KR100885616B1 - 글리세롤을 이용한 아미노산의 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 탄소원으로서 글리세롤 동시 이용성을 갖는 아미노산 생산용 미생물, 상기 미생물을 제조하는 방법 및 상기 미생물을 이용하여 아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하여 바이오 디젤 등의 부산물로 생산되는 글리세롤을 이용하여 아미노산을 높은 효율로 생산함으로써 기존에 사용되는 포도당 등의 발효원료를 보다 값싼 원료로 대체할 수 있다.
글리세롤, 미생물, 발효

Description

글리세롤을 이용한 아미노산의 생산 방법{Method for producing amino acids using glycerol}
본 발명은 탄소원으로서 글리세롤 동시 이용성을 갖는 아미노산 생산용 미생물, 상기 미생물을 제조하는 방법 및 상기 미생물을 이용하여 아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
최근 석유 등의 천연자원의 사용량 증가 등으로 인한 고유가 및 이의 사용으로 인한 공해 등의 문제를 해결하기 위하여, 자연계의 재생물질을 이용한 대체 에너지 개발이 주목받고 있다. 이중 가장 주목 받는 것은 발효를 통해 얻어지는 에탄올(Bioethanol)과 식물유래 오일에서 얻어지는 바이오디젤(BioDiesel)이다.
바이오디젤은 주로 식물 유래의 오일을 기질로 하여 메탄올(methanol)과 촉매를 이용한 에스테르 형성반응(esterification)을 통해 합성된 지방산 메틸에스테르 혹은 지방산 에틸에스테르를 일컫는다. 이 과정에서 필연적으로 전체 무게의 10% 정도의 비율로 글리세롤이 부산물로서 형성된다.
글리세롤은 C3H8O3로 C6H12O6인 글루코오스에 비하여 1단계 환원된 물질로 미생물의 대사 과정상에서 보다 향상된 정도로 환원력을 제공할 수 있다. 발효를 통하여 생산되는 많은 물질이 그 대사과정에서 환원력을 요구하는 경우가 많기 때문에 글리세롤을 기질로서 효과적으로 이용할 수 있다면, 수율 및 생산성에 있어 향상을 가져올 수 있다. 그러나, 이러한 특성에도 불구하고 현재까지 글리세롤을 이용하여 연구된 경우는 로이터린 (reuterin, 참조: Talarico et. al., Antimicrob. Agents Chemother., 32:1854-1858 (1988)), 2,3-부탄디올 (2,3-butanediol, 참조: Biebl, et al., Appl Microbiol. Biotechnol. 50:24-29 (1998)), 1,3-프로판디올 (1,3-propanediol, 참조: Menzel, et. al., Enzyme Microb. Technol., 20:82-86 (1997)), 숙신산 (대한민국 등록특허 제0313134호), 이타콘산 (Itaconic acid, 참조 미국등록특허 제5,457,040호), 3-히드록시프로판알데히드 (3-hydroxypropanaldehyde, 참조: Doleyres et al. Appl. Micribiol. Biotechnol. 68(4):467-474 (2005)), 프로피온산(propionic acid, 참조: Himmi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 53: 435-440 (2000))에 한정되어 있었다. 이러한 이유는 기존 발효 산업에서 효과적으로 이용되었던 탄소원에 비하여 글리세롤이 고가였기 때문이다. 오히려, 발효를 통해 글리세롤을 생산하는 연구가 진행되었다(Wang et al., Biotechnol. Adv., 19(3): 201-223 (2001)). 그러나, 바이오 디젤의 생산량이 늘어남으로써 글리세롤의 생산량이 늘고 따라서, 가격이 급격히 하락하고 있는 실정이다. 이러한 점에 근거하여 최근 글리세롤을 포함하는 바이오디젤의 부산물 을 이용하여 1,3-프로판디올 (Gonzalez-Pajuelo et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31: 442-446, (2004)) 및 수소 및 에탄올을 생산하는 경우(Ito et al., J. Biosci. Bioeng., 100(3): 260-265 (2005))가 보고되었으나, 대표적인 발효제품인 아미노산 및 주요한 대사 산물의 경우에는 아직 그 예를 찾을 수 없다.
지금까지 글리세롤은 비누 제조업, 지방산 제조업, 왁스 및 계면활성제 생산 제조업 등에서 생산되었으나, 상기한 바와 같이 바이오디젤의 생산량이 급증함에 따라 부산물인 글리세롤의 생산도 늘어나며 글리세롤을 포함하고 있는 부산물을 효과적으로 처리하는 문제가 발생할 것이다. 또한, 정제된 글리세롤의 경우도 가격이 급락할 것으로 예상된다. 따라서, 글리세롤을 이용하여 효과적으로 발효에 의해 유용한 화학 물질을 생산할 수 있다면 많은 부속 효과를 가져 올 수 있다.
