgaaaagc tcgccggcgg caacggcccc 1020 ttctcggtcc acgcctccaa gggcgtacac atcgtggtac caaagaacgt ctttgatgcc 1080 gacgcagcca tgtgctttgt caccgaaaag tccgtgctct tcgtgatccc atggggtgaa 1140 tactggatca tcggcaccac cgacaccgac tgggatctca accgcgcaga ccccgcacca 1200 actgccgccg acatcaacta catcctcgac gaagtcaacc agcgagtccg ccggcccatc 1260 caacactccg acatcgtcgg cgtgtactcc ggactccgcc cgctgctctc cggcaaatcc 1320 gacaccacca ccaagctgtc gcgcaaccac gccgtagcaa aggtcatgcc tggactcgtc 1380 tccgtcgccg gcggtaagta caccacctac cgtgtgatcg gcaaggatgc agtcgacctc 1440 gccaccgaag acttggactt ccgcgtacca gcctccgaat cggaacgcac cccgatcctc 1500 ggtgccgacg gctaccacgc cctacaaaac caagcaccac gcatcgcccg caccttcggc 1560 accacagagg acgtcgtcga gcacctgctc ggccgctacg gctccctcgt ccatgaggtc 1620 ctagaaccga gcgtcgataa acctgagctg ctcgaaccca tcccaggcgc gccgggctac 1680 attaaggcag aggccgtcta tgccgtcacc cacgagggtg ccctgcacgt cgaggacatc 1740 gtggaacgtc gcctacgtgc cggcatcgaa tacgccgacc gtggcgttgc cgcagctccc 1800 gccatcgccg agctcgttgc cgactacctt ggctgggacg ccgagcgcac cgccgccgag 1860 gtcaccgcgt tcaccgaccg cgtgtccgcc gaaatcgccg ccgagaagga gctcactgac 1920 aaagccgcca acgagcacat cgtggcaggc tccgcggtgc gcagctatgt ggatgtgtca 1980 ggtgataact aatgaccgcc ctacaagcat tcggctggga gtttttgggc acagccctcc 2040 tgcttctcct cggtaacggc gtttgcgccg tcaacagcct gcgcacctcc gcaggcaaag 2100 gcactggctg ggtgcttatc gctttcggct ggggcatggc ggtattcgtc ggtgcctcag 2160 tggcaagccc cagcggcggc cacctcaacc cagcggtcac tatcgcgctg gcgatcaaag 2220 gcagcacacc atggaacctg gtaggcggct atgttctcgg gcagttcctc ggagccatgt 2280 ttggtgcaat cctgtgctgg ctgacattca agcagctttt cgacgccaac aacaccgacg 2340 aaaacggaaa cgtcacggga gctaaccgca ccaccggcgg tatcttcttc accggccccg 2400 cccacaatca gaacgggtgg aacatggtca ccgagttcat cggcacctgc gtactgctgc 2460 tgttcatctt cttcggcccc accggcggcg acctaggccc catgacctat ttcgcagtcg 2520 cctttgtgat cgttgccata ggcttgtcgc taggcacacc gaccggctac gccatcaacc 2580 ctgtgcgtga cctcggcccc cgcctgatgt acgccttcgt gctgcccatt aaagacaaag 2640 gatccgcgaa ctggggctat gcctgggttc cgatcgtcgg ccccatgatc gccgcggtct 2700 tctgcggagt gctggccact gtagtgctgt agtgaaaggg aaccacacca atgaatcaac 2760 cacagtatgt tgctgcgatt gaccaaggaa cgacgtcgac acgctgcatc attttcgacc 2820 acaacggcca acaagtaggc gttggccagt acgaacacga acaaatcttc ccccaaaaag 2880 gctgggtaga gcacaaccca atggaaatct gggccagcac gcgccaagcc gttgggacag 2940 cactcgccga aagcgacgtc tcccgtgaag acatcgtagc cgtaggcata acaaaccagc 3000 gtgaaaccac ggtggtctgg aacaaaacta ctggtgaacc catatataac gccattgtgt 3060 ggcaggacac ccgcactaac tccatctgct cggagttagc ccaaggcgac cctgcccggt 3120 ggcagaaacg taccggtttg ctcatcaact cataccccgc gggcccccga ctcaagtgga 3180 tattggacaa cgtcgagggt gcccgcgaac tagcagagaa cggcgatttg ctcttcggaa 3240 ccattgatac gtggttgctg tggaacctga ccggcggtgc cgagggtgac aacggccagc 3300 ctgccgttca cgctaccgac gtaaccaatg cctcccgcac cctactcatg gatctggaat 3360 ccctgcaatg ggatgaggaa ctatgtgccg cgttggatat tccaatgcag gtgttgccag 3420 agattcgtcc ttcagttggt aacttcggcc aagtacgtgc acgtggatca ctagctggtg 3480 ttccgatccg cgccatcctc ggtgaccagc aagccgcaat gttcggacag gcatgcttcc 3540 ggccaggtga tgccaaatgt acatacggca cggggttgtt ccttctggag aacacaggca 3600 aaaccccgaa gcattccgaa aacggtttgc tcaccaccgt gtgtttccag ctcgaaggcg 3660 aaaaaccggt ctatgccctc gaaggatccg ttgccatggg gggctcgctc gtccaatggc 3720 tacgcgacaa ccttcaaatc atcccgaact cgcccgccat tgaaaacctc gcacgcgaag 3780 tacccgacaa cggtggcgtg tacatcgtcc ccgcattctc cggactattc gcaccacgct 3840 ggcgccccga cgcccgcggg gtcatcgtgg gcctgacccg ctttgccaac cgcaagcacc 3900 tcgcccgcgc agtactcgag gccaccgcct accaagtgcg cgaagtgatc gatgccatgg 3960 tcgcggattc cggagtagaa ctcaccgaaa tgcgtgtcga cggcggcatg gtcatgaacg 4020 aactgctcat gcaattccaa gccgacgtcc tacgatccga cgtcacgcgc cccaagaaca 4080 tcgagaccac agccaccggc gtagcctacg cagccggcct cggcgtgggc tactgggaca 4140 gcctcgacgt actccgcaac atgaacgaag tggacaaaac ctggcacgcc aagatggacg 4200 ccgacaagat cgacgagctc cttgccgaat ggaacaaagc agtcgaacgc acctacaact 4260 gggaaaacta 4270