미생물의 글리세롤 이용은 대장균 (Escherichia coli)과 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)에서 잘 알려져 있다. 대장균에 있어, 세포 외부의 글리세롤은 에너지의 소모 없이 아쿠아글리세로포린(aquaglyceroporin)의 하나인 GlpF를 이용하여 세포 안으로 들어오게 된다 (Heller et al., J. Bacteriol. 144:274-278, (1980)). 들어온 글리세롤은 글리세롤 키나아제 (glycerol kinase, GlpK)에 의하여 글리세롤-3-인산으로 전환된 후, 글리세롤-3-인산 디히드로게나제 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)에 의해 디히드록시아세톤인산 (dihydroxyacetonephosphate, DHAP)로 전환되고 트리오스 인산 이소머라제 (Triosephosphate isomerase, TpiA)에 의하여 글리세르알데히드-3-인산(glyceraldehyde-3-phosphate, G-3-P)으로 전환되어 해당과정을 거쳐 대사되게 된다 (Lin EC, Annu. Rev. Microbiol. 30:535-578, (1976)). 글리세롤 키나아제의 활성이 없는 경우에 있어서는 글리세롤 디히드로게나제(glycerol dehydrogenase, Gdh)에 의하여 디히드록시아세톤(dihydroxyacetone, DHA)으로 전환된 후, 글리세롤 키나아제나 디히드록시아세톤 키나아제(dihydroxyacetone kianse, DHA kinase)에 의해 디히드록시아세톤 포스페이트(dihydroxyacetone phosphate: DHAP)로 전환된 후, 글리세르알데히드-3-인산(glyceraldehyde-3-phosphate: G-3-P)로 전환되어 대사된다(Paulsen et al., Microbiology, 146: 2343-2344, (2000)). 글리세롤의 대사과정은 다양한 형태로 조절을 받는다. 특히 글리세롤과 글루코스가 같이 존재하는 경우, 야생형의 대장균은 배타적으로 글루코스만을 이용한 후 글리세롤을 이용하는 이단계 적응(diauxic growth)을 하는 것으로 알려져 있다(Lin, Annu. Rev. Microbiol. 30:535-578, (1976)).
상기 언급한 바와 같이 바이오디젤의 부산물로서 얻어지는 글리세롤을 탄소원으로서 효과적으로 이용할 경우, 상당한 부가가치를 얻을 수 있다. 또한 글리세롤과 글루코스를 탄소원으로 동시에 가용할 수 있는 경우 야생형의 대장균은 배타적으로 글루코스만을 이용하고, 글루코스가 모두 이용된 후 글리세롤을 이용하는 이단계 적응(diauxic growth) 현상을 보이게 되어, 글리세롤을 포함하는 복합 탄소원이 공급될 때 발효 효율이 감소하게 된다. 본 발명자들은 이러한 사실에 근거하여, 미생물의 글리세롤 이용 가능성에 대하여 집중적으로 연구를 수행한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 고효율 및 저비용으로 아미노산을 생산하기 위하여 탄소원으로서 글리세롤 동시 이용성을 갖는 아미노산 생산용 미생물을 이용하여 글리세롤이 포함된 배지를 통해 아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 탄소원으로서 글리세롤 동시 이용성을 갖는 아미노산 생산용 미생물 및 그 미생물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 탄소원으로서 글리세롤 동시 이용성을 갖는 아미노산 생산용 미생물을 글리세롤이 포함된 배양 배지에 접종하여 배양하는 단계; 및 상기 단계로부터 생산된 배양물에서 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 글리세롤을 이용한 아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 "탄소원으로서 글리세롤 동시 이용성을 갖는 아미노산 생산용 미생물"은 글리세롤을 제외한 탄소원을 이용하여 아미노산을 생산하면서 동시에 탄소원으로서 글리세롤을 이용하여 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 말한다. 상기 글리세롤을 제외한 탄소원은 본원 분야에서 널리 알려진 탄소원으로서, 예를 들면 자당, 과당, 유당, 글루코스, 말토즈, 전분, 셀룰로오즈 등의 탄수화물; 대두유, 해바라기유, 파마자유, 코코넛유 등의 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산 등의 지방산 등이 있으며, 보다 바람직한 탄소원은 글루코스, 과당, 유당이며, 보다 더 바람직한 탄소원은 글루코스이다. 본 발명의 미생물은 상기 탄소원을 이용하면서 동시에 글리세롤을 탄소원으로서 이용하여 아미노산을 생산할 수 있어 상기 탄소원 이용한 후에 글리세롤을 이용하는 미생물에 비하여 최종 생산되는 아미노산의 생산 효율이 높다. 구체적인 예로, 글루코스와 글리세롤을 탄소원으로서 동시에 제공하는 경우 야생형의 대장균은 배타적으로 글루코스만을 이용하고 글루코스가 모두 이용된 후 글리세롤을 이용하는 이단계 적응(diauxic) 현상을 나타내므로, 글리세롤을 포함하는 복합 탄소원이 공급될 때 발효 효율이 감소한다. 이에 반하여, 탄소원으로서 글리세롤 동시 이용성을 갖는 아미노산 생산용 미생물은 상기 야생형 균주와 달리 글리세롤 또는 글루코스만 단독으로 있는 경우보다 글루코스 및 글리세롤이 동시에 존재하는 경우 이들 모두를 동시에 이용함으로써 발효 효율이 증가하여 최종 생산되는 아미노산의 생산량이 보다 많다.
본 발명의 상기 미생물은 바람직하게는 미생물의 염색체 상에 galR 유전자 및/또는 glpR 유전자를 포함하고 있으며, 이들 유전자 중의 어느 하나 또는 모두가 불활성화되어 있을 수 있다. galR 유전자의 발현에 의하여 생성된 GalR 단백질은 갈락토즈 및 포도당을 포함한 여러 종의 당을 세포 내부로 수송하는 퍼미아제(permease)인 GalP 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다(MARK GEANACOPOULOS AND SANKAR ADHYA, Journal of Bacteriology, Jan. 1997, p.228-234, Vol. 179, No. 1). glpR 유전자의 발현에 의하여 생성된 GlpR 단백질은 글리세롤-3-인산 대사과정의 조절 인자로 글리세롤 대사과정에 해당하는 glpD, glpFK, glpTQ, glpABC 오페론의 작동유전자에 결합하여 해당 유전자의 전사를 억제하는 것으로 알려져 있다(Larson et al., J. Bio. Chem. 262(33): 15869-15874; Larson et al., J. Biol. Chem. 267(9): 6114-6121 (1992); Zeng et al., J. Bacteriol. 178(24): 7080-7089, (1996)). 본 발명자들은 GalP 단백질의 발현을 증가시키거나 글리세롤 대사 과정의 대표적 조절 인자인 glpR을 불활성화시킴으로서 글리세롤의 이용 효능을 증가시킬 수 있음을 발견하고, 이들과 관련된 유전자들을 불활성화하고자 하였다. 이러한 불활성화 방법에는 예를 들면, 자외선과 같은 빛 또는 화학물질을 이용하여 돌연변이를 유발하고, 얻어진 돌연변이체로부터 glpR 유전자 및/또는 galR 유전자가 불활성화된 균주를 선별하는 방법 등이 있으며, 이러한 방법은 당해 분야의 당업자에게 알려진 방법을 사용할 수 있다. 또한, 상기 불활성화 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함된다. 상기 DNA 재조합 기술에는 예를 들면, glpR 유전자 및/또는 galR 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합 (homologous recombination)이 일어나게 함으로써 이루어질 수 있다. 또한, 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터에는 우성 선별 마커를 포함할 수 있다. 상기 glpR 유전자 및 galR 유전자의 서열은 공지되어 있으며, 미국 생물공학정보센터(NCBI) 또는 일본 DNA 데이터 뱅크와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 또한 대장균(Escherichia coli)에 있어서, 상기 glpR 유전자 및 galR 유전자는 공지되어 있으며, Blattner 등(Science 277:1453-1462(1997)에 의하여 공개된 대장균의 게놈 서열로부터도 얻을 수 있다. 또한, 상기 glpR 유전자 및 galR 유전 자는 유전 코드의 축퇴 또는 기능적으로 중성인 돌연변이로 인하여 발생하는 대립유전자(allele)도 포함한다. 본 발명에 있어서, "불활성화"란 활성이 있는 glpR 유전자 및/또는 galR 유전자가 발현되지 않거나 글리세롤 관련 유전자의 발현을 억제하지 못하는 경우 또는 활성이 있는 GalP 산물이 발현되지 않는다는 것을 말한다. 따라서, glpR 유전자가 불활성화되면 글리세롤 관련 유전자 또는 그 조합의 발현이 증가하게 되며, galR 유전자가 불활성화되면 GalP의 발현은 증가하게 된다.
본 발명에 있어서 상기 미생물은 아미노산을 생산할 수 있는 미생물로서 글리세롤 동시 이용성을 갖는 미생물, 바람직하게는 미생물의 염색체 상에 galR 유전자 및/또는 glpR 유전자를 포함하고 있으며, 이들 유전자 중의 어느 하나 또는 모두가 불활성화할 수 있는 미생물이라면 원핵 미생물 또는 진핵 미생물의 어느 것도 제한되지 않는다. 예를 들자면, 에스케리키아 (Escherichia) 속, 엔테로박테리아 (Enterobacteria) 속, 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 크렙시엘라 (Klebsiella) 속, 시트로박터 (Citrobacter) 속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속, 바실러스 (Bacillus) 속, 락토바실러스 (Lactobacillus) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 사카로마이세스 (Saccharomyces)속, 아스퍼질러스 (Aspergillus) 속에 포함되는 미생물을 들 수 있다. 바람직하게는, 엔테로박테리아세 (Enterobacteriaceae)과에 포함되는 미생물이며, 더욱 바람직하게는 에스케리키아 (Escherichia) 속에 속하는 미생물이며, 보다 더 바람직하게는 대장균이다. 가장 바람직하게는, 대장균 (Escherichia coli) FTR2537 및 FTR2533 (KCCM-10540 및 KCCM-10541) (대한민국 특허공보 2005-0079344), 대장균(Escherichia coli) CJM002(KCCM-10568) 및 대장균 (Escherichia coli) CJIT6007 (KCCM-10755P) 및 이를 유래로 하는 대장균이다. 상기 미생물은 탄소원으로서 글리세롤 동시 이용성을 갖고 있으므로, 탄소원으로서 글리세롤이 포함된 경우에 포함되지 않는 경우보다 더 우수한 아미노산 생산 능력을 나타낸다.
상기 미생물에 있어, L-쓰레오닌 고생산성 균주인 대장균 FTR2533은 대장균 (Escherichia coli) FTR7624로부터 galR 유전자를 불활성화하여 유도된 것이며(대한민국 특허공보 2005-0079344), 대장균 FTR7624는 KCCM-10236으로부터 유도되었다. 대장균 FTR7624는 KCCM-10236의 염색체 내부에 존재하는 tyrR 유전자를 불활성화시킴으로써 L-쓰레오닌의 생산량을 향상시킨 것이며, KCCM-10236 은 L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루신 리키형 요구성, L-리신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노 부티릭산에 대한 내성을 가지며 포스포에놀피루베이트 카르복실레이즈 유전자(ppc)가 도입되고 쓰레오닌 합성하는 경로 관련 유전자들 (thrA: aspartokinase I-homoserine dehydrognase, thrB: homoserine kinase, thrC: threonine synthase)이 도입됨으로써 L-쓰레오닌의 생산량이 증가한 균주이다 (대한민국 특허공보 2005-0079344). 또한, L-메치오닌 고생산성 균주인 대장균 (Escherichia coli) CJM002 (KCCM-10568)은 L-쓰레오닌 고생산성 균주인 대장균 FTR2533을 모균주로 하여 모균주가 갖고 있던 L-메치오닌 요구성을 NTG 돌연변이법을 통해 해제한 균주이다. 상기 대장균(Escherichia coli) CJIT6007은 glpR과 상동성을 지니는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 결손 카세트를 중합효소 연쇄반 응을 통해 제작한 후 대장균 FTR2533 균주에 도입하여 glpR 유전자 및 galR 유전자를 모두 불활성화한 균주이다.