Claims

글리세롤-3-인산 디하이드로게나아제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase), 글리세롤 키나아제(glycerol kinase) 및 글리세롤 유입 촉진자 단백질(glycerol uptake facilitator protein)을 암호화하는 유전자인 glpDFK 유전자와 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 프로모터로 구성되며 서열번호 12의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 글리세롤 이용 관련 glpDFK 오페론.
삭제
제1항에 있어서,

상기 프로모터는 프로모터 pcj7(특허 등록번호 KR0620092)인 것을 특징으로 하는 glpDFK 오페론.
도 1에 도시된 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 벡터.
상기 제4항의 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
제 5항에 있어서,

상기 코리네박테리움속 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰(corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 글루타미쿰 CgGB3로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
제 5항에 있어서,

상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 CO03-0012(KCCM 10865P)인 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
상기 제4항의 벡터로 코리네박테리움 속 미생물을 형질전환시키는 단계;

상기 형질전환된 코리네박테리움 속 미생물을 탄소원으로서 글리세롤을 일부 또는 단독으로 포함하는 배양배지에 접종하여 배양하는 단계; 및

상기 배양물로부터 아미노산을 분리하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 글리세롤을 이용하여 아미노산을 생산하는 방법.
제 8항에 있어서,

상기 코리네박테리움 속 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 CgGB3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 글리세롤을 이용하여 아미노산을 생산하는 방법.
제 8항에 있어서,

상기 코리네박테리움 속 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) CO03-0012 (KCCM10895P) 인 것을 특징으로 하는, 글리세롤을 이용하여 아미노산을 생산하는 방법.
제 8항에 있어서,

상기 아미노산이 라이신인 것을 특징으로 하는, 글리세롤을 이용하여 아미노산을 생산하는 방법.