본 발명의 상기 미생물을 이용하여 아미노산을 생산하는 방법에서, 상기 미생물의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들면, ["Biochemical Engineering", James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176]에 개시되어 있다.
배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 본 발명에서 사용되는 배지는 글리세롤을 탄소원으로서 일부 혹은 전부 포함한다. 그 외의 적정량의 탄소원이 다양하게 이용될 수 있다. 이러한 탄소원은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 도당, 자당, 과당, 유당, 글루코스, 말토즈, 전분, 셀룰로오즈 등의 탄수화물; 대두유, 해바라기유, 파마자유, 코코넛유 등의 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산 등의 지방산 등이 있다. 특히 바람직한 탄소원은 글루코스이다. 상기 글리세롤은 배양 배지 리터 당 1 g 내지 300 g 포함되는 것이 바람직하다. 배지에서 상기 글리세롤 함량은 배양 배지의 전체 탄소원 함량과 대비하여 10 내지 100중량%의 비율이며, 상기 함량 범위를 벗어나면 생산되는 아미노산의 수율이 감소하는 문제점이 있다. 상기 탄소원 외에 사용될 수 있는 질소원의 예는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소, 또는 이산화탄소 가스를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양 기간은 원하는 아미노산을 계속적으로 생산할 수 있는 기간으로서, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.
상기 배양물로부터 아미노산을 회수하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 이온교환 크로마토그래피 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 의하여 생산되는 아미노산은 이에 제한되지 않으나, 산업적으로 유용한 아스파탐산(Aspartate), 쓰레오닌(Threonine), 리신(lysine), 메티오닌(methionine), 이소루신(isoleucine), 아스파라진(Asparagine), 글루탐산(Glutamic acid), 글루타민(Glutamine), 프롤린(Proline), 알라닌 (Alanine), 발린 (Valine), 류신 (Leucine), 트립토판 (Tryptophan), 티로신 (Tyrosine), 페닐알라닌 (Phenylalanine), 세린 (Serine), 글리신 (Glycine), 시스테인 (Cysteine), 아르기닌 (Arginine), 히스티딘 (Histidine) 등을 예로 들 수 있다. 바람직하게는 상기 아미노산은 아스파탐산, 리신, 쓰레오닌 또는 메티오닌이며, 보다 바람직하게는 쓰레오닌 또는 메티오닌이다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명은 탄소원으로서 글리세롤 동시 이용성을 갖는 아미노산 생산용 미생물에 관한 것이다. 하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 염색체 상의 glpR 유전자 및/또는 galR 유전자가 불활성화되어 있는 탄소원으로서 글리세롤 동시 이용성을 갖는 아미노산 생산용 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 미생물은 아미노산을 생산할 수 있는 미생물로서 글리세롤 동시 이용성을 갖는 미생물, 바람직하게는 미생물의 염색체 상에 galR 유전자 및/또는 glpR 유전자를 포함하고 있으며, 이들 유전자 중의 어느 하나 또는 모두가 불활성화할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 또는 진핵 미생물의 어느 것도 제한되지 않는다. 예를 들면, 에스케리키아 (Escherichia) 속, 엔테로박테리아 (Enterobacteria) 속, 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 크렙시엘라 (Klebsiella) 속, 시트로박터 (Citrobacter) 속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속, 바실러스 (Bacillus) 속, 락토바실러스 (Lactobacillus) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 사카로마이세스 (Saccharomyces)속, 아스퍼질러스 (Aspergillus) 속에 포함되는 미생물이다. 바람직하게는, 엔테로박테리아세 (Enterobacteriaceae)과에 포함되는 미생물이며, 보다 바람직하게는 에스케리키아 (Escherichia) 속에 속하는 미생물이고, 보다 더 바람직하게는 대장균(Escherichia coli .)이다. 가장 바람직하게는 대장균 CJIT6007 (수탁번호 KCCM-10755P)이다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 탄소원으로서 글리세롤 동시 이용성을 갖는 아미노산 생산용 미생물, 특히 galR 유전자 및/또는 glpR 유전자가 불활성화된 유전자를 포함하는 글리세롤 동시 이용성을 갖는 아미노산 생산용 미생물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
하나의 구체적 양태로, 불활성화된 glpR 유전자 또는 그의 DNA 단편을 제조하는 단계; 아미노산을 생산할 수 있는 미생물에 도입시켜 상기 미생물의 염색체 상에 존재하는 glpR 유전자와 재조합시키는 단계; 및 glpR 유전자가 불활성화된 미생물을 선별하는 단계를 포함하는 글리세롤을 고효율로 이용할 수 있는 미생물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 미생물은 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae) 과에 속하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)이고, 가장 바람직하게는 대장균 CJIT6007(수탁번호 KCCM-10755P)이다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 불활성화된 glpR 유전자 또는 그의 DNA 단편이란, 숙주 내의 glpR 유전자와 서열 상동성을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하나, 결실, 치환, 및 역위와 같은 돌연변이가 도입되어 활성이 있는 glpR 산물을 발현할 수 없는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 불활성화된 glpR 유전자 또는 그의 단편을 숙주세포 내로 도입하는 과정은 예를 들면, 형질전환(transformation), 접합(conjugation), 형질도입(transduction) 또는 전기 천공 (electroporation) 에 의하여 이루어질 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 불활성화된 glpR 유전자 또는 그의 DNA 단편이 형질전환에 의하여 숙주세포 내로 도입되는 경우, 불활성화 절차는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 균주의 배양물과 혼합하여 수행할 수 있다. 이 경우, 균주는 천연적으로 DNA 유입에 대해 컴피턴트하여 형질전환할 수 있으나, 이전에 균주를 적절한 방법에 의해 DNA 유입을 위해 컴피턴트하도록 만드는 것이 바람직하다. 상기 불활성화된 glpR 유전자 또는 그의 DNA 단편은 게놈 DNA의 절편 내에 외래 DNA 조각을 도입하고, 이 서열의 야생형 염색체 카피를 불활성화 상태로 치환시킨다. 한 구체예에서, 상기 불활성 화 폴리뉴클레티드 서열은 표적 부위 DNA의 일부분을 포함하는 "테일(tail)"을 5' 및 3' 말단에 포함하는 것이다. 상기 불활성화 폴리뉴클레오티드 서열에는 편의상 선별 마커 예를 들면, 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있다. 표적 DNA가 항생제 내성 유전자에 의해 불활성화되는 경우, 형질전환체의 선별은 적절한 항생물질이 함유된 한천 평판 상에서 실시한다. 형질전환에 의하여 숙주세포에 도입된 상기 불활성화 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA 중의 테일 서열과의 상동 재조합에 의하여 야생형 게놈 서열을 불활성화시킬 수 있다.
다른 하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 상기 방법과 동일한 방법으로 galR 유전자 및 glpR 유전자 중의 어느 하나의 유전자 또는 모두를 상기와 같은 방법으로 순차적으로 또는 동시에 불활성화시킨 미생물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법의 일 예로, 본 발명의 글리세롤을 포함하는 다양한 탄소원으로부터 발효를 통하여 효과적으로 아미노산을 생산할 수 있도록 글리세롤 대사 관련 유전자들의 조절 인자인 glpR유전자를 불활성화시킨 미생물을 제조하는 방법은 다음의 과정을 포함한다.
먼저, glpR과 상동성을 지니는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 결손 카세트 (deletion cassette)를 pKD3 플라스미드를 주형으로 하는 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 통해 제작한다. 다음으로, 리콤비나제 (Recombinase)를 지니고 있는 pKD46 플라스미드를 포함하는 대장균을 상기 중합효소 연쇄반응으로부터 얻어지는 DNA 절편을 이용하여 형질 전환한다. 형질 전환된 대장균을 항생제 마커가 포함된 평판 배지에 도말한 후, 항생제 내성을 갖는 균주를 선별함으로써 glpR 유전자가 불활성화된 균주를 분리한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명자들은 glpR과 상동성을 지니는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 결손 카세트를 중합효소 연쇄반응을 통해 제작한 후, L-쓰레오닌 고생산성 균주인 대장균 FTR2533 균주에 도입하였다. 그 결과 야생 glpR 유전자가 불활성화되어 모균주에 비하여 글리세롤을 효율적으로 이용하고, L-쓰레오닌을 고수율로 생성하는 새로운 균주를 개발하였다. 이 새로운 균주는 대장균 (Escherichia coli) CJIT6007로 명명하였고 부다페트스협약하의 국제기관인 한국미생물보존센터에 2006년 6월 2일에 기탁하였다(수탁번호 KCCM-10755P).
이하 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 쓰레오닌 생산 균주의 글리세롤 동시 이용성( 글루코스와 글리세롤) 관련 플라스크 실험
대장균 야생형 균주 K12 및 FTR2533 균주를 각각 MMYE 플레이트에 접종하여, 33℃ 인큐베이터에서 12시간 배양한 후, MMYE 액상 배지에 한 백금이 접종하여 33 ℃, 200 rpm 조건으로 6시간 배양하였다. MMYE 배지 조성은 하기 표 1과 같다.
MMYE 배지 조성
글루코스 2g
MgSO4·7H2O 0.493g
CaCl2 0.011g
Na2HPO4·12H2O 6g
NaCl 0.5g
KH2PO4 3g
효모엑기스 10g
DW 1L로 채움
글루코스와 CaCl2, MgSO4·7H2O는 각각 별도 멸균하였다. 배지 멸균 전 4N KOH 2.2 mL을 첨가하였다.
MMYE에서 배양한 K12 및 FTR2533 균주를 각각 역가 배지 25 mL(250 mL 용량의 플라스크)에 500 ul 접종하여 33℃, 200 rpm 조건으로 48 시간 동안 배양하였다. 각각의 균주를 이용하여 글루코스와 글리세롤이 다른 비율로 포함되어 있는 쓰레오닌 역가 배지에서 시간별 탄소원 소비양상을 파악하여 FTR2533 균주의 글리세롤 동시 이용성 여부를 확인하였다. 쓰레오닌 생산을 위한 역가 배지의 조성은 하기 표 2와 같다.
쓰레오닌 역가 배지 조성
C-소스 70 g
KH2PO4 2 g
(NH4)2SO4 25 g
MgSO4·7H2O 1 g
MnSO4·4H2O 0.01 g
FeSO4·7H2O 0.01 g
DL-Met 0.15 g
효모엑기스 2 g
CaCO3 30 g
DW 1L로 채움
C-소스와 KH2PO4는 각각 별도 살균하였고, 배지를 멸균하기 전에 4N KOH를 2.2 mL 첨가하였다. C-소스의 경우 글루코스와 글리세롤 비율에 따라서 아래 표 3과 같이 5 가지로 조성을 달리하였다.
　 글루코스-글리세롤
1 70-0
2 52.5-17.5
3 35.0-35.0
4 17.5-52.6
5 0-70
(단위; g/L)
쓰레오닌 생성량은 배양액을 증류수로 500배 희석한 후 원심분리해서 얻은 상등액을 HPLC를 통해 분석하였고, 글루코스와 글리세롤의 양은 배양액을 증류수로 10배 희석한 후 원심분리해서 얻은 상등액을 HPLC를 통해 분석하였다. OD의 경우 0.3N HCl 용액에 배양액을 50배 희석하여 562 nm에서 측정하였다. 하기 표 4와 표 5는 각각 야생형 균주 K12 및 쓰레오닌 균주 FTR2533 플라스크 실험 결과로서, 배양 시작 후 12 시간, 24 시간 및 48 시간에서의 글루코스 및 글리세롤의 사용하고 남아있는 정도 및 쓰레오닌 생산량을 비교하였다. Glc는 글루코스, Gly는 글리세롤, Thr은 쓰레오닌을 나타내며, 각각의 단위는 g/L 이다.
야생형 균주 K12 의 플라스크 역가시험 결과
글루코스:글리세롤 12 hr 24 hr 48 hr
OD Glc Gly Thr OD Glc Gly Thr OD Glc Gly Thr
70:0 18.2 49 0 0 21.9 33.3 0 0 21.0 17.2 0 0
52.5:17.5 17.6 33.2 17.4 0 21.0 21.8 17.3 0 20.3 12.2 17.0 0
35:35 14.1 14.4 35.0 0 20.1 5.5 34.5 0 19.0 0 35.0 0
17.5 :52.5 13.4 0 51.3 0 20.5 0 20.7 0 20.0 0 15.8 0
0:70 15.8 0 49.9 0 22.6 0 36.3 0 21.8 0 19.0 0
쓰레오닌 생산균주 FTR2533 의 플라스크 역가시험 결과
글루코스:글리세롤 12 hr 24 hr 48 hr
OD Glc Gly Thr OD Glc Gly Thr OD Glc Gly Thr
70:0 4.2 69.2 0 1.7 18.8 38.3 0 8.8 19.2 0 0 23.1
52.5:17.5 4.8 52.5 15.7 2.2 19.2 29.9 3.5 11.4 22.7 0 0 23.9
35:35 4.8 32.3 33.6 2.0 20.5 15.7 21.5 12.1 19.9 0 0 26.7
17.5 :52.5 4.3 14.0 52.5 1.8 19.9 0 36.2 10.5 20.6 0 0 24.4
0:70 4.3 0 68.5 1.6 12.4 0 47.4 7.9 19.6 0 0 28.4
상기 표 4와 표 5의 결과에서 알 수 있듯이, 야생형 균주 K12 는 글리세롤 및 글루코스가 복합적으로 포함된 모든 역가배지에서 플라스크 배양 12시간, 24시간에 글루코스를 우선적으로 소비하고 글리세롤을 소비하여 글리세롤 동시 이용성이 없는 것을 알 수 있으나, 쓰레오닌 생산균주인 FTR2533의 경우(표 5)에는 배양 12시간부터 글리세롤과 글루코스를 동시에 소비하는 것을 확인하였다. 또한 쓰레오닌 생산균주 FTR2533의 경우, 글리세롤이 50% 포함된 복합탄소원 배지 및 글리세롤이 단독으로 포함되는 배지에서 글루코스만을 탄소원으로 포함한 배지에 비해 쓰레오닌 생산성이 각각 15%, 23% 증가하는 것을 확인하였고, FTR2533 균주가 글리세롤이 포함된 배지를 사용하였을 경우 높은 수율로 쓰레오닌을 생산하는 것을 확인하였다(표 5).
실시예 2. 재조합 플라스미드 제작과 이를 이용한 glpR 유전자의 불활성화 ( Knock - out )
본 실시예에서는 대장균 염색체 내의 glpR 유전자를 상동 재조합에 의하여 불활성화시켰다. 이를 위해, FRT-one-step PCR 결실 방법을 사용하였다 (PNAS, 97: 6640-6645 (2000)). 이를 위해 서열번호 1 및 2 프라이머를 이용하여 pKD3 벡터 (PNAS, 97: 6640-6645 (2000))를 주형으로 하여 PCR 반응으로 결손 카세트 (deletion cassette)를 제작하였다. 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1분 동안 실시하고, 이를 30회 수행하였다.
Forward primer : 5' ATGAAACAAACACAACGTCACAACGGTATTATCGAACTGGTTAAACAGCAGTGT
AGGCTGGAGCTGCTTC 3' 서열번호 1)
Reverse primer : 5' TGCTGATGCTGCCCATATTGACCATCGCGTTACGGCCAAATTTCGAGTGACA
TATGAATATCCTCCTTAG 3' (서열번호 2)
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기영동한 후, 1.2 kbp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편은 pKD46 벡터 (PNAS, 97: 6640-6645 (2000))를 미리 형질 전환시킨 대장균 (Escherichia coli) FTR2533 균주에 전기천공하였다. 전기천공을 위하여 pKD46이 포함된 FTR2533 균주는 100 ㎍/L 암피실린 (amplicillin)과 5mM 아라비노스 (L-arabinose)가 포함된 LB 배지를 이용하여 30℃에서 OD600 = 0.6 까지 배양한 후 멸균 증류수로 2회, 10% 글리세롤로 1회 세척하여 사용하였다. 전기천공은 2500V로 가하였다. 회수된 균주는 25㎍/L 클로람페니콜 (Chloramphenichol)을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 배양한 후 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주는 균주를 주형으로 하여 동일한 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR한 후 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.2 kb로 관찰되는 것을 확인함으로서 glpR 유전자의 결손을 확인하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터 (PNAS, 97: 6640-6645 (2000))를 형질전환하여 LB 배지에서 배양하였으며, 다시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 150 bp로 작아짐으로서 클로람페니콜 마커가 제거되었음을 확인하여 최종 glpR 이 결손 된 FTR2533DglpR 균주를 획득하였다. 제작된 균주는 CJIT6007으로 명명하였다.
실시예 3. CJIT6007 균주의 L- 쓰레오닌 생산
글리세롤 대사과정 조절 인자인 glpR을 결손시킨 대장균 CJIT6007을 이용하여, 글리세롤이 포함된 복합탄소원 배지 및 글리세롤이 단독으로 포함된 쓰레오닌 역가배지에서, 글리세롤 동시 이용성 여부와 L-쓰레오닌 생산성을 확인하였다.
CJIT6007를 MMYE 플레이트에 접종하여 33℃ 인큐베이터에서 12시간 배양한 후 MMYE 액상 배지에 한 백금이 접종하여 33℃, 200 rpm 조건으로 6시간 배양하였다. MMYE 배지 조성은 상기 표 1과 같다. 글루코스와 CaCl2, MgSO4·7H2O는 각각 별도 멸균하였다. 배지 멸균 전 4N KOH 2.2 mL을 첨가하였다.
MMYE에서 배양한 균주를 역가 배지 25 mL(표 2)에 500 ul 접종하여 33℃, 200 rpm 조건으로 48시간 동안 배양하였다. 글리세롤의 초기 농도는 70 g/L 로 하였다. 글리세롤과 KH2PO4는 각각 별도 살균하였고 배지를 멸균하기 전에 4N KOH를 2.2 mL 첨가하였다. 쓰레오닌 생성량은 배양액을 증류수로 500배 희석한 후 원심분리해서 얻은 상등액을 HPLC를 통해 분석하였고, 글루코스와 글리세롤의 양은 배양액을 증류수로 10배 희석한 후 원심분리해서 얻은 상등액을 HPLC를 통해 분석하였다. OD의 경우 0.3N HCl 용액에 배양액을 50배 희석하여 562 nm에서 측정하였다. 그 결과는 하기 표 6과 같다. 표 6은 쓰레오닌 균주의 플라스크 실험 결과로서, 배양 시작 후 12시간, 24 시간 및 48 시간에서의 글루코스와 글리세롤의 배지 잔존량 및 쓰레오닌 생산량을 확인하였다. Gly는 글리세롤, Thr은 쓰레오닌을 나타내며, 각각의 단위는 g/L 이다.
쓰레오닌 생산균주 FTR2533DglpR 의 플라스크 역가시험 결과
글루코스:글리세롤 12 hr 24 hr 48 hr
OD Glc Gly Thr OD Glc Gly Thr OD Glc Gly Thr
70:0 5.3 67.3 0 2.0 17.5 34.5 0 8.1 20.1 0 0 23.4
52.5:17.5 5.5 50.8 14.6 2.4 18.9 29.8 0.9 11.5 20.5 0 0 25.2
35:35 5.5 30.2 32.8 2.2 19.8 9.9 21.5 12.8 21.4 0 0 29.0
17.5 :52.5 5.6 13.1 48.0 2.0 18.7 0 33.9 10.1 21.0 0 0 26.1
0:70 5.3 0 68.2 1.7 12.8 0 46.5 8.6 18.7 0 0 28.2
표 6의 결과에서 알 수 있듯이, glpR 유전자가 불활성화된 재조합 균주 FTR2533△glpR 도 글루코스와 글리세롤이 복합적으로 포함된 역가배지에서 글리세롤을 글루코스와 동시에 이용하는 것을 확인하였으며 동일 조건의 FTR2533 균주에 비해 쓰레오닌 생산성이 증가하는 것을 확인하였다. 특히 글리세롤이 50% 포함된 복합 탄소원 배지의 경우(글루코스:글리세롤 = 35:35), FTR2533 균주에 비해 배양 24시간에 탄소원 소모속도가 보다 향상됨을 확인하였고, 최종적으로 FTR2533 균주에 비해 쓰레오닌 생산성이 8.6% 증가한 것을 확인하였다(표 5 및 6). 따라서 glpR 유전자가 불활성화된 FTR2533△glpR 균주의 경우 glpR 유전자가 불활성화되지 않은 균주에 비하여 글리세롤을 탄소원으로 동시에 이용하여 보다 높은 수율로 L-쓰레오닌을 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. 메치오닌 생산을 위한 발효
PCT 국제공개 WO 06/001616에 기재된 메치오닌 생산 균주인 대장균 CJM002 (KCCM-10568)를 글리세롤을 복합 탄소원으로 하여 메치오닌 생산 실험을 수행하였다. 대장균 CJM002는 대장균 FTR2533을 모주로 하여 얻어진 것으로 메치오닌의 생합성 경로가 강화된 균주이다. 메치오닌 생산을 실험하기 위하여 삼각플라스크 배양을 실시하였다. 평판 LB 배지에 KCCM-10568을 도말하여 31℃에서 하룻밤 배양한 후 단일 콜로니를 3ml LB 배지에 접종한 후 31℃에서 5 시간 배양하고 다시 25ml 메치오닌 생산 배지를 포함한 250ml 삼각플라스크에 200배 희석하여 31℃, 200 rpm에서 64시간 배양한 후 HPLC 분석을 통하여 메치오닌 생산량을 비교하였다.
메치오닌 생산 배지
조성 농도(리터당)
배지 A 배지 B 배지 C 배지 D 배지 E
글루코스 40 g 30 g 20 g 10 g 0 g
글리세롤 0 g 10 g 20 g 30 g 40 g
황산암모늄 17 g 17 g 17 g 17 g 17 g
KH2PO4 1.0 g 1.0 g 1.0 g 1.0 g 1.0 g
MgSO4ㆍ7H2O 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g
FeSO4ㆍ7H2O 5 mg 5 mg 5 mg 5 mg 5 mg
MnSO4ㆍ8H2O 5 mg 5 mg 5 mg 5 mg 5 mg
ZnSO4 5 mg 5 mg 5 mg 5 mg 5 mg
탄산칼슘 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g
효모엑기스 2 g 2 g 2 g 2 g 2 g
pH (7.0)
L-메치오닌 생산성 비교
배지 OD 글루코스 소모(g/L) 글리세롤 소모(g/L) L-메치오닌 (g/L)
A 14.2 40 0 0.35
B 8.1 30 9 0.41
C 8.0 20 19.5 0.27
D 14.7 10 30 0.42
E 11.9 0 40 0.64
표 8에서 알 수 있듯이, CJM002 역시 글루코스와 글리세롤의 복합 배지를 이용하여 효과적으로 L-메치오닌을 생산할 수 있었다. 특히 글리세롤을 단독으로 이용한 배지 E의 경우 글루코스를 단독으로 이용한 배지 A의 경우에 비해 L-메치오닌의 생산 수율이 80% 증가하였다.
본 발명에 따르면, 탄소원으로서 글리세롤 동시 이용성을 갖는 아미노산 생산용 미생물을 이용하여 바이오 디젤의 부산물인 글리세롤이 포함된 복합 탄소원을 포함한 배지 또는 글리세롤을 단독으로 포함한 배지에서 효과적이고 높은 수율로 아미노산을 생산할 수 있어, 기존에 사용되는 포도당 등의 발효원료를 보다 값싼 원료로 대체할 수 있다.
<110> CJ Corp. <120> Method for producing amino acids using glycerol <130> PA9706-0367/KR <150> KR 10-2006-0057633 <151> 2006-06-26 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 atgaaacaaa cacaacgtca caacggtatt atcgaactgg ttaaacagca gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 tgctgatgct gcccatattg accatcgcgt tacggccaaa tttcgagtga catatgaata 60 tcctccttag 70

Claims (19)

  1. 탄소원으로서 글리세롤과 글루코스 동시 이용성을 갖는 아미노산 생산용 대장균으로서 glpR 유전자 및 galR 유전자가 동시에 불활성화된 대장균을 글리세롤이 포함된 배양 배지에 접종하여 배양하는 단계; 및
    상기 단계로부터 생산된 배양물에서 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 글리세롤을 이용한 아미노산의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 글리세롤은 배양 배지 리터 당 1 g 내지 300 g 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지의 글리세롤 함량은 배양 배지의 전체 탄소원 함량과 대비하여 10 내지 100중량%의 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 생산되는 아미노산이 쓰레오닌 또는 메티오닌인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 대장균(Escherichia coli)이 KCCM-10755P 인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 탄소원으로서 글리세롤과 글루코스 동시 이용성을 갖는 아미노산 생산용 미생물로서 glpR 유전자 및 galR 유전자가 동시에 불활성화된 아미노산 생산용 대장균.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제9항에 있어서, 대장균(Escherichia coli)이 대장균 CJIT6007(수탁번호 KCCM-10755P)인 미생물.
  14. 제9항에 있어서, 생산되는 아미노산이 쓰레오닌 또는 메티오닌인 것을 특징으로 하는 미생물.
  15. (a) 불활성화된 glpR 유전자 및 galR 유전자, 또는 그의 DNA 단편을 제조하는 단계;
    (b) 아미노산을 생산할 수 있는 대장균에 도입시켜 상기 대장균의 염색체 상에 존재하는 glpR 유전자 및 galR 유전자와 재조합시키는 단계; 및
    (c) glpR 유전자 및 galR 유전자가 불활성화된 대장균을 선별하는 단계를 포함하는, 탄소원으로서 글리세롤과 글루코스 동시 이용성을 갖는 아미노산 생산용 대장균의 제조 방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 제15항에 있어서, 대장균이 대장균 CJIT6007 (수탁번호 KCCM-10755P)인 것을 특징으로 하는 방법.
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